聚乙二醇化人類hdl粒子和其制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供包含聚乙二醇化高密度脂蛋白（HDL）粒子的組合物、制造包含聚乙二醇化HDL粒子的組合物的方法和使用聚乙二醇化HDL粒子治療各種疾病和病狀的方法。
【專利說明】聚乙二醇化人類HDL粒子和其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)案主張2011年3月25日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/467，723號(hào)的優(yōu)先權(quán),此申請(qǐng)案的全部?jī)?nèi)容在此以引用的方式并入本文中。
[0002]本申請(qǐng)案中參考多個(gè)公開案和公開專利。對(duì)這些公開案的完全引用呈現(xiàn)于權(quán)利要求書之前的參考文獻(xiàn)部分中。這些公開案的揭示內(nèi)容全部在此以引用的方式并入本申請(qǐng)案中以便更完全地描述與本發(fā)明有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)水平。
[0003]本文中披露的工作是根據(jù)國立衛(wèi)生研究院的授權(quán)號(hào)HI54591在政府支持下進(jìn)行。因此美國政府對(duì)本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0004]血漿HDL膽固醇含量與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)逆相關(guān)，表明其具有保護(hù)作用。在人類中，已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中測(cè)試再造HDL粒子的潛在抗動(dòng)脈粥樣硬化性質(zhì)，并且這些研究實(shí)際上證實(shí)引起冠狀動(dòng)脈粥樣硬化消退。
[0005]當(dāng)前，呈重組型或原生形式的純化人類載脂蛋白A-1 (apoA-1)與磷脂和膽汁鹽組合使用以便產(chǎn)生重組型人類HDL粒子。HDL粒子是由蛋白質(zhì)和脂肪(其將膽固醇載運(yùn)到肝臟)組成，膽固醇在肝臟中從身體去除。盡管膽汁鹽的兩性性質(zhì)可以促進(jìn)重組型HDL粒子形成，但重組型HDL制備中的殘余膽汁鹽可能在人類中引起副作用并且因此限制可使用的重組型HDL粒子的數(shù)量。血漿HDL粒子的初始含量和能否在適當(dāng)時(shí)間時(shí)期內(nèi)保持其足夠治療濃度可判定HDL粒子療法的功效。
[0006]負(fù)責(zé)血漿HDL粒子的代謝回轉(zhuǎn)的機(jī)制仍定義不清。肝臟和腎是與HDL粒子分解代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)的主要器官。如果可以降低血漿HDL粒子或其載脂蛋白的清除率，那么很有可能在HDL粒子劑量降低的情況下獲得足夠的治療濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種包含聚乙二醇化(pegylated)高密度脂蛋白(HDL)粒子的組合物，這些聚乙二醇化高密度脂蛋白粒子包含載脂蛋白A-1 (ApoA-1 )，其中組合物中至少50%ApoA-1 是單聚乙二醇化(monopegylated) ApoA-Ι。
[0008]本發(fā)明還提供一種包含聚乙二醇化高密度脂蛋白(HDL)粒子的組合物，這些聚乙二醇化高密度脂蛋白粒子除聚乙二醇化ApoA-1以外還包含聚乙二醇化蛋白質(zhì)。
[0009]本發(fā)明還提供一種制備包含聚乙二醇化HDL粒子的組合物的方法，所述方法包含:Ca)混合HDL粒子與聚乙二醇來源以便形成混合物；(b)將來自步驟(a)的混合物在使得HDL粒子蛋白質(zhì)與聚乙二醇分子之間形成共價(jià)鍵的條件下培育；和((3)從來自步驟(b)的產(chǎn)物中分離聚乙二醇化HDL粒子，由此制備包含聚乙二醇化HDL粒子的組合物。
[0010]本發(fā)明還提供一種通過本文中所述方法制備的組合物。
[0011]本發(fā)明還提一種供治療罹患發(fā)炎性血管疾病的個(gè)體的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效治療個(gè)體的本文中所述組合物。[0012]本發(fā)明還提供一種治療罹患血脂異常的個(gè)體的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效治療個(gè)體的本文中所述組合物。
[0013]本發(fā)明還提供一種提高個(gè)體中血漿HDL含量的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效提高個(gè)體中血漿HDL含量的本文中所述組合物。
[0014]本發(fā)明還提供一種促進(jìn)膽固醇從個(gè)體巨噬泡沫細(xì)胞中流出的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效促進(jìn)膽固醇從個(gè)體巨噬泡沫細(xì)胞中流出的本文中所述組合物。
[0015]本發(fā)明還提供一種降低個(gè)體中白細(xì)胞量的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效降低個(gè)體中白細(xì)胞量的本文中所述組合物。
[0016]本發(fā)明還提供用于治療罹患發(fā)炎性血管疾病的個(gè)體的本文中所述組合物。本發(fā)明還提供用于治療罹患血脂異常的個(gè)體的本文中所述組合物。本發(fā)明還提供用于提高個(gè)體中的血漿高密度脂蛋白含量的本文中所述組合物。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)膽固醇從個(gè)體巨噬泡沫細(xì)胞中流出的本文中所述組合物。本發(fā)明還提供用于降低個(gè)體中白細(xì)胞量的本文中所述組合物。
[0017]本發(fā)明還提供一種向個(gè)體投予化合物的方法，所述方法包含投予個(gè)體一定量的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié) 合的化合物的組合物，以便由此將化合物投予個(gè)體。
[0018]本發(fā)明還提供一種包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的化合物的組合物和一種提高個(gè)體中LCAT量的方法，所述方法包含投予個(gè)體一定量的有效提高個(gè)體中的LCAT量的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物。
[0019]本發(fā)明還提供一種治療罹患動(dòng)脈粥樣硬化的個(gè)體的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效治療個(gè)體的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物。
[0020]本發(fā)明還提供一種治療罹患一種腎病或處于罹患一種腎病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效治療個(gè)體或者降低或消除個(gè)體腎病風(fēng)險(xiǎn)的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT或ApoL-1WT的組合物。
[0021]本發(fā)明還提供一種包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的化合物的組合物，所述聚乙二醇化HDL粒子是用作將化合物投予個(gè)體的遞送工具。
[0022]本發(fā)明還提供一種包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物，其是用于提高個(gè)體中的LCAT量。
[0023]本發(fā)明還提供一種包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物，其是用于治療罹患動(dòng)脈粥樣硬化的個(gè)體。
[0024]本發(fā)明還提供一種包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT或ApoL-1WT的組合物，其是用于治療罹患一種腎病的個(gè)體或者降低或消除個(gè)體罹患腎病的風(fēng)險(xiǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1A和圖1B:人類apoA-1的聚乙二醇化作用。在4°C (圖1A)或室溫(圖1B)下在不存在活性PEG (Al、BI或B2)或存在活性PEG (A2、B3、B4)情況下將純化人類apoA_I聚乙二醇化約16小時(shí)并且通過SDS-PAGE和庫馬斯藍(lán)染色(Coomassie Blue Staining)來分析。較低的溫度引起apoA-1的部分聚乙二醇化作用并且較高的溫度引起apoA-1的多聚乙二醇化(multipegylation)。在4°C下培育較長(zhǎng)時(shí)間也會(huì)引起多聚乙二醇化(未圖示)。
[0026]圖2A和圖2B:膽固醇從巨噬細(xì)胞流出。小鼠腹膜巨噬細(xì)胞用50 μ g/ml乙?；?LDL和并入乙酰基-LDL制劑中的I μ Ci/ml [3H]膽固醇標(biāo)記過夜。在洗滌細(xì)胞后，通過添加指示濃度的apoA-1或PEG-apoA-1來起始膽固醇流出。流出百分比確定為培養(yǎng)基計(jì)數(shù)/(培養(yǎng)基+細(xì)胞計(jì)數(shù))X 100。圖2A中使用的PEG-apoA-1是如圖1A (部分聚乙二醇化)中制備并且如圖1B (多聚乙二醇化)中制備的PEG-apoA-1用于圖2B中所示之流出。
[0027]圖3:人類HDL的聚乙二醇化。在存在或不存在活化聚乙二醇的情況下培育人類HDL0對(duì)未經(jīng)修飾的原生HDL或聚乙二醇化HDL進(jìn)行SDS-PAGE分析。展示凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色(Coomassie Brilliant Blue staining)。
[0028]圖4:原生和聚乙二醇化人類HDL促進(jìn)膽固醇從巨噬細(xì)胞中流出。鼠類巨噬細(xì)胞樣RAW細(xì)胞用在含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中再造的[3H]膽固醇標(biāo)記。在洗滌后，通過添加所指示的量的HDL來起始膽固醇流出。如所述確定膽固醇的流出百分比。
[0029]圖5:活體內(nèi)未聚乙二醇化的HDL的代謝回轉(zhuǎn)。將0.8毫克HDL蛋白質(zhì)通過尾靜脈注射到小鼠中。在注射后的指定時(shí)間點(diǎn)從小鼠獲得血液的等分試樣。對(duì)來自各樣品的0.1微升血衆(zhòng)進(jìn)行西方墨點(diǎn)分析(Western analysis)并且展示結(jié)果。
[0030]圖6:活體內(nèi)聚乙二醇化HDL的代謝回轉(zhuǎn)。將Img PEG-HDL蛋白質(zhì)制劑通過尾靜脈注射到小鼠中。在注射后的指定時(shí)間點(diǎn)從小鼠獲得血液的等分試樣。對(duì)來自各樣品的0.1微升血漿進(jìn)行西方墨點(diǎn)分析并且展示結(jié)果。
[0031]圖7:在用WTD喂養(yǎng)的Apoe+小鼠中，PEG-rHDL可以比rHDL更有效地降低白細(xì)胞(Wbcs)總量。(實(shí)例5) Apoe+小鼠用WTD喂養(yǎng)9周，隨后接受生理食鹽水、rHDL (40毫克/公斤)或PEG-rHDL (40毫克/公斤)輸注。2周后，小鼠接受第二次輸注(相同條件)并且在6天后測(cè)量白細(xì)胞總量。與生理食鹽水相比*p〈0.0。
[0032]圖8:通過流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)評(píng)估單核細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞并且使用來自全血細(xì)胞分析的計(jì)數(shù)將其轉(zhuǎn)換為細(xì)胞數(shù)/微升 。(實(shí)例5)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值土SEM。與生理食鹽水相比 *Ρ〈0.05。
[0033]圖9:解剖主動(dòng)脈弓，清洗并且用油紅O (OilRedO)染色以便對(duì)病灶定量。(實(shí)例5)數(shù)據(jù)表示為平均病灶面積百分比土SEM。與生理食鹽水相比*Ρ〈0.005。
[0034]圖10:在第5小時(shí)和第24小時(shí)檢查人類PEG-HDL和原生HDL影響膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流出的能力(實(shí)例6)。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 申請(qǐng)人:以前已經(jīng)研發(fā)了使用活化甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)使純化人類apoA_I聚乙二醇化以便增加人類apoA-1的血漿半衰期的方法，所述人類apoA-1的聚乙二醇化形式仍保留其重要生物活性，即促進(jìn)膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流出(PCT國際申請(qǐng)公開案第W02010/141097號(hào))。盡管使用W02010/141097中披露的方法觀測(cè)到單聚乙二醇化物質(zhì)，但反應(yīng)并不完全，因?yàn)橹苿┲腥源嬖诖罅吭鷄poA-1 (圖1A)。當(dāng)增加活化PEG的反應(yīng)時(shí)間或數(shù)量以便提供更完全的聚乙二醇化作用時(shí)，獲得多聚乙二醇化物質(zhì)的混合物或觀測(cè)到不完全聚乙二醇化(W02010/141097中第30頁第14-20行和圖1B)。因此，W02010/141097中的方法未產(chǎn)生含有超過40%-50%單聚乙二醇化apoA-1的組合物。
[0036]因?yàn)閱尉垡叶蓟镔|(zhì)優(yōu)于原生和多聚乙二醇化apoA-1 (已經(jīng)證明原生和多聚乙二醇化apoA-1具有功能損失，如由促進(jìn)膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流出的能力降低證實(shí)(W02010/141097中第33頁第6_8行和圖1B圖2B))，因此需要可以產(chǎn)生較高濃度的單聚乙二醇化apoA-1物質(zhì)的經(jīng)過改良的聚乙二醇化方法。
[0037]如本文中所述，使用HDL粒子而非其去脂化載脂蛋白作為蛋白質(zhì)聚乙二醇化作用底物的新穎方法與根據(jù)W02010/141097的方法相比具有多種優(yōu)點(diǎn)。
[0038]具體地說，本文中提供的聚乙二醇化方法可以產(chǎn)生含有超過50%單聚乙二醇KapoA-1同時(shí)基本上不含不合意多聚乙二醇化物質(zhì)的HDL粒子組合物。使用原生HDL(apoA-1)作為聚乙二醇化作用底物還可以提高目標(biāo)聚乙二醇化作用的特異性和效率，因?yàn)樾纬蒆DL和HDL的功能的脂質(zhì)化作用所需的apoA-1的必需氨基酸殘基可能由HDL粒子中的脂質(zhì)分子保護(hù)而免于聚乙二醇化作用。其它優(yōu)點(diǎn)包括改良的一致性、節(jié)省成本(需要更少的材料)、不存在膽汁鹽和易于分離(可使用梯度離心)。相比而言，W02010/141097中披露的方法具有部分由分離難度引起的工藝過程放大問題(scale-up problems)。
[0039]本發(fā)明提供包含聚乙二醇化高密度脂蛋白(HDL)粒子的組合物，這些聚乙二醇化高密度脂蛋白粒子包含載脂蛋白A-1 (ApoA-1 )，其中組合物中至少50%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物中至少70%或至少80%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1。在另一實(shí)施例中，組合物中至少90%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1。在另一實(shí)施例中，組合物中至少98%或至少99%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1。
[0040]在一個(gè)實(shí)施例中，組合物基本上不含多聚乙二醇化ApoA-1。在另一實(shí)施例中，組合物基本上不含膽汁鹽。
[0041 ] 在一個(gè)實(shí)施例中，組合物中全部單聚乙二醇化ApoA-1中的至少50%經(jīng)過N端聚乙二醇化。在另一實(shí)施例中，組合物中全部單聚乙二醇化ApoA-1中的至少60%經(jīng)過N端聚乙二醇化。在另一實(shí)施例中，組 合物中全部單聚乙二醇化ApoA-1中的至少70%經(jīng)過N端聚乙二醇化。在另一實(shí)施例中，組合物中全部單聚乙二醇化ApoA-1中的至少80%經(jīng)過N端聚乙二醇化。在另一實(shí)施例中，組合物中全部單聚乙二醇化ApoA-1中的約80%經(jīng)過N端聚乙二醇化。
[0042]在一個(gè)實(shí)施例中，單聚乙二醇化ApoA-1包含與ApoA-1共價(jià)鍵結(jié)的聚乙二醇，所述聚乙二醇的分子量在10，000道爾頓(Dalton)與30，000道爾頓之間。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇的分子量在15，000道爾頓與25，000道爾頓之間。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇的分子量在19，000道爾頓與21，000道爾頓之間。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇的分子量是約
20,000道爾頓。
[0043]在一個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇化HDL粒子是聚乙二醇化重組型HDL粒子或聚乙二醇化突變型HDL粒子。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇化HDL粒子是聚乙二醇化復(fù)原HDL粒子。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇化HDL粒子是聚乙二醇化原生HDL粒子。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇化HDL粒子是聚乙二醇化人類HDL粒子。
[0044]本發(fā)明還提供包含聚乙二醇化高密度脂蛋白(HDL)粒子的組合物，這些聚乙二醇化高密度脂蛋白粒子除聚乙二醇化ApoA-1以外還包含聚乙二醇化蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含聚乙二醇化ApoA-1和不同的聚乙二醇化蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，組合物包含聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其中所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)包括以下各物中的至少一種:載脂蛋白 A-1I (apo A-1I)、載脂蛋白 A-1V (ApoA-1V)、載脂蛋白 A-V (Apo V)、載脂蛋白 C-1 (ApoC-Ι)、載脂蛋白C-1KApo C-1I)、載脂蛋白C-1IKAp0 C-1II)、載脂蛋白D(Apo D)、載脂蛋白E (Apo E)、載脂蛋白F (Apo F)、載脂蛋白M (Apo M)、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)(CETP)、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)(PLTP)、對(duì)氧磷酯酶(paraoxonase)、血小板活化因子?；饷?PAF-AH)、凝聚素(apo J)、血清類淀粉蛋白A (SAA)和組織因子路徑抑制劑(TFPI)。
[0045]在一個(gè)實(shí)施例中，組合物中至少50%蛋白質(zhì)是單聚乙二醇化蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，組合物中至少70%或至少80%蛋白質(zhì)是單聚乙二醇化蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，組合物中至少90%蛋白質(zhì)是單聚乙二醇化蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施例中，組合物中至少98%或99%蛋白質(zhì)是單聚乙二醇化蛋白質(zhì)。
[0046]本發(fā)明還提供制備包含聚乙二醇化HDL粒子的組合物的方法，所述方法包含:(a)混合HDL粒子與聚乙二醇來源以便形成混合物；(b)將來自步驟(a)的混合物使得HDL粒子蛋白質(zhì)與聚乙二醇分子之間形成共價(jià)鍵的條件下培育；和(c)從來自步驟(b)的產(chǎn)物中分離聚乙二醇化HDL粒子，由此制備包含聚乙二醇化HDL粒子的組合物。
[0047]在一個(gè)實(shí)施例中，HDL粒子是重組型HDL粒子或突變型HDL粒子。在另一實(shí)施例中，HDL粒子是復(fù)原HDL粒子。在另一實(shí)施例中，HDL粒子是原生HDL粒子。在另一實(shí)施例中，HDL粒子是人類HDL粒子。
[0048]在一個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇的分子量在10，000道爾頓與30，000道爾頓之間。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇的分子量在15，000道爾頓與25，000道爾頓之間。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇的分子量在19，000道爾頓與21，000道爾頓之間。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇的分子量是約20，000道爾頓。在一個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇來源是甲氧基聚(乙二醇)。
[0049]在一個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇與HDL粒子的摩爾比率是2:1到10:1。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇與HDL粒子的摩爾比率是4:1到9:1。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇與HDL粒子的摩爾比率是7:1到9:1。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇與HDL粒子的摩爾比率是7:1到8:1。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇與HDL粒子的摩爾比率是8:1。在另一實(shí)施例中，聚乙二醇與HDL粒子的摩爾比率是約8:1。
[0050]在一個(gè)實(shí)施例中，在步驟a)中，混合物中的HDL粒子濃度是1.25-12.5毫克/毫升。在另一實(shí)施例中，在步驟(a)中，混合物中的HDL粒子濃度是約5毫克/毫升。
[0051]在一個(gè)實(shí)施例中，在步驟(b)中將HDL和聚乙二醇來源培育2-48小時(shí)。在另一實(shí)施例中，在步驟(b)中將HDL和聚乙二醇來源培育4-48小時(shí)、6_36小時(shí)、8_30小時(shí)、10-24小時(shí)、12-20小時(shí)、8-16小時(shí)、10-14小時(shí)或約11小時(shí)。在另一實(shí)施例中，在步驟(b)中將HDL和聚乙二醇來源培育約20小時(shí)。
[0052]在一個(gè)實(shí)施例中，在步驟(b)中于2°C-37°C下培育HDL粒子和聚乙二醇來源。在另一實(shí)施例中，在2°C -30°C、2°C -20°C、2°C -10°C或3°C -6V下培育HDL粒子和聚乙二醇來源。在另一實(shí)施例中，在4°C _6°C下培育HDL粒子和聚乙二醇來源。在另一實(shí)施例中，在約4°C下培育HDL粒子和聚乙二醇來源。在另一實(shí)施例中，在步驟(b)中于約6°C下培育HDL和聚乙二醇來源。
[0053]在一個(gè)實(shí)施例中，步驟(b)更包含通過添加約IM甘氨酸來淬滅混合物的步驟。在另一實(shí)施例中，步驟(b)更包含通過添加甘氨酸使甘氨酸濃度達(dá)到5mM-75mM來淬滅混合物的步驟。在另一實(shí)施例中，淬滅混合物使甘氨酸濃度達(dá)到約10mM。在另一實(shí)施例中，淬滅混合物使甘氨酸濃度達(dá)到25mM-75mM。在另一實(shí)施例中，淬滅混合物使甘氨酸濃度達(dá)到40mM-60mM。在另一實(shí)施例中，淬滅混合物使甘氨酸濃度達(dá)到48mM-52mM。在另一實(shí)施例中，淬滅混合物使甘氨酸濃度達(dá)到約50mM。
[0054]在一個(gè)實(shí)施例中，在步驟(C)中通過凝膠-過濾色譜法從步驟(b)的產(chǎn)物中分離聚乙二醇化HDL粒子。在另一實(shí)施例中，所述方法是在不存在膽汁鹽的情況下進(jìn)行。
[0055]本發(fā)明還提供通過本文中所述方法制備的組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含單聚乙二醇化載脂蛋白A-1 (ApoA-1 )，其中組合物中至少50%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1。在另一實(shí)施例中，組合物中至少70%或至少80%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1。在另一實(shí)施例中，組合物中至少90%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1。在另一實(shí)施例中，組合物中至少98%或99%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1。
[0056]在一個(gè)實(shí)施例中，組合物基本上不含多聚乙二醇化ApoA-1。在另一實(shí)施例中，組合物基本上不含膽汁鹽。
[0057]在一個(gè)實(shí)施例中，組合物中全部單聚乙二醇化ApoA-1中的至少50%經(jīng)過N端聚乙二醇化。在另一實(shí)施例中，組合物中全部單聚乙二醇化ApoA-1中的至少60%經(jīng)過N端聚乙二醇化。在另一實(shí)施例中，組合物中全部單聚乙二醇化ApoA-1中的至少70%經(jīng)過N端聚乙二醇化。在另一實(shí)施例中，組合物中全部單聚乙二醇化ApoA-1中的至少80%經(jīng)過N端聚乙二醇化。在另一實(shí)施例中，組合物中全部單聚乙二醇化ApoA-1中的約80%經(jīng)過N端聚乙二醇化。
[0058]本發(fā)明還提供治療罹患發(fā)炎性血管疾病的個(gè)體的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效治療個(gè)體的本文中所述組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，發(fā)炎性血管疾病是動(dòng)脈粥樣化或動(dòng)脈粥樣硬化。在另一實(shí)施例中，發(fā)炎 性血管疾病是動(dòng)脈粥樣硬化血栓性心血管疾病。
[0059]本發(fā)明還提供治療罹患血脂異常的個(gè)體的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效治療個(gè)體的本文中所述組合物。
[0060]本發(fā)明還提供提高個(gè)體中血漿HDL含量的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效提高個(gè)體中血漿HDL含量的本文中所述組合物。
[0061]本發(fā)明還提供促進(jìn)膽固醇從個(gè)體巨噬泡沫細(xì)胞中流出的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效促進(jìn)膽固醇從個(gè)體巨噬泡沫細(xì)胞中流出的本文中所述組合物。
[0062]本發(fā)明還提供降低個(gè)體中白細(xì)胞量的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效降低個(gè)體中白細(xì)胞量的本文中所述組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，白細(xì)胞包括單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞或其兩者。
[0063]本發(fā)明還提供用于治療罹患發(fā)炎性血管疾病的個(gè)體的本文中所述組合物。本發(fā)明還提供用于治療罹患血脂異常的個(gè)體的本文中所述組合物。本發(fā)明還提供用于提高個(gè)體中的血漿高密度脂蛋白含量的本文中所述組合物。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)膽固醇從個(gè)體巨噬泡沫細(xì)胞中流出的本文中所述組合物。本發(fā)明還提供用于降低個(gè)體中的白細(xì)胞量的本文中所述組合物。
[0064]本發(fā)明還提供向個(gè)體投予化合物的方法，所述方法包含投予個(gè)體一定量的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的化合物的組合物，以便由此將化合物投予個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施例中，所述化合物是卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)。在另一實(shí)施例中，所述化合物是野生型ApoL-1 (ApoL-1 WT)。
[0065]本發(fā)明還提供提高個(gè)體中LCAT量的方法，其包含投予個(gè)體一定量有效提高個(gè)體中的LCAT量的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物。
[0066]本發(fā)明還提供治療罹患動(dòng)脈粥樣硬化的個(gè)體的方法，其包含投予個(gè)體一定量有效治療個(gè)體的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物。
[0067]本發(fā)明還提供治療罹患一種腎病或處于罹患一種腎病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效治療個(gè)體或者降低或消除個(gè)體罹患腎病風(fēng)險(xiǎn)的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT或ApoL-1 WT的組合物。
[0068]本發(fā)明還提供包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的化合物的組合物，所述聚乙二醇化HDL粒子是用作將化合物投予個(gè)體的遞送工具。
[0069]本發(fā)明還提供包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物，其是用于提高個(gè)體中的LCAT量。
[0070]本發(fā)明還提供包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物，其是用于治療罹患動(dòng)脈粥樣硬化的個(gè)體。
[0071]本發(fā)明還提供包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT或ApoL-1 WT的組合物，其是用于治療罹患一種腎病的個(gè)體或者降低或消除個(gè)體罹患腎病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0072]對(duì)于前述實(shí)施例，預(yù)期本文中披露的每一個(gè)實(shí)施例適用于其它所披露的實(shí)施例中的每一者。
[0073]定義
[0074]如本文中所使用并且除非另有說明，否則以下每一個(gè)術(shù)語應(yīng)具有下文闡述的定義。
[0075]“投予”試劑可以使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種方法和遞送系統(tǒng)中的任一種來實(shí)現(xiàn)或進(jìn)行。投予可以是(例如，但不限于)靜脈內(nèi)、經(jīng)口、肌肉內(nèi)、血管內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)、心肌內(nèi)和皮下投予。
[0076]術(shù)語“高密度脂蛋白(HDL)粒子”涵蓋所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員提及的HDL粒子，包括前 _L、β HDL, HDL2 (包括 HDL2a 和 HDL2b)、HDL3，如原生或復(fù)原 HDL (rHDL)粒子。HDL 粒子代表多種血漿脂蛋白，其在尺寸、載脂蛋白(apo )和脂質(zhì)組成方面呈現(xiàn)多種多樣性。盡管HDL的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和組成可能比較復(fù)雜，但HDL的最基本形式含有磷脂和載脂蛋白(apo)。已經(jīng)顯示超過20種蛋白質(zhì)與HDL粒子相關(guān)聯(lián)，其中一些蛋白質(zhì)包括載脂蛋白A-Kapo A-1),載脂蛋白A-1I (apo A-1I)、載脂蛋白A-1V (ApoA-1V)、載脂蛋白A-V (Apo V)、載脂蛋白C-1 (Apo C-Ι)、載脂蛋白 C-1I (Apo C-1I)、載脂蛋白 C-1II (Apo C-1II)、載脂蛋白 D (ApoD)、載脂蛋白E (Apo E)、載脂蛋白F (Apo F)、載脂蛋白M (Apo M)、卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT )、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)(CETP )、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)(PLTP )、對(duì)氧磷酯酶、血小板活化因子?；饷?PAF-AH)、凝聚素(apoj)、血清類淀粉蛋白A (SAA)和組織因子路徑抑制劑(TFPI)(馮？艾克德斯汀(von Eckardstein), 1994)。
[0077]最充足和主要的載脂蛋白是apoA-1 (雷恩(Ryan) 2010,阿斯曼(Assmann),1982 ;馮?艾克德斯汀，1994 ;斯科勒(Skinner), 1994 ;安拉瑪哈(Anantharamaiah), 1991 ；布魯特(81"011丨116?6)，1995，布魯特，2001;弗蘭克？6 (Frank PG)，2000 ;西格雷斯特(segerest)，2000，科隆(1(1011)，2002)，其與磷脂和膽固醇相關(guān)聯(lián)，封閉膽固醇酯的核心(西特斯(Stroes)，US2008/0214434A1)。HDL還可以是從突變型HDL載脂蛋白制備的突變型HDL，這些突變型HDL載脂蛋白已從血漿分離或通過遺傳工程產(chǎn)生。[0078]如本文中所使用，“人類HDL粒子”意指完全或部分來源于人類來源的HDL粒子。人類HDL粒子可以是原生型，即從人類血清分離，或是復(fù)原的，例如通過將人類載脂蛋白、載脂蛋白片段或肽與磷脂囊泡一起活體外培育而形成。人類HDL粒子還可以是由經(jīng)過工程改造的人類載脂蛋白制備的重組型人類HDL粒子或者由從人類血漿分離或通過遺傳工程產(chǎn)生的突變型人類HDL載脂蛋白制備的突變型人類HDL (雷恩2010 ;吉洛特(Gillotte)，1996 ;尼森(Nissen) 2003 JiVjc(Matsunaga) 1999 ;曹(Cho) 2009 ;張(Zhang) 2010)。
[0079]“聚乙二醇化HDL粒子”是一種HDL粒子，其具有一或多個(gè)通過與HDL粒子的蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵與其結(jié)合的PEG分子并且其與非聚乙二醇化HDL粒子不同。HDL粒子的聚乙二醇化使粒子中的蛋白質(zhì)組分而非脂質(zhì)組分聚乙二醇化。因此，當(dāng)HDL粒子(例如復(fù)原HDL(rHDL)粒子)中僅存在載脂蛋白A-1時(shí)，則聚乙二醇化HDL粒子中的所有聚乙二醇化蛋白質(zhì)均是聚乙二醇化載脂蛋白A-1。但是，當(dāng)HDL粒子(例如原生人類HDL粒子)含有除載脂蛋白A-1以外的蛋白質(zhì)時(shí)，則聚乙二醇化HDL粒子還可以含有除聚乙二醇化載脂蛋白A-1以外的聚乙二醇化蛋白質(zhì)。如果聚乙二醇化作用是非選擇性的，則不同類型的聚乙二醇化蛋白質(zhì)的比率可以相同，假設(shè)聚乙二醇化作用不受其它因素(例如蛋白質(zhì)的相對(duì)位置)影響。如果一種蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)相比更加位于HDL粒子的外部，則預(yù)期所述更加位于外部的蛋白質(zhì)的聚乙二醇化百分比更高。
[0080]如用于PEG衍生蛋白質(zhì)，“單聚乙二醇化”應(yīng)意指一個(gè)(但不超過一個(gè))聚乙二醇分子通過共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)連接。
[0081]如用于PEG衍生蛋白質(zhì)，“多聚乙二醇化”應(yīng)意指超過一個(gè)(例如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或超過四個(gè))聚乙二醇分子各自通 過共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)連接。例如，具有兩個(gè)通過共價(jià)鍵與自身連接的聚乙二醇分子的蛋白質(zhì)是多聚乙二醇化蛋白質(zhì)。
[0082]如本文中所使用，組合物中蛋白質(zhì)的百分比,例如“組合物中單聚乙二醇化ApoA-1的百分比”，可指以重量計(jì)或以摩爾量計(jì)的單聚乙二醇化ApoA-1的百分比。在一個(gè)實(shí)施例中，百分比是指以摩爾量計(jì)的百分比。例如，包含HDL粒子(其包含ApoA-1)的組合物，其中組合物中至少50%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1意指以摩爾量計(jì)，組合物中至少50%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1。
[0083]對(duì)于組合物，當(dāng)關(guān)于多聚乙二醇化PEG衍生蛋白質(zhì)(例如多聚乙二醇化載脂蛋白A-1)使用時(shí)，“基本上不含”應(yīng)意指其中不存在多聚乙二醇化載脂蛋白A-1或多聚乙二醇化載脂蛋白A-1含量不可由常規(guī)方法檢測(cè)的組合物。載脂蛋白A-1 (apoA-1)(其如下文所述經(jīng)過聚乙二醇化)可以是野生型載脂蛋白或其變異體，其包括A-1 Milano (Argl73Cys)或變異體(Argl73Pro)，以及2007年5月29日頒布的美國專利第7，223，726號(hào)(奧達(dá)(Oda)等人)中描述的變異體。
[0084]“單聚乙二醇化載脂蛋白A-1 ”是一種載脂蛋白A-1，其具有通過共價(jià)鍵與其結(jié)合的單一 PEG分子并且與多聚乙二醇化載脂蛋白A-1和非聚乙二醇化載脂蛋白A-1不同。
[0085]如用于PEG衍生型肽、多肽或蛋白質(zhì)，“N端聚乙二醇化”應(yīng)意指聚乙二醇分子通過共價(jià)鍵連接到衍生的肽、多肽或蛋白質(zhì)的N端區(qū)域，當(dāng)呈線性形式時(shí)，N端區(qū)域是最靠近分子的N端的肽、多肽或蛋白質(zhì)的50%、25%或10%。在一個(gè)實(shí)施例中，N端聚乙二醇化將意指聚乙二醇分子通過共價(jià)鍵連接到N端殘基(即N端)。
[0086]如本文中所使用，“分離的”化合物是在肯定的分離作用后從粗反應(yīng)混合物或天然源分離的化合物。分離作用必然涉及分離化合物與混合物或天然來源中的其它成分以及一些雜質(zhì)、未知副產(chǎn)物和殘余量的其它允許剩余的成分。純化是肯定的分離作用的實(shí)例。
[0087]“發(fā)炎性血管疾病”應(yīng)意指人類血管或心血管系統(tǒng)疾病，其包含血管或心血管系統(tǒng)中的組織(例如其血管)的發(fā)炎性反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施例中，疾病是糖尿病性心血管疾病。
[0088]“血脂異?！笔怯蓚€(gè)體中血漿膽固醇、三酸甘油酯(TG)或其兩者升高或者高密度脂蛋白含量過低(其有助于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展)標(biāo)記的病理狀態(tài)。病因可以是原發(fā)性(遺傳性)或繼發(fā)性。血清膽固醇含量>240毫克/分升(>6.2毫摩爾/升)表示血脂異常。因此，如本文中所使用，術(shù)語“血脂異常”或“脂質(zhì)異常性”是指血漿中脂質(zhì)含量異常升高或降低，包括(但不限于)與以下病狀有關(guān)的脂質(zhì)含量改變:冠心病；冠狀動(dòng)脈?。恍难芗膊?、高血壓、再狹窄、血管或血管周圍性疾病；脂質(zhì)異常性病癥；異常脂蛋白血；低密度脂蛋白膽固醇含量過高；極低密度脂蛋白膽固醇含量過高；高密度脂蛋白含量過低；脂蛋白Lp (a)膽固醇含量過高；載脂蛋白B含量過高；動(dòng)脈粥樣硬化(包括動(dòng)脈粥樣硬化的治療和預(yù)防)；高脂質(zhì)血癥；聞膽固醇血癥；家族性聞膽固醇血癥(Ρ?);家族性組合型聞脂質(zhì)血癥(FCH);脂蛋白脂肪酶不足，例如高三酸甘油酯血癥、低α -脂蛋白血癥和高膽固醇血癥脂蛋白。
[0089]關(guān)于組合物，“基本上不含膽汁鹽”應(yīng)意指其中不存在膽汁鹽(包括基于膽汁酸膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和石膽酸的膽汁鹽)含量或膽汁鹽含量不可由常規(guī)方法檢測(cè)的組合物。未使用膽汁鹽制備但可能仍含有微量膽汁鹽的組合物也屬于此類別。
[0090]載脂蛋白A-1 (apoA-1)可以是野生型載脂蛋白或其變異體,其包括A-1Milano(Argl73Cys)或變異體 (Argl73Pro)，以及(例如)2007年5月29日頒予奧達(dá)等人的美國專利第7，223，726號(hào)和2010年8月19日公布的PCT國際申請(qǐng)公開案第W02010/093918號(hào)(其均以全文引用的方式并入本文中)中描述的變異體和模擬物。野生型人類ApoA-1蛋白質(zhì)序列在GenBank寄存編號(hào)NP_000030 (其內(nèi)容在此并入本文中)下可見。載脂蛋白A-1可以由NCBI參考序列:NM_000039.1編碼或由GenBank:BC005380.1 (載脂蛋白cDNA)編碼，這兩個(gè)序列在此并入本文中。
[0091]本發(fā)明涵蓋載脂蛋白A-1類似物和“單聚乙二醇化載脂蛋白A-1類似物”。所述野生型類似物可以與野生型序列具有70%到99%序列一致性。單聚乙二醇化載脂蛋白A-1類似物能夠介導(dǎo)膽固醇從(例如)人類巨噬泡沫細(xì)胞中流出，如通過本領(lǐng)域中已知的任一種常規(guī)分析法(包括下文中描述的分析法)測(cè)量。
[0092]載脂蛋白A-1純化方法描述于美國專利第6，090, 921號(hào)和第6，423，830號(hào)中，其使用陰離子交換色譜凝膠純化ApoA并且這些專利在此以全文引用的方式并入本文中。
[0093]在一個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇化HDL粒子是在由US7，759，315B2 (以引用的方式并入本文中)指定的劑量范圍內(nèi)投予。HDL劑量范圍是0.1到200毫克。在另一實(shí)施例中，劑量范圍是每次治療20毫克apoA-1/公斤體重到200毫克apoA_I/公斤體重。在另一實(shí)施例中，劑量范圍是每次治療10毫克到80毫克HDL (基于載脂蛋白的重量)/公斤體重。例如，所投予的HDL劑量可以是由靜脈內(nèi)注射和/或輸注臨床所需時(shí)期(例如幾分鐘到若干小時(shí)范圍內(nèi)的時(shí)期，例如多達(dá)24小時(shí))所提供的約0.2毫克到100毫克HDL/公斤體重(基于載脂蛋白的重量)。如果需要的話，HDL投藥可以重復(fù)一次或若干次。實(shí)際投藥量將由所治療疾病的性質(zhì)和HDL投藥率決定?？梢栽谥委熎陂g投予不同量的劑量，例如在治療開始時(shí)投予一次或兩次高的大丸劑量，接著投予較低的保持劑量。[0094]復(fù)原HDL的產(chǎn)生描述于(例如)美國專利第5，652，339號(hào)中。重組型HDL的產(chǎn)生描述于(例如)美國專利第6，559，284號(hào)和PCT國際專利申請(qǐng)公開案W087/02062中(大腸桿菌(E.coli)、酵母和CHO細(xì)胞中)。這些文獻(xiàn)和美國專利第7，759，315B2號(hào)的內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
[0095]對(duì)于HDL粒子在人類中的治療性或預(yù)防性使用，HDL的劑量(克量)必須實(shí)現(xiàn)血漿中apoA-1或HDL粒子含量的顯著提高(參見例如美國專利第5，652，339號(hào))。
[0096]在一個(gè)實(shí)施例中，每周一次投予個(gè)體醫(yī)藥調(diào)配物或聚乙二醇化HDL粒子持續(xù)約6個(gè)月、約5個(gè)月、約4個(gè)月、約3個(gè)月、約2個(gè)月或約I個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施例中，約每天、約每隔一天、約每3天、約每4天、約每5天、約每6天、約每7天、約每8-10天或約每11-14天投予醫(yī)藥調(diào)配物或聚乙二醇化HDL粒子。
[0097]在一個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇化HDL粒子是以液體醫(yī)藥調(diào)配物形式投予，其摩爾滲透壓濃度是約280毫克滲透壓(mOsm)到約320毫克滲透壓。在一個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇化HDL粒子是以液體醫(yī)藥調(diào)配物形式投予，其摩爾滲透壓濃度是約290毫克滲透壓。
[0098]一種遞送嵌入HDL粒子中的單聚乙二醇化ApoA-1 (野生型或突變型蛋白質(zhì))的方法是通過將大量蛋白質(zhì)靜脈內(nèi)輸注到患者中，如由基耶薩G (ChiesaG) 2002和希爾托里(Sirtori) 1999描述。嵌入HDL粒子中的單聚乙二醇化apoA-Ι (野生型或突變型蛋白質(zhì))可以單獨(dú)投予或與其它心血管或降三酸甘油酯藥物(例如士他汀(statin))組合投予。其可以按慣例使用賦形劑和穩(wěn)定劑制備成滅菌、凍干粉末形式以便用于注射，或使用穩(wěn)定劑以及口服和胃腸道代謝肽酶抑制劑制備以便口服投藥。其還可以通過包括(但不限于)靜脈內(nèi)、輸注或肌肉內(nèi)投藥的方法投予。在一個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇化HDL粒子是通過靜脈內(nèi)輸注投予到個(gè)體的外周靜脈中。在實(shí)施例 中，聚乙二醇化HDL粒子(無論單獨(dú)或以醫(yī)藥組合物形式)是靜脈內(nèi)投予到手臂關(guān)節(jié)窩或者進(jìn)入胸部的中心線中。在實(shí)施例中，醫(yī)藥調(diào)配物是注入個(gè)體手臂肘窩處的頭血管或肘正中血管中。
[0099]如本文中所使用，“醫(yī)藥載劑”是醫(yī)藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑或媒劑，其是用于將即用型化合物(instant compound)遞送到動(dòng)物或人類中。載劑可以是液體、噴霧劑、凝膠或固體并且是根據(jù)心里所計(jì)劃的投藥方式選擇。在一個(gè)實(shí)施例中，醫(yī)藥載劑是適用于靜脈內(nèi)投藥的無菌型醫(yī)藥學(xué)上可接受的溶劑。
[0100]在一個(gè)實(shí)施例中，無菌液體醫(yī)藥調(diào)配物包含蔗糖-甘露糖醇載劑和磷酸鹽緩沖液。在一個(gè)實(shí)施例中，蔗糖-甘露糖醇載劑包含約6.0%到約6.4%蔗糖和約0.8%到約1%甘露糖醇。在一個(gè)實(shí)施例中，蔗糖-甘露糖醇載劑包含約6.2%蔗糖和約0.9%甘露糖醇。在一個(gè)實(shí)施例中，無菌液體醫(yī)藥調(diào)配物的PH值是約7.0到約7.8。在一個(gè)實(shí)施例中，無菌液體醫(yī)藥調(diào)配物的PH值是約7.5。用于向個(gè)體投予含有載脂蛋白A-1的HDL粒子的調(diào)配物和方法描述于美國專利第7，435，717號(hào)中，其內(nèi)容在此以全文引用的方式并入本文中，并且這些調(diào)配物和方法可用于本文中所述含有載脂蛋白A-1的聚乙二醇化HDL粒子。
[0101]其它可注射型藥物遞送系統(tǒng)包括溶液、懸浮液和凝膠。口服遞送系統(tǒng)包括片劑和膠囊。這些遞送系統(tǒng)可含有賦形劑，諸如黏合劑(例如羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、其它纖維素材料和淀粉)、稀釋劑(例如乳糖和其它糖、淀粉、磷酸氫鈣和纖維素材料)、崩解劑(例如淀粉聚合物和纖維素)和潤滑劑(例如硬脂酸酯和滑石)。
[0102]用于可復(fù)原遞送系統(tǒng)的溶液、懸浮液和散劑包括媒劑，諸如懸浮劑(例如樹膠、三仙膠、纖維質(zhì)和糖)、保濕劑(例如山梨糖醇)、增溶劑(例如乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性劑(例如十二烷基硫酸鈉、斯潘(Spans)、吐溫(Tweens)和十六烷基批唳)、防腐劑和抗氧化劑(例如對(duì)羥基苯甲酸酯、維他命E (vitamins E)和維他命C以及抗壞血酸)、抗結(jié)塊劑、涂布劑和螯合劑(例如EDTA)。
[0103]在一個(gè)實(shí)施例中，所治療的個(gè)體的HDL-膽固醇含量低于45毫克/分升(男性)或低于50暈克/分升(女性)。
[0104]在一個(gè)實(shí)施例中，所治療的個(gè)體(男性或女性)的HDL-膽固醇〈40毫克/分升[<1.04毫摩爾/升]。
[0105]本文中所述治療方法中的聚乙二醇化HDL和組合物是按有效量使用。如本文中所使用，術(shù)語“有效量”是指當(dāng)按本發(fā)明的方式使用時(shí)足以產(chǎn)生所需治療反應(yīng)且無不當(dāng)?shù)牟涣几弊饔?諸如毒性、刺激或過敏反應(yīng))并且與合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比率相稱的組分的數(shù)量。特定有效量將隨例如所治療的特定病狀、患者的身體狀態(tài)、所治療的哺乳動(dòng)物類型、治療持續(xù)時(shí)間、同時(shí)使用的療法(如果存在)的性質(zhì)以及所使用的特定調(diào)配物和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)等因素而變化。
[0106]如本文中所使用，“疾病治療”或“治療”疾病、病癥或病狀(例如心血管疾病)涵蓋引起疾病、病癥或病狀的抑制、消退或停滯，或者改善或緩和疾病、病癥或病狀的癥狀。在一個(gè)實(shí)施例中，具有動(dòng)脈粥樣化作為其癥狀的疾病的治療包含降低動(dòng)脈粥樣化的體積。非限 制性實(shí)例包括動(dòng)脈粥樣化和動(dòng)脈粥樣硬化。
[0107]如本文中所使用，“罹患疾病、病狀或病癥的個(gè)體”意指肯定地診斷患有所述疾病、病狀或病癥的個(gè)體。
[0108]如本文中所使用，關(guān)于聚乙二醇化分子，除非另有說明，否則“聚乙二醇”(PEG)意指具有式OH-CH2- (CH2-O-CH2) n-CH2-0H的聚合物，其中一個(gè)羥基由鍵結(jié)到聚乙二醇化分子的共價(jià)鍵置換并且其中η是氧亞乙基的數(shù)目。本文中適用的聚乙二醇的平均分子量可以是5，000到40，000。每一個(gè)PEG分子的實(shí)際分子量應(yīng)不小于平均分子量的90%并且不超過平均分子量的110%。在特定實(shí)施例中，PEG的平均分子量是5，000,10, 000,20, 000,30, 000和40，000。在一個(gè)實(shí)施例中，PEG是分支鏈PEG。在實(shí)施例中，PEG可以是經(jīng)取代或未經(jīng)取代的直鏈。
[0109]如本文中所使用，“聚乙二醇來源”應(yīng)意指任何技術(shù)上認(rèn)可的用于使分子聚乙二醇化的PEG來源。非限制性實(shí)例包括甲氧基PEG (例如可以從美國德克薩斯州艾倫杰克姆技術(shù)公司(JenKem Technology USA, Allen, TX)獲得的呈甲氧基PEG丙醛形式，其分子量是 20，000)。其它來源包括聚乙二醇 200、300、400、600、1000、1450、3350、4000、6000、8000、20000、30000和40000 (CAS編號(hào):25322-68-3)和三氟乙基磺酰基單甲氧基PEG (TMPEG)0還可以使用分支鏈和多臂(multiarm)PEG。聚乙二醇化技術(shù)論述于羅伯特(Roberts)等人，先進(jìn)藥物遞送評(píng)論(Adv Drug Deliv Rev.)，2002年6月17日；54 (4):459_76，其全部?jī)?nèi)容在此以引用的方式并入本文中。可以使用以-NH2、-OH或-SH為目標(biāo)的活化PEG。
[0110]在一個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇化分子是按如下方式產(chǎn)生:將PEG醛存儲(chǔ)在-20°c下并且在使用前從存儲(chǔ)器取出且完全平衡達(dá)到室溫。人類HDL粒子按約4毫克/毫升的濃度在50mM乙酸鈉(pH5.5)、IOmM氰基硼氫化鈉中復(fù)原。計(jì)算所使用的PEG醛的量(摩爾比率PEGiHDL蛋白質(zhì)=8:1)并且溶解于使用50mM乙酸鈉(pH5.5)、10mM氰基硼氫化鈉的緩沖液中。接著，隨平緩漩渦將PEG溶液緩慢添加到蛋白質(zhì)溶液中。混合物在4°C下培育過夜。通過添加甘氨酸到50mM使反應(yīng)物淬滅并且在4°C下培育16小時(shí)。
[0111]如本文中所使用，關(guān)于所述數(shù)目使用的“約”涵蓋所述值的±1%的范圍。作為實(shí)例，約 100 毫克 / 公斤由此包括 99,99.1,99.2,99.3,99.4,99.5,99.6,99.7,99.8,99.9、100,100.1,100.2,100.3,100.4,100.5,100.6,100.7,100.8,100.9 和 101 毫克 / 公斤。因
此，在一個(gè)實(shí)施例中，約100毫克/公斤包括100毫克/公斤。
[0112]如本文中所使用，化合物的“量”或“劑量”(例如以毫克為單位測(cè)量)是指藥物產(chǎn)品中存在的化合物重量，與藥物產(chǎn)品的形式無關(guān)。
[0113]如本文中所使用，“抑制”個(gè)體中的疾病進(jìn)程或疾病并發(fā)癥意指預(yù)防或減緩個(gè)體中的疾病進(jìn)程和/或疾病并發(fā)癥。
[0114]應(yīng)理解，當(dāng)提供一個(gè)范圍時(shí)，本發(fā)明也提供所述范圍內(nèi)的所有整數(shù)和其十分位。例如,“0.2-5暈克/公斤”表不0.2暈克/公斤、0.3暈克/公斤、0.4暈克/公斤、0.5暈克/公斤、0.6毫克/公斤等，最多5.0毫克/公斤。
[0115]用聚乙二醇化HDL進(jìn)行的治療可以是組合療法的一個(gè)組成部分或者是一個(gè)附屬療法，即用另一種用于治療疾病的藥物(例如士他汀、煙酸、雌激素、依澤替米貝(ezemtimibe)、煙堿酸)和一或多種本發(fā)明化合物共同治療或給予需要藥物的個(gè)體或患者。此組合療法可以是依序療法(其中首先用一種藥物治療患者且接著用另一種藥物治療患者)或?qū)煞N藥物同時(shí)或并行給予。視所用劑型而定，這些藥物可以通過相同途徑或兩種或多于兩種不同投藥途徑單獨(dú)投 予。
[0116]本文中所述各種元素的所有組合均屬于本發(fā)明的范疇內(nèi)。
[0117]參考以下實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)可以更好地理解本發(fā)明，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地了解詳細(xì)描述的特定實(shí)驗(yàn)僅說明本發(fā)明，本發(fā)明更完全地描述于隨附權(quán)利要求中。
[0118]實(shí)駘細(xì)節(jié)
[0119]實(shí)例1:人類apoA-1的聚乙二醇化
[0120]人類apoA-1的聚乙二醇化形式保留其關(guān)鍵生物活性，即促進(jìn)膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流出。
[0121]甲氧基PEG丙醛(M-PEG-ALD) MW20000是從美國杰克姆技術(shù)公司(艾倫，德克薩斯州)購得。從存儲(chǔ)器移出含有PEG的瓶子并且完全平衡到室溫。將在50mM乙酸鈉(pH5.5)、IOmM氰基硼氫化鈉中復(fù)原的ApoA-1溶解。PEG醛是按PEG:apoA-Ι摩爾比率=10:1使用。將所需量的PEG溶解于50mM乙酸鈉(pH5.5)、IOmM氰基硼氫化鈉的等分試樣中。隨平緩漩渦將PEG制劑與人類apoA-1溶液混合。人類apoA-Ι的最終濃度是約2毫克/毫升到6毫克/毫升?；旌衔镌?°C下培育過夜。為了使所形成的多聚乙二醇化物質(zhì)降到最低，通過添加IM甘氨酸使?jié)舛冗_(dá)到IOmM或濃度達(dá)到50mM來淬滅反應(yīng)物。在這些條件下，apoA-1優(yōu)選在N端聚乙二醇化。通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色分析聚乙二醇化人類apoA-1并且展示于圖1中。
[0122]在4°C下培育約16小時(shí)后，約一半的人類apoA-1分子聚乙二醇化(圖1A)。在這些條件下，聚乙二醇化apoA-1似乎主要是同源物質(zhì)。盡管觀測(cè)到單聚乙二醇化物質(zhì)，但反應(yīng)并不完全，因?yàn)橹苿┲腥源嬖诖罅吭鷄poA-1 (圖1A-2)。如果將培育溫度改為室溫，則大部分apoA-1聚乙二醇化(圖1B)。但是，apoA-1的多聚乙二醇化似乎在這些條件下比較顯著，因?yàn)楫a(chǎn)生具有較高分子量的多種PEG-apoA-1物質(zhì)(圖1B)。
[0123]實(shí)例2:膽固醇從巨噬細(xì)胞中流出
[0124]通過將細(xì)胞與經(jīng)過修飾的LDL制劑(100微克乙?；?LDL蛋白質(zhì)/毫升)一起在放射性膽固醇示蹤劑([3H]膽固醇)存在下培育來使小鼠腹膜巨噬細(xì)胞負(fù)載有膽固醇。將細(xì)胞洗滌三次，其中在細(xì)胞培養(yǎng)基加0.2%牛血清白蛋白中平衡30分鐘后進(jìn)行最后一次洗漆。接著通過添加未經(jīng)修飾的原生apoA-1或聚乙二醇化apoA-1制劑來起始膽固醇流出。為了排除流出分析法中自由PEG分子的潛在作用，在流出分析法期間將相同量的未經(jīng)淬滅的PEG制劑添加到未經(jīng)修飾的apoA-1制劑群組中。結(jié)果展示于圖2中。
[0125]如所展示，人類apoA-1的聚乙二醇化不會(huì)不利地影響apoA_I促進(jìn)膽固醇流出的活性。膽固醇從巨卩遼泡沫細(xì)胞中流出到apoA-1或PEG-apoA-1顯示類似劑量反應(yīng)(圖2)。圖2中的流出分析法中使用的PEG-apoA-1制劑是來自圖1A中展示的制劑。但是，如圖1B中所示的apoA-1的多聚乙二醇 化引起膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流出降低(圖2)。因此，多聚乙二醇化apoA-1具有功能損失，如由促進(jìn)膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流出的能力降低顯示(圖2B)。
[0126]實(shí)例3:人類HDL的聚乙二醇化
[0127]述
[0128]I)分離HDL粒子。通過密度梯度離心從人類血漿中分離人類HDL。首先通過d=l.063時(shí)的密度梯度離心從血漿中去除非HDL脂蛋白。接著收集HDL作為d=l.21時(shí)的密度梯度離心的頂部脂蛋白層。
[0129]2)HDL的聚乙二醇化。程序甲氧基PEG丙醛(M-PEG_ALD)MW20000是從美國杰克姆技術(shù)公司(艾倫，德克薩斯州)購得。將PEG完全平衡到室溫。通過密度梯度離心從人類血漿中分離人類HDL。首先通過d=l.063時(shí)的密度梯度離心從血漿中去除非HDL脂蛋白。接著收集HDL作為d=l.21時(shí)的密度梯度離心的頂部脂蛋白層。經(jīng)過純化的人類HDL在50mM乙酸鈉(pH5.5)、10mM氰基硼氫化鈉中復(fù)原。待要使用的PEG醛的量計(jì)算為PEG = HDL蛋白質(zhì)摩爾比率=8:1。將所需量的PEG溶解于50mM乙酸鈉(pH5.5)、IOmM氰基硼氫化鈉的等分試樣中并且隨平緩漩渦混合PEG制劑與人類HDL溶液。人類HDL蛋白質(zhì)的最終濃度是約5毫克/毫升?；旌衔镌?°C下培育過夜。為了使所形成的多聚乙二醇化物質(zhì)降到最低，通過添加IM甘氨酸使?jié)舛冗_(dá)到50mM來淬滅反應(yīng)物。在這些條件下，HDL蛋白質(zhì)優(yōu)選在N端聚乙二醇化。
[0130]3)分離聚乙二醇化HDL粒子?？梢酝ㄟ^凝膠-過濾色譜法容易地從未經(jīng)合并的PEG分子分離和純化聚乙二醇化HDL。
[0131]4)庫馬斯藍(lán)染色:凝膠在50%Me0H、10%HoAC、40%H20中預(yù)先固定30分鐘。用0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250將上述溶液中的凝膠染色2-4小時(shí)直到凝膠呈均勻藍(lán)色。染色在凝膠在染料溶液中不再可見時(shí)完成。在5%Me0H、7.5%HoAC、87.5%H20中脫色4_24小時(shí)(相同溶液存在多種變化)。脫色直到背景呈透明狀。
[0132]5)西方墨點(diǎn)法(Western blot):將約5微克到200微克HDL蛋白質(zhì)與勒姆利緩沖液(Laemmli buffer)l:1 (v: V)混合并且加熱到80°C保持5分鐘。將樣品裝載到SDS-PAGE凝膠上并且跑膠直到藍(lán)色正面位于凝膠底部。將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上以便進(jìn)行免疫墨點(diǎn)分析。在振動(dòng)器上將膜在補(bǔ)充有5%脫脂乳粉和0.1%吐溫20的20-30毫升IXTris緩沖液中阻斷30分鐘。與用Tris緩沖液、5%牛奶和0.1%吐溫20稀釋的初級(jí)抗人類apoA-1抗體一起培育。在室溫下培育4小時(shí)。在振動(dòng)器上在室溫下于含有0.1%吐溫20的約50毫升IXTris緩沖液中洗滌3次(5_10分鐘)。與二級(jí)抗體一起在室溫下培育30分鐘到I小時(shí)。使用Amersham HRP結(jié)合型抗兔抗體作為二級(jí)抗體。在室溫下于含有0.1%吐溫20的約50mllXTris緩沖液中洗滌3次，每次10分鐘。用來自皮爾斯公司(PIERCE)(伊利諾斯州(IL))的ECL試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)。在單獨(dú)試管中，按1:1比率混合黑色和白色ECL溶液。將溶液等分到膜上并且使反應(yīng)進(jìn)行I分鐘。排干ECL，用塑料包裝并且暴露于薄膜。
[0133]6)巨噬細(xì)胞膽固醇流出:將小鼠巨噬細(xì)胞樣RAW細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清中培養(yǎng)。細(xì)胞用[3H]膽固醇(0.5Ci/毫升)標(biāo)記過夜。細(xì)胞用DMEM加0.2%牛血清白蛋白洗滌三次并且通過在存在或不存在所指示量的HDL或apoA-1情況下添加DMEM培養(yǎng)基、
0.2%牛血清白蛋白來起始流出。流出進(jìn)行2到8小時(shí)。接著收集培養(yǎng)基。細(xì)胞用溶解緩沖液(PBS加0.1N NaOH和0.1%SDS)溶解。使用β液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定培養(yǎng)基和細(xì)胞溶解產(chǎn)物的放射性。
[0134]7)半衰期實(shí)驗(yàn):將100-300微升體積的所指示量的原生或PEG-HDL通過尾靜脈注射到3-5個(gè)月齡的C57BL6/J小鼠(杰克遜實(shí)驗(yàn)室,美因河(Jackson Laboratory, Main))中。在所示時(shí)間點(diǎn)時(shí)，從小鼠收集血液的等分試樣并且通過離心分離血漿。接著對(duì)相當(dāng)于0.05到0.2微升血漿的血漿等分試樣進(jìn)行如上文所述的SDS-PAGE和西方墨點(diǎn)分析。通過密度測(cè)定法測(cè)定經(jīng)過顯影的薄膜上蛋白質(zhì)帶的密度。通過血液循環(huán)中人類載脂蛋白的清除率來估算活體內(nèi)原生或PEG-apoA-1的半衰期。
[0135]8)抗人類apoA-1抗體的來源是來自英國伯明翰結(jié)合位點(diǎn)公司(BINDINGSITE, Birmingham, UK.)，產(chǎn)品 目錄號(hào) #PC085。
[0136]MS
[0137]通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色分析聚乙二醇化人類HDL并且展示于圖3中。在4°C下培育約16小時(shí)后，HDL粒子中>90%人類apoA-Ι聚乙二醇化(圖3，HDL中的聚乙二醇化apoA-1表示為PEG-ApoA-1并且HDL中未經(jīng)修飾的原生apoA-1表示為ApoA-1 )。在這些條件下，聚乙二醇化HDL粒子主要是均質(zhì)物質(zhì)。
[0138]實(shí)例3A:聚乙二醇化人類HDL具有促進(jìn)膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流出的生物學(xué)活性
[0139]提出HDL的抗動(dòng)脈粥樣化性質(zhì)的主要機(jī)制是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，其中HDL將膽固醇從外周組織(例如巨噬泡沫細(xì)胞)轉(zhuǎn)運(yùn)回到肝臟以便進(jìn)行處理。在此情形中，膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流到HDL構(gòu)成膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的初始步驟。已明確證實(shí)HDL充當(dāng)膽固醇接受體并且促進(jìn)膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流出。因此，重要的是測(cè)試聚乙二醇化HDL促進(jìn)膽固醇流出的生物活性。在此實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試N端聚乙二醇化人類HDL粒子與原生HDL相比促進(jìn)膽固醇從巨噬細(xì)胞中流出的能力。將鼠類巨噬細(xì)胞樣RAW細(xì)胞用放射性膽固醇示蹤劑([3H]膽固醇)標(biāo)記。在用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞以便去除細(xì)胞外膽固醇示蹤劑后，如圖4中所指示通過添加未經(jīng)修飾的原生人類HDL或聚乙二醇化HDL來起始膽固醇流出。為了排除流出分析法中自由PEG分子的潛在作用，在流出分析法期間將相同量的經(jīng)過淬滅的PEG制劑添加到未經(jīng)修飾的HDL制劑群組中。結(jié)果展示于圖4中。人類HDL粒子的目標(biāo)聚乙二醇化不會(huì)顯著影響HDL促進(jìn)膽固醇流出的活性。膽固醇從巨噬細(xì)胞流到原生HDL或PEG-HDL顯示類似劑量反應(yīng)(圖4)。圖4中的流出分析法中使用的PEG-HDL制劑是來自如圖3中所示的制劑。
[0140]實(shí)例3B:聚乙二醇化人類HDL粒子的活體內(nèi)半衰期增加
[0141]為了評(píng)估血液循環(huán)中PEG-HDL粒子的藥物動(dòng)力學(xué)和清除率，在小鼠中比較未聚乙二醇化HDL的活體內(nèi)代謝回轉(zhuǎn)與PEG-HDL粒子的活體內(nèi)代謝回轉(zhuǎn)。圖5展示通過尾靜脈注射到小鼠循環(huán)中的0.8毫克未聚乙二醇化HDL的代謝回轉(zhuǎn)。通過血漿等分試樣的西方墨點(diǎn)分析估算的HDL蛋白質(zhì)(主要是apoA-1)的半衰期是約7小時(shí)。在注射后96小時(shí)，所有人類apoA-1似乎均被清除(剩余信號(hào)似乎是內(nèi)源小鼠apoA-1，因?yàn)閹芏扰c出血前對(duì)照物的帶密度類似)。接著將N端聚乙二醇化人類HDL (在此情況下使用20kDa M-PEG-ALD)注射到小鼠中。圖6展示小鼠血漿中約I毫克PEG-HDL粒子的代謝回轉(zhuǎn)。與未聚乙二醇化人類HDL相比，通過HDL中PEG-apoA-1的清除率估算的PEG-HDL的代謝回轉(zhuǎn)時(shí)間顯著增加(圖6對(duì)比圖5)。估算的半衰期是約24小時(shí)，即聚乙二醇化HDL粒子的半衰期與未聚乙二醇化HDL粒子相比增加3倍。72小時(shí)后血漿中仍剩余大量PEG-HDL。
[0142]實(shí)例4:聚乙二醇化人類HDL粒子和發(fā)炎性血.管疾病
[0143]向患有發(fā)炎性血管疾病的個(gè)體靜脈內(nèi)投予一定量的含有上文中所述聚乙二醇化HDL粒子的組合物。投藥可以按每公斤體重15毫克apoA-1到每公斤體重45毫克apoA_I的劑量在1-2個(gè)月內(nèi)進(jìn)行。可以通過標(biāo)準(zhǔn)超聲波方法測(cè)量治療進(jìn)程。聚乙二醇化HDL粒子可于包含蔗糖-甘露糖醇載劑和磷酸鹽緩沖液的無菌液體醫(yī)藥調(diào)配物中投予。蔗糖-甘露糖醇載劑可包含約6.2%蔗糖和約0.9%甘露糖醇。無菌液體醫(yī)藥調(diào)配物的pH值可以是約7.5。液體醫(yī)藥調(diào)配物的摩爾滲透壓濃度可以是約290毫克滲透壓。聚乙二醇化HDL粒子可以呈HDL粒子液體醫(yī)藥調(diào)配物形式投予，其每50毫升包含小于6，000個(gè)顆粒(尺寸大于10 μ m)或每50毫升包含小于600個(gè)顆粒(尺寸大于25 μ m)。
[0144]如果發(fā)炎性血管疾 病是動(dòng)脈粥樣化，則觀測(cè)到動(dòng)脈粥樣化體積減小。如果發(fā)炎性血管疾病是動(dòng)脈粥樣硬化，則觀測(cè)到斑塊尺寸減小。
[0145]在一個(gè)月到兩個(gè)月的時(shí)期內(nèi)向患有血脂異常的個(gè)體靜脈內(nèi)投予包含上文中所述高密度脂蛋白(HDL)粒子的組合物。發(fā)現(xiàn)投予聚乙二醇化HDL組合物可以改善個(gè)體中的血
脂異常。
[0146]在1-2個(gè)月的時(shí)期內(nèi)靜脈內(nèi)投予包含HDL粒子的組合物(其包含上文中所述的聚乙二醇化載脂蛋白A-1)可以增加HDL-膽固醇含量低于45毫克/分升(男性)或低于50毫克/分升(女性)的個(gè)體中的血漿HDL含量。在1-2個(gè)月的時(shí)期內(nèi)靜脈內(nèi)投予包含HDL粒子的組合物(其包含上文中所述的聚乙二醇化載脂蛋白A-1)還可以增加HDL-膽固醇含量低于40毫克/分升(男性)的個(gè)體中的血漿HDL含量。聚乙二醇化HDL粒子組合物可以呈HDL粒子液體醫(yī)藥調(diào)配物形式投予，其每50毫升包含小于6，000個(gè)顆粒(尺寸大于10 μ m)或每50毫升包含小于600個(gè)顆粒(尺寸大于25 μ m)。
[0147]碰
[0148]盡管用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥理學(xué)介入傳統(tǒng)上集中于降低LDL-膽固醇含量作為治療目標(biāo)，但多種介入試驗(yàn)也顯示HDL的血漿濃度與心血管疾病發(fā)病率之間存在反相關(guān)。支持HDL-膽固醇的心肌保護(hù)功能的流行病學(xué)證據(jù)表明HDL影響與動(dòng)脈粥樣化形成有關(guān)的細(xì)胞過程。因此，高密度脂蛋白(HDL)療法吸引研究人員更多的注意力并且已顯示具有極大的變?yōu)榕c現(xiàn)有動(dòng)脈粥樣硬化療法互補(bǔ)的新穎方法的潛力。但是，一個(gè)與HDL、重組型apo-AI或apo-A1-磷脂復(fù)合物的直接輸注有關(guān)的問題是實(shí)現(xiàn)并且在適當(dāng)時(shí)期內(nèi)保持血漿HDL處于其足夠的治療濃度并且不在人類中引起副作用。此外，并未報(bào)導(dǎo)在無膽汁鹽情況下制造合適的HDL粒子組合物。
[0149]此處披露的是使用活化甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)使人類HDL聚乙二醇化以便增加人類HDL的血漿半衰期的方法。重要的是，所產(chǎn)生的人類HDL的聚乙二醇化形式仍保留其生物學(xué)活性，例如促進(jìn)膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流出。此外，通過將未聚乙二醇化HDL粒子或聚乙二醇化HDL粒子注射到小鼠的尾靜脈中來評(píng)估聚乙二醇化HDL代謝回轉(zhuǎn)。結(jié)果表明所估算的半衰期與未聚乙二醇化HDL粒子相比增加約3倍。
[0150]此技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是聚乙二醇化HDL產(chǎn)物的純化比較簡(jiǎn)單并且有效。可以通過凝膠-過濾色譜法快速地純化聚乙二醇化HDL產(chǎn)物。
[0151]PCT公開案第W02010/141097號(hào)披露經(jīng)過純化的單聚乙二醇化apoA_I的半衰期增加、具有促膽固醇活性并且可以并入復(fù)原HDL粒子中。但是，證實(shí)經(jīng)過純化的多聚乙二醇KapoA-1具有與所需品質(zhì)相反的品質(zhì)。在測(cè)試時(shí)，多聚乙二醇化形式降低膽固醇從巨噬細(xì)胞中流出。因此，人類apoA-1的單聚乙二醇化形式是用于心血管和/或發(fā)炎疾病療法的人類apoA-1的更有效形式，這是因?yàn)閱尉垡叶蓟痑poA-1具有顯著更長(zhǎng)的半衰期并且保持其生物活性。但是，產(chǎn)生單聚乙二醇化apoA-1的效率是一種障礙，其中PCT公開案第2010/141097號(hào)中的方法產(chǎn)生不超過40%_50%單聚乙二醇化apoA_I。
[0152]因此，通過使HDL粒子中的一或多種蛋白質(zhì)單聚乙二醇化來使HDL粒子本身聚乙二醇化是一種提供意外積極成果的方法。使用本文中所述方法進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入HDL粒子中的約90%蛋白質(zhì)(其主要是apoA-1)變?yōu)閱尉垡叶蓟４送?，加入HDL粒子中的apoA-1未發(fā)生顯著多聚乙二醇 化。假設(shè)因?yàn)閍poA-1嵌入HDL粒子內(nèi)使apoA_I的N端可以用于單聚乙二醇化。因此，不僅聚乙二醇化方法更加特殊，而且本文中的方法更加有效。
[0153]此外，這種產(chǎn)生HDL粒子的方法無需使用膽汁鹽。這是一項(xiàng)重要特征，因?yàn)槟懼}可能在人類中引起不良健康影響。
[0154]總而言之，不希望受任何特定理論束縛，這些研究表明以下觀點(diǎn):使用人類HDL或復(fù)原HDL作為底物進(jìn)行的N端聚乙二醇化作用可以提高人類HDL蛋白質(zhì)(尤其HDL apoA-1)的目標(biāo)聚乙二醇化作用的效率。聚乙二醇化人類HDL促進(jìn)膽固醇從巨噬細(xì)胞中流出的效力與原生HDL相同，并且具有增加的活體內(nèi)半衰期。因此，人類HDL或rHDL中的apoA-Ι/磷脂復(fù)合物作為底物的目標(biāo)聚乙二醇化作用代表更優(yōu)良的方法，其可以提高用于心血管或發(fā)炎疾病的人類apoA-1或HDL介導(dǎo)的療法的功效。
[0155]實(shí)例5:檢杳rHDL相對(duì)PEP_rHDL對(duì)于活體內(nèi)動(dòng)脈粥樣化形成的作用
[0156]在三周期間內(nèi)向用高脂肪高膽固醇飲食喂養(yǎng)9周的ApoE+小鼠兩次注射生理食鹽水、40毫克/毫升HDL蛋白質(zhì)劑量的rHDL或PEG_rHDL (其在先前研究中在apoE+小鼠中展示rHDL對(duì)外周單核細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞計(jì)數(shù)的邊際作用)。接著，測(cè)定外周白細(xì)胞概況和動(dòng)脈粥樣化形成。與用生理食鹽水處理的小鼠相比，rHDL輸注未對(duì)外周總白細(xì)胞、單核細(xì)胞或嗜中性白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示顯著影響(圖7和圖8)，也不對(duì)正面主動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)域具有任何作用(圖9)。驚人的是，相同劑量的PEG-rHDL顯著降低總白細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖?和圖8)以及動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)域(圖9)。這些結(jié)果表明PEG-rHDL與rHDL相比可以更有效地降低動(dòng)脈粥樣硬化，與活體內(nèi)PEG-rHDL的半衰期延長(zhǎng)一致。
[0157]此項(xiàng)研究表明DPEG-HDL與HDL相比可以更有效地減緩動(dòng)脈粥樣硬化；2)PEG_HDL的使用劑量可以低于HDL，并且副作用降低而且治療效能增加；3)此可以轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)成本(rHDL制備中的主要因素)降低。
[0158]實(shí)例6:膽固醇從巨噬泡沫細(xì)胞中流出
[0159]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中將I毫克人類PEG-HDL注射到小鼠中并且與I毫克對(duì)照性HDL進(jìn)行比較。接著在第5小時(shí)和第24小時(shí)對(duì)血漿樣品進(jìn)行巨噬細(xì)胞膽固醇流出分析。發(fā)現(xiàn)根據(jù)本文中所述方法制造的PEG-HDL具有更優(yōu)良的提高血清膽固醇流出能力的能力(結(jié)果展示于圖10中)。對(duì)照性血清和原生HDL樣品引起類似程度的膽固醇流出。此觀測(cè)結(jié)果可在某種程度上由對(duì)照性血清含有殘余膽固醇(并且或許含有HDL)的事實(shí)解釋。
_0] 實(shí)例7:聚乙二醇化HDL粒子治療發(fā)炎性血管疾病
[0161]復(fù)合物和組合物可以用于多種疾病的預(yù)防性或治療性治療，包括(但不限于)心血管疾病(例如急性冠狀動(dòng)脈綜合癥(ACS、動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗塞)或例如糖尿病、中風(fēng)或心肌梗塞等易發(fā)展成ACS的疾病、病癥或病狀；高膽固醇血癥(例如血清膽固醇升高或LDL膽固醇升高)和由高密度脂蛋白(HDL)含量降低引起的低膽固醇血癥，例如丹吉爾病(Tangier disease)的癥狀。
[0162]復(fù)合物和組合物可以用于治療或預(yù)防血脂異常和/或?qū)嵸|(zhì)上任何與血脂異常相關(guān)聯(lián)的疾病、病狀和/或病癥。與血脂異常相關(guān)聯(lián)的疾病包括(但不限于)冠心病、冠狀動(dòng)脈病、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、心血管疾病、高血壓、再狹窄、血管或血管外周疾??；脂質(zhì)異常性病癥；異常脂蛋白血癥；低密度脂蛋白膽固醇含量過高；極低密度脂蛋白膽固醇含量過高；高密度脂蛋白含量過低；脂蛋白Lp (a)膽固醇含量過高；載脂蛋白B含量過高；；動(dòng)脈粥樣硬化(包括治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化)；高脂質(zhì)血癥；高膽固醇血癥；家族性高膽固醇血癥(FH);家族性組合型高脂質(zhì) 血癥(FCH);脂蛋白脂肪酶不足，例如高三酸甘油酯血癥、低α -脂蛋白血癥和脂蛋白高膽固醇血癥(hypercholesterolemialipoprotein)。
[0163]向罹患發(fā)炎性血管疾病的個(gè)體投予包含如本文中所述聚乙二醇化HDL粒子的組合物。投予組合物有效地治療個(gè)體。
[0164]向罹患動(dòng)脈粥樣化的個(gè)體投予包含如本文中所述聚乙二醇化HDL粒子的組合物。投予組合物有效地治療個(gè)體。
[0165]向罹患動(dòng)脈粥樣硬化的個(gè)體投予包含如本文中所述聚乙二醇化HDL粒子的組合物。投予組合物有效地治療個(gè)體。
[0166]向罹患動(dòng)脈粥樣硬化血栓性心血管疾病的個(gè)體投予包含如本文中所述聚乙二醇化HDL粒子的組合物。投予組合物有效地治療個(gè)體。
[0167]向罹患血脂異常的個(gè)體投予包含如本文中所述聚乙二醇化HDL粒子的組合物。投予組合物有效地治療個(gè)體。
[0168]向個(gè)體投予包含如本文中所述聚乙二醇化HDL粒子的組合物。投予組合物有效地提高個(gè)體中的血漿高密度脂蛋白含量。
[0169]向個(gè)體投予包含如本文中所述聚乙二醇化HDL粒子的組合物。投予組合物有效地促進(jìn)膽固醇從個(gè)體巨噬泡沫細(xì)胞中流出。
[0170]向個(gè)體投予包含如本文中所述聚乙二醇化HDL粒子的組合物。投予組合物有效地降低個(gè)體中的白細(xì)胞量。
[0171]向個(gè)體投予包含如本文中所述聚乙二醇化HDL粒子的組合物。投予組合物有效地降低個(gè)體中的動(dòng)脈粥樣硬化性病變。
[0172]實(shí)例8:聚乙二醇化HDL粒子作為與HDL結(jié)合的分子的遞送工具
[0173]聚乙二醇化HDL粒子可以用作將HDL結(jié)合物質(zhì)遞送到體內(nèi)的納米粒子。例如，卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT )可以在PEG-HDL上遞送并且受益于半衰期延長(zhǎng)。這可以作為人類LCAT不足的治療以便預(yù)防腎病，或用于治療動(dòng)脈粥樣硬化。此外，可以通過與PEG-HDL結(jié)合將野生型ApoL-1 (ApoL1-WT)與ApoLl的風(fēng)險(xiǎn)變異體一起遞送到個(gè)體以用于各種不同腎病。
[0174]如本文中所述的聚乙二醇化HDL粒子與LCAT酶結(jié)合。向罹患卵磷脂膽固醇LCAT不足的個(gè)體投予結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶并且投予結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶可以有效地提高個(gè)體中的LCAT含量或治療個(gè)體。此外，結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶與未結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶或結(jié)合到非聚乙二醇化HDL粒子的酶相比在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)。
[0175]如本文中所述的聚乙二醇化HDL粒子與LCAT酶結(jié)合。向罹患一種腎病或處于罹患一種腎病的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體投予結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶。投予結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶可以有效地治療個(gè)體、降低腎病風(fēng)險(xiǎn)或防止個(gè)體罹患腎病。此外，結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶與未結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶或結(jié)合到非聚乙二醇化HDL粒子的酶相比在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)。
[0176]如本文中所述的聚乙二醇化HDL粒子與LCAT酶結(jié)合。向罹患動(dòng)脈粥樣硬化的個(gè)體投予結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶并且投予結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶可以有效地治療個(gè)體。此外，結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶與未結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的酶或結(jié)合到非聚乙二醇化HDL粒子的酶相比在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)。
[0177]如本文中所述的聚乙二醇化HDL粒子與野生型ApoL-1 (ApoLl-WT)結(jié)合。向罹患一種與apoL-Ι的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)偶基因變異體相關(guān)聯(lián)的腎病的個(gè)體投予結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的ApoLl-WT并且投予結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的ApoLl-WT可以有效地治療個(gè)體或者降低或消除個(gè)體罹患所述腎病的風(fēng)險(xiǎn)。此外，結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的ApoLl-WT與未結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的ApoLl-WT或結(jié)合到非聚乙二醇化HDL粒子的ApoLl-WT相比在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)。
[0178]如本文中所述的聚乙二醇化HDL粒子與ApoLl-WT結(jié)合。向具有與一種腎病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的ApoLl的對(duì)偶基因變異體的個(gè)體投予結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的ApoLl-WT并且投予結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的ApoLl-WT可以有效地降低或消除個(gè)體罹患腎病的風(fēng)險(xiǎn)。此外，結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的ApoLl-WT與未結(jié)合到聚乙二醇化HDL粒子的ApoLl-WT或結(jié)合到非聚乙二醇化HDL粒子的ApoLl-WT相比在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)。
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【權(quán)利要求】
1.一種包含聚乙二醇化高密度脂蛋白(HDL)粒子的組合物，所述聚乙二醇化高密度脂蛋白粒子包含載脂蛋白A-1(ApoA-1),其中所述組合物中的至少50%所述ApoA-1是單聚乙二醇化 ApoA-1。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述組合物中至少90%所述ApoA-1是單聚乙二醇化 ApoA-1。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述組合物基本上不含多聚乙二醇化ApoA-10
4.如權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物基本上不含膽汁鹽。
5.如權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物中所述全部單聚乙二醇化ApoA-1中的至少70%經(jīng)過N端聚乙二醇化。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物中所述全部單聚乙二醇化ApoA-1中的約80%經(jīng)過N端聚乙二醇化。
7.如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述單聚乙二醇化ApoA-1包含與所述ApoA-1共價(jià)鍵結(jié)的聚乙二醇，所述聚乙二醇的分子量在19,000道爾頓(Dalton)與21,000道爾頓之間。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述聚乙二醇的分子量是約20，000道爾頓。
9.如權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述聚乙二醇化HDL粒子是聚乙二醇化重組型HDL粒子或聚乙二醇化突變型HDL粒子。
10.如權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述聚乙二醇化HDL粒子是聚乙二醇化復(fù)原HDL粒子。
11.如權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述聚乙二醇化HDL粒子是聚乙二醇化原生HDL粒子。
12.如權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的組合物,其中所述聚乙二醇化HDL粒子是聚乙二醇化人類HDL粒子。
13.—種包含聚乙二醇化高密度脂蛋白(HDL)粒子的組合物，所述聚乙二醇化高密度脂蛋白粒子包含聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其中所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)包括以下物質(zhì)中的至少一種:載脂蛋白A-1I (apoA-1I)、載脂蛋白A-1V (ApoA_IV)、載脂蛋白A-V (ApoA_V)、載脂蛋白 C-1 (ApoC-1)、載脂蛋白 C-1I (ApoC-1I)、載脂蛋白 C-1II (ApoC-1II)、載脂蛋白 D(ApoD)、載脂蛋白E (ApoE)、載脂蛋白F (ApoF)、載脂蛋白M (ApoM)、卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)(CETP)、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)(PLTP)、對(duì)氧磷酯酶、血小板活化因子酰基水解酶(PAF-AH)、凝聚素(apoj)、血清類淀粉蛋白A (SAA)和組織因子路徑抑制劑(TFPI)。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述組合物中至少50%所述蛋白質(zhì)是單聚乙二醇化蛋白質(zhì)。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述組合物中至少90%所述蛋白質(zhì)是單聚乙二醇化蛋白質(zhì)。
16.—種制備包含聚乙二醇化HDL粒子的組合物的方法，所述方法包含: Ca)混合HDL粒子與聚乙二醇來源以便形成混合物；(b)將所述來自步驟(a)的混合物在使得所述HDL粒子蛋白質(zhì)與聚乙二醇分子之間形成共價(jià)鍵的條件下培育；和 (c)從所述來自步驟(b)的產(chǎn)物中分離聚乙二醇化HDL粒子， 由此制備所述包含聚乙二醇化HDL粒子的組合物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述HDL粒子是重組型HDL粒子或突變型HDL粒子。
18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述HDL粒子是復(fù)原HDL粒子。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述HDL粒子是原生HDL粒子。
20.如權(quán)利要求16至19中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述HDL粒子是人類HDL粒子。
21.如權(quán)利要求16至20中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述聚乙二醇的分子量在19，000道爾頓與21，000道爾頓之間。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述聚乙二醇的分子量是約20，000道爾頓。
23.如權(quán)利要求16至22中任 一權(quán)利要求所述的方法，其中所述聚乙二醇來源是甲氧基聚(乙二醇)。
24.如權(quán)利要求16至23中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述聚乙二醇與HDL粒子的摩爾比率是2:1到10:1。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述聚乙二醇與HDL粒子的摩爾比率是約8:1。
26.如權(quán)利要求16至25中任一權(quán)利要求所述的方法，其中在步驟a)中，所述混合物中的HDL粒子濃度是1.25-12.5毫克/毫升。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中在步驟(a)中，所述混合物中的所述HDL粒子濃度是約5暈克/暈升。
28.如權(quán)利要求16至27中任一權(quán)利要求所述的方法，其中在步驟(b)中，將所述HDL和所述聚乙二醇來源培育2-48小時(shí)。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中在步驟(b)中，將所述HDL和所述聚乙二醇來源培育約20小時(shí)。
30.如權(quán)利要求16至29中任一權(quán)利要求所述的方法，其中在步驟(b)中，在2°C-37°C下培育所述HDL和所述聚乙二醇來源。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中在步驟(b)中，在4°C-6°C下培育所述HDL和所述聚乙二醇來源。
32.如權(quán)利要求16至31中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(b)更包含通過添加約IM甘氨酸來淬滅所述混合物的步驟。
33.如權(quán)利要求16至31中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(b)更包含通過添加甘氨酸使甘氨酸濃度達(dá)到5mM-75mM來淬滅所述混合物的步驟。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中將所述混合物淬滅到甘氨酸濃度達(dá)到約10mM。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中將所述混合物淬滅到甘氨酸濃度達(dá)到約50mM。
36.如權(quán)利要求16至35中任一權(quán)利要求所述的方法，其中在步驟(c)中，通過凝膠-過濾色譜法從所述步驟(b)的產(chǎn)物中分離所述聚乙二醇化HDL粒子。
37.如權(quán)利要求16至36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述方法是在不存在膽汁鹽的情況下進(jìn)行。
38.一種組合物，其是通過如權(quán)利要求16至37中任一權(quán)利要求所述的方法制備。
39.如權(quán)利要求38所述的組合物，其包含載脂蛋白A-1(ApoA-1)，其中所述組合物中的至少50%ApoA-1是單聚乙二醇化ApoA-1。
40.如權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述組合物中的至少90%所述ApoA-1是單聚乙二醇化 ApoA-1。
41.如權(quán)利要求38至40中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物基本上不含多聚乙二醇化ApoA-1。
42.如權(quán)利要求38至41中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物基本上不含膽汁鹽。
43.如權(quán)利要求38至42中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物中所述全部單聚乙二醇化ApoA-1中的至少70%經(jīng)過N端聚乙二醇化。
44.如權(quán)利要求43所述的組合物，其中所述組合物中所述全部單聚乙二醇化ApoA-1中的約80%經(jīng)過N端聚乙二醇化。
45.一種治療罹患發(fā)炎性血管疾病的個(gè)體的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效治療所述個(gè)體的如權(quán)利要求1至15和39至44中任一權(quán)利要求所述的組合物。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述發(fā)炎性血管疾病是動(dòng)脈粥樣化或動(dòng)脈粥樣硬化。`
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述發(fā)炎性血管疾病是動(dòng)脈粥樣硬化血栓性心血管疾病。
48.一種治療罹患血脂異常的個(gè)體的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效治療所述個(gè)體的如權(quán)利要求1至15和39至44中任一權(quán)利要求所述的組合物。
49.一種提高個(gè)體中血漿HDL含量的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效提高所述個(gè)體中血漿HDL含量的如權(quán)利要求1至15和39至44中任一權(quán)利要求所述的組合物。
50.一種促進(jìn)膽固醇從個(gè)體巨噬泡沫細(xì)胞中流出的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效促進(jìn)膽固醇從所述個(gè)體巨噬泡沫細(xì)胞中流出的如權(quán)利要求1至15和39至44中任一權(quán)利要求所述的組合物。
51.—種降低個(gè)體中白細(xì)胞量的方法，其包含投予個(gè)體一定量的有效降低所述個(gè)體中白細(xì)胞量的如權(quán)利要求1至15和39至44中任一權(quán)利要求所述的組合物。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述白細(xì)胞包括單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞或其兩者。
53.如權(quán)利要求1至15和39至44中任一權(quán)利要求所述的組合物，其是用于治療罹患發(fā)炎性血管疾病的個(gè)體。
54.如權(quán)利要求1至15和39至44中任一權(quán)利要求所述的組合物，其是用于治療罹患血脂異常的個(gè)體。
55.如權(quán)利要求1至15和39至44中任一權(quán)利要求所述的組合物，其是用于提高個(gè)體中的血漿高密度脂蛋白含量。
56.如權(quán)利要求1至15和39至44中任一權(quán)利要求所述的組合物,其是用于促進(jìn)膽固醇從個(gè)體巨噬泡沫細(xì)胞中流出。
57.如權(quán)利要求1至15和39至44中任一權(quán)利要求所述的組合物，其是用于降低個(gè)體中的白細(xì)胞量。
58.一種向個(gè)體投予化合物的方法，所述方法包含投予個(gè)體一定量的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的所述化合物的組合物，以便由此將所述化合物投予所述個(gè)體。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述化合物是卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述化合物是野生型ApoL-1(ApoL-1ffT)0
61.一種提高個(gè)體中LCAT量的方法，其包含投予所述個(gè)體一定量的有效提高個(gè)體中LCAT量的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物。
62.一種治療罹患動(dòng)脈粥樣硬化的個(gè)體的方法，其包含投予所述個(gè)體一定量的有效治療所述個(gè)體的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物。
63.一種治療罹患一種腎病或處于罹患一種腎病的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法，其包含投予所述個(gè)體一定量的有效治療所述個(gè)體或者降低或消除所述個(gè)體罹患所述腎病的風(fēng)險(xiǎn)的包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT或ApoL-1WT的組合物。
64.—種包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的化合物的組合物，其是用于將所述化合物投予個(gè)體。
65.一種包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物，其是用于提高個(gè)體中的LCAT 量。
66.一種包含與聚乙二 醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT的組合物，其是用于治療罹患動(dòng)脈粥樣硬化的個(gè)體。
67.一種包含與聚乙二醇化HDL粒子結(jié)合的LCAT或ApoL-1WT的組合物，其是用于治療罹患一種腎病的個(gè)體或者降低或消除所述個(gè)體罹患所述腎病的風(fēng)險(xiǎn)。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103458918SQ201280016074
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月25日
【發(fā)明者】艾倫·R·塔爾, 楠·王 申請(qǐng)人:紐約哥倫比亞大學(xué)理事會(huì)