Tfeb變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及組成型定位在真核細(xì)胞核內(nèi)的TFEB相關(guān)分子，如變體、突變體、截短蛋白、嵌合體等。這類分子在需要誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的所有疾病中具有治療應(yīng)用性，所述疾病例如溶酶體貯積癥、神經(jīng)變性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
【專利說明】TFEB變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組成型定位在真核細(xì)胞核內(nèi)的TFEB相關(guān)分子，如變體、突變體、截短蛋白、嵌合體等。這類分子在需要誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的所有疾病中具有治療應(yīng)用性，所述疾病例如溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
[0002]背景和現(xiàn)有技術(shù)
[0003]自體吞噬是一種分解代謝過程，依賴于自噬體和溶酶體這兩種不同類型細(xì)胞器的協(xié)同作用(I)。饑餓期間，細(xì)胞擴(kuò)張這兩種細(xì)胞區(qū)室(compartment)以促進(jìn)降解和再循環(huán)過程。
[0004]所述溶酶體維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)并調(diào)節(jié)多種生理過程，包含細(xì)胞清除、脂質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)、能量代謝、質(zhì)體膜修復(fù)、骨重塑和抵御病原體。所有這些過程需要溶酶體對(duì)環(huán)境信號(hào)的適應(yīng)性且動(dòng)態(tài)的反應(yīng)。確實(shí)，生理信號(hào)(例如衰老和饑餓)和病理病癥(包含溶酶體貯積癥(LSD)、神經(jīng)退行性疾病、損傷和感染)可以產(chǎn)生所述溶酶體的適應(yīng)性反應(yīng)(34、35、36)。
[0005]對(duì)調(diào)解溶酶體功能的機(jī)制和溶酶體適應(yīng)的基本機(jī)制的理解仍然處在初始階段。調(diào)解溶酶體生物發(fā)生的主要作用物是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子一TFEB (2)。已確定的TFEB轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)有參與底物降解的溶酶體水解酶，調(diào)解溶酶體與其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)相互作用的溶酶體膜蛋白，和參與溶酶體酸化的液泡H+-ATP酶(νΑΤΡ酶)復(fù)合物的組件(37，2)。
[0006]W02010/092112涉 及能增強(qiáng)作用于所謂清除元件(CLEAR element)上的細(xì)胞降解通路的分子；其中列有TFEB。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本 申請(qǐng)人:顯示了在饑餓期間，細(xì)胞活化能控制自體吞噬通路的主要步驟的轉(zhuǎn)錄程序，所述步驟包含自噬體形成、自噬體一溶酶體融合和底物降解。所述轉(zhuǎn)錄因子EB (TFEB)此前已鑒定為溶酶體生物發(fā)生的主要基因(2)，該轉(zhuǎn)錄因子通過驅(qū)動(dòng)自體吞噬和溶酶體基因的表達(dá)來調(diào)整這種轉(zhuǎn)錄程序。
[0008]本 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)TFEB的核定位和活性由特異性絲氨酸磷酸化來調(diào)節(jié)。與饑餓相似，基于藥理或基因突變對(duì)特異性磷酸化的抑制通過活化TFEB來誘導(dǎo)自體吞噬。這些數(shù)據(jù)公開了通過控制兩種協(xié)同細(xì)胞器的生物發(fā)生和合作而參與調(diào)節(jié)溶酶體一自體吞噬通路的一種新的激酶依賴性機(jī)制。
[0009]因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是組成型定位在真核細(xì)胞核內(nèi)的TFEB變體蛋白。本發(fā)明所述TFEB變體蛋白包含絲氨酸殘基的取代或改變以使其對(duì)磷酸化不敏感。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)識(shí)別能進(jìn)行除了酪氨酸以外的其他氨基酸取代以使所述TFEB變體對(duì)磷酸化不敏感。例如，絲氨酸殘基能取代為天然氨基酸，例如中性氨基酸如丙氨酸，或非天然氨基酸。組成型定位在真核細(xì)胞核內(nèi)的TFEB變體蛋白包含TFEB的突變體、截短蛋白、嵌合體。
[0010]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述TFEB變體蛋白由Seq.1d N0.2所含的氨基酸序列組成，并且其中絲氨酸殘基的取代在Seq.1d N0.2的SER142和/或SER211處。優(yōu)選Seq.1dN0.2所含的氨基酸序列是氨基酸117 —氨基酸166，并且絲氨酸殘基的取代是在Seq.1dN0.2的SER142處(Seq Id N0.4)。或者，所述氨基酸序列實(shí)質(zhì)上由Seq.1d N0.2組成，并且絲氨酸殘基的取代是在SER142和/或SER211處。在最優(yōu)選實(shí)施方式中，Seq.1d.N0.2的SER142和/或SER211處由ALA取代。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是供醫(yī)學(xué)應(yīng)用的上述TFEB變體蛋白的。
[0012]上述TFEB變體蛋白用于治療需要誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的疾病中具有優(yōu)勢(shì)，其優(yōu)選用于治療任意下列病變:溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
[0013]溶酶體貯積癥的示例有:激活因子缺乏癥/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、α _甘露糖苷貯積癥、天冬氨?；咸烟前纺?、膽固醇酯貯積病、慢性己糖胺酶A缺乏癥、胱氨酸貯積癥、Danon病、法布里病、法伯(Farber)病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖涎酸貯積癥、高歇(Gaucher)病(包含I型、II型和III型)、GMl神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病(包含嬰兒型、晚嬰型/少年型、成年型/慢性)、I細(xì)胞疾病/黏脂沉積癥II型、嬰兒游離唾液酸貯積病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏癥、Krabbe病(包含嬰兒發(fā)病、遲發(fā)性)、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、假性赫爾利多營(yíng)養(yǎng)障礙綜合征/黏脂沉積癥IIIA型、MPS I型賀勒綜合征、MPS I型施艾氏綜合征、MPS I型賀勒氏-施艾氏綜合征、MPS II型亨特綜合征、A型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIA型、B型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIB型、A型莫奎歐氏癥/MPS IVA型、B型莫奎歐氏癥/MPS IVB型、MPS IX型透明質(zhì)酸酶缺乏癥、尼曼-匹克氏(Niemann-Pick)病(包含A型、B型和C型)、神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病(包含CLN6病、非典型晚嬰型、遲發(fā)型變異、幼年(early juvenile)巴-斯-沃三氏(Baten-Spielmeyer-Vogt) / 少年型 NCL/CLN3病、芬蘭晚嬰型變異CLN5、詹-比二氏(Jansky-Bielschowsky)病/晚嬰型CLN2/TPP1病、Kufs/成年發(fā)病型NCL/CLN4病、北方癲癇/異晚嬰型CLN8和神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(Santavuor1-Haltia )/嬰兒型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷貯積癥、龐培氏病/11型糖原貯積病、致密性成骨不全癥、山霍夫氏病/成年發(fā)病型/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、嬰幼兒山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、青少年山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸貯積病、家族黑蒙性白癡(Tay-Sachs)/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、Wolman病、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥。
[0014]肝病的示例有:α I抗胰蛋白酶缺陷和脂肪肝病。
[0015]肌肉疾病的示例有:自體吞噬液泡肌病和過度自噬X連鎖肌病。
[0016]代謝疾病的示例有:高膽固醇血癥和脂肪肝病。
[0017]神經(jīng)退行性疾病的示例有:阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病和脊髓性小腦萎縮癥。
[0018]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是包含上述TFEB突變蛋白的編碼序列的核酸。優(yōu)選所述核酸包含Seq.1d N0.3的序列。
[0019]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是于適當(dāng)調(diào)節(jié)序列下包含上述核酸的表達(dá)載體。
[0020]本發(fā)明所述表達(dá)載體對(duì)用于基因治療是有利的。
[0021]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提高離體培養(yǎng)細(xì)胞中內(nèi)源或重組溶酶體酶的產(chǎn)量的方法，所述方法包含以下步驟:_將所述核酸或上述表達(dá)載體導(dǎo)入所述細(xì)胞，和-使所編碼的TFEB變體蛋白得以表達(dá)。[0022]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是通過給予對(duì)象以治療有效量的上述TFEB變體蛋白來治療疾病的方法，優(yōu)選當(dāng)所述疾病通過誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)得以緩解時(shí)。
[0023]更優(yōu)選所述疾病選自:溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。上文提供了這些疾病的示例。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1:TFEB誘導(dǎo)自體吞噬。(A)穩(wěn)定過量表達(dá)TFEB的HeLa細(xì)胞用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并且如圖示來處理。各實(shí)驗(yàn)分析大約100個(gè)細(xì)胞，均一式三份。圖顯示了 GFP陽(yáng)性囊泡的定量。(B-F)在TFEB-3xflag穩(wěn)定過量表達(dá)(+)和對(duì)照細(xì)胞(-)中LC3的Western印跡分析(B)。圖表示使用imagej軟件對(duì)三個(gè)獨(dú)立印跡分析LC3II表達(dá)(相對(duì)于肌動(dòng)蛋白)的定量；(C)血清和氨基酸饑餓(Starv) 了指定時(shí)間(h=小時(shí))的TFEB穩(wěn)定過量表達(dá)細(xì)胞，(D-F)從(D)正常培養(yǎng)基、(E)饑餓培養(yǎng)基或者(F)補(bǔ)充有巴伐洛霉素的饑餓培養(yǎng)基(4h;400nM)中培養(yǎng)的TFEB-RNAi和用亂序RNAi (對(duì)照(ctr))處理的對(duì)照細(xì)胞中分離的細(xì)胞裂解液。圖表示三個(gè)獨(dú)立印跡中LC3II表達(dá)(相對(duì)于肌動(dòng)蛋白)的定量，并且條帶強(qiáng)度使用imagej軟件分析定量。(G) TFEB mRNA水平通過qPCR分析，所用cDNA從轉(zhuǎn)染了靶定TFEB的3種不同siRNA寡核苷酸(寡核苷酸#1、#2、#3)或者亂序siRNA寡核苷酸(ctr)的細(xì)胞中制備。(H)用空(對(duì)照)或TFEB載體轉(zhuǎn)染的、穩(wěn)定表達(dá)GFP-mRFP-LC3的HeLa細(xì)胞固定的代表性共聚焦照片。最少計(jì)數(shù)2000個(gè)細(xì)胞，并且所述值表示獲自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的囊泡的平均數(shù)值(相對(duì)于對(duì)照，%)。AL(自噬溶酶體)=mRFP陽(yáng)性/GFP陰性囊泡；總體:mRFP陽(yáng)性囊泡。(所有誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。T檢驗(yàn)(未配對(duì))p值(*) <0.05, (**)〈0.01)
[0025]圖2:饑餓調(diào)節(jié)TFEB的核移位和活性。(A)散點(diǎn)圖顯示不同條件下培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞中51個(gè)自體吞噬相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平中倍數(shù)變化差異的對(duì)數(shù)值。X軸=對(duì)照組。Y軸=處理組。圓圈表示有增加(紅色)或降低(綠色)倍數(shù)變化的基因。如指示進(jìn)行比較。(B)染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析。柱狀圖顯示由qPCR試驗(yàn)測(cè)得的免疫沉淀的DNA的量。數(shù)值相對(duì)進(jìn)樣來標(biāo)準(zhǔn)化，并且以對(duì)`模擬對(duì)照的相對(duì)富集作圖。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式三份。(C)正常、饑餓和TFEB-siRNA饑餓細(xì)胞中TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)的qPCR分析。GAPDH和HPRT表示持家基因，而ATG10、ATG9A和ATG4D表示對(duì)照基因(非TFEB靶標(biāo)基因)。(D-F)穩(wěn)定過量表達(dá)TFEB的HeLa細(xì)胞保持不處理或者營(yíng)養(yǎng)饑餓4小時(shí)。(D)就TFEB核定位分析各包含50-100個(gè)細(xì)胞的5個(gè)區(qū)域。P值(*)=〈0.01。(E)細(xì)胞進(jìn)行核/胞質(zhì)分級(jí)分離，并用Flag抗體印跡。H3和微管蛋白分別用作核和胞質(zhì)的標(biāo)記。(F)核部分用Flag和H3(加樣對(duì)照)抗體印跡。(G)核提取物中Flag、微管蛋白和H3的Western印跡分析，所述核提取物從正常、饑餓和饑餓/正常培養(yǎng)基刺激I小時(shí)(正常)或者培養(yǎng)基刺激前用AP-2 (AKT抑制劑)、雷帕霉素(mTOR抑制劑)和UO126 (MEK抑制劑)預(yù)處理I小時(shí)的細(xì)胞中制備?？偺崛∥镉糜诖_證抑制劑的效率。(H)用組成型活性MEK(caMEK)質(zhì)?；蛴每蛰d體轉(zhuǎn)染的TFEBsiRNA或TFEB亂序?qū)φ占?xì)胞中溶酶體和自體吞噬基因的qPCR分析。如圖所示進(jìn)行饑餓。(所有誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。T檢驗(yàn)(未配對(duì))P值(*)〈0.05，(**)〈0.01)
[0026]圖3:絲氨酸磷酸化調(diào)節(jié)TFEB活性。(A)在表達(dá)突變形式TFEB_3xFlag的HeLa細(xì)胞中的TFEB亞細(xì)胞定位，用Flag抗體免疫染色。分析來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的各自包含50-100個(gè)細(xì)胞的5個(gè)區(qū)域。(B)對(duì)空、正常和突變TFEB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24小時(shí)TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)的qPCR分析。(C，D)蛋白提取物中LC3II(C)和Lampl (D)的Western印跡分析，蛋白提取物來自以等量空(pcDNA)、TFEB-3xFlag或TFEBS142A-3xFlag載體轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞。如圖所示加入巴伐洛霉素。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式三份，并且對(duì)肌動(dòng)蛋白水平來標(biāo)準(zhǔn)化蛋白水平的定量。(E)穩(wěn)定表達(dá)GFP-mRFP-LC3并用pcDNA、Tfeb或Ser-Tfeb轉(zhuǎn)染24小時(shí)的HeLa細(xì)胞中的自噬溶酶體分析(AL=RFP陽(yáng)性/GFP陰性)。如圖1H所述定量。(F)用抗Erk抗體對(duì)HeLa細(xì)胞的Western印跡分析，所述HeLa細(xì)胞用HA_Erk2和/或TFEB_3xFlag轉(zhuǎn)染、在全血清中維持或營(yíng)養(yǎng)饑餓中保持4小時(shí)，以及用抗Flag抗體免疫沉淀。裂解液用抗FLAG免疫沉淀，并且用抗Erk抗體印跡。(G)體外激酶試驗(yàn)。在ATP-Y32P以及TFEB蛋白的氨基酸120 - 170的肽(TFEB-S-142)或絲氨酸142被丙氨酸取代的相似肽(TFEB-A-142)存在下孵育重組激酶。以所述肽整合放射性的量來測(cè)量磷酸化效率(“磷酸化靈敏度”)。(H)過量表達(dá)TFEB的HeLa穩(wěn)定克隆用ERK1/2特異性siRNA寡核苷酸或者對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染。48h后，細(xì)胞在不處理、血清饑餓或者血清和氨基酸(a.a.)饑餓下保持4小時(shí)，收集并進(jìn)行核分離和Flag免疫印跡。總裂解液用ERK抗體探測(cè)。所有誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值(*)=〈0.05。
[0027]圖4:TFEB介導(dǎo)的自體吞噬誘導(dǎo)的體內(nèi)分析。(A)在進(jìn)食、16小時(shí)禁食和24小時(shí)禁食的小鼠中GFP陽(yáng)性囊泡的免疫熒光分析。圖中顯示囊泡的定量。(B)來自進(jìn)食和禁食動(dòng)物的肝樣品中TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)的qPCR分析(n=3;誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值(*)〈0.05)。Gapdh和Hprt用作參比基因。(C，D)在用AAV2/9Tcfeb_HA感染并且處死前禁食16小時(shí)的2月齡野生型小鼠中TFEB亞細(xì)胞定位的分析。(C) HA免疫熒光分析。圖顯示了核HA信號(hào)的定量。對(duì)各個(gè)肝計(jì)數(shù)100個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。n=3只小鼠/組。*=〈0.001。(D)在進(jìn)行核分級(jí)分離的肝樣品中的HA、微管蛋白和H3的Western印跡分析。總的肝裂解液用HA抗體探測(cè)以確證進(jìn)食和禁食動(dòng)物中相似的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。(E)注射有AAV2/9Tcfeb-HA的小鼠的肝提取物中LC3、肌動(dòng)蛋白、P-ERK1/2和ERK1/2的Western印跡分析。(F)來自2月齡GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠的凍存肝切片中GFP Western印跡分析和DAPI染色，所述轉(zhuǎn)基因小鼠注射有AAV-Tcfeb-HA或鹽水溶液(對(duì)照組)，并且在處死前自由進(jìn)食或禁食24小時(shí)。圖中顯示了 GFP陽(yáng)性囊泡的定量。(G)分離自條件型Tc feb-3xFLAG轉(zhuǎn)基因小鼠(Tcfeb-3Xflag; AlbCRE)的肝樣品中自體吞噬和溶酶體TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)的qPCR分析，其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)由肝特異性CRE重組酶(即白蛋白-CRE)驅(qū)動(dòng)。(H)來自 Alb-CRE、Tcfeb-3xFlag 和 Tcfeb_3xFlag; Alb-CRE 小鼠的肝蛋白提取物中LC3和肌動(dòng)蛋白的Western印跡分析。
[0028]圖5 =TFEB瞬時(shí)過量表達(dá)誘導(dǎo)自體吞噬。(A)HeLa細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有編碼帶flag標(biāo)簽的TFEB蛋白的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞收集、裂解，并且對(duì)IOmg蛋白樣品分析LC3、Flag和肌動(dòng)蛋白免疫反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式三份，并且使用imagej軟件分析定量條帶強(qiáng)度。(誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值(*)〈0.05) (B)C0S-7細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有空載體或TFEB-3xFlag載體。24小時(shí)后，細(xì)胞用溶酶體抑制劑(抑胃酶肽/E64，lOyg/ml，西格瑪公司(SIGMA))處理4小時(shí)。10 μ g細(xì)胞裂解液用于LC3和肌動(dòng)蛋白免疫印跡。
[0029]圖6:在TcFEB過量表達(dá)型MEF中誘導(dǎo)自體吞噬。(A，B)用表達(dá)TcFEB的慢病毒感染的MEF和對(duì)照細(xì)胞的電子顯微圖。(a)TcFEB表達(dá)后觀察到的自體吞噬結(jié)構(gòu)，其包含自噬體(AV)和自噬溶酶體(AL)。(B)早期自噬體的形成。電子密集細(xì)胞質(zhì)材料周圍的膜分離(箭頭)。(C)自體吞噬結(jié)構(gòu)(AV和AL)數(shù)目和⑶早期自噬體數(shù)目的定量。至少分析30個(gè)細(xì)胞/組。誤差線表示SEM; P值(*)<0.05;(林*)〈0.0001。[0030]圖1:TFEB促進(jìn)自噬體形成。(A)對(duì)照和穩(wěn)定過量表達(dá)TFEB的細(xì)胞用巴伐洛霉素(baf;12小時(shí)400nM)處理，收集并且用于LC3I1、Flag和肌動(dòng)蛋白免疫印跡。(B)對(duì)照和穩(wěn)定過量表達(dá)TFEB的細(xì)胞保持不處理或用10 μ g/ml溶酶體抑制劑抑胃酶肽/E64處理4小時(shí)，裂解并且用于LC3、Flag和肌動(dòng)蛋白免疫印跡。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式三份，并且使用imagej軟件分析定量帶強(qiáng)度。(誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值(*)〈0.05)
[0031]圖8 =TFEB增強(qiáng)溶酶體蛋白水解。在正常或饑餓條件下，TFEB過量表達(dá)、TFEB枯竭和對(duì)照細(xì)胞中長(zhǎng)壽命蛋白降解的速率。如圖所示加入3-甲基腺嘌呤(3MA)。(誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值(*)〈0.05)
[0032]圖9:自體吞噬基因亞組的啟動(dòng)子區(qū)域中TFEB推定的結(jié)合元件的分布。數(shù)字指示結(jié)合元件距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的距離。
[0033]圖10:饑餓增強(qiáng)TFEB活性。螢光素酶報(bào)導(dǎo)試驗(yàn)使用載有四個(gè)TFEB結(jié)合位點(diǎn)串聯(lián)拷貝的構(gòu)建物。正常和TFEB過量表達(dá)的HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染有含TFEB結(jié)合位點(diǎn)的人工啟動(dòng)子。在饑餓條件下培養(yǎng)時(shí)，兩種細(xì)胞類型都顯示增強(qiáng)的反式激活潛能。(誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差ρ(*)〈0.05)
[0034]圖11:饑餓通過MAPK誘導(dǎo)TFEB的核移位。(A)饑餓誘導(dǎo)胞質(zhì)TFEB遷移率改變和核移位。正常培養(yǎng)基；饑餓培養(yǎng)基(4小時(shí))；饑餓+正常，表示細(xì)胞在饑餓培養(yǎng)基中培養(yǎng)(4小時(shí))，再補(bǔ)充正常培養(yǎng)基培養(yǎng)I小時(shí)然后收集。胞質(zhì)和核部分用于Flag免疫印跡。(B)如圖2G所示處理的HeLa細(xì)胞中通過免疫熒光分析TFEB細(xì)胞定位。圖顯示呈現(xiàn)TFEB核定位的細(xì)胞的百分比。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值(*)=〈0.05。
[0035]圖12 =TFEB 核移位依賴于 S142 磷酸化。(A)表達(dá) TFEB_3xFlag、S142A_3xFlag、S332-3xFlag或S423_3xFlag蛋白的HeLa細(xì)胞用于核蛋白分離。等量的核蛋白用麗春紅染色確證。(B)在正常和饑餓條件下，表達(dá)TFEB-3xFlag、S142A_3xFlag和S142D_3xFlag蛋白的HeLa細(xì)胞用于核蛋白分離。(C)從表達(dá)TFEB_3xFlag和TFEB_S142A_3xFlag的HeLa細(xì)胞分離的胞質(zhì)蛋白的Flag免疫印跡顯示在正常培養(yǎng)基中S142A以相比野生型(WT)TFEB較低分子量的條帶遷移，而在饑餓條件下這種變化不再明顯。(D)從表達(dá)TFEB-3xFlag、S142A-3xFlag和S142D_3xFlag的受饑餓HeLa細(xì)胞分離的胞質(zhì)蛋白的Flag免疫印跡顯示TFEB-S142D的變化減弱。
[0036]圖13:S142A TFEB突變顯示活性增強(qiáng)。穩(wěn)定過量表達(dá)GFP-LC3的HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染以等量的空、TFEB-3xFlag或S142A-TFEB_3xFlag質(zhì)粒，并且定量自噬體數(shù)。各點(diǎn)分析至少10個(gè)區(qū)域(包含4-10細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式三份。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。P值(*)〈0.05。
[0037]圖14:與TFEB旁系同源物(paralogue)、MITF和相關(guān)TFEB有關(guān)家族成員的TFEB-人(human ) S142磷酸化位點(diǎn)的多序列比對(duì)。通過對(duì)ExPASy蛋白組學(xué)服務(wù)器上的UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST檢索(2.2.17)鑒定出TFEB_human同源物。 申請(qǐng)人:去除帶有關(guān)鍵詞“推定”、“未鑒定”和“cDNA”的記錄以及沒有基因名稱的記錄。下一步，發(fā)明人用ClustalW(1.82)比對(duì)剩余的同源物。由Seaview生成多個(gè)序列的比對(duì)。圖僅顯示TFEB_HUMAN序列中長(zhǎng)20個(gè)氨基酸的片段與來自TFEB、MITF、TCFEB、TFE3和TCFE3家族的其他蛋白的比對(duì)。“sp”表不SwissProt條目，而“tr”表不Tremble條目。P19484是UniProrKB登錄代碼。TFEB_HUMAN分別表示基因名稱和物種名稱。
[0038]圖15:體內(nèi)TcFEB過量表達(dá)的策略。㈧用抗HA抗體免疫染色的凍存肝切片的代表性圖片(以確證病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率)。(B)來自Tcfeb-HA注射小鼠和對(duì)照小鼠的肝蛋白提取物用HA和肌動(dòng)蛋白抗體免疫印跡。(C)生成TcFEB條件型過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠系。頂部顯示CRE重組酶之前和之后的轉(zhuǎn)基因載體圖。左側(cè)顯示同窩幼畜的代表性基因型，而右側(cè)顯示小鼠n4中相應(yīng)的肝特異性TFEB過量表達(dá)。
[0039]圖16 =TFEB過量表達(dá)增加MEF、NSC、HeLa和C0S-7細(xì)胞的培養(yǎng)基中溶酶體酶的釋放。在培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染有空載體或TFEB表達(dá)載體的細(xì)胞中測(cè)定溶酶體酶酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和β_己糖胺酶的活性。根據(jù)生產(chǎn)商方案，使用PolyFect轉(zhuǎn)染試劑(凱杰公司(Qiagen))或 Lipofectamine2OOO 試劑(英杰公司(Invitrogen))轉(zhuǎn)染 HeLa、Cos7 細(xì)胞和來自小鼠模型MLIV (S7)、MPSIIIA (S7)和MSD的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。TFEB_3xFLAG HeLa穩(wěn)定細(xì)胞系(CF7)已有描述(2)。圖顯示釋放的酶活性相較總活性的百分比。
[0040]圖17:TFEB正向控制溶酶體的胞吐。MPSIIIA MEF細(xì)胞維持在補(bǔ)充有10%FBS和青霉素/鏈霉素(正常培養(yǎng)基)的DMEM中。根據(jù)生產(chǎn)商方法，亞融合細(xì)胞使用Lipofectamine?2000(英杰公司)轉(zhuǎn)染。使用編碼帶標(biāo)簽硫酸胺酶(SGSH3XFlag)的質(zhì)粒和空質(zhì)粒或編碼TFEB的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MPS-1IIA MEF0轉(zhuǎn)染后一天，培養(yǎng)基置換為DMEM0.5%FBS。轉(zhuǎn)染后兩天，收集條件培養(yǎng)基和球團(tuán)用于硫酸胺酶活性測(cè)量，并且計(jì)算酶釋放到培養(yǎng)基中的百分比。
[0041]圖18:溶酶體應(yīng)激誘導(dǎo)TFEB核移位。免疫印跡:經(jīng)氯喹(CQ)或水楊酰胺A(Salicylihalamide A, SalA)處理的表達(dá)TFEB - 3 x Flag的HeLa細(xì)胞中提取的蛋白用于核/胞質(zhì)分級(jí)分離并用FLAG抗體印跡以檢測(cè)TFEB。組蛋白3 (H3)和微管蛋白分別用作核和胞質(zhì)的標(biāo)記。印跡是三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的代表。
[0042]圖19:mT0RCl調(diào)節(jié)TFEB。⑷溶酶體應(yīng)激抑制mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。如圖示，處理過夜的HeLa細(xì)胞中分離的蛋白提取物的免疫印跡。膜用p-T202/Y204_ERKl/2、ERK1/2、P-T389-S6K和S6K的抗體探測(cè)以測(cè)量ERK和mTORCl活性。(B) Torinl誘導(dǎo)TFEB去磷酸化和核移位。從經(jīng)無氨基酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且如圖示后續(xù)刺激至少3小時(shí)的TFEB-3 X FLAGHeLa細(xì)胞分離的胞質(zhì)和核部分的FLAG免疫印跡。用H3和微管蛋白抗體確證正確的亞細(xì)胞分級(jí)分離。(C，D) ERK和mTOR抑制劑對(duì)TFEB核移位的影響和劑量反應(yīng)曲線。TFEB - GFPHeLa細(xì)胞接種入384孔板，培養(yǎng)12小時(shí)，并用2.54ηΜ_50 μ M范圍內(nèi)10種不同濃度的ERK抑制劑U0126或mTOR抑制劑雷帕霉素、Torinl和Torin2處理。37°C下在包含各個(gè)化合物的RPMI培養(yǎng)基中保持3小時(shí)后，細(xì)胞洗滌、固定，再用DAPI染色，并用共聚焦自動(dòng)顯微鏡(Opera高內(nèi)涵系統(tǒng),帕金埃爾默公司(Perkin Elmer))照相。(C)各化合物測(cè)試濃度的代表性圖片。比例尺代表30 μ m。(D)圖顯示各化合物的10個(gè)不同濃度(以濃度的對(duì)數(shù)顯示)下核移位的百分比。使用Prism軟件計(jì)算各化合物的EC50(詳見材料和方法)。(E)氨基酸誘導(dǎo)TFEB分子量變化。從HEK-293T細(xì)胞分離的蛋白提取物的免疫印跡，所述HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染有TFEB-3XFLAG或空載體，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)饑餓和用氨基酸(a.a.)刺激50分鐘。所用抗體是p-T389-S6K、S6K和FLAG。(F) Rag敲減誘導(dǎo)TFEB核移位。穩(wěn)定表達(dá)Flag - 3 x TFEB的HeLa細(xì)胞用編碼短發(fā)夾(Sh_) RNA的慢病毒感染，所編碼的Sh-RNA靶定螢光素酶(對(duì)照)或者RagC和RagD mRNA。轉(zhuǎn)染96h后，細(xì)胞保持不處理(N=正常培養(yǎng)基)、饑餓(S=饑餓培養(yǎng)基)或者用Torinl (T=Torinl)處理4小時(shí),然后用于核/胞質(zhì)分級(jí)分離。用FLAG抗體檢測(cè)TFEB定位，而微管蛋白和H3分別用作胞質(zhì)和核部分的對(duì)照；S6K磷酸化水平用于檢測(cè)RagC和RagD敲減效率。(G)mT0RC2不影響TFEB磷酸化。從Sinl-/-或?qū)φ张咛?E14.5)分離的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)用編碼TFEB - 3 x FLAG的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染；感染后48小時(shí)，細(xì)胞如圖示用Torinl(T)處理4小時(shí)，用于核/胞質(zhì)分級(jí)分離并且用FLAG、微管蛋白和H3免疫印跡。
[0043]圖20:mT0RCl在絲氨酸142 (S142)處磷酸化TFEB。(A) Torinl誘導(dǎo)S142去磷酸化。如圖示處理HeLa細(xì)胞，并將總提取物和核提取物用TFEB p_S142磷酸化抗體和抗FLAG抗體探測(cè)。(B) TFEB蛋白結(jié)構(gòu)示意圖顯示預(yù)測(cè)的mTORCl磷酸化位點(diǎn)和它們?cè)诩棺祫?dòng)物中的保守性。根據(jù)人同種型I編號(hào)。(C)所述磷酸化位點(diǎn)的序列保守性評(píng)分，以及mTOR共有基序和TFEB磷酸化位點(diǎn)附近序列之間的定量一致性。⑶S142和S211調(diào)節(jié)TFEB定位。表達(dá)絲氨酸-向-丙氨酸突變形式TFEB - 3 X Flag的HeLa細(xì)胞中TFEB亞細(xì)胞定位的Flag免疫染色。核用DAPI進(jìn)行染色。數(shù)值是包含至少50個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的五個(gè)區(qū)域的平均。學(xué)生t檢驗(yàn)(未配對(duì))*#Ρ〈(λ 001。比例尺代表30 μ m。
[0044]圖21:溶酶體通過TFEB調(diào)芐基因表達(dá)。(A)氯奎處理抑制原代肝細(xì)胞中mTORCl的活性。從 2 月齡 Tcfebflox/flox (對(duì)照)和 Tcfebflox/flox; Alb-Cre (Tcfeb-/-)小鼠分離的原代肝細(xì)胞保持不處理或用Torinl、U0126或氯奎處理過夜。隨后，細(xì)胞裂解，并且蛋白提取物用圖示抗體免疫印跡。(B，C)TFEB調(diào)節(jié)對(duì)氯奎和Torinl的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。來自對(duì)照(flox/flox)和Tcfeb-/-(flox/f1x;alb-Cre)小鼠的原代肝細(xì)胞中TFEB祀標(biāo)基因的定量PCR(qPCR)。細(xì)胞用氯奎(左)和Torinl(右)處理。表達(dá)水平顯示為所述經(jīng)處理對(duì)比相應(yīng)未處理樣品的表達(dá)增加％。數(shù)值表示三個(gè)獨(dú)立的肝細(xì)胞制備(三只小鼠/基因型)的平均值土 s.d。學(xué)生t檢驗(yàn)(雙尾)*P值< 0.05。
[0045]材料和方法
[0046]細(xì)胞培養(yǎng)、培養(yǎng)基、藥物和細(xì)胞處理HeLa和COS以及HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC。細(xì)胞在下列培養(yǎng)基中培養(yǎng):(正常)補(bǔ)充有10%FBS的DMEM高葡萄糖；(饑餓)補(bǔ)充有IOmMHEPES、有Ca和Mg的HBSS培養(yǎng)基；(血清)補(bǔ)充有20%FBS的EBSS ；(氨基酸培養(yǎng)基)無葡萄糖和無血清DMEM ;藥物處理:雷帕霉素(2.5mg/ml，西格瑪公司(SIGMA)) 2_4小時(shí)，除非另有說明；巴伐洛霉素(400nM，西格瑪公司)2-4小時(shí)；胰島素(100ng/ml西格瑪公司)2 小時(shí)；EGF、FGF(BD 生物科學(xué)公司(BD biosciences)) ；LIF(100ng/ml;ESGR0,密理博公司(Millipore)) 2 小時(shí)；ΡΜΑ(1 μ g/ml) 2 小時(shí)。U0126 (MEKi)于 25mM(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司(Cell Signaling))使用，API2 (AKT抑制劑)于ImM使用。溶酶體抑制劑是抑胃酶肽和E64(10mg/ml4小時(shí)西格瑪公司)。在圖18_2的實(shí)驗(yàn)中使用下列藥物:西格瑪公司的雷帕霉素(2.5 μ M5 μ M,除非另有說明);TOCRIS公司的Torinl (250nM250nM，除非另有說明)；細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(Cell Signaling technology)的 U0126 (50 μ M50 μ Μ);西格瑪公司的氯奎(100 μ M 100 μ M) Jeff De Brabander (德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心(UTSouthwestern))友情饋贈(zèng)的水楊酰胺A (2 μ M2 μ M)。
[0047]如下述生成原代肝細(xì)胞:2月齡小鼠用阿佛丁(240mg/kg)深度麻醉，并首先用補(bǔ)充有IOmM HEPES和0.5mM EGTA的25ml HBSS(西格瑪公司H6648)的灌注，然后用包含100U/ml膠原酶(Wako公司)和0.05mg/ml胰蛋白酶抑制劑(西格瑪公司)的相似溶液灌注。肝在皮氏培養(yǎng)皿中分離，細(xì)胞球團(tuán)在HBSS中洗滌，并且以濃度5x10s細(xì)胞/35mm涂板，并在補(bǔ)充有10%FBS、2mM谷胺酰胺、0.1mM胰島素、0.1mM地塞米松和青霉素/鏈霉素的威廉姆斯E培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第二天，如本文所述處理細(xì)胞。Sinl-/-和對(duì)照MEF如原先所述(46)生成，并且維持在補(bǔ)充有10%FBS、谷胺酰胺和青霉素/鏈霉素的DMEM中。
[0048]生成Tcfebflrai小鼠系
[0049] 申請(qǐng)人:使用公共可得的胚胎干細(xì)胞(ES)克隆(http://www.eucomm.0rg/),其中通過同源重組靶定Tcfeb外顯子4和5處。重組ES細(xì)胞克隆注射入胚泡中，胚泡用于生成載有工程改造等位基因的小鼠系。肝特異性KO通過雜交Flox/Flox小鼠與在白蛋白啟動(dòng)子下表達(dá)CRE的轉(zhuǎn)基因系(ALB-CRE)而生成，所述轉(zhuǎn)基因系獲自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Jacksonlaboratory)。所有涉及小鼠的方法得到貝勒醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。[0050]轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒和siRNA
[0051]質(zhì)粒和siRNA都用Lipofectamine LTX(英杰公司)利用反向轉(zhuǎn)染方法來轉(zhuǎn)染。經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞于48或72小時(shí)后收集。siRNA TFEB在50nM(達(dá)馬可公司(Dharmacon))下使用，siRNA ERKI/2在IOOnM(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司)下使用。
[0052]根據(jù)生產(chǎn)商方法使用Lipof ectamine2000或LTX (英杰公司)，用DNA質(zhì)粒pRK5-mycPATl、pCEP4-TFEB-his、pClG2-TFEB 和 p3 x FLAG-CMVTFEB 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。定位突變根據(jù)生產(chǎn)商(司查塔基公司(Stratagene))指示進(jìn)行,通過測(cè)序證實(shí)正確的突變。
[0053]Western 印跡
[0054]細(xì)胞或組織溶解在補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑(羅氏公司(ROCHE))和磷酸酶抑制劑(西格瑪公司)的RIPA緩沖液中。加載10-30微克到4-12%Bis-Tris凝膠(NUPAGE，英杰公司)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并且使用ECL方法(皮爾斯公司(Pierce))通過western印跡分析。使用以下抗體:LC3(諾復(fù)斯生物制品公司)、FLAG、b-肌動(dòng)蛋白、微管蛋白(西格瑪公司)、HA (科文斯公司(Covance))、H3、ERKl/2、p-ERKl/2、p-AKT、p-70S6K (細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司)、ERK2(圣克魯茲公司(Santa Cruz))。蛋白水平使用ImageJ軟件分析定量。
[0055]核/胞質(zhì)分級(jí)分離
[0056]細(xì)胞以50%融合接種入6孔板，并且血清饑餓過夜(ON)。第二天在DMSO或激酶抑制劑存在下加入正常培養(yǎng)基。如原先所報(bào)導(dǎo)進(jìn)行亞細(xì)胞分級(jí)分離。簡(jiǎn)單說，細(xì)胞在0.5曲通 X-100 裂解緩沖液(50mM Tris-HCl.0.5% 曲通、137.5mM NaCl、10% 甘油、5mM EDTA，補(bǔ)充有新鮮蛋白酶和磷酸酶抑制劑)中裂解。上清液代表胞質(zhì)部分，而核球團(tuán)洗滌兩次，并在0.5曲通X-100緩沖液0.5%SDS中裂解并超聲處理。
[0057]長(zhǎng)壽命蛋白的降解
[0058]亞融合細(xì)胞用L-U14C-絲氨酸培養(yǎng)20小時(shí)，并且用冷培養(yǎng)基追蹤I小時(shí)以降解短壽命蛋白。隨后細(xì)胞用正常培養(yǎng)基或饑餓培養(yǎng)基(最終存在3-MA)培養(yǎng)4小時(shí)。長(zhǎng)壽命蛋白的降解速率用培養(yǎng)基中的溶解放射性與可酸性沉淀的細(xì)胞球團(tuán)中的不溶放射性的比率來計(jì)算。
[0059]RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、ChIP和定量PCR
[0060]使用TRIzol (英杰公司)從組織中提取或者使用RNAesy柱(凱杰公司)從細(xì)胞中提取總RNA。使用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。溶酶體和自體吞噬基因特異性引物此前已報(bào)導(dǎo)2。自體吞噬基因引物和小鼠引物購(gòu)自SA生物科學(xué)公司(SABiosciences)。倍數(shù)變化使用SA生物科學(xué)公司的在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站(http://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php)計(jì)算，該網(wǎng)站使用 DDCt 方法。簡(jiǎn)單說，最穩(wěn)定的持家基因(GAPDH、ACTB, B2M、RPL13A、HPRT和親環(huán)素)的平均用作“標(biāo)準(zhǔn)化”基因以計(jì)算DCt值。然后，計(jì)算“對(duì)照”組和“實(shí)驗(yàn)”組之間的DDCt值。最后，使用2(_DDet)計(jì)算倍數(shù)變化。將生物學(xué)重復(fù)分組以計(jì)算倍數(shù)變化值。用未配對(duì)T檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖中星號(hào)指示P值〈0.05。
[0061]蛋白激酶預(yù)測(cè)
[0062] 申請(qǐng)人:使用T 五種方法，包括 CrPhos0.8、GPS-2.1、PhosphoMotifFinder>Networkin和PH0SIDA，采用默認(rèn)參數(shù)(15-19)。根據(jù)其置信評(píng)分，進(jìn)一步過濾CrPhos0.8和GPS-2.1預(yù)測(cè)。對(duì)前者而言，用假陽(yáng)性率(FPR)等于或小于30%來考慮預(yù)測(cè)。對(duì)后者而言，用評(píng)分等于或大于5來考慮預(yù)測(cè)。計(jì)算GPS-2.1評(píng)分為實(shí)際評(píng)分和臨界值之間的差異。從其他三種方法中取所有預(yù)測(cè)。Networkin的情形中，結(jié)合Networkin和Networkin2的預(yù)測(cè)。各方法描述了在不同激酶分類中與S142位點(diǎn)相關(guān)的激酶，所述分類簡(jiǎn)單涉及四種層次水平:激酶組、激酶家族、激酶亞族和激酶本身。為獲得各層次等級(jí)的一般共性，如果所述預(yù)測(cè)尚未以這四種層次等級(jí)的方式分類，那么我們將各預(yù)測(cè)按這四種層次等級(jí)分類。在http://kinase, org/kinbase數(shù)據(jù)庫(kù)的脊椎動(dòng)物進(jìn)化支和人物種下檢索缺失分類。根據(jù)各分類中的主要得票發(fā)現(xiàn)各分類的共性。
[0063]體外激酶實(shí)驗(yàn)
[0064]TFEB-S-142:Seq Id N0.2 的氨基酸(aa.) 117-166:
[0065]PPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPNSPMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMR
[0066]和TFEB-A_142:Seq Id N0.4，對(duì)應(yīng) Seq Id N0.2 的氨基酸 117-166，其中 Ser142Ala (粗體):
[0067]PPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPN A PMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMR
[0068]其由GENESCRIPT 公司合成。所述測(cè)試肽 TFEB-A-142 和 TFEB-S-142 在 50mMHEPES pH7中制成ImM?？磥頉]有溶解問題。使用密理博公司的標(biāo)準(zhǔn)放射性測(cè)量試驗(yàn)，所述激酶試驗(yàn)在室溫下以200 μ M ATP和100 μ M各個(gè)肽進(jìn)行40分鐘。所有蛋白激酶在其標(biāo)準(zhǔn)KinaseProf iler?試驗(yàn)濃度下使用。孵育之后，所有試驗(yàn)通過加酸來終止，并取等分樣品點(diǎn)樣在P30和Filtermat A上以分離產(chǎn)物。所有測(cè)試進(jìn)行一式三份，并且包括各蛋白激酶的常見底物作為對(duì)照。
[0069]體內(nèi)基因遞送
[0070]小鼠飼養(yǎng)在貝勒醫(yī)學(xué)院的轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)室中(美國(guó)德克薩斯州休斯頓)。GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠是N.Mizushima的友情饋贈(zèng)。除非另有說明，使用C57B6雌性小鼠(4周齡)。所述AAV載體由TIGEM AAV載體中心實(shí)驗(yàn)室生成。簡(jiǎn)單說，通過取代GFP序列而把小鼠TFEB (TcFEB)編碼序列克隆到pAAV2.1-CMV-GFP質(zhì)粒中并與HA標(biāo)簽一同并入框架中。然后將所得的PAAV2.1-CMV-TcFEB-HA與pAd-Helper和pack2/9包被質(zhì)粒三重轉(zhuǎn)染入亞融合293細(xì)胞內(nèi)。重組AAV2/9載體通過兩輪CsCl純化。表達(dá)為基因組拷貝數(shù)(GC/mL)的載體滴度通過使用TaqMan(馬薩諸塞州沃森姆的帕金埃爾默公司，生命和分析科學(xué))PCR定量和點(diǎn)印跡分析來估算。各小鼠眼窩竇后注射1.25χ10η病毒顆粒，并在3周后處死。分析基因表達(dá)時(shí)，饑餓小鼠已缺食16小時(shí)，或者分析GFP-LC3點(diǎn)數(shù)目時(shí)，已缺食24小時(shí)。
[0071]組織學(xué)和免疫熒光
[0072]收集肝樣品， 并且在含4%多聚甲醛的PBS中固定過夜。在含10和30%蔗糖的PBS中冷凍保護(hù)后，樣品在OCT(加利福尼亞州托蘭斯SF公司(Sakura Finetech))中冷凍，并且切片成30 μ m厚度。在Axioplan2 (紐約州桑伍德的蔡司公司(Zeiss))上照相。對(duì)免疫熒光而言，切片在含2.5%BSA的PBS+0.1%曲通X-100中室溫封閉2小時(shí)。封閉后，樣品用一抗孵育20小時(shí)，并在PBS+0.05%TX-100中洗滌三次后，用偶聯(lián)有Alexafluor488或Alexaf luor555 (英杰公司)的二抗孵育3小時(shí)。對(duì)HA的免疫組織化學(xué)分析，使用親和素-生物素復(fù)合物(ABC)方法(Vectastain Elite ABC試劑盒)?？笹FP來自阿柏堪穆公司(Abcam);(稀釋 1:500)。
[0073]電子顯微術(shù)
[0074]對(duì)照和TFEB過量表達(dá)細(xì)胞用PBS洗滌，并且在溶解有1%戊二醛的0.2M Hepes緩沖液(PH7.4)中室溫固定30分鐘。細(xì)胞然后在0s04中再固定2h。在梯度乙醇中脫水后，細(xì)胞包埋入Epon812(伏路卡公司(Fluka))中，并且在60°C聚合72小時(shí)。在Leica EM UC6中切出薄切片，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛復(fù)染。使用裝備有ULTRAVIEW CCD數(shù)碼照相機(jī)(荷蘭埃因霍溫的飛利浦公司(Philips))的Philips Tecna1-12電子顯微鏡，從薄切片獲得EM圖片?？张菪纬傻亩渴褂肁nalySIS軟件(德國(guó)明斯特的軟成像系統(tǒng)公司(Soft ImagingSystems))進(jìn)行。定量用細(xì)胞的選擇是基于其對(duì)體視學(xué)(stereologic)分析的適宜性，即僅僅分析經(jīng)其中心區(qū)域切過的細(xì)胞(基于高爾基膜的存在測(cè)定)。
[0075]動(dòng)物模型
[0076]所有涉及小鼠的方法都得到貝勒醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。GFP-LC3轉(zhuǎn)基因系如原先所述。如下產(chǎn)生Tcfeb的組織特異性過量表達(dá):將Tcfeb_3xFlag cDNA插入CAGCAT盒[雞肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(CAG)后有側(cè)接21oxP位點(diǎn)的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT) cDNA]后，并且用于生成轉(zhuǎn)基因小鼠 (貝勒醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)基因中心)。小鼠然后與白蛋白_CRE(獲自杰克遜實(shí)驗(yàn)室)系雜交。對(duì)48饑餓方案而言，小鼠缺食22小時(shí)，隨后進(jìn)食2小時(shí)，再禁食24小時(shí)后處死。
[0077]酶活性
[0078]溶酶體酶酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和β -己糖胺酶的活性采用合適的熒光或顯色底物來測(cè)定。SGSH活性按照Fraldi等Hum Mol Gen2007 (33)中所述測(cè)定。
[0079]免疫印跡和抗體
[0080]小鼠抗TFEB單克隆抗體購(gòu)自MB公司(My Biosource)目錄號(hào)MBS120432。為了生成抗pS142特異性抗體，兔子免疫接種偶聯(lián)有KLH的如下肽:AGNSAPN{pSer}PMAMLHIC。第四次免疫后，處死兔子并收集血清。通過循環(huán)流過含非磷酸化抗原的柱來除去血清中非磷酸化特異性的抗體。然后使用含磷酸化肽的柱來純化磷酸化特異性抗體。
[0081]細(xì)胞用包含蛋白酶和磷酸酶抑制劑(西格瑪公司)的M-PER緩沖液(賽默公司(Thermo))裂解；如上所述分離核/胞質(zhì)部分。蛋白通過SDS - PAGE(英杰公司；還原NuPAGE4 - 12%Bis_tris凝膠,MES SDS緩沖液)分離。如需要,所述凝膠使用20ml Imperial蛋白染色劑(塞摩費(fèi)舍爾公司(Thermo Fisher))在室溫染色I(xiàn)小時(shí)，并且用水脫色。通過用1-Blot (英杰公司)把蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上來進(jìn)行免疫印跡分析。所述膜用含5%脫脂奶粉的TBS-T緩沖液(含0.05%吐溫20的TBS)封閉，并且用一抗抗體抗FLAG和抗TUBULIN(西格瑪公司；1:2000)、抗H3(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司；1:10000)在室溫孵育2小時(shí)，而下列抗體在 5%BSA 中孵育過夜(ON):抗 TFEB (MB 公司;1:1000)、抗 P TFEB (1:1000) ERKI/2、p-ERKI/2, p-P70S6K、P70S6K(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司；1:1000)。所述膜用TBS-T緩沖液洗滌三次，并且用堿性磷酸酶偶聯(lián)的IgG(普洛麥格公司；0.2mg/ml)室溫孵育I小時(shí)。所述膜用TBS緩沖液洗滌三次，并使所表達(dá)的蛋白通過加入IOml Western Blue穩(wěn)定底物(普洛麥格公司)而顯現(xiàn)。
[0082]高內(nèi)涵核移位試驗(yàn)
[0083]TFEB-GFP細(xì)胞接種入384孔板，培養(yǎng)12小時(shí)，并且用10個(gè)不同濃度(50000nM、16666.66ηΜ、5555.55ηΜ、1851.85ηΜ、617.28ηΜ、205.76ηΜ、68.58ηΜ、22.86ηΜ、22.86ηΜ、
7.62ηΜ和2.54ηΜ)的ERK抑制劑U0126 (西格瑪奧德里奇公司)和mTOR抑制劑雷帕霉素(西格瑪奧德里奇公司)、Torinl (Biomarin公司)和Torin2 (Biomarin公司)處理。37°C下RPMI培養(yǎng)基中3小時(shí)后，細(xì)胞洗滌、固定并且用DAPI染色。為了獲得圖像，通過使用共聚焦自動(dòng)顯微鏡(Opera高內(nèi)涵系統(tǒng)，帕金埃爾默公司)，對(duì)384孔板的各孔照10張照片。開發(fā)專門的腳本(script)來對(duì)不同圖像中的TFEB定位進(jìn)行分析(Acapella軟件，帕金埃爾默公司)。所述腳本計(jì)算來自核TFEB-GFP熒光的平均強(qiáng)度除以TFEB-GFP熒光胞質(zhì)強(qiáng)度均值的比值。所得結(jié)構(gòu)使用相同板中的陰性(RPMI培養(yǎng)基)和陽(yáng)性(HBSS饑餓)對(duì)照樣品來標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)通過使用Prism軟件(GraphPad軟件)由各化合物不同濃度下的核移位百分比來表示。使用非線性回歸擬合(Prism軟件)計(jì)算各化合物的EC50。
[0084]結(jié)果
[0085]TFEB誘導(dǎo)自體吞噬
[0086](巨)自體吞噬是進(jìn) 化保守的機(jī)制，該機(jī)制把胞質(zhì)內(nèi)材料靶定到溶酶體，因而在營(yíng)養(yǎng)饑餓期間提供能量供應(yīng)(1，3)。饑餓期間的自體吞噬活性由mTOR調(diào)節(jié)，mTOR的活性依賴
于細(xì)胞能量需要。
[0087]由于自體吞噬是自噬體和溶酶體緊密關(guān)聯(lián)的結(jié)果(1)， 申請(qǐng)人:測(cè)試了 TFEB是否調(diào)節(jié)自體吞噬，TFEB是控制溶酶體生物發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子。因?yàn)門FEB對(duì)溶酶體生物發(fā)生和功能(2)以及溶酶體的胞吐起到正向控制(圖16和17)，應(yīng)該預(yù)期TFEB過量表達(dá)會(huì)由于其通過溶酶體增加降解而減少自噬體數(shù)。令人驚訝的是，如使用LC3標(biāo)記所測(cè)定，HeLa細(xì)胞中穩(wěn)定的TFEB過量表達(dá)顯著增加了自噬體數(shù)，所述LC3標(biāo)記特異性結(jié)合自噬體(4-7)(圖la, b)。通過HeLa和Cos細(xì)胞中瞬時(shí)過量表達(dá)TFEB獲得相似數(shù)據(jù)(圖5)。在感染慢病毒過量表達(dá)TFEB的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上，通過電子顯微術(shù)也檢測(cè)到自噬體數(shù)的增加(圖6)。在用自噬體的溶酶體抑制劑/LC3II降解巴伐洛霉素和抑胃酶肽/E64(8)處理的細(xì)胞中持續(xù)這種增加，表明TFEB激活自噬體的形成(圖1a和圖7)。在TFEB過量表達(dá)的細(xì)胞中，營(yíng)養(yǎng)饑餓沒有進(jìn)一步增加自噬體數(shù)(圖la，c)，提示TFEB過量表達(dá)對(duì)自體吞噬的飽和效應(yīng)，并提出了 TFEB可能是饑餓誘導(dǎo)的自體吞噬的重要調(diào)節(jié)物的可能性。
[0088]與這些發(fā)現(xiàn)一致，HeLa細(xì)胞中TFEB的RNA干擾(RNAi)造成正常和饑餓條件下有或沒有巴伐洛霉素存在時(shí)LC3II水平都有降低(圖ld-f)。顯然，LC3II的降低與不同RNAi寡核苷酸造成的TFEB水平下調(diào)有關(guān)，這顯示了試驗(yàn)的特異性(圖lg)。這些功能增減的數(shù)據(jù)提示自卩遼體和溶酶體的生物發(fā)生(biogeneses)受TFEB共同調(diào)節(jié)。 申請(qǐng)人:然后使用帶RFP-GFP串聯(lián)標(biāo)簽的LC3蛋白測(cè)量自噬體向溶酶體運(yùn)輸?shù)乃俾?9)，所述蛋白區(qū)分早期溶酶體細(xì)胞器(GFP-陽(yáng)性/mRFP-陽(yáng)性)與酸化的自噬溶酶體(GFP-陰性/mRFP-陽(yáng)性)，因?yàn)镚FP信號(hào)(但mRFP不會(huì))在酸性細(xì)胞器內(nèi)被淬滅(9)。發(fā)現(xiàn)了 TFEB過量表達(dá)細(xì)胞中自噬溶酶體數(shù)高于對(duì)照細(xì)胞，表明TFEB提高自噬體一溶酶體融合，因而促進(jìn)溶酶體流動(dòng)(圖1h)。TFEB調(diào)節(jié)自體吞噬作用的功能證據(jù)來自以下觀察:長(zhǎng)壽命蛋白的降解因TFEB過量而增強(qiáng)，因TFEB敲減而降低。自體吞噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)消除這種增強(qiáng)(10)(圖8)。[0089]為了測(cè)試TFEB是否調(diào)節(jié)自體吞噬基因的表達(dá)， 申請(qǐng)人:分析了一組51個(gè)基因的mRNA水平，這些基因據(jù)報(bào)導(dǎo)參與自體吞噬通路中數(shù)個(gè)步驟(1，12，13)。觀察到過量表達(dá)TFEB的細(xì)胞中自體吞噬基因表達(dá)水平的提高與饑餓期間所得提高非常相似(HeLa細(xì)胞在EBSS培養(yǎng)基中4小時(shí))(皮爾遜(Pearson)相關(guān):r值=0.42;p值=0.001)，而其在TFEB沉默之后下調(diào)(圖 2a 與表 I 和 2)。其中，UVRAG、WIP1、MAPLC3B、SQSTMl、VPSl1、VPS18 和ATG9B的表達(dá)受TFEB過量表達(dá)的影響最顯著(表1和2)。已知這些基因在自體吞噬的不同步驟中起作用，并且看來是TFEB的直接靶標(biāo)，因?yàn)槠鋯?dòng)子中帶有至少一個(gè)CLEAR位點(diǎn)
(2)(圖9)。有趣的是，VPSl1、VPS18和UVRAG在自噬體運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中起作用(14)，這與TFEB過量表達(dá)細(xì)胞中溶酶體一自噬體融合的顯著增強(qiáng)一致。
[0090]這些數(shù)據(jù)指示TFEB參與饑餓誘導(dǎo)的自體吞噬的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。這個(gè)結(jié)論得到下面觀察的強(qiáng)烈支持。第一，螢光素酶報(bào)導(dǎo)試驗(yàn)(2)顯示饑餓增強(qiáng)了 TFEB對(duì)靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的影響(圖10)。第二，TFEB直接靶標(biāo)的表達(dá)在饑餓細(xì)胞中上調(diào)，并且這種上調(diào)受TFEB沉默的抑制(圖 2a, c) ο
[0091 ] 饑餓調(diào)節(jié)TFEB的核移位和活性。
[0092]為了鑒定饑餓誘導(dǎo)活化TFEB的機(jī)制， 申請(qǐng)人:分析了饑餓細(xì)胞中TFEB的亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄后修飾。在正常條件下，TFEB定位于胞質(zhì)(2)。觀察到營(yíng)養(yǎng)饑餓(EBSS培養(yǎng)基)快速誘導(dǎo)TFEB的核移位(圖2d，e)，以及饑餓細(xì)胞的胞質(zhì)TFEB看來分子量低于正常進(jìn)食細(xì)胞的TFEBjn western印跡分析所示(圖1la)。這個(gè)分子量改變發(fā)生快速但短暫，并且在向饑餓細(xì)胞中再加入正常培養(yǎng)基后I小時(shí)內(nèi)消除，同時(shí)核TFEB降低(圖1la)。通過向EBSS培養(yǎng)基補(bǔ)充血清、氨基酸或者生長(zhǎng)因子(即胰島素或EGF)， 申請(qǐng)人:觀察到TFEB核移位相較僅用饑餓培養(yǎng)基有顯著抑制(圖2f)。當(dāng)EBSS補(bǔ)充有細(xì)胞因子(即INF或LIF)時(shí)，幾乎未見影響(圖2f)，這提示TFEB活化是受對(duì)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子敏感的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)的過程。 申請(qǐng)人:用補(bǔ)充有mTOR激酶抑制藥物(雷帕霉素)、PI3K-AKT激酶抑制藥物(曲西立濱)和MEK激酶抑制藥物(U0126)的正常培養(yǎng)基刺激饑餓的細(xì)胞。MEKi抑制導(dǎo)致TFEB核定位，其水平與饑餓類似，而AKT和mTOR抑制沒有影響(圖2g和圖1lb)。這些數(shù)據(jù)提示TFEB活性受MAP激酶調(diào)節(jié)，揭示了這個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)饑餓誘導(dǎo)的自體吞噬中的意外作用。此外，HeLa細(xì)胞中組成型活性MEK(caMEK)的表達(dá)導(dǎo)致饑餓期間TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)的下調(diào)，因而模擬了 TFEB敲減的效果(圖2h)，而TFEB消耗細(xì)胞中caMEK過量表達(dá)對(duì)TFEB靶標(biāo)基因的表達(dá)沒有影響(圖2h)。
[0093]絲氨酸磷酸化調(diào)節(jié)TFEB活化
[0094]為了更詳細(xì)分析MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和TFEB之間的關(guān)系， 申請(qǐng)人:進(jìn)行了質(zhì)譜分析，并且鑒定了至少三個(gè)絲氨酸(即S142、S332和S402)在營(yíng)養(yǎng)富集培養(yǎng)基中被磷酸化，但是在饑餓培養(yǎng)基中則不然。把這三個(gè)絲氨酸各自突變成丙氨酸以消除磷酸化。在HeLa細(xì)胞中表達(dá)各突變的TFEB蛋白，并且分析TFEB核移位。TFEB(S142A)突變顯示核定位比TFEB(WT)、TFEB(S332A)和TFEB(S402A)顯著增加(圖3a和圖12a)。相反，磷酸模擬突變(TFEB S142D)在營(yíng)養(yǎng)饑餓中不能移位入核(圖12b)。S142A TFEB突變?cè)谡Ｅ囵B(yǎng)基中以較低分子量遷移，但是在饑餓培養(yǎng)基中則不然，而S142D突變?cè)陴囸I期間顯示比WT TFEB的變化減弱(圖12c，d)，進(jìn)一步證明了 S142在正常培養(yǎng)基中磷酸化，但是饑餓培養(yǎng)基中則不然。TFEB(S142A)的表達(dá)造成TFEB靶標(biāo)基因表達(dá)水平相較TFEB(WT)、TFEB(S332A)和TFEB(S402A)有提高(圖3b)。一致地，TFEB (S142A)導(dǎo)致的自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的誘導(dǎo)強(qiáng)于wt TFEB，如自噬體(圖3c和圖13)、溶酶體(圖3d)和自噬溶酶體(圖3e)數(shù)目增加所顯示。因此，TFEB核移位和活化受絲氨酸142磷酸化的調(diào)節(jié)。
[0095]為了鑒定負(fù)責(zé)絲氨酸142磷酸化的具體激酶， 申請(qǐng)人:進(jìn)行生物信息學(xué)分析，所用分析方法基于在一組實(shí)驗(yàn)確證的磷酸化位點(diǎn)基礎(chǔ)上構(gòu)建的計(jì)算模型(15-19)(詳細(xì)見方法)。與前面結(jié)果一致， 申請(qǐng)人:鑒定出絲氨酸特異性胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)作為絲氨酸142磷酸化的一流(top-ranking)候選(表3)。有趣地是,絲氨酸142在其他HLH-亮氨酸拉鏈基因家族成員中高度保守，例如小眼畸形(Microphthalmia)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)(圖14)，發(fā)現(xiàn)其由ERK2磷酸化(20)。ERK2介導(dǎo)TFEB磷酸化的其他證據(jù)來自在正常培養(yǎng)基中ERK2-TFEB的免疫共沉淀(圖3f)，但是在饑餓培養(yǎng)基中則不然。此外，siRNA介導(dǎo)的ERK1/2蛋白敲減誘導(dǎo)的TFEB核移位程度與營(yíng)養(yǎng)饑餓相似(圖3h)。
[0096]TFEB介導(dǎo)的自體吞噬誘導(dǎo)的體內(nèi)分析。
[0097] 申請(qǐng)人:分析了 GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)溶酶體/自體吞噬通路的TFEB介導(dǎo)控制的生理相關(guān)性(11)。由于有報(bào)導(dǎo)觀察到營(yíng)養(yǎng)耗減時(shí)肝中的自體吞噬反應(yīng)， 申請(qǐng)人:關(guān)注于肝的研究。肝中，GFP陽(yáng)性囊泡數(shù)在禁食24小時(shí)后開始增加，并且在48小時(shí)達(dá)到峰值(48小時(shí)饑餓方案見材料和方法)(圖4a)，而自體吞噬和溶酶體TFEB靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)在禁食16小時(shí)后顯現(xiàn)(圖4b)。因此，轉(zhuǎn)錄活化先于自噬體的體內(nèi)形成。重要地是，禁食16小時(shí)時(shí)，TFEB亞細(xì)胞定位完 全在核中(圖4c，d)，并且ERK磷酸化水平比進(jìn)食動(dòng)物有降低(圖4e)，饑餓表明調(diào)節(jié)體內(nèi)TFEB活性，這與培養(yǎng)細(xì)胞中觀察到的相似。
[0098] 申請(qǐng)人:使用病毒和轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的TFEB過量表達(dá)來評(píng)價(jià)TFEB是否足以誘導(dǎo)體內(nèi)自體吞噬。用包含帶HA表位標(biāo)簽的鼠TcfebcDNA的腺關(guān)聯(lián)病毒(AAV)載體(AAV2/9 -Tcfeb-ΗΑ)全身注射GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠(11)(圖15a，b)。來自Tcfeb注射動(dòng)物的肝樣品顯示GFP陽(yáng)性囊泡數(shù)顯著增加，并且這種增加由饑餓進(jìn)一步增強(qiáng)(圖4e，f)。另外，來自條件Tcfeb-3xFLAG轉(zhuǎn)基因小鼠的肝樣品(其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)由肝特異性CRE重組酶驅(qū)動(dòng)(即白蛋白-CRE)(圖15c))顯示溶酶體和自體吞噬基因的表達(dá)和自噬體數(shù)相比對(duì)照同胞仔都有顯著增加(圖4g，h)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明饑餓誘導(dǎo)TFEB在自體吞噬的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的重要作用。
[0099]TORCl調(diào)節(jié)TFEB亞細(xì)胞定位
[0100]然后在HeLa和HEK-293T細(xì)胞中分析TFEB亞細(xì)胞定位，所述細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有TFEB - 3 X FLAG質(zhì)粒，并經(jīng)溶酶體功能抑制劑處理過夜。這些處理包括使用溶酶體pH梯度抑制劑氯奎和ν-ΑΤΡ酶選擇性抑制劑水楊酰胺A(SalA) (38)。核/胞質(zhì)分級(jí)分離后進(jìn)行的免疫印跡顯示溶酶體應(yīng)激也誘導(dǎo)外源表達(dá)TFEB的核移位，并且TFEB核積聚也與TFEB - 3 xFLAG向更低分子量變化有關(guān)，提示溶酶體應(yīng)激可能影響TFEB磷酸化狀態(tài)(圖18)。
[0101]基于mTORCl位于溶酶體膜且其活性依賴于營(yíng)養(yǎng)和溶酶體功能(39，40)， 申請(qǐng)人:假定溶酶體應(yīng)激對(duì)TFEB核移位的影響可能受mTORCl介導(dǎo)。與這個(gè)觀點(diǎn)一致，按已知mTORCl底物P-P70S6K的水平所測(cè)得，氯奎或SalA抑制mTORCl活性，(圖19A) (40)。mTOR的參與看來與原先觀察到已知mTOR抑制劑雷帕霉素不影響TFEB活性的情形相反。然而，近期數(shù)據(jù)指示雷帕霉素是mTOR的部分抑制劑，因?yàn)樵谶@種藥物存在下，一些底物仍然被有效地磷酸化(41)。因此， 申請(qǐng)人:使用激酶抑制劑Torinl和Torin2 (屬于祀向mTOR催化位點(diǎn)的新分子類型)由此完全抑制mTOR活性(41，47，48)。
[0102] 申請(qǐng)人:用補(bǔ)充有Torinl (250nM)、雷帕霉素(2.5 μ M)或ERK抑制劑U0126 (50 μ Μ)的富氨基酸培養(yǎng)基刺激饑餓細(xì)胞，在所述細(xì)胞中TFEB被磷酸化并且定位到核。僅用營(yíng)養(yǎng)刺激饑餓細(xì)胞誘導(dǎo)TFEB分子量顯著變化，并且重新定位到胞質(zhì)中(圖19Β)。在濃度為50 μ M的ERK抑制劑U0126存在下，營(yíng)養(yǎng)刺激僅誘導(dǎo)部分TFEB分子量變化，提示受ERK的磷酸化部分導(dǎo)致TFEB胞質(zhì)定位。用2.5 μ M雷帕霉素處理也造成部分分子量變化，但是不影響TFEB的亞細(xì)胞定位(圖19Β)。然而，Torinl (250ηΜ)處理完全阻止?fàn)I養(yǎng)誘導(dǎo)的分子量變化，并繼而造成大量TFEB核積聚。使用穩(wěn)定過量表達(dá)融合有綠色熒光蛋白的TFEB (TFEB-GFP)的HeLa細(xì)胞在基于細(xì)胞的高內(nèi)涵試驗(yàn)中證實(shí)了這些數(shù)據(jù)。在這個(gè)試驗(yàn)中，通過自動(dòng)共聚焦顯微鏡(OPERA系統(tǒng))獲得經(jīng)處理細(xì)胞的圖像，并且用Acapella圖像軟件分析這些圖像以計(jì)算細(xì)胞的胞質(zhì)和核之間TFEB-GFP的平均熒光強(qiáng)度之比(詳細(xì)見材料和方法)(圖19C和D)。因?yàn)門orinl抑制mTORCl和mT0RC2復(fù)合物， 申請(qǐng)人:然后評(píng)價(jià)了各復(fù)合物對(duì)TFEB調(diào)節(jié)的作用。下面三個(gè)觀察提示TFEB主要受mTORCl調(diào)節(jié):(I)用氨基酸刺激饑餓細(xì)胞(所述氨基酸活化mTORCl但是不活化mT0RC2)誘導(dǎo)了廣泛的TFEB分子量變化，強(qiáng)烈提示磷酸化活動(dòng)(圖19E) ; (2)調(diào)節(jié)氨基酸向mTORCl信號(hào)的RagC和RagD的敲減造成TFEB核積聚，即使在保持于全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的細(xì)胞中亦然(圖19F) ; (3)在mT0RC2信號(hào)被破壞的細(xì)胞(Sinl-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)) (49，50，46)中，TFEB在Torinl處理后經(jīng)歷與對(duì)照細(xì)胞相似的分子量變化和核移位(圖19G)。
[0103] mTORCl通過S142磷酸化控制TFEB亞細(xì)胞定位
[0104]為了測(cè)試mTORCl是否在S142磷酸化TFEB， 申請(qǐng)人:生成了僅識(shí)別S142磷酸化的TFEB的磷酸特異性抗體。使用這種抗體， 申請(qǐng)人:觀察到在營(yíng)養(yǎng)耗盡培養(yǎng)基中培養(yǎng)的穩(wěn)定過量表達(dá)TFEB-3 X FLAG的HeLa細(xì)胞中，TFEB不再有S142磷酸化，這與 申請(qǐng)人:上面報(bào)導(dǎo)的結(jié)果一致(圖20A)。
[0105]然后，分析了在補(bǔ)充以含或不含Torinl或雷帕霉素的正常培養(yǎng)基的饑餓細(xì)胞中的S142磷酸化水平。Torinl清楚地減弱營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)的S142磷酸化時(shí)，但雷帕霉素卻沒有這種效果，提示S142表示雷帕霉素抗性mTORCl位點(diǎn)(圖20A)。這些結(jié)果清楚地表明TFEB是mTOR底物，并且S142是mTOR對(duì)TFEB磷酸化的關(guān)鍵殘基。
[0106]近期的發(fā)現(xiàn)提示mTORCl在多個(gè)位點(diǎn)磷酸化其靶標(biāo)蛋白(42，43，44)。為了鑒定可被mTOR磷酸化的其他絲氨酸殘基， 申請(qǐng)人:檢索了 TFEB編碼序列中mTORCl的共有磷酸受體基序(42)(圖20B和C)。將所有推定為mTORCl靶標(biāo)的TFEB氨基酸殘基突變成丙氨酸。然后測(cè)試了各個(gè)突變對(duì)TFEB亞細(xì)胞定位的影響，并且發(fā)現(xiàn)，與S142A相似，位點(diǎn)211的絲氨酸-向-丙氨酸突變(S211A)造成TFEB的組成型核定位(圖20D)。其他絲氨酸殘基的突變與野生型TFEB的表現(xiàn)相似(圖20D)。
[0107]總之，這些數(shù)據(jù)表明，除S142以外，S211也在TFEB亞細(xì)胞定位中起作用，并且提示S211表示mTORCl的額外祀標(biāo)位點(diǎn)。
[0108]溶酶體調(diào)節(jié)TFEB中的基因表達(dá)[0109]因?yàn)門FEB與mTORCl的相互作用控制TFEB核移位， 申請(qǐng)人:測(cè)試TFEB調(diào)芐基因表達(dá)的能力是否也受這種相互作用影響。在來自肝中刪除TFEB的條件敲除小鼠系(Tcfebfiwfl0X;alb-CRE)和對(duì)照小鼠系(Tcfebfl°x/fl°x)的原代肝細(xì)胞中，測(cè)試已顯示為TFEB靶標(biāo)的數(shù)個(gè)溶酶體/自體吞噬基因的表達(dá)(37)。細(xì)胞用氯奎或Torinl處理，或保持不處理。按p-S6K水平所測(cè)，這些處理抑制mTOR，而p-ERK的水平?jīng)]有受影響(圖21A)。相較對(duì)照肝細(xì)胞，從TFEB條件敲除小鼠中分離并且在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞在數(shù)個(gè)TFEB靶標(biāo)基因的表達(dá)水平上沒有顯示顯著差異。然而，盡管TFEB靶標(biāo)基因的表達(dá)在用氯奎處理后的對(duì)照小鼠肝細(xì)胞中有上調(diào)，但是這種上調(diào)在TFEB條件敲除小鼠的肝細(xì)胞中顯著減弱(圖21B)。相似地，對(duì)Torinl處理的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在TFEB條件敲除小鼠的肝細(xì)胞中顯著減弱(圖21C)?？傊@些結(jié)果表明TFEB在通過mTOR的溶酶體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。
[0110]已經(jīng)描述了調(diào)節(jié)自體吞噬的轉(zhuǎn)錄依賴性機(jī)制(24，25)和不依賴性機(jī)制(26，27)。這個(gè)研究鑒定了新的激酶依賴性調(diào)節(jié)回路，所述回路控制自噬體通路的多個(gè)關(guān)鍵步驟，例如自噬體形成、自噬體一溶酶體融合和溶酶體介導(dǎo)的自噬體內(nèi)容物降解。有趣的是， 申請(qǐng)人:觀察到自體吞噬/溶酶體基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)先于自噬體形成?？梢栽O(shè)想的是這種轉(zhuǎn)錄依賴性機(jī)制保證了更長(zhǎng)久且持續(xù)的自體吞噬活化。
[0111]自體吞噬功能障礙與數(shù)種遺傳疾病有關(guān)(28-30)，相反，原先的研究顯示了在神經(jīng)退行性疾病和肝纖維化的動(dòng)物模型中自體吞噬的增強(qiáng)有治療效果(29，31，32)。
[0112]在轉(zhuǎn)錄水平控制溶酶體一自體吞噬通路的新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)提示調(diào)節(jié)這些疾病中細(xì)胞清除的新方法。另外，提供了基于溶酶體酶的治療方法的副產(chǎn)品，提示提高細(xì)胞系生成內(nèi)源或重組溶酶體酶的產(chǎn)量的新策略(圖16和17)。另外，TFEB過量表達(dá)能提高底物清除，并且拯救LSD中細(xì)胞空泡形成(45);因此，調(diào)節(jié)TFEB活性的磷酸化介導(dǎo)機(jī)制的鑒定提供了促進(jìn)健康和疾病中細(xì)胞清除的新工具。
[0113]表1:響應(yīng)TFEB過量表達(dá)或細(xì)胞饑餓5的基因表達(dá)變化(皮爾森相關(guān)0.42)
【權(quán)利要求】
1.一種組成型定位在真核細(xì)胞核內(nèi)的TFEB變體蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述變體包含絲氨酸殘基取代以使其對(duì)磷酸化不敏感。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的TFEB變體蛋白，其特征在于,所述變體蛋白由Seq.1d N0.2所含氨基酸序列組成，并且其中所述絲氨酸殘基取代是在Seq.1d.N0.2的SER142和 / 或 SER211。
4.如權(quán)利要求3所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述Seq.1d N0.2中所含氨基酸序列是從氨基酸117到氨基酸166，并且所述絲氨酸殘基取代是在Seq.1d N0.2中的SER142，如 Seq Id N0.4 所示。
5.如權(quán)利要求3或4所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述在Seq.1d.N0.2中SER142和/或SER211的取代是ALA取代。
6.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的TFEB變體蛋白用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的TFEB變體蛋白用于治療需要誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的疾病中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求6所述的TFEB變體蛋白用于治療下列病癥中的應(yīng)用:溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
9.如權(quán)利要求8所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述溶酶體貯積癥包含:激活因子缺乏癥/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、α -甘露糖苷貯積癥、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、膽固醇酯貯積病、慢性己糖胺酶A缺乏癥、胱氨酸貯積癥、Danon病、法布里病、法伯(Farber)病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖涎酸貯積癥、高歇(Gaucher)病(包含I型、II型和III型)、GM1神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病(包含嬰兒型、晚嬰型/少年型、成年型/慢性)、1細(xì)胞疾病/黏脂沉積癥II型、嬰兒游離唾液酸貯積病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏癥、Krabbe病(包含嬰兒發(fā)病、遲發(fā)性)、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、假性赫爾利多營(yíng)養(yǎng)障礙綜合征/黏脂沉積癥IIIA型、MPS I型賀勒綜合征、MPS I型施艾氏綜合征、MPS I型賀勒氏-施艾氏綜合征、MPS II型亨特綜合征、A型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIA型、B型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIB型、A型莫奎歐氏癥/MPS IVA型、B型莫奎歐氏癥/MPS IVB型、MPS IX型透明質(zhì)酸酶缺乏癥、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病(包含CLN6病、非典型晚嬰型、遲發(fā)型變異、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬蘭晚嬰型變異CLN5、詹-比二氏病/晚嬰型CLN2/TPP1病、Kufs/成人發(fā)病型NCL/CLN4病、北方癲癇/異晚嬰型CLN8和神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥/嬰兒型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷貯積病、龐培氏病/11型糖原貯積病、致密性成骨不全癥、山霍夫氏病/成年發(fā)病型/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、嬰幼兒山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、青少年山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸貯積病、家族黑蒙性白癡/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、Wolman病、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥。
10.如權(quán)利要求8所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述肝病選自αI抗胰蛋白酶缺陷和脂肪肝病。
11.如權(quán)利要求8所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述肌肉疾病選自自體吞噬液泡肌病和過度自噬X連鎖肌病。
12.如權(quán)利要求8所述的TFEB變體蛋白， 其特征在于，所述代謝疾病選自高膽固醇血癥和脂肪肝病。
13.如權(quán)利要求8所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述神經(jīng)退行性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病和脊髓性小腦萎縮癥。
14.一種核酸，所述核酸包含編碼如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的TFEB變體蛋白的編碼序列。
15.如權(quán)利要求14所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含SeqId N0.3的序列。
16.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體在適當(dāng)調(diào)節(jié)序列下包含如權(quán)利要求14或15所述核酸。
17.如權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體用于基因治療。
18.一種提高離體培養(yǎng)細(xì)胞中內(nèi)源或重組溶酶體酶產(chǎn)量的方法，所述方法包含如下步驟:_將權(quán)利要求14或15所述的核酸或者權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體導(dǎo)入所述細(xì)胞，和-使所編碼的TFEB變體蛋白得以表達(dá)。
19.一種通過給予對(duì)象藥學(xué)有效量的如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的TFEB變體蛋白來治療疾病的方法，其特征在于，所述疾病通過誘導(dǎo)細(xì)胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)來緩解。
20.一種通過給予藥學(xué)有效量的如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的TFEB變體蛋白來治療疾病的方法，其特征在于，所述疾病選自:溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是代謝疾病，其中所述代謝疾病是高膽固醇血癥或脂肪 肝病。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是神經(jīng)退行性疾病，并且所述神經(jīng)退行性疾病是阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病或脊髓性小腦萎縮癥。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是溶酶體貯積癥，并且所述溶酶體疾病是:激活因子缺乏癥/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、α -甘露糖苷貯積癥、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、膽固醇酯貯積病、慢性己糖胺酶A缺乏癥、胱氨酸貯積癥、Danon病、法布里病、法伯(Farber)病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖涎酸貯積癥、高歇(Gaucher)病(包含I型、II型和III型)、GMl神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病(包含嬰兒型、晚嬰型/少年型、成年型/慢性)、I細(xì)胞疾病/黏脂沉積癥II型、嬰兒游離唾液酸貯積病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏癥、Krabbe病(包含嬰兒發(fā)病、遲發(fā)性)、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、假性赫爾利多營(yíng)養(yǎng)障礙綜合征/黏脂沉積癥IIIA型、MPS I型賀勒綜合征、MPS I型施艾氏綜合征、MPS I型賀勒氏-施艾氏綜合征、MPS II型亨特綜合型、A型沙費(fèi)利波綜合征/MPS IIIA型、B型沙費(fèi)利波綜合征/MPSIIIB型、A型莫奎歐氏癥/MPS IVA型、B型莫奎歐氏癥/MPS IVB型、MPS IX型透明質(zhì)酸酶缺乏癥、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病(包含CLN6病、非典型晚嬰型、遲發(fā)型變異、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬蘭晚嬰型變異CLN5、詹-比二氏病/晚嬰型CLN2/TPP1病、Kufs/成人發(fā)病型NCL/CLN4病、北方癲癇/異晚嬰型CLN8和神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥/嬰兒型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷貯積病、龐培氏病/11型糖原貯積病、致密性成骨不全癥、山霍夫氏病/成年發(fā)病型/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、嬰幼兒山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、青少年山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸貯積病、家族黑蒙性白癡/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、Wolman病、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是肝病，并且所述肝病是α?抗胰蛋白酶缺陷或脂肪肝病。
25.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是肌肉疾病，并且所述肌肉疾病是自體吞噬液泡肌病或過度 自噬X連鎖肌病。
【文檔編號(hào)】A61P43/00GK103619873SQ201280012155
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月7日
【發(fā)明者】C·塞滕布里, A·巴拉比奧, D·L·梅迪納薩納巴里 申請(qǐng)人:泰萊托恩基金會(huì)