專利名稱：用于治療肝癌的基因藥物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝癌治療領(lǐng)域，特別地，涉及一種用于治療肝癌的基因藥物，本發(fā)明的另一方面還提供了一種上述基因藥物的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球男性第五大惡性腫瘤,死亡率高居惡性腫瘤第二位，每年新發(fā)病例數(shù)與死亡人數(shù)幾乎接近I :1，而中國HCC的每年新發(fā)病例數(shù)約占全球的一半，嚴(yán)重危害著我國人民的生命健康。截止目前，肝切除技術(shù)已有顯著的進步，手術(shù)切除率顯著增加，術(shù)后并發(fā)癥與死亡率也顯著降低，肝癌治療方案基本確立為以外科手術(shù)治療為核心的綜合治療。然而，以術(shù)后5年生存率為標(biāo)志的長期生存率仍無根本性改善。究其原因，主要是由于肝癌細胞的高度侵襲性和手術(shù)后的高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率所致，尤其 對于晚期HCC和出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者缺少有效的臨床治療手段。這是影響肝癌患者術(shù)后長期生存的主要障礙。因此，研發(fā)抗肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移藥物具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。目前，可用于治療肝癌的藥物主要有傳統(tǒng)化療藥物和靶向藥物。常用化療藥物主要有5-氟脲嘧啶、阿霉素、表阿霉素、絲裂霉素、順鉬、卡鉬等。前述化療藥物的有效率均在10% 20%，治療效果不令人滿意，且特異性差，副作用大。雖然隨后還有新的、對腫瘤細胞殺傷力強的藥物上市，但是從治療效果，改變患者的手術(shù)后癌細胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，延長生命等綜合效果來說并不理想。靶向藥物是近年來研究肝癌的熱點，也涌現(xiàn)了一批像索拉菲尼等有價值的藥物。這些靶向藥物存在一個共同問題，在于作用的有效性及對患者生存時間的延長；但是效果并不理想，其中最為成功的索拉菲尼藥物對患者生存時間的延長也僅為3個月。因此，迫切需要我們研制能有效抑制肝癌細胞生長，復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移的的新型藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于治療肝癌的基因藥物，以解決現(xiàn)有治療肝癌的藥物不能有效抑制肝癌細胞生長，復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移的技術(shù)問題。為實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于治療肝癌的基因藥物，包括治療有效量的核苷酸序列和輔料；有效量的核苷酸序列為具有SEQ No. I的核苷酸序列。進一步包括將核苷酸序列負載的載體，載體為聚乙烯亞胺。進一步地，聚乙烯亞胺為糖基化聚乙烯亞胺；糖基化聚乙烯亞胺的氮/磷比為6 48。進一步地，糖基化聚乙烯亞胺的氮/磷比為24。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了前述基因藥物的制備方法，包括以下步驟I)將腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸進行體外合成步驟得到miR-140模擬物；2)將miR-140模擬物與輔料混合得到基因藥物。
進一步地，前述基因藥物的制備方法，還包括以下步驟I)按照權(quán)利要求5的方法制備miR-140模擬物，將miR-140模擬物用無RNA酶的水稀釋成miR-140模擬物溶液；2)將聚乙烯亞胺聚合物溶于氯化鈉溶液中制備濃度為O. 0Γ0. lmol/L的聚乙烯亞胺溶液；3)將聚乙烯亞胺溶液對miR-140模擬物溶液進行包裹步驟得到裝載有miR-140基因的聚乙烯亞胺載體；4)將聚乙烯亞胺載體與輔料混合得到基因藥物。進一步地，前述基因藥物的制備方法，還包括以下步驟
I)按照權(quán)利要求5的方法制備miR-140模擬物，將miR-140模擬物用無RNA酶的水稀釋成miR-140模擬物溶液；2)將2重量份的支鏈淀粉、I重量份的羰基二咪唑溶于無水二甲基亞砜中靜置4小時得到第一物質(zhì)；將2重量份聚乙烯亞胺加入到第一物質(zhì)中混勻后放置I天得到第二物質(zhì)；將第二物質(zhì)進行透析步驟3天得到糖基化聚乙烯亞胺聚合物；將糖基化聚乙烯亞胺聚合物溶于氯化鈉溶液中制備濃度為O. 0Γ0. lmol/L的糖基化聚乙烯亞胺溶液；3)將糖基化聚乙烯亞胺溶液對miR-140模擬物溶液進行包裹步驟得到裝載有miR-140基因的糖基化聚乙烯亞胺載體。4)將糖基化聚乙烯亞胺載體與輔料混合得到基因藥物。進一步地，體外合成步驟為I)用三氯乙酸脫去核苷酸中的二甲氧基三苯甲基保護基團得到具有游離的5’羥基的核苷酸；2)將具有亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并合成亞磷酰胺四氮唑活性中間體；3)將亞磷酰胺四氮唑活性中間體與具有游離的5’羥基的核苷酸進行縮合反應(yīng)得到寡核苷酸鏈；4)將寡核苷酸鏈用含碘的四氫呋喃溶液處理得到穩(wěn)定的寡核苷酸；5)按照miRNA基因文庫中miR-140的堿基序列重復(fù)步驟I)至步驟4) 263 271次得到具有miR-140堿基序列的初級產(chǎn)物；6)將miR-140初級產(chǎn)物進行切割、脫保護基和純化步驟得到miR-140模擬物。進一步地，前述包裹步驟為將miR-140模擬物溶液加入到載體溶液中，在室溫下孵育30分鐘得到裝載有miR-140基因的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了前述基因藥物的應(yīng)用，前述基因藥物通過口服、腸胃外施用或者全身施用的方式治療肝癌，miR-140的含量為2 μ g/次。本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明提供的一種用于治療肝癌的基因藥物，其有效成分miR-140能夠顯著抑制肝癌的生長，抑制肝癌細胞遷徙、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的能力，從而達到治療肝癌的目的。miR-140可以通過以五種單體核苷酸為原料在體外合成miR-140模擬物,直接轉(zhuǎn)染進入人體肝癌細胞中發(fā)揮作用，操作簡便，成本低。本發(fā)明以聚乙烯亞胺為運輸載體，單體為-CH2-CH2-NH-,其聚合物為納米顆粒分子材料，表面富含陽離子，主要通過細胞的內(nèi)吞作用完成miR-140模擬物的導(dǎo)入，具有合成簡單、無免疫原性和無感染等諸多優(yōu)點。由于腫瘤細胞的線粒體功能障礙或酶譜的改變，需要通過無氧酵解大量葡萄糖的方式才能獲得足夠的能量，本發(fā)明構(gòu)建了糖基化聚乙烯亞胺載體，糖基化聚乙烯亞胺載體對肝臟表面的唾液酸糖蛋白具有較高的親和力，具有增強腫瘤細胞對PEI聚合物的內(nèi)吞作用，提高其對腫瘤的靶向性的優(yōu)點。除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點。下面將參照圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明。


構(gòu)成本申請的一部分的附圖用來提供 對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中圖I為本發(fā)明優(yōu)選實施例的miRNA進行芯片分析的結(jié)果；圖2為本發(fā)明優(yōu)選實施例的miR-140模擬物的基因測序結(jié)果；圖3為本發(fā)明優(yōu)選實施例的HCCLM3型肝癌細胞劃痕愈合情況示意圖；圖4為本發(fā)明優(yōu)選實施例的HCCLM3型肝癌細胞穿透基質(zhì)膠的細胞的菌落圖；圖5為本發(fā)明優(yōu)選實施例的HCCLM3型肝癌細胞的生長曲線；圖6為本發(fā)明優(yōu)選是實力的MHCC97-H型肝癌細胞的生長曲線；圖7為本發(fā)明優(yōu)選實施例的HCCLM3肝癌細胞周期擬合軟件分析結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例進行詳細說明，但是本發(fā)明可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。miRNA是自然界中存在的一類高度保守的、長度為17 25nt的單鏈非編碼RNA分子，可通過與特定靶基因信使RNA (mRNA)的3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)互補位點的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控靶基因的表達，具有廣泛的生物學(xué)功能。研究人員發(fā)現(xiàn)miRNA主要通過兩種機制介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達調(diào)控，即miRNA通過與靶基因mRNA的3’UTR互補結(jié)合后，可誘導(dǎo)其直接降解或間接的翻譯抑制。目前有研究發(fā)現(xiàn)50%的miRNA在染色體上定位于與腫瘤相關(guān)的“脆性位點”，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。申請人通過研究發(fā)現(xiàn)miRNA中的miR-140基因與肝癌細胞中的靶基因TGFBRl與FGF9可以特異性結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控TGFBRl和FGF9基因的表達。若miR-140在肝癌組織中低表達，則肝癌病人腫瘤數(shù)目增多，形成包膜數(shù)量減少， m分期處于晚期的病人的比例明顯增加，整體生存時間與無瘤生存的時間更短。若將含有miR-140的載體轉(zhuǎn)染進入肝癌細胞中，提高miR-140在肝癌組織中的表達能力，則肝癌細胞的遷徙、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的能力將明顯降低，意味著肝癌病人的腫瘤數(shù)目減少， M分期處于晚期的病人的比例明顯減少，整體生存時間與無瘤生存的時間更長。因此，miR-140能夠顯著抑制肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力和增殖能力。根據(jù)前述miR-140能夠顯著抑制肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力和增殖能力，本發(fā)明提供了一種包含治療有效量的miR-140核昔酸序列的基因藥物，當(dāng)基因藥物攝入到體內(nèi)后，可以提聞體內(nèi)miR-140基因在肝癌組織中的表達能力，顯著抑制肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力和增殖能力，從而達到治療肝癌的目的。
本發(fā)明提供了一種基因藥物，前述基因藥物含有治療有效量的miR-140核苷酸序列。為了使miR-140發(fā)揮治療肝癌的作用，本發(fā)明模擬miR-140的核苷酸序列，用化學(xué)方法合成含有miR-140核苷酸序列的miR-140模擬物。miR-140模擬物能模擬細胞中的內(nèi)源性miR-140進行高水平表達，以增強內(nèi)源性miR-140的調(diào)控作用。miR-140模擬物可直接轉(zhuǎn)染進入細胞，無需構(gòu)建載體，也無需病毒防護方面的擔(dān)憂，操作既方便又安全。裝載有miR-140核苷酸序列的載體可以是聚乙烯亞胺載體。聚乙烯亞胺載體的作用是將miR-140模擬物包裹起來，并作為一個靶向性的載體，將miR-140模擬物靶向性帶入到肝癌細胞中。聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)的單體為-CH2-CH2-NH-,其聚合物為納米顆粒分子材料，表面富含陽離子，主要通過細胞的內(nèi)吞作用完成miR-140模擬物的導(dǎo)入。由于腫瘤細胞的線粒體功能障礙或酶譜的改變，需要通過無氧酵解大量葡萄糖的方式才能獲得足夠的能量，而糖基化PEI對肝臟表面的唾液酸糖蛋白具有較高的親和力。因此，以糖基化PEI為載體可以增強腫瘤細胞對PEI聚合物的內(nèi)吞作用，提高PEI聚合物對 腫瘤的靶向性，使miR-140能更準(zhǔn)確快速的發(fā)揮功效。糖基化PEI具有合成簡單、無免疫原性和無感染等諸多優(yōu)點。糖基化PEI的氮/磷(N/P)比為6 48時具有較好的生物安全性。糖基化PEI的N/P比為24時，其生物安全性能最佳。本發(fā)明的另一方面還提供了前述基因藥物的制備方法，包括以下步驟I)將腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸進行體外合成步驟得到miR-140模擬物。2)將miR-140模擬物與輔料混合得到片劑、膠囊、注射液、口服液、丸劑等劑型的
基因藥物。用腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸等五種單體核苷酸為原料，運用化學(xué)合成的方法合成含有miR-140序列的miR-140模擬物，能模擬細胞中的內(nèi)源性成熟miR-140的高水平表達，以增強內(nèi)源性miR-140的調(diào)控作用，并能直接轉(zhuǎn)染進入細胞，操作方便。前述基因藥物的制備方法，進一步地，還可以包括以下步驟I)按照前述的方法制備miR-140模擬物，將miR-140模擬物用無RNA酶的水稀釋成miR-140模擬物溶液。2)將聚乙烯亞胺聚合物溶于氯化鈉溶液中制備濃度為O. 0Γ0. lmol/L的聚乙烯亞胺溶液。3)將聚乙烯亞胺溶液對miR-140模擬物溶液進行包裹步驟得到裝載有MIR-140基因的聚乙烯亞胺載體。4)將聚乙烯亞胺載體與輔料混合得到片劑、膠囊、注射液、口服液、丸劑等劑型的基因藥物。當(dāng)miR-140模擬物溶液的濃度為f 100 μ g/ml時，基因藥物抑制肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力和增殖能力更明顯。雖然miR-140模擬物可以直接導(dǎo)入到細胞內(nèi)，但是缺乏靶向性，其治療肝癌的效果不明顯，本發(fā)明提供的基因藥物的制備方法，將miR-140模擬物用聚乙烯亞胺載體包裹起來，并作為一個祀向性的載體，將miR-140祀向性帶入到肝癌細胞中,通過內(nèi)吞作用進入肝癌細胞內(nèi)，使miR-140能更準(zhǔn)確快速的發(fā)揮功效，而聚乙烯亞胺載體合成簡單、無免疫原性和無感染，對人體安全無副作用。前述基因藥物的制備方法，進一步地，還可以包括以下步驟I)按照前述的方法制備miR-140模擬物，將miR-140模擬物用無RNA酶的水稀釋成miR-140模擬物溶液。2)將2重量份的支鏈淀粉、I重量份的羰基二咪唑溶于無水二甲基亞砜中靜置4小時得到第一物質(zhì)；將2重量份聚乙烯亞胺加入到第一物質(zhì)中混勻后放置I天得到第二物質(zhì)；將第二物質(zhì)進行透析步驟3天得到糖基化聚乙烯亞胺聚合物；將糖基化聚乙烯亞胺聚合物溶于氯化鈉溶液中制備濃度為O. 0Γ0. lmol/L的糖基化聚乙烯亞胺溶液。
3)將糖基化聚乙烯亞胺溶液對miR-140模擬物溶液進行包裹步驟得到裝載有MIR-140基因的糖基化聚乙烯亞胺載體。4)將糖基化聚乙烯亞胺載體與輔料混合得到片劑、膠囊、注射液、口服液、丸劑等劑型的基因藥物。由于腫瘤細胞的線粒體功能障礙或酶譜的改變，需要通過無氧酵解大量葡萄糖的方式才能獲得足夠的能量。本發(fā)明提供的基因藥物的制備方法，將聚乙烯亞胺進行糖基化，為腫瘤細胞提供足夠的能量，同時糖基化PEI對肝臟表面的唾液酸糖蛋白具有較高的親和力。因此，以糖基化PEI為載體可以增強腫瘤細胞對PEI聚合物的內(nèi)吞作用，提高PEI聚合物對腫瘤的靶向性，使miR-140能更準(zhǔn)確快速的發(fā)揮功效。體外合成步驟為去保護基用三氯乙酸脫去核苷酸中的二甲氧基三苯甲基保護基團得到具有游離的5’輕基的核苷酸；活化將具有亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并合成亞磷酰胺四氮唑活性中間體；連接將亞磷酰胺四氮唑活性中間體與具有游離的5’羥基的核苷酸進行縮合反應(yīng)得到寡核苷酸鏈；氧化將寡核苷酸鏈用含碘的四氫呋喃溶液處理得到穩(wěn)定的寡核苷酸；按照miRNA基因文庫中miR-140的堿基序列重復(fù)去保護基、活化、連接、氧化步驟263^271次得到得到具有miR-140堿基序列的初級產(chǎn)物；將miR-140初級產(chǎn)物進行切割、脫保護基和純化作用得到miR-140模擬物。為了防止未參與反應(yīng)的游離的5’羥基的核苷酸的干擾，連接步驟后還可以加入封閉步驟，封閉步驟為用乙酰酐和氮-甲基咪唑混合形成乙?；噭┓忾]未參與反應(yīng)的含有游離5’ -輕基的核苷酸。本發(fā)明以五種核苷酸單體為原料進行脫去保護基、活化、連接、封閉、氧化、切割、脫保護基、純化等步驟得到miR-140模擬物，能模擬細胞中的內(nèi)源性miR-140進行高水平表達，以增強內(nèi)源性miR-140的調(diào)控作用，使miR-140抑制肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力和增殖能力更強。同時miR-140模擬物不屬于病毒載體，無需病毒防護方面的擔(dān)憂，操作既方便又安全。包裹步驟為將濃度為I μ g/πιΓ ΟΟ μ g/ml的miR-140模擬物溶液加入到糖基化聚乙烯亞胺溶液中，室溫孵育30分鐘得到裝載有miR-140的糖基化聚乙烯亞胺載體。本發(fā)明的另一方面還提供了前述基因藥物的應(yīng)用，基因藥物通過口服、腸胃外施用或者全身施用的方式治療肝癌，miR-140的含量為2μ g/次。實施例以下實施例中，用于提取RNA的組織來源于肝癌手術(shù)切除后的離體肝臟組織，由湖南省湘雅醫(yī)院提供。標(biāo)記試劑盒購于Exiqon公司的miRCURY TM Array microarray kit試劑盒。濃縮試劑盒購于Qiagen公司的濃縮試劑盒，貨號#74104。芯片雜交試劑盒購于Exiqon公司miRNA芯片雜交試劑盒，貨號#208000V8. O。逆轉(zhuǎn)錄引物購自廣州銳博生物科技有限公司，其余材料均為市售。Transwell小室購于美國Corning公司?；|(zhì)膠購于Becton-Dicknson 公司。 實施例II)準(zhǔn)備腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸，用三氯乙酸脫去核苷酸中的二甲氧基三苯甲基保護基團得到具有游離的5’羥基的核苷酸；將具有亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并合成亞磷酰胺四氮唑活性中間體；用乙酰酐和氮-甲基咪唑等混合形成乙?；噭┓忾]未參與反應(yīng)的5’ -羥基；將亞磷酰胺四氮唑活性中間體與具有游離的5’羥基的核苷酸進行縮合反應(yīng)得到寡核苷酸鏈；將寡核苷酸鏈用含碘的四氫呋喃溶液處理得到穩(wěn)定的寡核苷酸；按照miRNA文庫中的miR-140的堿基序列重復(fù)去脫保護基、活化、連接、封閉、氧化步驟267次得到miR-140初級產(chǎn)物；將miR-140初級產(chǎn)物進行切割、脫保護基和純化作用得到miR-140模擬物粉末。2)將I重量份的miR-140模擬物粉末與I重量份的輔料進行混合、壓片得到基因藥物。實施例2I)準(zhǔn)備腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸，用三氯乙酸脫去核苷酸中的二甲氧基三苯甲基保護基團得到具有游離的5’羥基的核苷酸；將具有亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并合成亞磷酰胺四氮唑活性中間體；用乙酰酐和氮-甲基咪唑等混合形成乙?；噭┓忾]未參與反應(yīng)的5’ -羥基；將亞磷酰胺四氮唑活性中間體與具有游離的5’羥基的核苷酸進行縮合反應(yīng)得到寡核苷酸鏈；將寡核苷酸鏈用含碘的四氫呋喃溶液處理得到穩(wěn)定的寡核苷酸；按照miRNA文庫中的miR-140的堿基序列重復(fù)去脫保護基、活化、連接、封閉、氧化步驟267次得到miR-140初級產(chǎn)物；將miR-140初級產(chǎn)物進行切割、脫保護基和純化作用得到miR-140模擬物。2)將miR-140模擬物用無RNA酶水稀釋至濃度為85 μ g/ml的miR-140模擬物溶液；3)將聚乙烯亞胺聚合物溶于150mmol/L的氯化鈉溶液中制備濃度為O. Olmol/L的聚乙烯亞胺溶液；4)將miR-140模擬物溶液加入到聚乙烯亞胺溶液中，室溫孵育30分鐘得到裝載有miR-140的聚乙烯亞胺載體。5)將I重量份的裝載有miR-140的聚乙烯亞胺載體與I重量份的填充輔料混合、裝膠囊得到基因藥物。實施例3
I)準(zhǔn)備腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸，用三氯乙酸脫去核苷酸中的二甲氧基三苯甲基保護基團得到具有游離的5’羥基的核苷酸；將具有亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并合成亞磷酰胺四氮唑活性中間體；用乙酰酐和氮-甲基咪唑等混合形成乙?；噭┓忾]未參與反應(yīng)的5’ -羥基；將亞磷酰胺四氮唑活性中間體與具有游離的5’羥基的核苷酸進行縮合反應(yīng)得到寡核苷酸鏈；將寡核苷酸鏈用含碘的四氫呋喃溶液處理得到穩(wěn)定的寡核苷酸；按照miRNA文庫中的miR-140的堿基序列重復(fù)去脫保護基、活化、連接、封閉、氧化步驟267次得到miR-140初級產(chǎn)物；將miR-140初級產(chǎn)物進行切割、脫保護基和純化作用得到miR-140模擬物。2)將miR-140模擬物用無RNA酶水稀釋至濃度為75 μ g/ml的miR-140模擬物溶液；
3)將聚乙烯亞胺聚合物溶于150mmol/L的氯化鈉溶液中制備濃度為O. 05mol/L的聚乙烯亞胺溶液； 4)將miR-140模擬物溶液加入到聚乙烯亞胺溶液中，室溫孵育30分鐘得到裝載有miR-140的聚乙烯亞胺載體。5)將I重量份的裝載有miR-140的聚乙烯亞胺載體與I重量份的注射用水混合得到基因藥物。實施例4I)準(zhǔn)備腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸，用三氯乙酸脫去核苷酸中的二甲氧基三苯甲基保護基團得到具有游離的5’羥基的核苷酸；將具有亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并合成亞磷酰胺四氮唑活性中間體；用乙酰酐和氮-甲基咪唑等混合形成乙酰化試劑封閉未參與反應(yīng)的5’ -羥基；將亞磷酰胺四氮唑活性中間體與具有游離的5’羥基的核苷酸進行縮合反應(yīng)得到寡核苷酸鏈；將寡核苷酸鏈用含碘的四氫呋喃溶液處理得到穩(wěn)定的寡核苷酸；按照miRNA文庫中的miR-140的堿基序列重復(fù)去脫保護基、活化、連接、封閉、氧化步驟265次得到miR-140初級產(chǎn)物；將miR-140初級產(chǎn)物進行切割、脫保護基和純化作用得到miR-140模擬物。2)將miR-140模擬物用無RNA酶水稀釋至濃度為60 μ g/ml的miR-140模擬物溶液；3)將聚乙烯亞胺聚合物溶于150mmol/L的氯化鈉溶液中制備濃度為O. 01mol/L的聚乙烯亞胺溶液；4)將miR-140模擬物溶液加入到聚乙烯亞胺溶液中，室溫孵育30分鐘得到裝載有miR-140的聚乙烯亞胺載體。5)將I重量份的裝載有miR-140的聚乙烯亞胺載體與I重量份的注射用水混合得到基因藥物。實施例5I)準(zhǔn)備腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸，用三氯乙酸脫去核苷酸中的二甲氧基三苯甲基保護基團得到具有游離的5’羥基的核苷酸；將具有亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并合成亞磷酰胺四氮唑活性中間體；用乙酰酐和氮-甲基咪唑等混合形成乙?；噭┓忾]未參與反應(yīng)的5’ -羥基；將亞磷酰胺四氮唑活性中間體與具有游離的5’羥基的核苷酸進行縮合反應(yīng)得到寡核苷酸鏈；將寡核苷酸鏈用含碘的四氫呋喃溶液處理得到穩(wěn)定的寡核苷酸；按照miRNA文庫中的miR-140的堿基序列重復(fù)去脫保護基、活化、連接、封閉、氧化步驟269次得到miR-140初級產(chǎn)物；將miR-140初級產(chǎn)物進行切割、脫保護基和純化作用得到miR-140模擬物。2)將miR-140模擬物用無RNA酶水稀釋至濃度為50 μ g/ml的miR-140模擬物溶液；3)將O. 3mmol的支鏈淀粉、O. 15mmol的羰基二咪唑溶于30ml無水二甲基亞砜中靜置4小時得到第一物質(zhì)；將O. 3mmol聚乙烯亞胺加入到第一物質(zhì)中混勻后放置I天得到第二物質(zhì)；將第二物質(zhì)進行透析步驟3天得到糖基化聚乙烯亞胺聚合物。
4)將糖基化聚乙烯亞胺聚合物溶于150mmol/L的氯化鈉溶液中制備濃度為O. 01mol/L的糖基化聚乙烯亞胺溶液；5MfmiR-HO模擬物溶液加入到糖基化聚乙烯亞胺溶液中，室溫孵育30分鐘得到裝載有miR-140的糖基化聚乙烯亞胺載體。6)將I重量份的裝載有miR-140的糖基化聚乙烯亞胺載體與I重量份的注射用水混合得到基因藥物。實施例6I)準(zhǔn)備腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸，用三氯乙酸脫去核苷酸中的二甲氧基三苯甲基保護基團得到具有游離的5’羥基的核苷酸；將具有亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并合成亞磷酰胺四氮唑活性中間體；用乙酰酐和氮-甲基咪唑等混合形成乙?；噭┓忾]未參與反應(yīng)的5’ -羥基；將亞磷酰胺四氮唑活性中間體與具有游離的5’羥基的核苷酸進行縮合反應(yīng)得到寡核苷酸鏈；將寡核苷酸鏈用含碘的四氫呋喃溶液處理得到穩(wěn)定的寡核苷酸；按照miRNA文庫中的miR-140的喊基序列重復(fù)去脫保護基、活化、連接、封閉、氧化步驟271次得到miR-140初級產(chǎn)物；將miR-140初級產(chǎn)物進行切割、脫保護基和純化作用得到miR-140模擬物。2)將miR-140模擬物用無RNA酶水稀釋至濃度為30 μ g/ml的miR-140模擬物溶液；3)將O. 3mmol的支鏈淀粉、O. 15mmol的羰基二咪唑溶于30ml無水二甲基亞砜中靜置4小時得到第一物質(zhì)；將O. 3mmol聚乙烯亞胺加入到第一物質(zhì)中混勻后放置I天得到第二物質(zhì)；將第二物質(zhì)進行透析步驟3天得到糖基化聚乙烯亞胺聚合物。4)將糖基化聚乙烯亞胺聚合物溶于150mmol/L的氯化鈉溶液中制備濃度為O. 05mol/L的糖基化聚乙烯亞胺溶液；5)將miR-140模擬物溶液加入到糖基化聚乙烯亞胺溶液中，室溫孵育30分鐘得到裝載有miR-140的糖基化聚乙烯亞胺載體。6)將I重量份的裝載有miR-140的糖基化聚乙烯亞胺載體與I重量份的注射用水混合得到基因藥物。實施例7I)準(zhǔn)備腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸，用三氯乙酸脫去核苷酸中的二甲氧基三苯甲基保護基團得到具有游離的5’羥基的核苷酸；將具有亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并合成亞磷酰胺四氮唑活性中間體；用乙酰酐和氮-甲基咪唑等混合形成乙酰化試劑封閉未參與反應(yīng)的5’ -羥基；將亞磷酰胺四氮唑活性中間體與具有游離的5’羥基的核苷酸進行縮合反應(yīng)得到寡核苷酸鏈；將寡核苷酸鏈用含碘的四氫呋喃溶液處理得到穩(wěn)定的寡核苷酸；按照miRNA文庫中的miR-140的堿基序列重復(fù)去脫保護基、活化、連接、封閉、氧化步驟263次得到miR-140初級產(chǎn)物；將miR-140初級產(chǎn)物進行切割、脫保護基和純化作用得到miR-140模擬物。2)將miR-140模擬物用無RNA酶水稀釋至濃度為10 μ g/ml的miR-140模擬物溶液；3)將O. 3mmol的支鏈淀粉、O. 15mmol的羰基二咪唑溶于30ml無水二甲基亞砜中靜置4小時得到第一物質(zhì)；將O. 3mmol聚乙烯亞胺加入到第一物質(zhì)中混勻后放置I天得到第二物質(zhì)；將第二物質(zhì)進行透析步驟3天得到糖基化聚乙烯亞胺聚合物。4)將糖基化聚乙烯亞胺聚合物溶于150mmol/L的氯化鈉溶液中制備濃度為O. lmol/L的糖基化聚乙烯亞胺溶液；
5)將miR-140模擬物溶液加入到糖基化聚乙烯亞胺溶液中，室溫孵育30分鐘得到裝載有miR-140的糖基化聚乙烯亞胺載體。6)將I重量份的裝載有miR-140的糖基化聚乙烯亞胺載體與I重量份的注射用水混合得到基因藥物。對肝癌細胞中的miR-140進行芯片分析，驗證miR-140在腫瘤組織中是否具有低表達。將RNA從肝癌細胞中抽提出來。RNA的抽提方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的抽提方法。將包括8 μ I 2. 5χ標(biāo)記物緩沖液、2 μ I Hy3 熒光標(biāo)記物、2 μ I標(biāo)記酶、5 μ I RNA、3 μ I無RNA酶水的標(biāo)記試劑盒置于冰上，放置15 20min，使試劑盒中的內(nèi)容物充分融化，進行吹打混勻，使液體聚于管底。將抽提出來的RNA和標(biāo)記試劑盒在0°C下孵育一小時，然后轉(zhuǎn)入65°C下孵育15分鐘，得到已標(biāo)記的miRNA。在已標(biāo)記的miRNA里面加入350 μ I濃縮試劑盒中的Buffer RLT，充分混勻，然后加入3. 5倍體積無水乙醇，充分混勻。將已標(biāo)記的RNA加入濃縮試劑盒的離心管中，以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心15秒，去除濾出液。將試劑盒的離心管放到一個新的收集管中，力口入20 μ I /K，以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心I分鐘，沉淀即為濃縮的標(biāo)記miRNA。在10 μ L的濃縮標(biāo)記miRNA中加入10 μ L芯片雜交試劑盒中的2χ雜交緩沖液，在95°C孵育3飛分鐘后，在12000r/min轉(zhuǎn)速下離心兩分鐘得到雜交miRNA。在雜交小室兩端的小孔中加10 μ I水，在雜交小室中擱入芯片，印有芯片的那面朝上，將蓋玻片擱到芯片上，完全覆蓋，在一側(cè)加入20 μ I雜交miRNA，利用毛細作用使雜交樣品進入兩玻片間，將雜交小室的上蓋板蓋好，將金屬夾子夾好，在60°C下水浴16小時后取出玻片，將撥片浸入600C的洗滌溶液A中，晃動，至蓋玻片脫落；將芯片浸入洗滌溶液B中一次，然后浸入一管新的洗滌溶液B中，晃動2分鐘；然后將芯片在洗滌溶液C中洗滌2分鐘，在1000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘得到干燥芯片。洗滌溶液A、B、C均來自芯片雜交試劑盒，其中洗滌溶液A由20mL的20x鹽溶液、IOmL的10%洗滌劑溶液、2mL的無RNA酶水組成；溶液B由4mL的20x鹽溶液、溶液C由176mL的20x鹽溶液、190mL的10%洗滌劑溶液、198mL的無RNA酶水組成。將干燥芯片使用Gen印ix 4000B進行圖像掃描，使用635nm熒光下激發(fā)。
圖I為芯片分析結(jié)果，涂黑的部分表示該miRNA在肝癌中低表達。從圖I的結(jié)果可知，miR-140在孤立性大肝癌、結(jié)節(jié)性肝癌和小肝癌等三種肝癌亞型中均呈低表達，證明肝癌細胞中miR-140的含量低，對抑制肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力不強。對實施例I中化學(xué)合成的miR-140模擬物進行基因測序分析。將實施例的miR-140模擬物與miR-140標(biāo)準(zhǔn)品同時進行基因測序分析，將基因測序結(jié)果與miRNA文庫中的miR-140的堿基序列進行比對。圖2為實施例I的miR-140模擬物基因測序分析結(jié)果，從圖2可知，實施例I的miR-140模擬物的基因測序結(jié)果與miR-140標(biāo)準(zhǔn)品完全一致，同時測得的實施例I的miR-140模擬物的堿基序列與miRNA文庫中的miR-140的堿基序列完全一致，證明按照本發(fā)明的化學(xué)合成方法可以得到miR-140模擬物，與人體內(nèi)的miR-140的堿基序列完全一致。體外模擬試驗
HCCLM3型肝癌細胞的劃痕愈合試驗取對數(shù)生長期HCCLM3型肝癌細胞接種于預(yù)處理的6孔板上(10 μ g/ml纖維蛋白原的PBS過夜)，培養(yǎng)細胞至單層貼壁生長，融合率達到100%。用10 μ I微量移液器頭輕劃細胞表面，在DMEM培基漂洗2次，去除刮下的漂浮細胞及殘留FBS。實驗組的HCCLM3型肝癌細胞在無FBS的DMEM培養(yǎng)基中分別加入200 μ I實施例Γ7的基因藥物，培養(yǎng)48h。實驗組的HCCLM3細胞在無FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h。表I為實施例f 7和對比例I中中HCCLM3型肝癌細胞在0tT48h時的劃痕愈合情況。劃痕愈合率代表腫瘤細胞的遷徙運動能力，劃痕愈合率越低，則證明HCCLM3型肝癌細胞的遷徙運動能力越低，肝癌細胞的轉(zhuǎn)移能力更低。圖3為實驗組和對照組的細胞劃痕愈合情況示意圖。表I劃痕愈合率試驗結(jié)果表
權(quán)利要求
1.一種用于治療肝癌的基因藥物，其特征在于，所述基因藥物包括治療有效量的核苷酸序列和輔料；所述有效量的核苷酸序列為具有SEQ No. I的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因藥物，其特征在干，進ー步包括將所述核苷酸序列負載的載體，所述載體為聚こ烯亞胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因藥物，其特征在于，所述聚こ烯亞胺為糖基化聚こ烯亞胺；所述糖基化聚こ烯亞胺的氮/磷比為6 48。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因藥物，其特征在于，所述糖基化聚こ烯亞胺的氮/磷比為24。
5.一種權(quán)利要求I至4任一項所述基因藥物的制備方法，包括以下步驟 1)將腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸、胸嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸進行體外合成步驟得到miR-140模擬物； 2)將所述miR-140模擬物與輔料混合得到基因藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，還包括以下步驟 1)按照權(quán)利要求5的方法制備miR-140模擬物，將所述miR-140模擬物用無RNA酶的水稀釋成miR-140模擬物溶液； 2)將聚こ烯亞胺聚合物溶于氯化鈉溶液中制備濃度為O.ΟΓΟ. lmol/L的聚こ烯亞胺溶液； 3)將所述聚こ烯亞胺溶液對所述miR-140模擬物溶液進行包裹步驟得到裝載有miR-140基因的聚こ烯亞胺載體； 4)將所述聚こ烯亞胺載體與輔料混合得到基因藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，還包括以下步驟 1)按照權(quán)利要求5的方法制備miR-140模擬物，將所述miR-140模擬物用無RNA酶的水稀釋成miR-140模擬物溶液； 2)將2重量份的支鏈淀粉、I重量份的羰基ニ咪唑溶于無水ニ甲基亞砜中靜置4小時得到第一物質(zhì)；將2重量份聚こ烯亞胺加入到所述第一物質(zhì)中混勻后放置I天得到第二物質(zhì)；將所述第二物質(zhì)進行透析步驟3天得到糖基化聚こ烯亞胺聚合物；將所述糖基化聚こ烯亞胺聚合物溶于氯化鈉溶液中制備濃度為O. ΟΓΟ. lmol/L的糖基化聚こ烯亞胺溶液； 3)將所述糖基化聚こ烯亞胺溶液對所述miR-140模擬物溶液進行包裹步驟得到裝載有miR-140基因的糖基化聚こ烯亞胺載體。
4)將所述糖基化聚こ烯亞胺載體與輔料混合得到基因藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項所述的制備方法，其特征在于，所述體外合成步驟為 1)用三氯こ酸脫去核苷酸中的ニ甲氧基三苯甲基保護基團得到具有游離的5’羥基的核苷酸； 2)將具有亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并合成亞磷酰胺四氮唑活性中間體； 3)將所述亞磷酰胺四氮唑活性中間體與所述具有游離的5’羥基的核苷酸進行縮合反應(yīng)得到寡核苷酸鏈； 4)將所述寡核苷酸鏈用含碘的四氫呋喃溶液處理得到穩(wěn)定的寡核苷酸； 5)按照miRNA基因文庫中miR-140的堿基序列重復(fù)步驟I)至步驟4)263 271次得到具有miR-140堿基序列的初級產(chǎn)物； 6)將所述初級產(chǎn)物進行切割、脫保護基和純化步驟得到miR-140模擬物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項所述的制備方法，其特征在于，所述包裹步驟為將所述miR-140模擬物溶液加入到載體溶液中，在室溫下孵育30分鐘得到裝載有miR-140基因的載體。
10.一種權(quán)利要求I至5任一項所述基因藥物的應(yīng)用，其特征在于，所述基因藥物通過口服、腸胃外施用或者全身施用的方式治療肝癌，miR-140的含量為2 μ g/次。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療肝癌的基因藥物及其制備方法和應(yīng)用，基因藥物包括治療有效量的核苷酸序列和輔料；有效量的核苷酸序列為具有SEQ No.1的核苷酸序列。解決了現(xiàn)有治療肝癌的藥物不能有效抑制肝癌細胞生長，復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移的技術(shù)問題。
文檔編號A61P1/16GK102847171SQ20121037043
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者楊連粵, 楊浩 申請人:中南大學(xué)湘雅醫(yī)院