使用生長(zhǎng)分化因子15(gdf-15)治療或改善代謝障礙的方法
【專利摘要】提供了使用GDF15多肽治療代謝疾病和障礙的方法。在各個(gè)實(shí)施方案中，代謝疾病或障礙是2型糖尿病、肥胖、血脂異常、升高的葡萄糖水平、升高的胰島素水平以及糖尿病性腎病。
【專利說(shuō)明】使用生長(zhǎng)分化因子15(GDF-15)治療或改善代謝障礙的方法
[0001]本申請(qǐng)要求2011年4月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1 / 473，583的權(quán)益，所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本公開(kāi)發(fā)明涉及通過(guò)對(duì)有此需要的受試者施用治療有效量的GDF15來(lái)治療或改善代謝障礙例如2型糖尿病、升高的葡萄糖水平、升高的胰島素水平、血脂異常、肥胖或糖尿病性腎病。
[0003]發(fā)明背景
[0004]生長(zhǎng)分化因子15(⑶F15)是TGF0超家族的分支成員。其也稱為巨噬細(xì)胞抑制細(xì)胞因子 I(MICl) (Bootcov MR, 1997, Proc Natl AcadSci94:11514-9.)、胎盤骨形態(tài)發(fā)生因子(PLAB) (Hromas R1997, Biochim Biophys Acta.1354:40-4.)、胎盤轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (PTGFB) (Lawton LN1997, Gene.203:17-26)、前列腺衍生因子(PDF) (Paralkar VM1998,J Biol Chem.273:13760-7)和非類固醇抗炎藥物活化基因(NAG-1) (Baek SJ2001, J BiolChem.276:33384-92)。
[0005]人⑶F15基因位于染色體19pl3.2-13.1上；大鼠⑶F15基因位于染色體16上；以及小鼠⑶F15基因位于染色體8上。⑶F15開(kāi)放閱讀框橫跨兩個(gè)外顯子(Bottner M1999，Gene.237:105-11和NCBI)。成熟GDF15肽與其它家族成員共有低同源性(Katoh M2006,IntJMolMed.17:951-5.)。
[0006]⑶F15被合成為大的前體蛋白質(zhì),所述蛋白質(zhì)在二元切割位點(diǎn)(dibasic cleavagesite)上被切割以釋放羧基端`成熟肽。小鼠和大鼠⑶F15前體肽原(prepro-peptide)都包含303個(gè)氨基酸。人全長(zhǎng)前體包含308個(gè)氨基酸。嚙齒類動(dòng)物成熟肽在于RGRR(SEQ IDNO:13)切割位點(diǎn)加工后包含115個(gè)氨基酸。人成熟肽在于RGRRRAR(SEQ IDN0:14)切割位點(diǎn)加工后包含112個(gè)氨基酸。人成熟⑶F15肽與大鼠和小鼠成熟⑶F15肽共有66.1%和 68.1 % 的序列相似性(Bottner M1999，Gene.237:105-11 ；Bauskin AR2000，EMB0 J.19:2212-20 ；NCBI)。在成熟⑶F15肽中不存在糖基化位點(diǎn)。
[0007]成熟GDF15肽包含形成半胱氨酸結(jié)基元所需的7個(gè)保守半胱氨酸殘基和對(duì)于TGF^超家族成員是常見(jiàn)的單個(gè)鏈間二硫鍵。成熟肽還包含形成第4鏈間二硫鍵的兩個(gè)另外的半胱氨酸殘基。生物活性GDF15是通過(guò)一個(gè)鏈間二硫鍵共價(jià)連接的成熟肽的25kD同
二聚體。
[0008]已報(bào)道⑶F15循環(huán)水平在多個(gè)病理和生理狀況，最明顯地懷孕(Moore AG2000.JClinEndocrinolMetab85:4781-4788)、 β-地中海貧血(Tanno Τ2007, Nat Medl3:1096-101) (Zimmermann MB,2008Am JClin Nutr88:1026-31)、先天性紅細(xì)胞生成障礙性貧血(Tamary H2008,Blood.112:5241-4)中升高。在文獻(xiàn)報(bào)道中，⑶F15還與多種生物活性關(guān)聯(lián)。⑶F15敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明⑶F15可防止局部缺血/再灌注或過(guò)載誘發(fā)的心臟損傷(Kempf T, 2006, CircRes.98:351-60) (Xu J，2006，Circ Res.98:342-50)、防止年齡相關(guān)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺(jué)神經(jīng)元損失(Strelau J, 2009, JNeurosc1.29:13640-8.)、適度防止腎的代謝性酸中毒，并且可引起癌癥患者的惡病質(zhì)(cachexia) (Johnen H2007Nat Med.11:1333-40)。許多研究小組還研究了 GDF15在細(xì)胞凋亡和增殖中的作用，并且使用不同的細(xì)胞培養(yǎng)物和異種移植物模型報(bào)道了有爭(zhēng)議的結(jié)果。關(guān)于轉(zhuǎn)基因小鼠的研究顯示⑶F15防止致癌物或Apc突變誘導(dǎo)的腸和肺中的瘤形成(Baek SJ2006, Gastroenterology.131:1553-60)(Cekanova M2009, Cancer PrevRes2:450-8.)。
發(fā)明概要
[0009]提供了治療代謝障礙的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括向有此需要的受試者施用治療有效量的分離的人GDF15多肽。在各個(gè)實(shí)施方案中，代謝障礙是2型糖尿病、血脂異常、肥胖或糖尿病性腎病。在其它實(shí)施方案中，代謝障礙包括其中受試者具有大于或等于IOOmg / dL的空腹血糖水平的病況。對(duì)其進(jìn)行所述方法的受試者可以是哺乳動(dòng)物，例如人。在具體的實(shí)施方案中，⑶F15蛋白包含SEQ IDN0:2、6和10之一和/或由SEQ IDNO:9的核酸序列編碼。在一些實(shí)施方案中，以包含與藥學(xué)上可接受的載體混合的⑶F15多肽的藥物組合物的形式施用GDF15多肽。在其它實(shí)施方案中，提供的方法還包括在施用后的時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定受試者的血糖水平的步驟。在其它實(shí)施方案中，所述方法還包括在施用后的時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定受試者的血 清胰島素水平的步驟。 [0010]還提供了治療代謝障礙的另一種方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括向有此需要的受試者施用治療有效量的包含以下氨基酸序列的分離的人GDF15多肽，所述氨基酸序列與SEQ ID NO:2、6和10之一具有至少90%的序列同一性。在各個(gè)實(shí)施方案中，代謝障礙是2型糖尿病、血脂異常、肥胖或糖尿病性腎病。在其它實(shí)施方案中，代謝障礙包括其中受試者具有大于或等于IOOmg / dL的空腹血糖水平的病況。對(duì)其進(jìn)行所述方法的受試者可以是哺乳動(dòng)物，例如人。在具體的實(shí)施方案中，⑶F15蛋白包含SEQ ID N0:2、6和10之一和/或由SEQ ID NO:1、5和9之一編碼。在一些實(shí)施方案中以包含與藥學(xué)上可接受的載體混合的GDF15多肽的藥物組合物的形式施用GDF15多肽。在其它實(shí)施方案中，提供的方法還包括在施用后的時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定受試者的血糖水平的步驟。在其它實(shí)施方案中，方法還包括在施用后的時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定受試者的血清胰島素水平的步驟。
[0011]附圖簡(jiǎn)述
[0012]圖1是一系列兩個(gè)條形圖，顯示營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)鼠肝臟(圖1A)和鼠脂肪(圖1B)的⑶F15表達(dá)的調(diào)控。
[0013]圖2是一系列兩個(gè)條形圖。顯示PPAR激動(dòng)劑對(duì)鼠肝臟(圖2A)和鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞(圖2B)的⑶F15表達(dá)的上調(diào)。
[0014]圖3是一系列曲線圖和條形圖，顯示在用鼠⑶F15的AAV介導(dǎo)的治療后瘦素-缺陷型ob / ob小鼠的代謝特征譜的改善；測(cè)量AAV鼠GDF15注射對(duì)血糖水平(圖3A)和體重(圖3C)的影響，進(jìn)行2個(gè)月。在AAV注射后2周(圖3B)測(cè)量血漿胰島素水平，并且在AAV注射后3周(圖3D)測(cè)量平均每日食物攝入。AAV注射后2個(gè)月測(cè)量總膽固醇(圖3E)、NEFA(圖3F)、甘油三酯(圖3G)和胰島素水平(圖3H)。
[0015]圖4是一系列兩個(gè)曲線圖和兩個(gè)條形圖，顯示用鼠⑶F15的ob / ob小鼠的AAV介導(dǎo)的治療的降糖活性，并且顯示降糖作用不依賴于減輕的體重。對(duì)飼研究(pair-feedingstudy)包括3組動(dòng)物:一組用對(duì)照AVV注射并且自由接觸食物，第二組用AAV⑶F15注射并且自由接觸食物，以及第三組用對(duì)照AVV注射并且飼以相同量的由注射GDF15AAV的動(dòng)物的組在前一天消費(fèi)的食物。注射GDF15或?qū)φ誂AV的小鼠中隨時(shí)間過(guò)去的食物攝入與體重的比率示于圖4A中；圖4B顯示用對(duì)照或GDF15AAV處理的隨意喂飼的小鼠和用對(duì)照AAV注射的對(duì)飼小鼠的隨時(shí)間過(guò)去的體重；圖4(:顯示對(duì)飼研究結(jié)束時(shí)的血漿葡萄糖水平；和圖4D顯示對(duì)飼研究結(jié)束時(shí)的體重。
[0016]圖5是一系列四個(gè)曲線圖和兩個(gè)條形圖，分別顯示鼠⑶F15AAV對(duì)飼以高脂肪飲食的小鼠(圖5A-5C)和飼以標(biāo)準(zhǔn)飲食(normal choffdiet)的小鼠(圖OT-5F)的血漿葡萄糖水平、體重和食物攝入的影響。
[0017]圖6是一系列四個(gè)曲線圖，顯示用鼠GDF15的AAV介導(dǎo)的治療對(duì)飼以高脂肪飲食的小鼠的胰島素敏感性和葡萄糖耐受性的影響；圖6A和6B分別顯示在AAV注射后3周在OGTT過(guò)程中測(cè)量的血漿葡萄糖和血漿胰島素水平，并且圖6C和6D顯示AAV注射后2周在ITT過(guò)程中測(cè)量的血漿葡萄糖和血漿葡萄糖/基礎(chǔ)葡萄糖水平。
[0018]圖7是一系列曲線圖和四個(gè)條形圖，顯示DIO小鼠的AAV-介導(dǎo)的人⑶F15治療對(duì)葡萄糖水平(圖7A);食物攝入(圖7B);體重(圖7C)以及DIO小鼠中表達(dá)的人GDF15的量(圖7D)的影響。
[0019]圖8是顯示AAV介導(dǎo)的人⑶F15對(duì)KKAy小鼠中的葡萄糖耐受性的增進(jìn)的影響的曲線圖和兩個(gè)條形圖；圖8A顯示OGTT過(guò)程中血漿葡萄糖的水平；圖8B顯示AAV注射后3周和6周的體重；并且圖8C顯示AAV注射后3周和6周的胰島素水平。
[0020]圖9是一系列九個(gè)條形圖，顯示在3-4周時(shí)間的過(guò)程中AAV介導(dǎo)的人⑶F15對(duì)KKAy小鼠中的糖尿(glucosuria)的影響；圖9A顯示尿糖水平；圖9B顯示尿量；圖9C顯示葡萄糖排泄；圖9D顯不尿白蛋白；圖9E顯不白蛋白排泄；圖9F顯不水?dāng)z入；圖9G顯不膜島素水平；圖9H顯示血漿葡萄糖水平；圖91顯示人⑶F15水平；圖9J顯示體重以及圖9K顯示食物攝入。
[0021]圖10是一系列四個(gè)條形圖，顯示AAV-介導(dǎo)的鼠⑶F15對(duì)DIO小鼠的總身體質(zhì)量(圖10A);脂肪質(zhì)量(圖10B);脂肪質(zhì)量/總身體質(zhì)量(圖10C);以及非脂肪質(zhì)量/總身體質(zhì)量(圖10D)的影響。
[0022]圖11是一系列兩個(gè)曲線圖和六個(gè)條形圖，顯示AAV-介導(dǎo)的人⑶F15對(duì)DIO小鼠的影響；圖1IA顯示體重；圖1IB顯示表達(dá)的人⑶F15的量；圖1IC顯示總身體質(zhì)量；圖1lD顯示脂肪質(zhì)量；圖1IE顯示非脂肪質(zhì)量；圖1IF顯示骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density)；圖1lG顯示脂肪質(zhì)量/身體質(zhì)量的百分比；以及圖1lH顯示非脂肪質(zhì)量/總身體質(zhì)量的百分比。
[0023]圖12是一系列二個(gè)條形圖，顯不重組鼠⑶F15對(duì)ob / ob小鼠的匍萄糖和食物攝入的影響；圖12A顯示血漿葡萄糖水平；圖12B顯示體重；以及圖12C顯示在媒介物或鼠⑶F15注射后第I和第2天的食物攝入。
[0024]圖13是一系列三個(gè)條形圖，顯示重組人⑶F15對(duì)ob / ob小鼠中的血漿葡萄糖水平、食物攝入和體重的影 響；圖13A顯不血衆(zhòng)匍萄糖水平；圖13B顯不食物攝入；以及圖13C
顯示體重。
[0025]圖14是一系列曲線圖和兩個(gè)條形圖，顯示重組人⑶F15在DIO小鼠中的作用；圖14A顯示在蛋白質(zhì)注射后3天在OGTT過(guò)程中測(cè)量的血漿葡萄糖水平；圖14B顯示食物攝入；以及圖14C顯示體重。
[0026]圖15是曲線圖和條形圖，顯示在口服脂質(zhì)激發(fā)后重組人⑶F15對(duì)B6D2F1雄性小鼠中的脂質(zhì)代謝的影響；圖15A顯示在脂質(zhì)耐受測(cè)試過(guò)程中血漿甘油三酯的水平；以及圖15B顯示重組人⑶F15的血漿暴露。
[0027]圖16是一系列四個(gè)條形圖，顯示在AAV-介導(dǎo)的鼠⑶F15施用后飼以高脂肪飲食3周的B6D21F小鼠的血液化學(xué)；圖16A顯示血漿胰島素水平；圖16B顯示非酯化脂肪酸(NEFA)水平；圖16C顯示總膽固醇水平；以及圖16D顯示甘油三酯水平。
[0028]發(fā)明詳述
[0029]本公開(kāi)內(nèi)容提供了通過(guò)向有此需要的受試者施用治療有效量的分離的人GDF15多肽來(lái)治療代謝障礙例如2型糖尿癥(在本文中可互換地稱為“2型糖尿病”)、升高的葡萄糖水平、升高的胰島素水平、血脂異?；蚍逝值姆椒?。還提供了施用和遞送方法。
[0030]本文中使用的包括在實(shí)施例中的重組多肽和核酸方法通常是Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)及隨后版本或 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人，編著，GreenPublishers Inc.and Wileyand Sonsl994)及隨后版本(為了任何目的將所述兩個(gè)參考資料通過(guò)引用并入本文)中所示的那些方法。
[0031]1.一般定義
[0032]按慣例，除非另外明確指出，否則如本文中所用，“一個(gè)/ 一種(a) ”和“一個(gè)/ 一種(an) ”意指“一個(gè)/ 一種或多個(gè)/多種”。
[0033]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”和“殘基”可互換使用并且，當(dāng)用于肽或多肽的情況中時(shí)，是指天然存在和合成的氨基酸，以及氨基酸類似物、氨基酸模擬物以及在化學(xué)上與天然存在的氨基酸相似的非天然存在的氨基酸。
[0034]“天然存在的氨基酸”是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及合成后被修飾的由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，即與氫、羧基、氨基和R基團(tuán)結(jié)合的α碳，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這樣的類似物可具有修飾R基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或修飾肽主鏈，但將保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0035]“氨基酸模擬物”是具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的化合物。實(shí)例包括酰胺、β _、Y-、S -氨基酸(例如哌啶-4-羧酸)等的甲丙烯?；虮；苌?。
[0036]“非天然存在的氨基酸”是具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，但未被翻譯復(fù)合物并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈的化合物?！胺翘烊淮嬖诘陌被帷边€包括但不限于通過(guò)天然編碼的氨基酸(包括但不限于20個(gè)常用氨基酸)的修飾(例如，翻譯后修飾)產(chǎn)生的，但它們本身不被翻譯復(fù)合物天然地并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈的氨基酸?？杀徊迦攵嚯男蛄谢蛑脫Q多肽序列的野生型殘基的非天然存在的氨基酸的實(shí)例的非限定性列表包括β-氨基酸、高氨基酸、環(huán)狀氨基酸和具有衍生側(cè)鏈的氨基酸。實(shí)例包括(以L-型或D-型；如括號(hào)中縮寫的):瓜氨酸(CU)、高瓜氨酸(hCit)、Na-甲基瓜氨酸(NMeCit)、Na-甲基高瓜氨酸(Na-MeHoCit)、鳥(niǎo)氨酸(Orn)、Na -甲基鳥(niǎo)氨酸(Na-MeOrn或NMeOrn)、肌氨酸(Sar)、高賴氨酸(hLys或hK)、高精氨酸(hArg或hR)、高谷氨酰胺(hQ)、Na-甲基精氨酸OMeR)、N a -甲基亮氨酸(N a -MeL或^eL)、N-甲基高賴氨酸(NMeHoK)、N a -甲基谷氨酰胺(NMeQ)、正亮氨酸(Nle)、正纈氨酸(Nva)、1，2，3，4-四氫異喹啉(Tic)、八氫吲哚-2-二羧酸(Oic)、3-(1_萘基)丙氨酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙氨酸(2_Nal)、1，2，3，4-四氫異喹啉(Tie)、2-茚滿基甘氨酸(IgI)、對(duì)-吲哚苯丙氨酸(pI_Phe)、對(duì)-氨基苯丙氨酸(4AmP或4-氨基-Phe)、4_胍基苯丙氨酸(Guf)、甘氨酰賴氨酸(縮寫“K (N ε -glycyl) ” 或“K(glycyl) ” 或“K(gly) ” )、硝基苯丙氨酸(nitrophe)、氨基苯丙氨酸(aminophe或氨基-Phe)、芐基苯丙氨酸(benzylphe)、Y-羧基谷氨酸(Y-carboxyglu)、羧脯氨酸(hydroxypro)、對(duì)羧基-苯丙氨酸(Cpa)、α -氨基己二酸(Aad)、N α -甲基繳氨酸(NMeVal)、Ν_ α -甲基亮氨酸(NMeLeu) ,Na-甲基正亮氨酸(NMeNle)、環(huán)戊基甘氨酸(Cpg)、環(huán)己基甘氨酸(Chg)、乙酰精氨酸(acetylarg)、α，β - 二氨基丙酸(Dpr) > α , y 二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、環(huán)己基丙氨酸(Cha)、4_甲基-苯丙氨酸(MePhe)、β , β -二苯基-丙氨酸(BiPhA)、氨基丁酸(Abu)、4_苯基-苯丙氨酸(或二苯基丙氨酸；4Bip)、α -氨基-異丁酸(Aib)、β -丙氨酸、β -氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、鎖鏈素、二胺基庚二酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、羥賴氨酸、別-羥賴氨酸、異鎖鏈賴氨素、別-異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基纈氨酸、4-羥脯氨酸(Hyp)、Y -羧基谷氨酸、ε -N, N, N-三甲基賴氨酸、ε -N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、ω-甲基精氨酸、4-氨基-O-鄰苯二甲酸(4ΑΡΑ)和其它類似氨基酸，以及明確列出的那些氨基酸的任一種的衍生形式。
[0037]術(shù)語(yǔ)“分離的核酸分子”是指從5’至3’端閱讀的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的單鏈或雙鏈聚合物(例如，本文中提供的GDF15核酸序列)或其類似物，所述分離的核酸分子已與至少約50%的當(dāng)從來(lái)源細(xì)胞分離總核酸時(shí)與所述分離的核酸分子一起被天然發(fā)現(xiàn)的多核苷酸、肽、脂質(zhì)、糖類、多核苷酸或其它材料分離。優(yōu)選地，分離的核酸分子大體上不含任何其它污染性核酸分子或在核酸的天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的可干擾其在多肽產(chǎn)生中的用途或其治療性、診斷性、預(yù)防性或研究用途的其它分子。
[0038]術(shù)語(yǔ)“分離的`多肽”和“分離的蛋白質(zhì)”可互換使用，并且是指已與至少約50、60、70、80、85、90、95、96、97、98或99%的當(dāng)從來(lái)源細(xì)胞分離時(shí)與所述多肽一起被天然發(fā)現(xiàn)的多肽、肽、脂質(zhì)、糖類、多核苷酸或其它材料分離的多肽(例如，本文中提供的GDF15多肽)。優(yōu)選地，分離的多肽大體上不含任何其它污染性多肽或在其天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的可干擾其治療性、診斷性、預(yù)防性或研究用途的其它污染物。
[0039]術(shù)語(yǔ)“編碼”是指編碼一種或多種氨基酸的多核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)不需要起始或終止密碼子。氨基酸序列可在由多核苷酸序列提供的6個(gè)不同閱讀框的任一個(gè)中編碼。
[0040]術(shù)語(yǔ)“同一的”和百分比“同一性”，在兩種或更多種核酸或多肽序列的情況中，是指相同的兩個(gè)或更多個(gè)序列?！鞍俜直韧恍浴币庵副容^的分子中的氨基酸或核苷酸之間相同殘基的百分比，并且基于待比較的最小分子的大小來(lái)進(jìn)行計(jì)算。為了進(jìn)行這些計(jì)算，比對(duì)中的空位(如果有的話)可通過(guò)特定的數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序(即，“算法”)來(lái)解決?？捎糜谟?jì)算比對(duì)的核酸或多肽的同一'I"生的方法包括例如ComputationalMolecular Biology, (Lesk, Α.Μ.,編著)，(1988)New York:0xford University Press ；Biocomputing Informatics and GenomePro iects, (Smith, D.ff.，編著)，1993，New York:Academic Press:Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M.,和Griffin, H.G,編著),1994, New Jersey:Humana Press ；von Heinje, G., (1987) SequenceAnalysis in Molecular Biology,New York:AcademicPress:Sequence Analysis Primer,(Gribskov, M.和 Devereux, J.,編著),1991, NewYork:M.Stockton Press ;和 Carillo 等人，(1988) SIAM J.AppliedMath.堅(jiān):1073 中描述的那些方法。
[0041]在計(jì)算百分比同一性中，以提供序列之間最大匹配的方式比對(duì)待比較的序列。用于測(cè)定百分比同一'I"生的計(jì)算機(jī)程序是GCG程序包,其包括GAP (Devereux等人，(1984) Nucl.Acid Res.1^:387 ；GeneticsComputer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)。計(jì)算算法GAP用于比對(duì)將對(duì)其測(cè)定百分比序列同一性的兩個(gè)多肽或多核苷酸。將序列比對(duì)以進(jìn)行它們各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配的跨度(matched span)”，如通過(guò)算法確定的)。將空位開(kāi)放罰分(gapopening penalty)(其計(jì)算為3x平均對(duì)角線,其中“平均對(duì)角線”是將使用的比較矩陣的對(duì)角線的平均值；“對(duì)角線”是由特定比較矩陣分配給每一個(gè)完美氨基酸匹配的評(píng)分或數(shù)目)和空位延伸罰分(其通常為空位開(kāi)放罰分的I/10)，以及比較矩陣?yán)鏟AM250或BL0SUM62與算法結(jié)合使用。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣(關(guān)于 PAM250 比較矩陣，參見(jiàn)，Dayhoff 等人，(1978) Atlas of Protein SequenceandStructure5:345-352 ;關(guān)于 BL0SUM62 比較矩陣，參見(jiàn) Henikoff 等人，(1992)proc.Natl.AcaD.Sc1.U.S.A.89: 10915-10919)也通過(guò)算法使用。
[0042]用于使用GAP程序測(cè)定多肽或核苷酸序列的百分比同一性的推薦參數(shù)如下:
[0043]算法:Needleman等人，1970，J.Mol.Biol.48:443_453 ；
[0044]比較矩陣:來(lái)自Henikoff等人的BL0SUM62，1992，同上；
[0045]空位罰分:12(但對(duì)于末端空位不使用罰分)
[0046]空位長(zhǎng)度罰分:4
[0047]相似性的閾值:0
[0048]用于比對(duì)兩個(gè)氨基酸序列的某些比對(duì)方案可導(dǎo)致僅兩個(gè)序列的短區(qū)域的匹配，并且該小的比對(duì)的區(qū)域可具有非常高的序列同一性，即使在兩個(gè)全長(zhǎng)序列之間不存在顯著的關(guān)系。因此，假如這樣的話，可調(diào)整選擇的比對(duì)法(例如，GAP程序)以導(dǎo)致橫跨靶多肽的至少50個(gè)連續(xù)氨基酸的比對(duì)。
[0049]術(shù)語(yǔ)“⑶F15多肽”和“⑶F15蛋白”可互換使用，并且意指在哺乳動(dòng)物例如人或小鼠中表達(dá)的天然存在的野生型多肽。為了本公開(kāi)內(nèi)容的目的，術(shù)語(yǔ)“GDF15多肽”可互換使用，意指任何全長(zhǎng)⑶F15多肽，例如，SEQ ID NO:2，其由308個(gè)氨基酸殘基組成并且由核苷酸序列SEQ ID N0:1(該序列，當(dāng)重組表達(dá)時(shí)，可以但不一定包含終止密碼子)編碼；包含多肽例如SEQ ID NO:6的活性前域(prodomain)的任何形式，其由279個(gè)氨基酸殘基組成，并且由核苷酸序列SEQ IDNO:5(該序列，當(dāng)重組表達(dá)時(shí)，可以但不一定包含終止密碼子)編碼，并且其中全長(zhǎng)GDF15多肽的氨基末端上的29個(gè)氨基酸殘基(B卩，其構(gòu)成信號(hào)肽)已被除去；和包含已從其除去了前域和信號(hào)序列的活性結(jié)構(gòu)域的多肽的任何形式例如SEQ ID NO:10，其由112個(gè)氨基酸殘基組成并且由核苷酸序列SEQ ID NO:9 (該序列，當(dāng)重組表達(dá)時(shí)，可以但不一定包含終止密碼子)編碼，其中信號(hào)序列和前域已被除去。GDF15多肽可以但不一定包含氨基末端甲硫氨酸，其可通過(guò)工程化或作為細(xì)菌表達(dá)過(guò)程的結(jié)果引入。
[0050]術(shù)語(yǔ)“⑶F15多肽”還包括其中天然存在的⑶F15多肽序列(例如，SEQ ID NO:2、6或10)已被修飾的⑶F15多肽。此類修飾包括但不限于一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換，包括利用非天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸類似物和氨基酸模擬物的置換。
[0051]在各個(gè)實(shí)施方案中，⑶F15多肽包含與天然存在的⑶F15多肽(例如，SEQ ID NO:2、6或10)具有至少約85%的同一性的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，⑶F15多肽包含與天然存在的⑶F15多肽氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:2、6或10)具有至少約90%或約95、96、97、98或99%的同一性的氨基酸序列。此類⑶F15多肽優(yōu)選地但不一定具有野生型GDF15多肽的至少一種活性，例如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平的能力；減輕體重的能力；或改善葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性的能力。本發(fā)明還包括編碼此類GDF15多肽序列的核酸分子。
[0052]如本文中所述，⑶F15多肽可包含信號(hào)序列(SEQ ID NO:2的殘基1_29)或其可除去信號(hào)序列(倘若為SEQ ID NO:6) 0在其它實(shí)施方案中，人GDF15多肽可除去信號(hào)序列，也可在殘基198上被切割，從而將前域的一級(jí)序列(SEQ ID NO:2的殘基30-198)與活性結(jié)構(gòu)域的一級(jí)序列分離。GDF15多肽的天然存在的生物活性形式是經(jīng)加工的成熟多肽(SEQID NO:2的殘基199-308)的同二聚體。在一些情況下，⑶F15多肽可用于治療或改善受試者的代謝障礙，其為來(lái)源于與受試者相同的物種的GDF15多肽的成熟形式。
[0053]⑶F15多肽優(yōu)選地具有生物活性。在各個(gè)不同的實(shí)施方案中，⑶F15多肽具有等于、大于或小于成熟GDF15蛋白的天然存在的形式的生物活性的生物活性，對(duì)于所述成熟⑶F15蛋白，已從全長(zhǎng)⑶F15序列的N末端除去信號(hào)肽并且其中前域已被切割(但不一定從活性結(jié)構(gòu)域除去)。生物活性的實(shí)例包括降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平的能力；減輕體重的能力；或改善葡萄糖耐受性、脂質(zhì)耐受性或胰島素敏感性的能力；降低尿糖和蛋白質(zhì)排泄的能力。
[0054]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”和“治療有效量”意指引發(fā)研究者、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)生尋求的組織系統(tǒng)、動(dòng)物或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)(所述生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)包括待治療的疾病或障礙的癥狀的減輕或改善)的GDF15多肽的量，即，支持可觀察水平的一個(gè)或多個(gè)期望的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)(例如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；減輕體重；或改善葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性)的GDF15多肽的量。
[0055]I1.GDF15多狀和核酸
[0056]如本文中所公開(kāi)，本公開(kāi)內(nèi)容中描述的GDF15多肽可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)工程化和/或產(chǎn)生。在各個(gè)實(shí)施方案中，編碼⑶F15的核酸序列(其可包含SEQ ID NO ;2、6或10的全部或部分)可使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋飶幕ЫMDNA或cDNA分離和/或擴(kuò)增。引物可按照標(biāo)準(zhǔn)(RT)-PCR擴(kuò)增技術(shù)基于本文中提供的核酸和氨基酸序列來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)。隨后可將擴(kuò)增的GDF15核酸克隆進(jìn)入適當(dāng)?shù)妮d體并且通過(guò)DNA序列分析來(lái)表征。
[0057]在分離或擴(kuò)增本文中提供的GDF15序列的全部或部分中用作探針的寡核苷酸可使用標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)例如自動(dòng)化DNA合成裝置來(lái)設(shè)計(jì)和產(chǎn)生，或可從更長(zhǎng)的DNA序列分離。
[0058]I1.A.天然存在的GDF15多肽和變體GDF15多肽及多核苷酸序列
[0059]在體內(nèi)，⑶F15表達(dá)為包含信號(hào)序列、前域和活性結(jié)構(gòu)域的連續(xù)氨基酸序列。
[0060]全長(zhǎng)人⑶F15的308個(gè)氨基酸的序列是(顯示具有任選的N末端甲硫氨酸密碼子(括號(hào)內(nèi))):
[0061 ] (M)PGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASPPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCT(SEQ ID NO:2)
[0062]并且由DNA序列(顯示具有任選的N末端甲硫氨酸密碼子(括號(hào)內(nèi))和任選的終止密碼子)編碼:
[0063](ATG)CCCGGGCAAGAACTCAGGACGGTGAATGGCTCTCAGATGCTCCTGGTGTTGCTGGTGCTCTCGTGGCTCCCGCATGGGGGCGCCCTGTCTCTGGCCGAGGCGAGCCGCGCAAGTTTCCCGGGACCCTCAGAGTTGCACTCCGAAGACTCCAGATTCCGAGAGTTGCGGAAACGCTACGAGGACCTGCTAACCAGGCTGCGGGCCCACCAGAGCTGGGAAGATTCGAACACCGACCTCGTCCCGGCCCCTGCAGTCCGGATACTCACGCCAGAAGTGCGGCTGGGATCCGGCGGCCACCTGCACCTGCGTATCTCTCGGGCCGCCCTTCCCGAGGGGCTCCCCGAGGCCTCCCGCCTTCACCGGGCTCTGTTCCGGCTGTCCCCGACGGCGTCAAGGTCGTGGGACCTGACACGACCGCTGCGGCGTCAGCTCAGCCTTGCAAGACCCCAGGCGCCCGCGCTGCACCTGCGACTGTCGCCGCCGCCGTCGCAGTCGGACCAACTGCTGGCAGAATCTTCGTCCGCACGGCCCCAGCTGGAGTTGCACTTGCGGCCGCAAGCCGCCAGGGGGCGCCGCAGAGCGCGTGCGCGCAACGGGGACCACTGTCCGCTCGGGCCCGGGCGTTGCTGCCGTCTGCACACGGTCCGCGCGTCGCTGGAAGACCTGGGCTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTGCATCGGCGCGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGCGGCAAACATGCACGCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCCTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATATGA[0064](SEQ ID NO:1).[0065]全長(zhǎng)鼠⑶F15的303個(gè)氨基酸的序列是(顯示具有任選的N末端甲硫氨酸密碼子(括號(hào)內(nèi))):
[0066](M)APPALQAQPPGGSQLRFLLFLLLLLLLLLSWPSQGDALAMPEQRPSGPESQLNADELRGRFQDLLSRLHANQSREDSNSEPSPDPAVRILSPEVRLGSHGQLLLRVNRASLSQGLPEAYRVHRALLLLTPTARPWDITRPLKRALSLRGPRAPALRLRLTPPPDLAMLPSGGTQLELRLRVAAGRGRRSAHAHPRDSCPLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMCVGGCPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPVVLMHRTDSGVSLQTYDDLVARGCHCA(SEQIEN0:4)
[0067]并且由DNA序列(經(jīng)顯示具有任選的N末端甲硫氨酸密碼子(括號(hào)內(nèi))和任選的終止密碼子)編碼:
[0068](ATG)GCCCCGCCCGCGCTCCAGGCCCAGCCTCCAGGCGGCTCTCAACTGAGGTTCCTGCTGTTCCTGCTGCTGTTGCTGCTGCTGCTGTCATGGCCATCGCAGGGGGACGCCCTGGCAATGCCTGAACAGCGACCCTCCGGCCCTGAGTCCCAACTCAACGCCGACGAGCTACGGGGTCGCTTCCAGGACCTGCTGAGCCGGCTGCATGCCAACCAGAGCCGAGAGGACTCGAACTCAGAACCAAGTCCTGACCCAGCTGTCCGGATACTCAGTCCAGAGGTGAGATTGGGGTCCCACGGCCAGCTGCTACTCCGCGTCAACCGGGCGTCGCTGAGTCAGGGTCTCCCCGAAGCCTACCGCGTGCACCGAGCGCTGCTCCTGCTGACGCCGACGGCCCGCCCCTGGGACATCACTAGGCCCCTGAAGCGTGCGCTCAGCCTCCGGGGACCCCGTGCTCCCGCATTACGCCTGCGCCTGACGCCGCCTCCGGACCTGGCTATGCTGCCCTCTGGCGGCACGCAGCTGGAACTGCGCTTACGGGTAGCCGCCGCCAGGGGGCGCCGAAGCGCGCATGCGCACCCAAGAGACTCGTGCCCACTGGGTCCGGGGCGCTGCTGTCACTTGGAGACTGTGCAGGCAACTCTTGAAGACTTGGGCTGGAGCGACTGGGTGCTGTCCCCGCGCCAGCTGCAGCTGAGCATGTGCGTGGGCGAGTGTCCCCACCTGTATCGCTCCGCGAACACGCATGCGCAGATCAAAGCACGCCTGCATGGCCTGCAGCCTGACAAGGTGCCTGCCCCGTGCTGTGTCCCCTCCAGCTACACCCCGGTGGTTCT
TATGCACAGGACAGACAGTGGTGTGTCACTGCAGACTTATGATGACCTGGTGGCCCGGGGCTGCCACTGCGCTTGA
[0069](SEQ I D NO:3).[0070]在29個(gè)殘基的信號(hào)序列切割后人GDF15的氨基酸序列是(顯示具有任選的N末端甲硫氨酸密碼子(括號(hào)內(nèi))):
[0071 ] (M)LSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSSRPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ IDNO:6)
[0072]并且由DNA序列(顯示具有任選的N末端甲硫氨酸密碼子(括號(hào)內(nèi))和任選的終止密碼子)編碼:
[0073](ATG)CTGTCTCTGGCCGAGGCGAGCCGCGCAAGTTTCCCGGGACCCTCAGAGTTGCACTCCGAAGACTCCAGATTCCGAGAGTTGCGGAAACGCTACGAGGACCTGCTAACCAGGCTGCGGGCCAACCAGAGCTGGGAAGATTCGAACACCGACCTCGTCCCGGCCCCTGCAGTCCGGATACTCACGCCAGAAGTGCGGCTGGGATCCGGCGGCCACCTGCACCTGCGTATCTCTCGGGCCGCCCTTCCCGAGGGGCTCCCCGAGGCCTCCCGCCTTCACCGGGCTCTGTTCCGGCTGTCCCCGACGGCGTCAAGGTCGTGGGACGTGACACGACCGCTGCGGCGTCAGCTCAGCCTTGCAAGACCCCAGGCGCCCGCGCTGCACCTGCGACTGTCGCCGCCGCCGTCGCAGTCGGACCAACTGCTGGCAGAATCTTCGTCCGCACGGCCCCAGCTGGAGTTGCACTTGCGGCCGCAAGCCGCCAGGGGGCGCCGCAGAGCGCGTGCGCGCAACGGGGACCACTGTCCGCTCGGGCCCGGGCGTTGCTGCCGTCTGCACACGGTCCGCGCGTCGCTGGAAGACCTGGGGTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTGCATCGGCGGGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGGCGGCAAACATGCACGCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATATGA
[0074](SEQ ID NO:5).[0075]在32個(gè)殘基的信號(hào)序列切割后鼠GDF15的氨基酸序列是(顯示具有任選的N末端甲硫氨酸密碼子(括號(hào)內(nèi))):
[0076](M)SQGDALAMPEQRPSGPESQLNADELRGRFQDLLSRLHANQSREDSNSEPSPDPAVRILSPEVRLGSHGQLLLRVNRASLSQGLPEAYRVHRALLLLTPTARPWDITRPLKRALSLRGPRAPALRLRLTPPPDLAMLPSGGTQLELRLRVAAGRGRRSAHAHPRDSCPLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMCVGECPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPVVLMHRTDSGVSLQTYDDLVARGCHCA(SEQ ID NO:8)
[0077]并且由DNA序列(顯示具有任選的N末端甲硫氨酸密碼子(括號(hào)內(nèi))和任選的終止密碼子)編碼:
[0078](ATG)TCGCAGGGGGACGCCCTGGCAATGCCTGAACAGCGACCCTCCGGCCCTGAGTCCCAACTCAACGCCGACGAGCTACGGGGTCGCTTCCAGGACCTGCTGAGCCGGCTGCATGCCAACCAGAGCCGAGAGGACTCGAACTCAGAACCAAGTCCTGACCCAGCTGTCCGGATACTCAGTCCAGAGGTGAGATTGGGGTCCCACGGCCAGCTGCTACTCCGCGTCAACCGGGCGTCGCTGAGTCAGGGTCTCCCCGAAGCCTACCGCGTGCACCGAGCGCTGCTCCTGCTGACGCCGACGGCCCGCCCCTGGGACATCACTAGGCCCCTGAAGCGTGCGCTCAGCCTCCGGGGACCCCGTGCTCCCGCATTACGCCTGCGCCTGACGCCGCCTCCGGACCTGGCTATGCTGCCCTCTGGCGGCACGCAGCTGGAACTGCGCTTACGGGTTGCCGCCGGCAGGGGGCGCCGAAGCGCGCATGCGCACCCAAGAGACTCGTGCCCACTGGGTCCGGGGCGCTGCTGTCACTTGGAGACTGTGCAGGCAACTCTTGAAGACTTGGGCTGGAGCCACTGGGTGCTGTCCCCGCGCCAGCTGCAGCTGAG
CATGTGCGTGGGCGAGTGTCCCCACCTGTATCGCTCCGCGAACACGGATGCGCAGATCAAAGCACGCCTGCATGGCC
TGCAGCCTGACAAGGTGCCTGCCCCGTGCTGTGTCCCCTCCAGCTACACCCCGGTGGTTCTTATGCACAGGACAGAC
AGTGGTGTGTCACTGCAGACTTAAGATGACCTGGTGGCCCGGGGCTGCCACTGCGCTTGA
[0079](SEQ ID NO:7).[0080]人⑶F15的重組活性形式的氨基酸序列(其包括含有9個(gè)分子間二硫鍵的同二聚體)(顯示具有任選的N-末端甲硫氨酸殘基(括號(hào)內(nèi)))是:
[0081 ] (M)ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ IDNO:10)
[0082]并且由DNA序列(經(jīng)顯示具有任選的N末端甲硫氨酸密碼子(括號(hào)內(nèi))和任選的終止密碼子)編碼:
[0083](ATG)GCGCGCAACGGGGACCACTGTCCGCTCGGGCCCGGGCGTTGCTGCCGGTCTGCACACGGTCCGCGCGTCGCTGGAAGACCTGGGCTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTGCATCGGCGCGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGCGGCAAACATGCACGCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATATAA
[0084](SEQIDN0:9).[0085]鼠⑶F15的重組活性形式的氨基酸序列(其包括含有9個(gè)分子間二硫鍵的同二聚體)(顯示具有任選的N-末端甲硫氨酸殘基(括號(hào)內(nèi)))是:
[0086](M)SAHAHPRDSC PLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMCVGECPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPVVLMHRTDSGVSLQTYDDLVARGCHCA(SEQID NO:12)
[0087]并且由DNA序列(顯示具有任選的N末端甲硫氨酸密碼子(括號(hào)內(nèi))和任選的終止密碼子)編碼:
[0088](ATG)AGCGCGCATGCGCACCCAAGAGACTCGTGCCCACTGGGTCCGGGGCGCTGCTGTCACCTGGA GACTGTGCGGGCAACTCTTGAAGACTTGGGCTGGAGCGACTGGCTGTTGTCCCCGCCAGGTGCAGCTGAGCAT GTGCGTGGGCGAGTGTCCCCACCTGTATCGCTCCGCGAACACGCATGCGCAGATCAAAGCACGCCTGCATGGCCTGCAGCCTGACAAGGTGCCTGCCCCGTGCTGTGTCCCCTCCAGCTACRCCCCGGTGGTTCTTATGCACAGGACAGACAGTGGTGTGTCACTGCAGACTTATGATGACCTGGTGGCCCGGGGCTGCCACTGCGCTTGA(SEQ IDNO:11).[0089]如本文中所述，術(shù)語(yǔ)“⑶F15多肽”是指含有人氨基酸序列SEQID NO:2、6和10的⑶F多肽。然而，術(shù)語(yǔ)“⑶F15多肽”還包括含有與天然存在的⑶F多肽序列例如SEQ ID NO:
2、6和10相異在于I個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列以使得所述序列與SEQ ID NO:2、6和10具有至少85%的同一性的多肽。⑶F多肽可通過(guò)在⑶F15多肽的特定位置引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換(保守的或非保守的)和使用天然或非天然存在的氨基酸序列來(lái)產(chǎn)生。
[0090]“保守氨基酸置換”可包括利用非天然殘基(即，在野生型FGF21多肽序列的該相同位置上發(fā)現(xiàn)的殘基)對(duì)天然氨基酸殘基(即，在野生型FGF21多肽序列的給定的位置上發(fā)現(xiàn)的殘基)的置換，以便對(duì)該位置上的氨基酸殘基的極性或電荷幾乎無(wú)影響或無(wú)影響。保守氨基酸置換還包括通常通過(guò)化學(xué)肽合成而非通過(guò)生物系統(tǒng)中的合成并入的非天然存在的氨基酸殘基。這類肽包括模擬肽(peptidomimetics)以及氨基酸部分的其它保守或倒轉(zhuǎn)形式。[0091]天然存在的殘基可基于共同的側(cè)鏈性質(zhì)分成如下種類:
[0092](I)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ；
[0093](2)中性親水性:Cys、Ser、Thr ；
[0094](3)酸性:Asp、Glu ;
[0095](4)堿性:Asn、Gin、His、Lys、Arg ;
[0096](5)影響鏈定向的殘基:Gly、Pro ;和
[0097](6)芳香性:Trp、Tyr、Phe。
[0098]另外組的氨基酸還可使用例如Creighton (1984) PROTEINS:STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES(第 2 版 1993)，ff.H.Freeman and Company 中描述的原理來(lái)配制。在一些情況下，可以有用地進(jìn)一步基于此類特征的兩種或更多種特征來(lái)表征置換(例如，利用“小的極性”殘基例如Thr殘基的置換可在適當(dāng)?shù)那闆r中代表高度保守的置換)。
[0099]保守置換可包括這些種類之一的成員與相同種類的另一成員的交換。非保守置換可包括這些種類之一的成員與另一種類的成員的交換。
[0100]具有已知的與上述分組的物理化學(xué)性質(zhì)相似的物理化學(xué)性質(zhì)的合成、稀有或修飾氨基酸殘基可用作序列中特定氨基酸殘基的“保守”替代物。例如，D-Arg殘基可用作典型的L-Arg殘基的替代物。還可能出現(xiàn)這樣的情況，可根據(jù)上述種類的兩個(gè)或更多個(gè)種類描述特定的置換(例如，利用小的疏水性殘基的置換，意指利用在兩個(gè)上述種類中發(fā)現(xiàn)的殘基或在本領(lǐng)域中已知具有與此類滿足這兩種定義的殘基相似的物理化學(xué)性質(zhì)的其它合成、稀有或修飾殘基置換一個(gè)氨基酸)。
[0101]本文中提供的編碼⑶F15多肽的核酸序列(包括簡(jiǎn)并成SEQ IDNO:1、5和9的那些序列)以及編碼SEQ ID N0:2、6和10的多肽變體的那些核酸序列形成本公開(kāi)內(nèi)容的其它方面。
[0102]IL B.GDF15 載體
[0103]為了表達(dá)本文中提供的⑶F15核酸序列，可將適當(dāng)?shù)木幋a序列例如SEQ ID NO:1,5或9克隆進(jìn)入適當(dāng)?shù)妮d體，并在引入適當(dāng)?shù)乃拗骱?，可根?jù)標(biāo)準(zhǔn)克隆和表達(dá)技術(shù)表達(dá)所述所述序列以產(chǎn)生編碼的多肽，所述技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的(例如，如Sambrook, J.,Fritsh,E.F.和Maniatis, T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第 2版,編著，Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，1989中描述的)。本發(fā)明還涉及這類包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的此類載體。
[0104]“載體”是指遞送媒介物，其(a)促進(jìn)多肽編碼核酸序列的表達(dá)；(b)促進(jìn)多肽從其產(chǎn)生；(C)隨即促進(jìn)靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化；(d)促進(jìn)核酸序列的復(fù)制；(e)改善核酸的穩(wěn)定性；(f)促進(jìn)核酸和/或轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)柒的細(xì)胞的檢測(cè)；和/或(g)另外賦予多肽編碼核酸有利的生物學(xué)和/或生理化學(xué)功能。載體可以是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括染色體、非染色體以及合成的核酸載體(包含適當(dāng)?shù)囊唤M表達(dá)控制元件的核酸序列)。此類載體的實(shí)例包括SV40的衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質(zhì)粒、來(lái)源于質(zhì)粒與噬菌體DNA的組合的載體以及病毒核酸(RNA或DNA)載體。
[0105]重組表達(dá)載體可被設(shè)計(jì)來(lái)用于在原核(例如，大腸桿菌(E.coli))或真核細(xì)胞(例如，昆蟲(chóng)細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)GDF15蛋白。代表性宿主細(xì)胞包括通常用于克隆和表達(dá)的那些宿主，包括大腸桿菌菌株T0P10F’、T0P10、DH10B、DH5a、HBlOU W3110、BL21(DE3)和 BL21 (DE3)pLysS、BLUESCRIPT(Stratagene)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系 CHO、CH0-K1、HEK293、293-EBNA pIN 載體(Van Heeke&Schuster, J.Biol.Chem.264:5503-5509(1989) ；pET 載體(Novagen, Madison ffis.)。或者，可以例如使用 T7啟動(dòng)子調(diào)控序列和Τ7聚合酶以及體外翻譯系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達(dá)載體。優(yōu)選地，載體包含在含有編碼多肽的核酸序列的克隆位點(diǎn)的上游的啟動(dòng)子?？杀淮蜷_(kāi)和關(guān)閉的啟動(dòng)子的實(shí)例包括Iac啟動(dòng)子、Τ7啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子trp啟動(dòng)子。
[0106]因此，本文中提供的是有利于重組⑶F15表達(dá)的包含編碼⑶F15的核酸序列的載體。在各個(gè)實(shí)施方案中，載體包含調(diào)節(jié)⑶F15的表達(dá)的可操作地連接的核苷酸序列。載體可包含任何適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)促進(jìn)元件或與所述啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)促進(jìn)元件連接。此類元件的實(shí)例包括強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子(例如，人CMV IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、RSV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、SL3-3啟動(dòng)子、MMTV啟動(dòng)子或HIV LTR啟動(dòng)子、EFla啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子)、有效的聚腺苷酸終止序列、大腸桿菌的質(zhì)粒產(chǎn)物的復(fù)制起始點(diǎn)、抗生素抗性基因(作為選擇標(biāo)記)和/或方便的克隆位點(diǎn)(例如，多接頭)。相對(duì)于組成型啟動(dòng)子例如CMVIE，載體還可包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一個(gè)方面，提供了與組織特異性啟動(dòng)子可操作地連接的包含編碼⑶F15多肽的序列的核酸，所述組織特異性啟動(dòng)子促進(jìn)序列在代謝相關(guān)組織例如肝或胰腺組織中的表達(dá)。
[0107]I1.C.宿豐細(xì)朐
[0108]在本公開(kāi)內(nèi)容的另一個(gè)方面，提供了包含本文中公開(kāi)的⑶F15核酸和載體的宿主細(xì)胞。在各個(gè)實(shí)施方案中，將載體或核酸整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組，在其它實(shí)施方案中所述載體或核酸存在于染色體外。
[0109]提供了包含這樣的核酸、載體或其任一或兩者的組合的重組細(xì)胞例如酵母、細(xì)菌(例如，大腸桿菌)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，永生化哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。在各個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含含有編碼⑶F15多肽的表達(dá)的序列的非整合核酸例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌?；蚓€性表達(dá)元件的細(xì)胞。`
[0110]包含本文中提供的編碼GDF15多肽的核酸序列的載體可通過(guò)轉(zhuǎn)化或通過(guò)轉(zhuǎn)染引入宿主細(xì)胞。利用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法是公知的。
[0111]⑶F15編碼核酸可經(jīng)病毒載體定位在宿主細(xì)胞或宿主動(dòng)物中和/或遞送至宿主細(xì)胞或宿主動(dòng)物。任何適當(dāng)?shù)牟《据d體可用于該能力。病毒載體可單獨(dú)地或與一種或多種病毒蛋白質(zhì)(所述蛋白質(zhì)有利于本發(fā)明的核酸在期望的宿主細(xì)胞中的遞送、復(fù)制和/或表達(dá))組合地包含許多病毒多核苷酸。病毒載體可以是包含病毒基因組的全部或部分的多核苷酸、病毒蛋白質(zhì)/核酸綴合物、病毒樣顆粒(VLP)或包含病毒核酸和⑶F15多肽-編碼核酸的完整病毒顆粒。病毒顆粒病毒載體可包括野生型病毒顆?；蛐揎棽《绢w粒。病毒載體可以是需要另一個(gè)載體或野生型病毒的存在以進(jìn)行復(fù)制和/或表達(dá)的載體(例如，病毒載體可以是依賴于輔助病毒的病毒)，例如腺病毒載體擴(kuò)增子。通常地，此類病毒載體由野生型病毒顆粒或在其蛋白質(zhì)和/或核酸含量上進(jìn)行了修飾以增加轉(zhuǎn)基因能力或幫助核酸的轉(zhuǎn)染和/或表達(dá)的病毒顆粒組成(此類載體的實(shí)例包括皰疹病毒/ AAV擴(kuò)增子)。通常地，病毒載體與通常感染人的病毒相似和/或來(lái)源于所述病毒。在該方面適當(dāng)?shù)牟《据d體顆粒包括例如腺病毒載體顆粒(包括腺病毒科的任何病毒或來(lái)源于腺病毒科的病毒的任何病毒)、腺伴隨病毒載體顆粒(AAV載體顆粒)或其它細(xì)小病毒和微小病毒載體顆粒、乳頭瘤病毒載體顆粒、黃病毒載體、甲病毒載體、皰疹病毒載體、痘病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體)。
[0112]I1.P.GDF15 多狀的分離
[0113]如本文中所描述表達(dá)的⑶F15多肽可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化法來(lái)分離。⑶F15多肽可從其中其天然表達(dá)的細(xì)胞分離，或其可從已被工程化以表達(dá)GDF15的細(xì)胞，例如不天然表達(dá)⑶F15的細(xì)胞分離。
[0114]可用于分離⑶F15多肽的蛋白質(zhì)純化法以及相關(guān)材料和試劑在本領(lǐng)域是已知的。純化GDF15多肽的示例性方法提供于下文中的實(shí)施例中?？捎糜诜蛛xGDF15多肽的其它純化法可見(jiàn)于參考資料例如 Bootcov MR, 1997，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:11514-9，F(xiàn)airlie WD, 2000, Gene254:67-76 中。
[0115]II1.包含CT)F15多肽的藥物組合物
[0116]提供了包含⑶F15多肽的藥物組合物。此類⑶F15多肽藥物組合物可包含與被選擇以適合施用模式的藥學(xué)上或生理上可接受的配方試劑混合的治療有效量的⑶F15多肽。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的載體”或“生理上可接受的載體”是指適合用于實(shí)現(xiàn)或增強(qiáng)GDF15多肽向人或非人受試者的身體內(nèi)的遞送的一種或多種配方試劑。該術(shù)語(yǔ)包括在生理上是相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等的一種或多種以及其組合。在一些情況下，優(yōu)選在藥物組合物中包含等滲劑例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。藥學(xué)上可接受的物質(zhì)例如濕潤(rùn)劑或少量輔助物質(zhì)例如濕潤(rùn)或乳化劑、防腐劑或緩沖劑(所述物質(zhì)增強(qiáng)GDF15多肽的貯存期限或效力)，還可用作載體或載體的組分。可接受的藥學(xué)上可接受的載體優(yōu)選在使用的劑量和濃度上對(duì)受者是無(wú)毒的。
[0117]藥物組合物可包含用于修飾、維持或保持例如pH、克分子滲透壓濃度(οsmoIarity)、粘性、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無(wú)菌性、穩(wěn)定性、組合物的溶解或釋放、吸附或滲透速率的配方試劑。適當(dāng)?shù)呐浞皆噭┌ǖ幌抻诎被?例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩沖劑(例如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其它有機(jī)酸)、填充劑(bulking agent)(例如甘露醇或甘氨酸)、螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA))、絡(luò)合劑(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、環(huán)糊精或羥丙基環(huán)糊精)、充填劑、單糖、二糖和其它糖類(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑、乳化劑、親水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、形成鹽的抗衡離子(例如鈉)、防腐劑(例如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯己定、山梨酸或過(guò)氧化氫)、溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(例如甘露醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或濕潤(rùn)劑(例如普流羅尼類；PEG;山梨糖酯；聚山梨醇酯例如聚山梨酯20或聚山梨酯80;曲拉通(Triton);氯丁三醇(tromethamine);卵磷脂；膽固醇或tyloxapal)、穩(wěn)定性增強(qiáng)劑(例如鹿糖或山梨醇)、張力增強(qiáng)劑(例如堿金屬鹵化物-優(yōu)選地氯化鈉或氯化鉀-或甘露醇、山梨醇)、遞送媒介物、稀釋劑、賦形劑和/或藥物佐劑(參見(jiàn)，例如，REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICEOF PHARMACY,第 19 版，(1995) ;Berge 等人，J.Pharm.Sc1.，6661)，1-19 (1977)。其它相關(guān)原則、方法和試劑描述于例如Lieberman等人，PHARMACEUTICALDOSAGE FORMS-DISPERSESYSTEMS (第 2 版，第 3卷，1998) ;AnseI 等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS&DRUGDELIVERYSYSTEMS (第 7 版，2000) ；Martindale, THE EXTRAPHARMACOPEIA (第 31 版)，Remington’ SPHARMACEUTICALSCIENCES (第 16-20 版和隨后的版本)；The Pharmacological Basis OfTherapeutics, Goodman 和 Gilman,編著(第 9 版一1996) ；ffilson 和 Gisvolds，TEXTBOOKOF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado 和 Remers，編著(第10版，1998)中。配制藥學(xué)上可接受的組合物原則也描述于例如Aulton，PHARMACEUTICS:THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESTGN, Churchill LiVingstone(New York) (1988),EXTEMPORANEOUS ORALLIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP (1998)，為了任何目的通過(guò)引用并入本文中)。
[0118]最佳藥物組合物將由本領(lǐng)域技術(shù)人員取決于例如期望的施用途徑、遞送形式和期望的劑量來(lái)確定(參見(jiàn)，例如，Remington’ sPHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)。此類組合物可影響GDF15多肽的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率以及體內(nèi)清除速率。
[0119] 藥物組合物中的主要媒介物或載體在性質(zhì)上可以是含水的或非含水的。例如，用于注射的適當(dāng)媒介物或載體可以是水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，可能補(bǔ)充有在用于胃腸外施用的組合物中常用的其它材料。中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是另外的示例性媒介物。其它示例性藥物組合物包含約PH7.0-8.5的Tris緩沖液或約pH4.0-5.5的醋酸鹽緩沖液，其還可包含山梨醇或適當(dāng)?shù)奶娲?substitute)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)GF21多肽突變體組合物可通過(guò)將選擇的具有期望的純度的組合物與任選的配方試劑(Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES,同上)混合來(lái)制備，以凍干的餅狀物或水溶液形式進(jìn)行貯存。此外，可使用適當(dāng)?shù)馁x形劑例如蔗糖將GDF15多肽產(chǎn)物配制為冷凍干產(chǎn)物(Iyophilizate)。
[0120]⑶F15多肽藥物組合物可被選擇用于胃腸外遞送?；蛘?，組合物可被選擇用來(lái)吸入或通過(guò)消化道例如口服遞送。此類藥學(xué)上可接受的組合物的制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
[0121]配方組分以對(duì)于施用部位是可接受的濃度存在。例如，使用緩沖劑來(lái)將組合物維持在生理pH或略微更低的pH，通常在約5至約8的pH范圍內(nèi)。
[0122]當(dāng)預(yù)期胃腸外施用時(shí)，用于本發(fā)明的治療性組合物可以以在藥學(xué)上可接受的媒介物中包含期望的GDF15多肽的無(wú)熱原、胃腸外可接受的含水溶液的形式存在。用于胃腸外注射的特別適合的媒介物是無(wú)菌蒸餾水，將GDF15多肽在所述無(wú)菌蒸餾水中配制為適當(dāng)?shù)胤栏臒o(wú)菌等滲溶液。然而，另一種制備可包括利用試劑例如可注射微球體、生物蝕解顆粒、多聚體化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠?；蛑|(zhì)體配制期望的分子，所述試劑提供產(chǎn)物的受控或持續(xù)釋放，所述產(chǎn)物隨后可通過(guò)忙庫(kù)注射(depot injection)來(lái)進(jìn)行遞送。還可使用透明質(zhì)酸，并且該透明質(zhì)酸可具有在循環(huán)中延長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的作用。用于期望的分子引入的其它適當(dāng)方法包括可植入的藥物遞送裝置。
[0123]在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物可被配制來(lái)用于吸入。例如，可將GDF15多肽配制為用于吸入的干粉。GDF15多肽吸入溶液還可利用噴射劑配制來(lái)用以進(jìn)行氣霧劑遞送。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溶液可被霧化。經(jīng)肺施用進(jìn)一步描述于國(guó)際公布號(hào)W094 / 20069中，所述國(guó)際公布描述了化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的經(jīng)肺遞送。
[0124]還預(yù)期某些制劑可通過(guò)口服施用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以該方式施用的GDF15多肽可利用或不利用通常用于固體劑型例如片劑和膠囊的配制的那些載體來(lái)進(jìn)行配制。例如，膠囊可被設(shè)計(jì)來(lái)在胃腸道的特定點(diǎn)釋放制劑的活性部分，此時(shí)生物利用度被最大化并且系統(tǒng)前降解(pre-systemic degradation)被最小化。其它試劑可被包括來(lái)促進(jìn)GDF15多肽的吸收。還可應(yīng)用稀釋劑、調(diào)味劑、低熔點(diǎn)石蠟、植物油、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和粘合劑。
[0125]另一種藥物組合物可包括與適合用于片劑生產(chǎn)的無(wú)毒賦形劑混合的有效量的⑶F15多肽。通過(guò)將片劑溶解在無(wú)菌水或另一種適當(dāng)?shù)拿浇槲镏?，可以以單位劑量形式制備溶液。適當(dāng)?shù)馁x形劑包括但不限于惰性稀釋劑例如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或粘合劑例如淀粉、明膠或阿拉伯樹(shù)膠；或潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
[0126]其它⑶F15多肽藥物組合物對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，包括在持續(xù)或受控遞送制劑中含有GDF15多肽的制劑。用于配制多種其它持續(xù)或受控遞送工具例如脂質(zhì)體載體、生物蝕解微?；蚨嗫字榱Ｒ约懊?kù)型注射劑(depot injection)的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是已知的(參見(jiàn)，例如，國(guó)際公布號(hào)W093 / 15722，該國(guó)際公布描述了用于遞送藥物組合物的多孔聚合物微粒的受控釋放，和Wischke&Schwendeman, 2008, Int.J.Pharm.364:298-327,以及 Freiberg&Zhu，2004，Int.J.Pharm.282:1-18，所述文獻(xiàn)討論了微球體/微粒的制備和使用)。如本文中所述，水凝膠是持續(xù)或受控遞送制劑的實(shí)例。
[0127]持續(xù)釋放制劑的其它實(shí)例包括以成形制品(shaped article)例如薄膜或微膠囊的形式存在的半透性聚合物基質(zhì)。持續(xù)釋放基質(zhì)可包括聚酯、水凝膠、聚交酯(polylactide)(美國(guó)專利號(hào)3，773，919和歐洲專利號(hào)0058481)、L_谷氨酸與Y乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，1983, Biopolymers22:547-56)、聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer 等人，1981, J.Biomed.Mater.Res.15: 167-277 和 Langer, 1982, Chem.Tech.12:98-105)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D (-) -3-羥基丁酸(歐洲專利號(hào)0133988)。持續(xù)釋放組合物還可包括指質(zhì)體，其可通過(guò)本領(lǐng)域已知的幾種方法的任一種方法來(lái)制備。參見(jiàn)，例如，Epstein 等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.82:3688-92 ；和歐洲專利號(hào) 0036676,0088046 和 0143949。
[0128]待用于體內(nèi)施用的⑶F15多肽藥物組合物通常應(yīng)當(dāng)是無(wú)菌的。這可通過(guò)經(jīng)由無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)將組合物進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，使用該方法的滅菌可在凍干和重建之前或之后進(jìn)行。用于胃腸外施用的組合物可以以凍干的形式或以溶液貯存。此外，通常將胃腸外組合物置于具有無(wú)菌進(jìn)入口的容器，例如靜脈溶液包(intravenous solution bag)或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶中。
[0129]在藥物組合物已配制后，可將其作為溶液、懸浮液、凝膠、乳劑、固體或作為脫水或凍干的粉劑貯存在無(wú)菌小瓶中。可以以即用型形式或以在施用前需要復(fù)水的形式(例如，凍干的)貯存此類制劑。
[0130]在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)單劑量施用單位的試劑盒。試劑盒可每一個(gè)包含具有干燥的蛋白質(zhì)的第一容器和具有含水制劑的第二容器。還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是包含單室和多室預(yù)裝注射器(例如，液體注射器和Iyosyringe)的試劑盒。
[0131]待治療性使用的GDF15多肽藥物組合物的有效量將取決于例如治療背景和目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，用于治療的適當(dāng)劑量水平從而將變化，這部分取決于遞送的分子、將對(duì)其使用GDF15多肽的適應(yīng)癥、施用途徑以及患者的尺寸(體重、體表面積或器官尺寸)以及狀況(年齡和一般健康)。因此，臨床醫(yī)生可滴定劑量和改變施用途徑以獲得最佳治療效果。取決于上述因素，常用劑量可在約0.1 μ g/kg多至約IOOmg / kg或更高的范圍內(nèi)變化。在其它實(shí)施方案中，劑量可在0.lyg/ kg多至約IOOmg / kg ;或I μ g/kg多至IOOmg /kg ;或?yàn)?5 μ g / kg、10 μ g / kg、15 μ g / kg、20 μ g / kg、25 μ g/kg、30 μ g/kg、35 μ g/kg、40 μ g / kg>45 μ g / kg>50 μ g / kg>55 μ g / kg>60 μ g / kg>65 μ g / kg>70 μ g / kg、75yg / kg多至約IOOmg / kg的范圍內(nèi)變化。在其它實(shí)施方案中，劑量可為50 μ g / kg、100 μ g / kg、150 μ g / kg>200 μ g / kg>250 μ g / kg、300μ g/kg、350μ g / kg>400 μ g /kg>450 μ g / kg>500 μ g / kg>550 μ g / kg>600 μ g / kg>650 μ g / kg>700 μ g / kg、750 μ g / kg、800 μ g / kg、850 μ g / kg、900 μ g / kg、950 μ g / kg、100 μ g / kg、200 μ g /kg>300 μ g / kg>400 μ g / kg>500 μ g / kg>600 μ g / kg>700 μ g / kg>800 μ g / kg、900 μ g / kg、1000 Ug / kg>2000 μ g / kg>3000 μ g / kg>4000 μ g / kg>5000 μ g / kg、6000 μ g / kg>7000 μ g / kg>8000 μ g / kg>9000 μ g / kg 或 IOmg / kg。
[0132]給藥頻率將取決于待使用的制劑中的GDF15多肽的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通常地，臨床醫(yī)生將施用組合物直至劑量達(dá)到獲得期望的效果。組合物從而可在一段時(shí)間內(nèi)以單次劑量，以兩次或更多次劑量(其可包含相同量的期望的分子或可以不包含相同量的期望的分子)施用，或通過(guò)植入裝置或?qū)Ч茏鳛檫B續(xù)輸注來(lái)施用。適當(dāng)?shù)膭┝康倪M(jìn)一步精細(xì)化由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)常規(guī)地進(jìn)行，并且在由他們常規(guī)進(jìn)行的任務(wù)的范圍內(nèi)。適當(dāng)?shù)膭┝靠赏ㄟ^(guò)使用適當(dāng)?shù)膭┝?反應(yīng)數(shù)據(jù)來(lái)確定。
[0133]藥物組合物的施用途徑符合已知的方法例如口服；通過(guò)經(jīng)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)(實(shí)質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)(intraportal)或病灶內(nèi)途徑的注射；通過(guò)持續(xù)釋放系統(tǒng)(其還可被注射)；或通過(guò)植入裝置進(jìn)行的方法。當(dāng)期望時(shí)，組合物可通過(guò)單次快速靜脈注射(bulus injection)或通過(guò)輸注連續(xù)地，或通過(guò)植入裝置進(jìn)行施用。
[0134]或者或另外地，組合物可通過(guò)已將期望的分子吸附至其上或包入其中的膜、海綿或其它適當(dāng)?shù)牟牧系闹踩雭?lái)局部施用。當(dāng)使用植入裝置時(shí)，可將裝置植入任何適當(dāng)?shù)慕M織或器官，并且期望的分子的遞送可以是通過(guò)擴(kuò)散、定時(shí)釋放彈丸或連續(xù)施用。
[0135]為了以預(yù)定的速率遞送藥物例如GDF15多肽以便藥物濃度可在長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)維持在期望的治療有效水平上，可使用多種不同的方法。在一個(gè)實(shí)例中，可使用包含聚合物例如明膠(例如，牛明膠、人明膠或來(lái)自另一來(lái)源的明膠)或天然存在的或合成產(chǎn)生的聚合物的水凝膠。任何百分比的聚合物(例如，明膠)可用于水凝膠，例如5、10、15或20%。適當(dāng)?shù)臐舛鹊倪x擇可取決于多種因素，例如期望的治療特征譜(therapeutic profile)和治療性分子的藥代動(dòng)力學(xué)特征譜(pharmacokinetic profile)。
[0136]可被摻入水凝膠的聚合物的實(shí)例包括聚乙二醇(“PEG”)、聚氧化乙烯、聚氧化乙烯-共聚-聚氧化丙烯、共聚-聚氧化乙烯嵌段或無(wú)規(guī)共聚物、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(氨基酸)、葡聚糖、肝素、多糖、聚醚等。
[0137]當(dāng)產(chǎn)生水凝膠制劑時(shí)可被考慮的另一個(gè)因素是水凝膠與交聯(lián)劑的交聯(lián)程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，交聯(lián)可通過(guò)牽涉甲基丙烯酸酐的甲基丙烯酰化(methacrylation)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些情況下，高度的交聯(lián)可能是期望的，然而在其它情況下，更低程度的交聯(lián)是優(yōu)選的。在一些情況下，更高程度的交聯(lián)提供更長(zhǎng)的持續(xù)釋放。更高程度的交聯(lián)可提供較堅(jiān)硬的水凝膠和更長(zhǎng)的藥物遞送持續(xù)時(shí)間。[0138]聚合物與交聯(lián)劑(例如，甲基丙烯酸酐)的任何比率可用于產(chǎn)生具有期望的性質(zhì)的水凝膠。例如，聚合物與交聯(lián)劑的比率可以為例如8:1,16:1,24:1或32:1。例如，當(dāng)水凝膠聚合物為明膠并且交聯(lián)劑為甲基丙烯酸酯時(shí)，可使用8:1U6:1,24:1或32:1的甲基丙烯酸酯:明膠的比率。
[0139]V.GDF15蛋白和核酸的治療性用途
[0140]GDF15多肽可用于治療、診斷或改善代謝病況或障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，待治療的代謝障礙是糖尿病，例如2型糖尿癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，代謝病況或障礙是肥胖。在其它實(shí)施方案中，代謝病況或障礙是血脂異常、升高的葡萄糖水平、升高的胰島素水平或糖尿病性腎病。例如，可使用GDF15多肽治療或改善的代謝病況或障礙包括其中人受試者具有 IOOmg / dL 或更高，例如 125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200或高于200 mg / dL的空腹血糖水平的狀態(tài)。血糖水平可在進(jìn)食或空腹?fàn)顟B(tài)下，或在隨機(jī)狀態(tài)下測(cè)定。代謝 病況或障礙還可包括其中受試者處于增加的發(fā)展代謝病況的風(fēng)險(xiǎn)中的狀況。對(duì)于人受試者，此類狀況包括100 mg / dL的空腹血糖水平?？墒褂冒荈15多肽的藥物組合物治療的病況還可見(jiàn)于相關(guān)文獻(xiàn)例如，American DiabetesAssociation Standards of Medical Care in Diabetes Care-2011, American DiabetesAssociation, Diabetes Care 第 34 卷，增刊號(hào) I, S11-S61, 2010,其通過(guò)引用并入本文。
[0141]在本申請(qǐng)中，代謝障礙或病況例如2型糖尿病、升高的葡萄糖水平、升高的胰島素水平、血脂異常、肥胖或糖尿病性腎病可通過(guò)向有此需要的患者施用治療有效劑量的GDF15多肽，例如人⑶F15多肽例如SEQ ID NO:2、6或10來(lái)治療。施用可如本文中所述，例如通過(guò)IV注射、腹膜內(nèi)(IP)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射或以片劑或液態(tài)成型(liquid formation)的形式口服來(lái)進(jìn)行。在一些情況下，⑶F15多肽的治療有效劑量或優(yōu)選劑量可由臨床醫(yī)生來(lái)確定。GDF15多肽的治療有效劑量將取決于，除其它以外，施用方案、施用的試劑的單位劑量、是否將GDF15多肽與其它治療劑組合施用、受者的免疫狀態(tài)和健康。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”意指引發(fā)研究者、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)生尋求的組織系統(tǒng)、動(dòng)物或人類的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)(所述生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)包括待治療的疾病或病癥的癥狀的減輕或改善)的GDF15多肽的量，即支持可觀察水平的一種或多種期望的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)(例如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；減輕體重；或改善葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性)的⑶F15多肽的量。
[0142]應(yīng)指出，治療有效劑量的⑶F15多肽還可隨期望的結(jié)果而變化。因此，例如，在其中顯示較低水平的血糖的情況下，⑶F15的劑量將相應(yīng)地高于其中期望相較較低水平的血糖的劑量。相反地，在其中顯示較高水平的血糖的情況下，GDF15的劑量將相應(yīng)地低于其中期望相較較高水平的血溏的劑量。
[0143]在各個(gè)實(shí)施方案中，受試者是具有IOOmg / dL或更高的血溏水平的人，其可用⑶F15多肽進(jìn)行治療。
[0144]在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的方法包括首先測(cè)量受試者中的一種或多種代謝相關(guān)化合物例如葡萄糖、胰島素、膽固醇、脂質(zhì)的基線水平。然后向受試者施用包含GDF15多肽的藥物組合物。在期望的一段時(shí)間后，再次測(cè)量受試者中的一種或多種代謝相關(guān)化合物(例如，血糖、胰島素、膽固醇、脂質(zhì))的水平。然后將兩個(gè)水平相比較以測(cè)定受試者中的代謝相關(guān)化合物的相對(duì)變化。取決于該比較的結(jié)果，可再施用一個(gè)劑量的包含GDF15分子的藥物組合物，以獲得期望水平的一種或多種代謝相關(guān)化合物。
[0145]應(yīng)注意，可將包含⑶F15多肽的藥物組合物與另一種化合物共施用。與⑶F15多肽共施用的化合物的身份和性質(zhì)將取決于待治療或改善的病況的性質(zhì)?？膳c包含GDF15多肽的藥物組合物組合施用的化合物的實(shí)例的非限定性目錄包括羅西格列酮、吡咯列酮、瑞格列奈、那格列奈(nateglitinide)、二甲雙胍、艾塞那肽(exenatide)、西他列汀(stiagliptin)、普蘭林肽、格列吡嗪、格列美脲(glimepriride)、阿卡波糖(acarbose)和米格列醇。
[0146]V1.試劑盒
[0147]還提供的是用于實(shí)施公開(kāi)的方法的試劑盒。此類試劑盒可包括藥物組合物例如本文中公開(kāi)的那些藥物組合物，包括編碼本文中提供的肽或蛋白質(zhì)的核酸、包含此類核酸的載體和細(xì)胞，以及包含含此類核酸的化合物的藥物組合物，可在無(wú)菌容器中提供所述藥物組合物。任選地，還可包括關(guān)于如何在代謝障礙的治療中使用提供的藥物組合物的說(shuō)明書(shū)，或使所述說(shuō)明書(shū)可為患者或醫(yī)療服務(wù)提供者所用。
[0148]在一個(gè)方面，試劑盒包括(a)包含治療有效量的GDF15多肽的藥物組合物；和(b)一個(gè)或多個(gè)用于藥物組合物的容器。這樣的試劑盒還可包括其使用說(shuō)明書(shū)；說(shuō)明書(shū)可以是針對(duì)精確的待治療的代謝障礙定制的。說(shuō)明書(shū)可描述試劑盒中提供的材料的用途和性質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括患者用以進(jìn)行施用以治療代謝障礙例如升高的葡萄糖水平、升高的胰島素水平、肥胖、2型糖尿病、血脂異?；蛱悄虿⌒阅I病的說(shuō)明書(shū)。
[0149]說(shuō)明書(shū)可被打印在襯底例如紙或塑料等上，并且在該試劑盒的容器或其組件(例如，與包裝相關(guān)的)等貼標(biāo)簽中，可將其作為包裝說(shuō)明書(shū)(package insert)提供于試劑盒中。在其它實(shí)施方案中，說(shuō)明書(shū)以存在于適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)例如CD-ROM、軟盤等上的電子存儲(chǔ)數(shù)據(jù)文件形式提供。在其它實(shí)施方案中，實(shí)際的說(shuō)明書(shū)不存在于試劑盒中，但提供了用于從遠(yuǎn)程來(lái)源例如通過(guò)因特網(wǎng)獲得說(shuō)明書(shū)的工具。該實(shí)施方案的實(shí)例是包括網(wǎng)址的試劑盒，在所述網(wǎng)址上可閱覽說(shuō)明書(shū)和/或可從該網(wǎng)址下載說(shuō)明書(shū)。
[0150]通常期望將試劑盒的一些或全部組分包裝在適當(dāng)?shù)陌b中以維持無(wú)菌性?？蓪⒃噭┖械慕M分包裝在試劑盒容器組件中以產(chǎn)生單個(gè)容易操作的單元，其中試劑盒容器組件例如盒子或類似結(jié)構(gòu)，可以是或可以不是氣密容器，例如，以進(jìn)一步保持試劑盒的一些或全部組分的無(wú)菌性。
實(shí)施例
[0151]下列實(shí)施例，包括進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和得出的結(jié)果，僅僅被提供用于舉例說(shuō)明目的，并且不被解釋為限制本發(fā)明。
[0152]實(shí)施例1
[0153]GDF15多狀的制各
[0154]將用⑶F15表達(dá)載體(用親和標(biāo)記物構(gòu)建)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生長(zhǎng)至在600nm處的光密度為9，隨后進(jìn)行誘導(dǎo)，并在6小時(shí)后在63的光學(xué)密度下通過(guò)離心收集所述細(xì)菌。將冷凍的細(xì)胞糊解凍，利用低剪切均質(zhì)器(low shear homogenizer)以15% (重量/體積)將其重懸浮于緩沖液中，直至漿體變得均勻。隨后使細(xì)胞經(jīng)歷高剪切均化以破裂細(xì)胞并釋放包含產(chǎn)物的包涵體。隨后將所得的勻漿在5C以5，OOOx g離心I小時(shí)，來(lái)以沉淀的形式收集包涵體，將細(xì)胞質(zhì)污染物留在棄去的上清液中。通過(guò)使用冷凍水和低剪切均質(zhì)器將沉淀均勻地重懸浮至初始勻漿體積來(lái)從包涵體洗去殘留的細(xì)胞質(zhì)，隨后如先前一樣進(jìn)行離心。隨后將所得的沉淀(經(jīng)洗漆的包涵體(washed inclusion body) (WIBS))于-80C冷凍。
[0155]將充足量的WIBS和鹽酸胍(GnHCl)在pH8.5下用于還原-溶解(reducing-solubiIization)以得到約25mg / ml的還原產(chǎn)物和6M GnHCl的終濃度。隨后通過(guò)攪拌進(jìn)入具有堿性pH的含有氧化還原劑、離液劑(chaotrope)和共溶劑的重折疊緩沖液將溶解快速稀釋25倍。將重折疊溶液輕輕攪拌，在6C下空氣氧化72小時(shí)或直至溶液對(duì)于Ellman’ s試劑是陰性的。隨后將重折疊溶液在5C通過(guò)深度過(guò)濾(depth filtration)澄清以允許10倍的超濾濃縮，以及隨后透析過(guò)濾至pH8.5的含有50mM磷酸鈉和低離液劑濃度的緩沖液中。將隨后的滲余物(retentate)加溫至25C，并且隨后將pH降至酸性范圍以引起污染物沉淀。通過(guò)在25C以5，OOOx g離心30分鐘除去沉淀,并通過(guò)0.45um過(guò)濾進(jìn)一步澄清所得的上清液。然后將濾出液(AP)調(diào)整至pH8.5和低鹽濃度，以允許進(jìn)行包括固定化金屬親和層析(imm obilized metal affinity chromatography) (IMAC)的純化的第一步驟。
[0156]在蛋白質(zhì)折疊和AP后，使用兩步層析系列(two-stepchromatography train)純化⑶F15。將調(diào)整的AP施加到用pH8.5的含有低鹽濃度的緩沖離液劑平衡的IMAC柱。隨后用平衡緩沖液洗滌柱直至獲得基線紫外線(UV)水平。通過(guò)置換劑(displacer)濃度的逐步增加洗脫產(chǎn)物和污染物，收集洗脫物，隨后通過(guò)考馬斯染色的SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)進(jìn)行測(cè)定，以鑒定哪個(gè)洗脫物級(jí)分包含以GDF15的預(yù)測(cè)分子量遷移的多肽。在完成IMAC后，將含有產(chǎn)物的混合級(jí)分在25C調(diào)整至pH7.2和5mMEDTA。通過(guò)在25C添加低濃度的酶(以切除親和標(biāo)記物)進(jìn)行數(shù)小時(shí)來(lái)將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成成熟長(zhǎng)度的⑶F15。用有機(jī)改性劑調(diào)整切割反應(yīng)混合物，并通過(guò)添加乙酸和有機(jī)溶劑來(lái)調(diào)整至酸性pH。這允許在25C進(jìn)行由從反相柱線性梯度洗脫產(chǎn)物組成的終層析步驟。將來(lái)自層析的洗脫收集為級(jí)分，并隨后通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行測(cè)定，以確定混合用于均勻產(chǎn)物的適當(dāng)?shù)募?jí)分。將所得的混合物通過(guò)透析過(guò)濾至弱酸性緩沖液中來(lái)進(jìn)行緩沖液交換，通過(guò)超濾進(jìn)行濃縮，進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，并隨后于5C貯存或進(jìn)行冷凍。
[0157]實(shí)施例2
[0158]鼠CT)F15在肝和附睪組織中的調(diào)控
[0159]肝和脂肪組織是哺乳動(dòng)物的主要代謝器官。為了鑒定用于代謝障礙的治療的潛在新型治療靶，進(jìn)行微陣列研究以比較進(jìn)食或禁食的野生型或肥胖ob / ob小鼠的肝和脂肪組織的基因表達(dá)模式。從自由接觸食物(“進(jìn)食”)或被禁食24小時(shí)(“禁食”)的年齡匹配的C57B16或ob / ob雄性小鼠(Jackson Labs)收獲肝或附睪脂肪組織以進(jìn)行RNA提取。將cRNA樣本與定制的微陣列芯片(Agilent)雜交。分析數(shù)據(jù)以比較野生型與ob / ob小鼠之間以及進(jìn)食與禁食小鼠之間的基因表達(dá)模式。鼠GDF15(SEQ ID NO:4 ；NCBI登錄號(hào)BC067248.1)被鑒定為在受肝和脂肪組織中受進(jìn)食/禁食調(diào)控以及在野生型和ob / ob小鼠中差異表達(dá)的靶基因。
[0160]圖1A和IB分別顯示⑶F15在肝和脂肪組織中的信號(hào)強(qiáng)度的改變。應(yīng)注意，⑶F15表達(dá)水平在來(lái)自ob / ob小鼠的肝組織中比C57B1 / 6小鼠的顯著更高。⑶F15表達(dá)水平被觀察到在C57B1 / 6小鼠和ob / ob小鼠的肝中被禁食下調(diào)。⑶F15表達(dá)水平在來(lái)自ob /Ob小鼠的脂肪組織中比C57B1 / 6小鼠的顯著更高。禁食在C57B1 / 6小鼠和ob / ob小鼠中升高⑶F15基因的表達(dá)水平。然而，倍數(shù)誘導(dǎo)在ob / ob小鼠中不太強(qiáng)勁。這些數(shù)據(jù)表明GDF15可能是新型代謝調(diào)節(jié)劑。
[0161]實(shí)施例3
[0162]PPAR激動(dòng)劑對(duì)⑶F15的誘導(dǎo)[0163]PPARa是調(diào)節(jié)肝中的代謝的細(xì)胞核受體和代謝障礙的主要治療性靶。PPARa據(jù)報(bào)導(dǎo)為在肝中介導(dǎo)禁食誘導(dǎo)的FGF21上調(diào)的主要調(diào)節(jié)劑(Inagaki T2007CellMetab5:415-25)。用PPARa激動(dòng)劑氯貝丁酯(500mg / kg)處理雄性C57B16小鼠(Jackson)，并且在處理后I天收獲肝組織以進(jìn)行RNA提取。將cRNA樣本與小鼠IOK微陣列(Motorola)雜交。分析數(shù)據(jù)以鑒定小鼠肝中的PPARci靶基因。圖2A顯示GDF15表達(dá)主要通過(guò)氯貝丁酯處理在小鼠肝中誘導(dǎo)，并且顯示⑶F15在肝中是PPARa的下游靶基困。
[0164]PPARy是脂肪組織中基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)劑，并且PPAR Y激動(dòng)劑在臨床上被批準(zhǔn)或被開(kāi)發(fā)來(lái)用于糖尿病治療。一些PPARy靶基因，例如脂連素、脂肪因子和脂肪組織中的PPARy靶基因(Maeda N2001Diabetes50 =2094-9)也被當(dāng)作用于2型糖尿病治療的治療性靶。比較用媒介物或PPAR Y激動(dòng)劑BRL49653處理的3T3-L1脂細(xì)胞中的基因表達(dá)模式，并且鼠⑶F15在脂細(xì)胞中被鑒定為靶基因誘導(dǎo)型PPARy激動(dòng)劑處理。分化的3T3-L1脂細(xì)胞利用IOuM BRL49653處理24小時(shí)。分離RNA樣本，將cRNA樣本與小鼠IOK微陣列(Motorola)雜交。分析數(shù)據(jù)以鑒定3T3-L1脂肪細(xì)胞中的PPARy基因。圖2B顯示⑶F15表達(dá)在3T3-L1小鼠的脂肪細(xì)胞中主要由BRL49653處理誘導(dǎo)，并且顯示⑶F15在脂肪細(xì)胞中是PPARy的下游靶基因，這表明GDF15具有為用于糖尿病治療的治療性靶的潛能。
[0165]實(shí)施例4
[0166]鼠CT)F15減少0b / Ob小鼠的食物攝入、體重增加、血液胰島素水平、血糖水平和血月旨水平
[0167]由于⑶F15受代謝改變或活化調(diào)節(jié)代謝的主要途徑的藥物治療強(qiáng)勁調(diào)控，因此我們檢查GDF15在體內(nèi)的過(guò)表達(dá)是否可引起肥胖和糖尿病ob / ob小鼠的代謝表型(ColemanDL1973Diabetologia 9:287-93)。為了兩個(gè)主要有利方面，將腺伴隨病毒(AAV)用于實(shí)現(xiàn)體內(nèi)過(guò)表達(dá)。首先，與轉(zhuǎn)基因不同，AAV可被用于成年動(dòng)物并且不干擾胎兒發(fā)育。其次，與其它類型用于體內(nèi)基因過(guò)表達(dá)的病毒不同，用無(wú)輔助病毒系統(tǒng)產(chǎn)生的AAV是復(fù)制缺陷型的并且不是病原性的(Matsushita T1998Gene Therapy5:938-45)。將 mu⑶F15 全長(zhǎng) cDNA (SEQID N0:3)克隆進(jìn)入具有EFla啟動(dòng)子和bGH聚腺苷酸的AAV載體。用無(wú)輔助病毒系統(tǒng)產(chǎn)生AAV,并通過(guò)層析和梯度離心進(jìn)行純化。用8xl012個(gè)基因組拷貝/動(dòng)物AAV-mu⑶F15或?qū)φ詹《窘?jīng)尾靜脈注射7周齡雄性ob / ob小鼠(Jackson Labs)。
[0168]在第10、17、24和63天檢查葡萄糖水平和體重(分別地，圖3A和3C)。從第3天至第24天每周測(cè)量食物攝(圖3D)。也在第17天測(cè)量血液胰島素(圖3B)。在第63天測(cè)量總膽固醇(圖3E)、游離脂肪酸(圖3F)、甘油三酯(圖3G)和胰島素水平(圖3H)。
[0169]相較于對(duì)照病毒處理的組，AAV-mu⑶F15組中下降的體重、食物攝入、血糖、胰島素、甘油三酯和膽固醇水平證明AAV介導(dǎo)的mu⑶F15的體內(nèi)過(guò)表達(dá)大大修正了 ob / ob小鼠中的代謝異常，包括攝食過(guò)度、肥胖、高血糖癥、高胰島素血癥和血脂異常。該數(shù)據(jù)確證了我們的假說(shuō):GDF15調(diào)節(jié)身體代謝并且可以是用于代謝障礙例如肥胖、糖尿病和血脂異常的治療的潛在治療性靶。
[0170]實(shí)施例5
[0171]鼠OF15改善Ob / Pb小鼠的高血糖癥而不依賴于食物攝入的減少并且無(wú)體重增血
[0172]⑶F15顯著減少ob / ob小鼠的過(guò)度食物攝入和體重增加，從而產(chǎn)生高血糖癥的改善是否繼發(fā)于減少的食物攝入和減少的體重增加的問(wèn)題。進(jìn)行對(duì)飼研究以確定GDF15是否可改善高血糖癥而不依賴于減少的食物攝入并且無(wú)體重增加。如實(shí)施例4中所述，用8xl012個(gè)基因組拷貝/動(dòng)物AAV-mu⑶F15或?qū)φ詹《窘?jīng)尾靜脈注射7周齡雄性ob / ob小鼠(Jackson Labs)。
[0173]一組對(duì)照病毒注射的小鼠(對(duì)飼組)具有有限的食物接觸。給予對(duì)飼組的食物的量(克食物攝入/克體重)經(jīng)計(jì)算等于在針對(duì)體重標(biāo)準(zhǔn)化后，由AAV-mu⑶F15注射的小鼠前一天消費(fèi)的食物的量(克食物攝入/克體重)。每天監(jiān)測(cè)體重和食物攝入，并且GDF15對(duì)這些參數(shù)的影響分別示于圖4A和4B中。在研究結(jié)束時(shí)測(cè)量葡萄糖水平和體重，并且⑶F15對(duì)這些參數(shù)的影響分別示于圖4C和4D中。
[0174]在17天的對(duì)飼研究過(guò)程中，⑶F15組相較于對(duì)照病毒組具有減少的食物攝入和體重增加，并且對(duì)飼組維持與⑶F15組相似的體重(圖4A和4B)。然而，⑶F15組具有比對(duì)照組和對(duì)飼組顯著更低的葡萄糖水平，這表明⑶F15可不依賴于食物攝入或體重來(lái)改善高血糖ob / ob小鼠的葡萄糖管理。
[0175]實(shí)施例6
[0176]鼠O) F15的效力`在高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)模型中比在lH常飼料喂養(yǎng)的模型中更強(qiáng)勁
[0177]我們隨后在B6D2F1小鼠(檢查糖尿病治療劑的效力的另一個(gè)嚙齒類動(dòng)物模型(Karasawa H2009MetabClin Exp58:296-33))中檢查AAV介導(dǎo)的⑶F15過(guò)表達(dá)對(duì)高脂肪飲食的效力。為了進(jìn)行比較，還在研究中包括飼以正常飼料的小鼠。對(duì)4周齡雄性B6D2F1小鼠(Harlan Labs)采用60%的高脂肪飲食或正常飼料，進(jìn)行3周。隨后如實(shí)施例4中所述，用8xl012個(gè)基因組拷貝/ ms AAV-mu⑶F15或?qū)φ詹《窘?jīng)尾靜脈注射它們。
[0178]在第7、13和28天通過(guò)血糖儀測(cè)量葡萄糖水平和體重；結(jié)果分別示于圖5A和5B中。每周測(cè)量食物攝入，進(jìn)行4周，并且結(jié)果示于圖5C中。飼以正常飼料的對(duì)照動(dòng)物的結(jié)果示于圖5D-5F中。AAV-mu⑶F15大大降低了飼以高脂肪飲食的小鼠的血糖水平和體重。相反地，在飼以常規(guī)飼料的具有正常血糖水平的小鼠中，作用非常弱。
[0179]這些結(jié)果表明⑶F15是在疾病模型中選擇性生效并且與一些糖尿病療法不同，不可能引發(fā)低血糖癥的代謝調(diào)節(jié)劑。
[0180]實(shí)施例7
[0181]鼠GDF15改善DIO小鼠的胰島素敏感性和葡萄糖耐受性
[0182]糖尿病是胰島素抗性和胰島素不足的代謝疾病。為了進(jìn)一步理解GDF15用于糖尿病治療的潛能，我們測(cè)試飼以高脂肪飲食的小鼠的葡萄糖耐受性和胰島素敏感性，所述小鼠已用AAV-mu⑶F15或?qū)φ詹《臼┯锰幚怼Ｐ坌訠6D2F1小鼠(Harlan Labs)飼以60%的高脂肪飲食，進(jìn)行3周，并且隨后如實(shí)施例4中所述，經(jīng)尾靜脈注射SxlO12個(gè)基因組拷貝/動(dòng)物AAV-mu⑶F15或?qū)φ詹《?。[0183]在AAV注射后3周進(jìn)行葡萄糖耐量測(cè)試(GTT)。如下進(jìn)行GTT:將動(dòng)物禁食4小時(shí)。隨后測(cè)量體重和葡萄糖水平(通過(guò)血糖儀)，隨后放血以用于胰島素測(cè)量，以IOml / kg 口服施用20%的葡萄糖水溶液。通過(guò)血糖儀測(cè)量葡萄糖給藥后第15、30、60、120分鐘的葡萄糖水平。在第15、30、60分鐘收集血液樣本以測(cè)量血清胰島素水平。圖6A和6B分別顯示GTT過(guò)程中的葡萄糖曲線和胰島素曲線。在GTT研究中，⑶F15組在所有時(shí)間點(diǎn)上相較于對(duì)照組具有更低的葡萄糖水平(圖6A)，表明GDF15處理的動(dòng)物具有改善的葡萄糖耐受性。葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌(GSIS)在所有時(shí)間點(diǎn)上也較低(圖6B)，表明在口服葡萄糖加載后需要更少的胰島素來(lái)進(jìn)行葡萄糖代謝，這表明GDF15處理改善了這些小鼠的胰島素敏感性。[0184]為了直接測(cè)試這些小鼠的胰島素敏感性，在對(duì)4小時(shí)禁食的小鼠進(jìn)行AAV注射后2周，進(jìn)行胰島素敏感性測(cè)試(1ST);使用0.5u / kg胰島素的腹膜內(nèi)給藥。如下進(jìn)行胰島素敏感性測(cè)試(1ST):將動(dòng)物禁食4小時(shí)。在測(cè)量體重和通過(guò)血糖儀測(cè)量葡萄糖水平后，用IOml / kg的0.5u / IOml Novolin溶液給動(dòng)物進(jìn)行腹膜內(nèi)給藥。通過(guò)血糖儀測(cè)量葡萄糖給藥后第15、30、60、120分鐘的葡萄糖水平。圖6C顯示1ST過(guò)程中的葡萄糖曲線。⑶F15處理組在所有時(shí)間點(diǎn)上相較于對(duì)照組具有更低的葡萄糖。圖6D顯示針對(duì)基線葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)化的葡萄糖水平，并且⑶F15處理組在第30、60、90分鐘相較于對(duì)照組具有更低的葡萄糖/基線葡萄糖比率，強(qiáng)烈地表明GDF15處理的動(dòng)物中改善的胰島素敏感性。
[0185]實(shí)施例8
[0186]人CT)F15改善DIO小鼠的葡萄糖耐受性
[0187]小鼠⑶F15成熟肽和人⑶F15成熟肽共有68.7%的同源性。為了檢查人⑶F15在小鼠模型中是否具有功能，在用AAV-hu⑶F15或?qū)φ詹《咎幚淼腂6D2F1D10小鼠中測(cè)試葡萄糖耐受性。對(duì)雄性B6D2F1小鼠(Harlan Labs)采用60%的高脂肪飲食，進(jìn)行5個(gè)月，隨后如實(shí)施例4中所述，經(jīng)尾靜脈注射SxlO12個(gè)基因組拷貝/動(dòng)物AAV-hu⑶F15或?qū)φ詹《尽?br> [0188]在AAV注射后2周，用4小時(shí)禁食的小鼠，如實(shí)施例7中所述進(jìn)行葡萄糖耐量測(cè)試；使用2g/kg的口服葡萄糖激發(fā)。圖7A描述了 GTT的結(jié)果。每3天測(cè)量一次食物攝入，進(jìn)行12天。圖7B顯示在12天的時(shí)期中食物攝入測(cè)量的結(jié)果。
[0189]在2周的時(shí)間點(diǎn)上，在進(jìn)行葡萄糖耐量測(cè)試之前測(cè)量體重。圖7C描述了在2周的時(shí)間點(diǎn)上體重測(cè)量的結(jié)果。
[0190]最后，通過(guò)hu⑶F15ELISA (R&D系統(tǒng))測(cè)量2周的時(shí)間點(diǎn)上的血漿⑶F15水平。圖7D顯示檢測(cè)到的hu⑶F15的量。由于缺乏檢測(cè)法，因此嚙齒類動(dòng)物的循環(huán)⑶F15水平不清楚。在正常人中，循環(huán)⑶F15水平據(jù)報(bào)道為數(shù)百pg/ml (Moore AG, 2000J ClinEndocrinolMetab85:4784-8)。我們的數(shù)據(jù)顯示AAV_h⑶F15處理組在循環(huán)中具有數(shù)納克的hu⑶F15(圖 7D)。
[0191]綜上所述，該數(shù)據(jù)顯示了與小鼠GDF15類似，人GDF15在小鼠模型中是有效的并且功能在兩種同源物之間是非常保守的，即使它們僅共有68.7%的序列同源性。
[0192]實(shí)施例9
[0193]人CT)F15阻止KK-Ay小鼠的胰島素敏感性和葡萄糖耐受性的惡化
[0194]我們進(jìn)一步測(cè)試⑶F15在KK-Ay小鼠(具有與ob / ob和DIO小鼠不同的病因?qū)W和癥狀的肥胖糖尿病嚙齒類動(dòng)物模型(Iwatsuka H 1970EndocrinolJpnl7:23-35))中的效力。如實(shí)施例4中所述，用8xl012個(gè)基因組拷貝/動(dòng)物AAV-hu⑶F15或?qū)φ詹《窘?jīng)尾靜脈注射17周齡雄性KK.Cg-Ay小鼠(Jackson Labs)。
[0195]在AAV注射后第3和第6周時(shí)間點(diǎn)上對(duì)禁食4小時(shí)的小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量測(cè)試；使用2g / kg 口服葡萄糖激發(fā)。對(duì)照組在第6周變得更具葡萄糖耐受性，因?yàn)閯?dòng)物變老并且疾病進(jìn)展，而⑶F15組在AAV注射后6周和3周維持相似的葡萄糖耐受性(圖8A)，這表明⑶F15處理阻止這些動(dòng)物中的疾病進(jìn)展。在葡萄糖激發(fā)之前，檢查小鼠的體重和血液胰島素水平。AAV注射對(duì)體重和血液胰島素的影響分別示于圖8B和8C中。對(duì)照組和⑶F15組在注射后3周具有輕度高胰島素血癥(圖SC)。雖然對(duì)照組在第6周變得更加具高胰島素血癥，但⑶F15組顯示改善的高胰島素血癥的趨勢(shì)(圖8C)，這表明與在B6D2F1高脂肪飲食小鼠中觀察到的類似，GDF15處理通過(guò)增強(qiáng)的胰島素敏感性改善了 KK-Ay小鼠的葡萄糖耐受性。
[0196]這些數(shù)據(jù)表明GDF15改善所有測(cè)試的糖尿病疾病小鼠模型的葡萄糖耐受性。
[0197]實(shí)施例10
[0198]人CDF15改善KKAy小鼠的糖尿和蛋白尿
[0199]KK-Ay小鼠的非常詳盡記載的糖尿病表型是腎并發(fā)癥，包括糖尿和蛋白尿(ReddiAS1988AdvExp Med Biol246:7-15)。我們還檢查了⑶F15處理后KK-Ay小鼠的葡萄糖和白蛋白排泄。如實(shí)施例4中所述，用SxlO12個(gè)基因組拷貝/動(dòng)物AAV-hu⑶F15或?qū)φ詹《窘?jīng)尾靜脈注射17周齡雄性KK.Cg-Ay小鼠(Jackson Labs)。
[0200]AAV注射后3周，檢查尿糖水平、尿白蛋白水平、尿量、每日水?dāng)z入、血清胰島素水平、血糖水平、血清hu⑶F15水平、體重和食物攝入。結(jié)果示于圖9A-9K(圖9A顯示尿糖水平,9B顯示尿量,9C顯示葡萄糖排泄,9D顯示尿白蛋白，9E顯示白蛋白排泄,9F顯示水?dāng)z入，9G顯示胰島素水平,9H顯示葡萄糖水平,91顯示體重，以及9J顯示食物攝,9K顯示hu⑶F15水平。GDF15組相較于對(duì)照組具有顯著改善的糖尿，通過(guò)尿糖水平(圖9A)、尿量(圖9B)和總葡萄糖排泄(圖9C)的降低顯示的。類似地，它們還具有顯著改善的蛋白尿，如通過(guò)降低的尿白蛋白水平(圖9D)、尿量(圖9B)和總尿白蛋白排泄(圖9E)顯示的。GDF15組還將水?dāng)z入減少至6ml / d /動(dòng)物，這與正常動(dòng)物的水?dāng)z入相似，而對(duì)照組的水?dāng)z入為約19ml / d / 動(dòng)物。
[0201]這些結(jié)果表明⑶F15顯著地改善了尿中的葡萄糖和白蛋白排泄，并且可在糖尿病性腎病中具有另外的有益作用。
[0202]實(shí)施例U
[0203]鼠CT)F15減少DIO模型中的脂肪質(zhì)暈和脂肪質(zhì)暈/總身體質(zhì)暈比率
[0204]由于⑶F15強(qiáng)勁地減少B6D2F1D10小鼠的食物攝入和體重增加，因此在AAV-mu⑶F15注射后測(cè)量B6D2F1D10小鼠的身體質(zhì)量和脂肪質(zhì)量以確定⑶F15是否主要減少身體脂肪質(zhì)量和可用作肥胖治療或主要減少瘦體質(zhì)量(body lean mass),這是不希望的。對(duì)4周齡雄性B6D2F1小鼠(Harlan)采用60 %的高脂肪飲食或正常飼料，進(jìn)行3周，隨后如實(shí)施例4中所述，經(jīng)尾靜脈注射SxlO12個(gè)基因組拷貝/動(dòng)物AAV-mu⑶F15或?qū)φ詹《尽?br> [0205]在AAV注射后5個(gè)月，通過(guò)DEXA掃描(PIXImus II，GE)測(cè)量總身體質(zhì)量和脂肪質(zhì)量。結(jié)果示于圖1OA(總身體質(zhì)量)和IOB (脂肪質(zhì)量)。也計(jì)算脂肪質(zhì)量/總身體質(zhì)量的比率和非脂肪質(zhì)量/總質(zhì)量的比率(分別地，圖1OC和10D)。5個(gè)月后，未暴露于外源⑶F15的飼以高脂肪飲食的小鼠(對(duì)照組)獲得許多重量，并且過(guò)度肥胖，而⑶F15組維持與瘦的年輕動(dòng)物相似的正常身體質(zhì)量(圖10A)。⑶F15組還具有低得多的身體脂肪質(zhì)量(圖10B)和身體脂肪質(zhì)量/總質(zhì)量比率(圖10C)。相反地，非脂肪質(zhì)量/總質(zhì)量比率在GDF15組中增加(圖10D)。該數(shù)據(jù)表明GDF15處理主要降低身體脂肪質(zhì)量并且可被當(dāng)作肥胖的治療。
[0206]實(shí)施例12
[0207]人CT)F15減少DIO模型中的脂肪質(zhì)暈和脂肪質(zhì)暈/總身體質(zhì)暈比率
[0208]由于與實(shí)施例12中概述的原因相似的原因，在AAV_huGDF15注射后測(cè)量B6D2F1D10小鼠中的身體質(zhì)量和脂肪質(zhì)量。對(duì)雄性B6D2F1小鼠(Harlan Labs)采用60%的高脂肪飲食，進(jìn)行5個(gè)月，隨后如實(shí)施例4中所述，經(jīng)尾靜脈注射SxlO12個(gè)基因組拷貝/動(dòng)物AAV-mu⑶F15或?qū)φ詹《尽?br> [0209] AAV注射后一年，AAV-h⑶F15處理組的體重維持在約30g(圖11A)，并且hu⑶F15血漿水平維持在約5ng/ml (圖11B)。通過(guò)DEXA掃描(PIXImus II，GE)測(cè)量總身體質(zhì)量(圖11C)、脂肪質(zhì)量(圖11D)和骨礦物質(zhì)密度(圖11E)。還計(jì)算脂肪質(zhì)量/總身體質(zhì)量的比率和非脂肪質(zhì)量/總質(zhì)量的比率(分別地，圖1lG和11H)。將一組飼以正常飼料的12周齡雄性B6D2F1小鼠包括在DEXA掃描中以進(jìn)行比較。
[0210]該實(shí)驗(yàn)顯示人GDF15通過(guò)減少脂肪質(zhì)量和增加非脂肪/總身體質(zhì)量比率展示抗肥胖性質(zhì)。
[0211]實(shí)施例13
[0212]重組鼠CT)F15蛋白改善痩素-缺陷型Ob / Ob小鼠的高血糖癥和攝食過(guò)度
[0213]我們通過(guò)AAV介導(dǎo)的體內(nèi)表達(dá)顯示小鼠和人GDF15在不同的小鼠模型中的強(qiáng)代謝效力。隨后，我們測(cè)試重組小鼠⑶F15蛋白在ob / ob小鼠中的效力。每天2次對(duì)6周齡雄性ob / obj鼠(Jackson Labs)皮下施用5mg / kg rmGDF15蛋白或媒介物。簡(jiǎn)而言之，按照食物攝入、體重和葡萄糖水平將ob / ob雄性小鼠隨機(jī)分入媒介物和處理組。每天2次對(duì)動(dòng)物皮下施用5mg / kg重組mu⑶F15蛋白或媒介物緩沖液,進(jìn)行2天。
[0214]測(cè)量注射之前和第I天及第2天的葡萄糖、體重、食物攝入。對(duì)于所有時(shí)間點(diǎn)，葡萄糖水平示于圖12A中，體重示于圖12B中，食物攝入示于圖12C中。
[0215]這些結(jié)果表明外源施用的重組小鼠⑶F15蛋白，與AAV-mu⑶F15類似，在ob / ob小鼠中是有效的。
[0216]實(shí)施例14
[0217]重組人CT)F15蛋白改善痩素-缺陷型Ob / Ob小鼠的高血糖癥和攝食過(guò)度
[0218]還在ob / ob小鼠中測(cè)試了重組人⑶F15蛋白的效力。通過(guò)單次注射，對(duì)7周齡雄性ob / ob小鼠(Jackson Labs)皮下施用5、1.5、0.5、0.15mg/kg rh⑶F15蛋白質(zhì)或媒介物緩沖液。如實(shí)施例13中所述,對(duì)動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)化分組。
[0219]處理后16-17小時(shí)測(cè)量葡萄糖、體重、食物攝入。葡萄糖水平示于圖13A中，食物攝入示于圖13B中，并且體重示于圖13C中。
[0220]數(shù)據(jù)顯示外源施用的重組人⑶F15蛋白急劇地改善ob / ob小鼠的攝食過(guò)度和高血糖癥，并且效力是劑量依賴性的。
[0221]實(shí)施例15
[0222]重組人GDF15蛋白改善DIO小鼠的葡萄糖耐受性[0223]我們還測(cè)試了重組人⑶F15蛋白在DIO模型中的效力。通過(guò)單次給藥，對(duì)飼以60%的高脂肪飲食6個(gè)月的雄性B6D2F1小鼠(HarlanLabs)皮下施用5mg / kg r⑶F15蛋白或質(zhì)媒介物緩沖液，如實(shí)施例13中所述對(duì)動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)化分組。
[0224]在給藥后3天，對(duì)禁食4小時(shí)的小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量測(cè)試(GTT);使用Ig / kg的口服葡萄糖激發(fā)。GTT的結(jié)果示于圖14A。每天測(cè)量食物攝入，并且其顯示于圖14B中。在進(jìn)行GTT之前測(cè)量體重，體重示于圖14C中。
[0225]綜上所述，這些結(jié)果表明重組人⑶F15蛋白在DIO小鼠模型中是有效的。
[0226]實(shí)施例16
[0227]重組人CT)F15改善脂質(zhì)耐受性
[0228]發(fā)現(xiàn)⑶F15的另一個(gè)有趣的代謝活性是:⑶F15急劇地改善小鼠的脂質(zhì)耐受性。給對(duì)以60 %的高脂肪飲食2個(gè)月的雄性B6D2F1小鼠(Harlan Labs)皮下施用5mg /kgrh⑶F15蛋白質(zhì)或媒介物緩沖液。4小時(shí)后，給小鼠口服施用20ml / kg20 % intralipid?。在脂質(zhì)激發(fā)后第0、60、90、120、180分鐘，通過(guò)比色測(cè)定(Sigma)測(cè)量血清甘油三酯水平。測(cè)量的血清甘油三酯的水平示于圖15A中。第180分鐘的血清rh⑶F15水平通過(guò)hu⑶F15ELISA(R&D Systems)來(lái)測(cè)量，并且示于圖15B中。
[0229]在⑶F15和媒介物處理的動(dòng)物中，在口服英脫利匹特激發(fā)后第30、60、90分鐘血清甘油三酯水平升高(圖15A)。然而，第60和90分鐘的甘油三酯水平在處理組中顯著更低，這表明GDF15急劇改善這些動(dòng)物的脂質(zhì)耐受性(圖15A)。包括高甘油三酯血癥的血脂異常是心血管疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)困子，是造成糖尿病患者的死亡率的最主要結(jié)果(HokansonJE1996J.Cardiovasc.Risk3:213-219)。⑶F15對(duì)脂質(zhì)耐受性的急劇改善表明⑶F15可在糖尿病血脂異常，特別地食后血脂異常中提供有益作用。
[0230]實(shí)施例7
[0231]鼠CT)F15改善DIO模型中的胰島素和脂質(zhì)特征譜
[0232]由于⑶F15精確地改善脂質(zhì)耐受性，我位還檢查了⑶F15是否長(zhǎng)期改善血脂特征譜。對(duì)B6D2F1小鼠(Harlan Labs)采用60%的高脂肪飲食，并且如實(shí)施例4中所述，經(jīng)尾靜脈給小鼠注射8xl012個(gè)基因組拷貝/動(dòng)物AAV-mu⑶F15或?qū)φ詹《尽Ｔ贏AV注射后3周測(cè)量血液胰島素、總膽固醇、NEFA和甘油三酯水平。結(jié)果示于圖16中；圖16A顯示胰島素水平，圖16B顯示NEFA水平，圖16C顯示總膽固醇水平，并且圖16D顯示甘油三酯水平。⑶F15組相較于對(duì)照組具有更低的膽固醇水平(圖16C)和甘油三酯水平，這表明⑶F15長(zhǎng)期改善脂質(zhì)特征譜。該數(shù)據(jù)還表明GDF15處理可在糖尿病血脂異常中提供有益作用。
【權(quán)利要求】
1.一種治療代謝障礙的方法，其包括向有此需要的受試者施用治療有效量的分離的人⑶F15多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述代謝障礙是2型糖尿病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述代謝障礙是血脂異常。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述代謝障礙是肥胖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述代謝障礙是糖尿病性腎病。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述代謝障礙包括其中所述受試者具有大于或等于100 mg/dL的空腹血糖水平的病況。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者是哺乳動(dòng)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述⑶F15蛋白包括SEQID NO:2、6和10之一。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述⑶F15多肽由SEQID NO: 1、5和9之一編碼。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中以包含與藥學(xué)上可接受的載體混合的所述⑶F15多肽的藥物組合物的形式施用所述⑶F15多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的方法，其還包括在所述施用后的時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定所述受試者的血糖水平的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括在所述施用后的時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定所述受試者的血清胰島素水平的步驟。
【文檔編號(hào)】A61P3/00GK103533951SQ201280017293
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月8日
【發(fā)明者】Y.熊, Y.李, W-C.葉, B.單, J.Z.圣 申請(qǐng)人:安姆根有限公司