一種仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)和功能的組織工程支架及其制備方法。該支架由生物可降解高分子制備、荷載有生長因子，表面遍布平行排列的微米級溝槽、外表面又為納米拓撲結(jié)構(gòu)的多孔膜狀物。制備方法如下：將載生長因子的納米顆粒與生物降解聚合物溶液攪拌均勻后，澆鑄到刻有平行排列溝槽的模具表面，冷凍二干燥去除溶劑，再進一步對支架進行表面處理后荷載生長因子，即得。本發(fā)明的組織工程支架具有的平行排列微米級溝槽結(jié)構(gòu)、表面納米拓撲結(jié)構(gòu)及其所荷載的生長因子可對血管平滑肌細胞的生長和繁衍起到與天然血管中膜層細胞外基質(zhì)相似的誘導(dǎo)與促進作用，使血管平滑肌細胞能在人工的支架上如同在天然血管的中膜層那樣呈取向有序的生長和繁衍。
【專利說明】一種仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]對于血管組織工程而言，生物可降解的支架起著支持并誘導(dǎo)細胞生長和繁衍、規(guī)定再生組織形狀和大小，并最終和機體組織結(jié)合在一起的作用，與細胞和生長因子一起成為組織工程的三大要素。目前，雖然有許多采用不同材料支架的血管組織工程研究報道，但是這些支架的結(jié)構(gòu)和功能與天然血管的細胞外基質(zhì)相比差距甚遠，且至今也未見與天然血管有相似結(jié)構(gòu)和功能的組織工程血管支架的報道。
[0003]血管壁是由外膜、中膜和內(nèi)膜所組成，其中的中膜是由高度取向的血管平滑肌細胞層組成，而在這些細胞層里平滑肌細胞和細胞外基質(zhì)沿圓周取向排列，起著血管所呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)支持作用。因此，要形成與天然血管中膜具有相似結(jié)構(gòu)和功能的組織工程血管，就必須要求支架能提供類似天然血管中膜對平滑肌細胞所提供的仿生結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，使血管平滑肌細胞和細胞外基質(zhì)在這樣的支架上沿圓周取向排列，早期能夠保持合成表型，使細胞快速生長和繁衍；而后期能使合成表型的細胞向收縮表型轉(zhuǎn)換，從而使血管具有生理活性和阻止新內(nèi)膜的形成。
[0004]目前一般采用的仿生方法就是先制備表面呈不同取向角度排列結(jié)構(gòu)的二維支架，然后再將其卷繞成多層的管狀結(jié)構(gòu)，以此得到不同圓形層內(nèi)具有不同斜度螺旋結(jié)構(gòu)的管形支架。但目前研究報道的均 是具有單一微米取向結(jié)構(gòu)或納米結(jié)構(gòu)表面拓撲形貌的聚內(nèi)酯二維支架。這種單一的表面拓撲形貌支架對于控制血管平滑肌細胞的粘附、生長、空間組織和功能并不很理想。
[0005]此外，理想的支架應(yīng)具備與天然組織相似的能分泌生長因子的功能。所以如果將與中膜再生相關(guān)生長因子一起荷載到具有多重表面拓撲形貌的多孔聚內(nèi)酯類支架上，使它們按一定的時間和濃度釋放以調(diào)控血管平滑肌細胞的增殖和分化，就有望成為具有天然血管壁中血管平滑肌細胞的生物化學和物理信號微環(huán)境功能的仿生血管支架。
[0006]由于聚乙交酯(PLA)、聚丙交酯(PGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)以及它們的共聚物等聚內(nèi)酯聚合物具有良好的生物相容性、良好的機械性能和可調(diào)的降解速率已獲得我國和美國等國家FDA的認證，成為可以應(yīng)用于制備植入體內(nèi)的醫(yī)療制品。因此用聚內(nèi)酯類生物降解高分子作為組織工程化血管支架的基材可以兼具安全性和有效性，具有應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架及其制備方法。
[0008]本發(fā)明所提供的組織工程支架是按照包括下述步驟的方法制備得到的:
[0009]I)制備載生長因子A的納米顆粒和載生長因子B的納米顆粒；或制備同時載生長因子A和B的納米顆粒；所述納米顆粒為可降解納米顆粒；
[0010]2)配制生物可降解聚合物的溶液，并向所述溶液中加入步驟I)制備的載生長因子A的納米顆粒和載生長因子B的納米顆?；蛲瑫r載生長因子A和B的納米顆粒，攪拌均勻后澆鑄到刻有平行排列溝槽的模具中，冷凍干燥去除溶劑，得到荷載生長因子A和B且表面具有平行排列的溝槽的膜狀多孔支架；
[0011]3)對所述膜狀多孔支架進行表面處理，使支架表面具有納米拓撲結(jié)構(gòu)；
[0012]4)在步驟3)處理后的膜狀多孔支架上荷載生長因子C，得到同時荷載生長因子A\B\C、表面既具平行排列微米級溝槽結(jié)構(gòu)、又具納米拓撲結(jié)構(gòu)的多孔結(jié)構(gòu)的膜狀物，即所述仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架。
[0013]上述方法，步驟I)中載生長因子納米顆粒的制備方法具體如下:將納米顆粒浸泡在生長因子A和/或B溶液中一段時間后，離心洗滌并冷凍干燥后，得到載生長因子的納米顆粒，載生長因子A和/或B的納米顆粒中生長因子A或B的質(zhì)量含量為0.005-2.0%。
[0014]所述納米顆粒具體可選自下述任意一種:明膠納米顆粒、膠原納米顆粒和二氧化娃納米顆粒。
[0015]所述明膠納米顆粒和膠原納米顆粒的粒徑均為400-1000納米。其由乳液-冷凝法制備，采用的乳化溫度為35-45°C，攪拌速率為4-6千轉(zhuǎn)/分鐘，乳化時間為2-10分鐘。
[0016]所述二氧化硅納米顆粒的粒徑為30-300納米，其由溶膠-凝膠法制備得到。
[0017]步驟2)中生物可降解聚合物與載生長因子的納米顆粒質(zhì)量比為0.8-20。
[0018]本發(fā)明中所述生`長因子A、生長因子B、生長因子C不相同但均為可促進血管中膜再生的生長因子。具體可選自下述任意一種:bFGF、TOGF-BB和TGF-β I。
[0019]生長因子溶液的濃度可為50ng/ml-500y g/ml，浸泡時間為5-300分鐘。
[0020]上述方法，步驟2)中所述生物可降解聚合物為聚內(nèi)酯。具體可選自下述任意一種單體形成的均聚物和至少兩種單體形成的共聚物中的任意一種:乙交酯(GA)、L-乳酸(LLA)、DL-乳酸(DLLA)和己內(nèi)酯(CL)。
[0021]所述生物可降解聚合物的溶液的濃度可為2.0-9.0g/100ml。
[0022]所述生物可降解聚合物的溶液中的溶劑是由第一溶劑和第二溶劑組成的混合溶劑；其中，第一溶劑選自下述至少一種:二氧六環(huán)、苯和四氫呋喃，第二溶劑選自下述至少一種:丙酮、三氯甲烷、乙醇和水；所述混合溶劑中所述第二溶劑的體積含量為2.0-10.0%。
[0023]步驟2)中所述刻有平行排列溝槽的模具中溝槽的寬為10-200微米，溝槽深為2-50微米，相鄰溝槽的間距為2-30微米。
[0024]上述方法，步驟3)中對所述膜狀多孔支架進行表面處理的方法可選自下述至少一種:等離子體處理法、水解處理法和等離子體處理-生物大分子錨定法。
[0025]等離子體處理-生物大分子錨定法是先對支架進行等離子體處理，然后再在支架上錨定膠原、陽離子化明膠或?qū)诱尺B蛋白等生物大分子的方法。
[0026]所述等離子體處理-生物大分子錨定法中所采用的生物大分子選自下述任意一種:膠原、陽離子化明膠和層粘連蛋白。
[0027]在步驟3)處理后的膜狀多孔支架上荷載生長因子C的方法可采用等離子體處理-生長因子錨定法或大分子自組裝法。[0028]本發(fā)明所制備的仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架中生長因子A、生長因子B和生長因子C的質(zhì)量含量為0.001-0.5%。
[0029]所述支架表面平行排列溝槽的寬為10-200微米，溝槽深為2-50微米，相鄰溝槽的間距為2-30微米。所述支架為膜狀多孔支架，其厚度為50-1000微米。
[0030]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果:
[0031 ] 1、本發(fā)明同時模擬天然血管中膜組織的結(jié)構(gòu)與功能，構(gòu)建兼具多孔結(jié)構(gòu)、平行排列微米級溝槽結(jié)構(gòu)和納米表面拓撲結(jié)構(gòu)多重表面拓撲形貌，并且能夠在一定時間以一定的濃度釋放出多種保持生物活性的生長因子，符合血管組織工程要求的支架。
[0032]2、本發(fā)明的組織工程支架由合成的可生物降解的聚內(nèi)酯聚合物制備，聚內(nèi)酯具有良好的生物相容性、良好的機械性能和可調(diào)的降解速率，實現(xiàn)了支架的力學性能、降解時間的可控性。
[0033]3、本發(fā)明在支架上以不同的方法同時荷載多種生長因子，使各種生長因子以一定的濃度和時間保持活性釋放。
【具體實施方式】
[0034]下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0035]下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0036]本發(fā)明提供的仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架的制備方法，步驟如下:1)載生長因子納米顆粒的制備:將納米粒子浸泡在生長因子A和/或B溶液中一段時間后，離心洗滌并冷凍干燥后，得到載生長因子的納米顆粒。
[0037]制備納米粒的材料為明膠、膠原或二氧化硅。
[0038]明膠納米粒子、膠原納米粒子由乳液-冷凝法制備，粒徑為400-1000納米。采用的乳化溫度為40°C，攪拌速率為4-6千轉(zhuǎn)/分鐘，乳化時間為2-10分鐘。
[0039]二氧化硅納米粒子由溶膠-凝膠法制備，粒徑為30-300納米。
[0040]所述生長因子A、 生長因子B和生長因子C各不相同，均可選自下述任意一種:bFGF、PDGF-BB 和 TGF- β I。
[0041]生長因子溶液的濃度可為50ng/ml-500 μ g/ml，浸泡時間為5-300分鐘。
[0042]2)仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架制備:配制一定濃度的生物可降解聚合物溶液，與載生長因子A和B納米顆粒攪拌均勻后澆鑄到刻有平行排列溝槽的模具表面，通過冷凍行燥去除溶劑，進一步對支架進行表面處理后，再將支架浸泡在生長因子C溶液中一段時間后，冷凍干燥得到具有仿天然血管中膜結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架。
[0043]所述生物可降解聚合物為生物可降解的聚內(nèi)酯，具體可以為聚乙交酯(PGA)、聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)，以及它們的共聚物。
[0044]所述聚合物溶液的濃度為2.0-9.0% (w/v)，溶劑則是由第一溶劑和第二溶劑組成的混合溶劑，其中第一溶劑為二氧六環(huán)、苯、四氫呋喃或它們的混合物、第二溶劑為丙酮、三氯甲烷、乙醇或水；混合溶劑中第二溶劑的含量為2.0-10.0% (v/v)。
[0045]所述表面處理的方法選自下述至少一種:等離子體處理技術(shù)、水解處理技術(shù)，或等離子體處理-生物大分子錨定技術(shù)。[0046]所述等離子體處理-生物大分子錨定表面處理技術(shù)中所采用的生物大分子具體是膠原、陽離子化明膠或?qū)诱尺B蛋白。
[0047]在這種仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架上培養(yǎng)的牛大動脈平滑肌細胞，沿著溝槽方向生長，在早期能夠保持細胞的合成表型，使細胞快速生長和繁衍，而后期能使合成表型的細胞向收縮表型轉(zhuǎn)換，從而使再生的血管具有生理活性和阻止新內(nèi)膜的形成。
[0048]在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。下列實施例旨在進一步描述本發(fā)明方法的各個方面。
[0049]實施例1、制備仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架
[0050]第一步:載生長因子bFGF明膠顆粒的制備:5ml的質(zhì)量濃度為10%明膠水溶液滴加入175ml的橄欖油中，40°C和5千轉(zhuǎn)/分鐘下攪拌10分鐘，然后將乳液冷卻至室溫，持續(xù)攪拌30分鐘，加入100ml丙酮，在5千轉(zhuǎn)/分鐘下繼續(xù)攪拌lh，生成顆粒分別用丙酮和4°C異丙醇洗滌后，離心收集。將得到的顆粒放入包含0.1%吐溫60的2%戊二醛溶液中，4°C交聯(lián)12小時。然后將顆粒放入100ml包含0.1 %吐溫60的IOmM氨基酸溶液中，37°C下攪拌30分鐘。用質(zhì)量濃度0.1 %吐溫60溶液洗滌后，離心冷凍干燥，得到粒徑為0.6-20微米的明膠顆粒。選取IOOmg粒徑為600-1000納米明膠顆粒浸泡在500 μ I濃度為200 μ g/ml的bFGF溶液中2小時，離心洗滌并冷凍干燥后，得到載bFGF的明膠顆粒，負載在IOOmg明膠顆粒上的bFGF為85.81 μ g。
[0051]第二步:載生長因子TGF-β I 二氧化硅納米顆粒制備:將200mg的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) ,96ml的水和0.7ml的2M濃度的NaOH水溶液在80°C下混合，保持30min，然后加入0.6ml的正硅酸乙酯(TEOS)，80°C下600轉(zhuǎn)/分攪拌下維持2小時，停止加熱并恢復(fù)至室溫，離心收集生成的二氧化硅粒子，甲醇洗滌。將上述獲得的二氧化硅粒子，加入由25mL甲醇和ImL濃鹽酸(質(zhì)量濃度37% )組成的溶液中，加熱回流10h，停止加熱并恢復(fù)至室溫。離心收集，甲醇洗滌，得到的二氧化硅的平均粒徑為160nm。取IOOmg 二氧化硅浸泡在500 μ I濃度為180 μ g/ml的TGF- β I溶液中2小時，離心洗滌并冷凍干燥后，得到載TGF- β I的二氧化硅納米顆粒，負載在IOOmg 二氧化硅顆粒上的TGF- β I為81.60 μ g。
[0052]第三步:將PLGA(L-LA/GA = 70/30，mol/mol)(數(shù)均分子量為12萬)配制成質(zhì)量濃度為5%的二氧六環(huán)溶液640 μ 1，并加入30 μ I水混合均勻，加入載bFGF的納米明膠顆粒8mg和載TGF-β I的二氧化硅納米粒子8mg，攪拌均勻，澆鑄到大小為3 X 3cm2表面具有平行排列溝槽的聚二甲基硅氧烷(PDMS)上，溝寬為50微米，溝槽深度5微米，槽間距為5微米。冷凍干燥使溶劑揮發(fā)，得到表面具有平行排列的微米級溝槽的多孔膜，膜厚度為100微米。
[0053]第四步:在0.25M NaOH/乙醇(V/V = 1/1)混合溶劑中，20°C下，浸泡薄膜2小時，用水洗滌并冷凍干燥后，得到表面既具平行排列的微米級溝槽、又具納米拓撲結(jié)構(gòu)的多孔膜狀物。
[0054]第五步:在功率為50W，氧氣氛下等離子體處理10分鐘，然后浸泡在2ml濃度為30 μ g/ml的TOGF-BB中，I小時后取出薄膜并用水洗滌三遍，得到仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的血管組織工程支架，即實驗樣(47mg)。實驗樣中bFGF、TGF-β I及TOGF-BB的含量分別為 6.87 μ g、6.48 μ g 和 33.60 μ g。[0055]對照樣I的制備:將PLGA(L-LA/GA = 70/30，mol/mol)(數(shù)均分子量為12萬)配制成濃度為5%三氯甲烷溶液640μ 1，澆鑄到光滑的大小為3X3cm2四氟乙烯槽中，室溫下使溶劑揮發(fā)，得到表面光滑無孔的致密結(jié)構(gòu)膜，作為對照樣I。
[0056]對照樣2的制備:將PLGA(L-LA/GA = 70/30，mol/mol)(數(shù)均分子量為12萬)配制成濃度為5%二氧六環(huán)溶液640 μ 1，并加入30 μ I水混合均勻，澆鑄到3X3cm2PDMS表面具有平行排列溝槽的PDMS上，溝寬為50微米，溝槽深度5微米，槽間距為5微米上，冷凍干燥使溶劑揮發(fā)，然后在0.25M NaOH/乙醇(V/V = 1/1)混合溶劑中，20°C下，浸泡薄膜2小時，用水洗滌并在室溫下干燥后，在功率為50W，氧氣氛下等離子體處理10分鐘，得到表面既具平行排列的微米級溝槽、又具納米拓撲結(jié)構(gòu)的多孔膜狀物，作為對照樣2。
[0057]釋放實驗:支架(實驗樣)浸泡在包含I %牛血清蛋白的磷酸緩沖液(pH 7.4)里，每隔一定時間后收集釋放介質(zhì)，采用ELISA方法測定其中的生長因子的量。實驗結(jié)果顯示:荷載在仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的血管組織工程支架上的三種生長因子均能持續(xù)釋放，bFGF能持續(xù)釋放21天，釋放量為79% JGF-β I能持續(xù)釋放28天，釋放量為81% ；PDGF-BB能持續(xù)釋放5天 ，釋放量為85%。
[0058]體外細胞培養(yǎng):將牛大動脈平滑肌細胞分別種植到對照樣1、對照樣2和實驗樣上。實驗結(jié)果顯示:在對照樣I上，平滑肌細胞和細胞外基質(zhì)呈無規(guī)組織形態(tài)；牛大動脈平滑肌細胞在實驗樣上培養(yǎng)3天后，細胞增殖明顯大于在兩種對照樣上的增殖，細胞沿著溝槽方向取向生長，而且平滑肌細胞骨架蛋白也沿著溝槽方向取向分布和聚集。培養(yǎng)15天后，牛大動脈平滑肌細胞的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)和hl-calponin等分化標志蛋白表達在實驗樣上最強。此研究結(jié)果表明在這種仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的血管組織工程支架上，培養(yǎng)血管平滑肌細胞在早期能夠保持細胞的合成表型，使細胞快速生長和繁衍，而后期能使合成表型的細胞向收縮表型轉(zhuǎn)換，從而使再生的血管具有生理活性和阻止新內(nèi)膜的形成。
[0059]實施例2、制備仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架
[0060]第一步:按照實施例1的方法制備載生長因子bFGF明膠顆粒。
[0061]第二步:按照實施例1的方法制備載生長因子TGF-β I 二氧化硅納米顆粒。
[0062]第三步:將PGLC (GA/L-LA/CL = 63/27/10，mol/mol/mol)(數(shù)均分子量為 8 萬)，配制成濃度為6%四氫呋喃溶液630 μ 1，并加入40 μ I三氯甲烷混合均勻，加入載bFGF的納米明膠顆粒8mg、和TGF-β I的二氧化娃納米粒子8mg,攪拌均勻,燒鑄到大小為3X3cm2表面具有平行排列溝槽的PDMS上，溝寬為80微米，溝槽深度5微米，槽間距為10微米。冷凍干燥使溶劑揮發(fā)，得到表面具有平行排列的微米級溝槽的多孔膜，膜厚度為80微米。
[0063]第四步:在功率為50W，氧氣氛下等離子體處理10分鐘，再浸泡在2ml濃度為30 μ g/ml的TOGF-BB中，I小時后取出薄膜并用水洗滌三遍，得到仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的血管組織工程支架，即實驗樣(50mg)。實驗樣中bFGF、TGF-β I及TOGF-BB的含量分別為 6.87 μ g、6.48 μ g 和 33.60 μ g。
[0064]對照樣I 的制備:將 PGLC(GA/L-LA/CL = 63/27/10,mol/mol/mol)(數(shù)均分子量為8萬)配制成濃度為6%三氯甲烷630 μ 1，澆鑄到光滑的大小為3X3cm2四氟乙烯槽中，室溫下使溶劑揮發(fā)，得到表面光滑無孔的致密結(jié)構(gòu)膜，作為對照樣I。
[0065]對照樣2的制備:將PGLC(GA/L-LA/CL = 63/27/10)(摩爾比，數(shù)均分子量為8萬)配制成濃度為6%四氫呋喃溶液630 μ 1，并加入40 μ I三氯甲烷混合均勻，澆鑄到3 X 3cm2PDMS表面具有平行排列溝槽的PDMS上，溝寬為80微米，溝槽深度5微米，槽間距為10微米，冷凍干燥使溶劑揮發(fā)，然后在功率為50W，氧氣氛下等離子體處理10分鐘，得到表面既具平行排列的微米級溝槽、又具納米拓撲結(jié)構(gòu)的多孔膜狀物，作為對照樣2。
[0066]釋放實驗:支架浸泡在包含I %牛血清蛋白的磷酸緩沖液(pH 7.4)里，每隔一定時間后收集釋放介質(zhì)，采用ELISA方法測定其中的生長因子的量。實驗結(jié)果顯示:荷載在仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的血管組織工程支架上的三種生長因子均能持續(xù)釋放，bFGF能持續(xù)釋放23天，釋放量為76%;TGF-13 I能持續(xù)釋放30天，釋放量為72%;PDGF_BB能持續(xù)釋放7天，釋放量為75%。
[0067]體外細胞培養(yǎng):將牛大動脈平滑肌細胞分別種植到對照樣1、對照樣2和實驗樣上。實驗結(jié)果顯示:在對照樣I上，平滑肌細胞和細胞外基質(zhì)呈無規(guī)組織形態(tài)；培養(yǎng)3天后，牛大動脈平滑肌細胞在實驗樣上的增殖明顯大于在兩種對照樣上的增殖，并且細胞沿著溝槽方向取向生長，而且平滑肌細胞骨架蛋白也沿著溝槽方向取向分布和聚集。培養(yǎng)15天后，牛大動脈平滑肌細胞的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)和hl-calponin等分化標志蛋白表達在實驗樣上最強。此研究結(jié)果表明在這種仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的血管組織工程支架上，培養(yǎng)血管平滑肌細胞在早期能夠保持細胞的合成表型，使細胞快速生長和繁衍，而后期能使合成表型的細胞向收縮表型轉(zhuǎn)換，從而使再生的血管具有生理活性和阻止新內(nèi)膜的形成。實施例3、制備仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架
[0068]第一步:載生長因子bFGF膠原顆粒的制備:5ml的質(zhì)量濃度為12%膠原溶液(溶劑為0.1N的乙酸水溶液)滴加入185ml的橄欖油中，40°C和5千轉(zhuǎn)/分鐘下攪拌10分鐘，然后將乳液冷卻至室溫，持續(xù)攪拌30分鐘，加入100ml丙酮，在5千轉(zhuǎn)/分鐘下繼續(xù)攪拌lh。生成顆粒分別用丙酮和4°C異丙醇洗滌后，離心收集。將得到的顆粒放入包含0.1%吐溫60的2%戊二醛溶液中，4°C交聯(lián)12小時。然后將顆粒放入100ml包含0.1%吐溫60的IOmM氨基酸溶液中，37°C下攪拌30分鐘。用0.1%吐溫60溶液洗滌后，離心冷凍干燥，得到粒徑為0.4-6微米的膠原顆粒。選取IOOmg粒徑為400-1000納米膠原顆粒浸泡在500 μ I濃度為200 μ g/ml的bFGF溶液中2小時，離心洗滌并冷凍干燥后，得到載bFGF的膠原顆粒，負載在IOOmg膠原顆粒上的bFGF為87.73 μ g。
[0069]第二步:載生長因子TGF-β I 二氧化硅納米顆粒制備:將200mg的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) ,96ml的水和0.7ml的2M濃度的NaOH水溶液在80°C下混合，保持30min，然后加入0.6ml的正硅酸乙酯(TEOS)，80°C下2千轉(zhuǎn)/分攪拌下維持2小時，停止加熱并恢復(fù)至室溫，離心收集生成的介孔二氧化硅粒子，甲醇洗滌。將上述獲得的粒子，加入由25mL甲醇和ImL濃鹽酸(質(zhì)量濃度37%)組成的溶液中，加熱回流10h，停止加熱并恢復(fù)至室溫。離心收集，甲醇洗滌，得到的二氧化硅的平均粒徑為50nm。取IOOmg 二氧化硅浸泡在500 μ I濃度為180 μ g/ml的TGF- β I溶液中2小時，離心洗滌并冷凍干燥后，得到載TGF- β I的二氧化硅納米顆粒,負載在IOOmg 二氧化硅顆粒上的TGF-β I為85.61 μ g。
[0070]第三步:將PGC(GA/CL = 50/50，mol/mol)(數(shù)均分子量為5萬)配制成濃度為8%苯溶液640 μ 1，并加入30 μ I水混合均勻，加入載bFGF的納米膠原顆粒5mg、和載TGF- β I的二氧化硅納米粒子5mg，攪拌均勻，澆鑄到大小為3 X 3cm2，表面具有平行排列溝槽的PDMS上，溝寬為50微米，溝槽深度5微米，槽間距為5微米。冷凍干燥使溶劑揮發(fā)，得到表面具有平行排列的微米級溝槽的多孔膜狀物，膜厚度為110微米。
[0071]第四步:在功率為20W，氨氣氛下等離子體處理10分鐘，然后浸泡在2ml濃度為
0.1 %的膠原溶液中(溶解膠原的溶劑為0.1N的乙酸水溶液)，其中膠原溶液中包含60 μ g的TOGF-BB，I小時后取出薄膜并用水洗滌三遍，得到仿天然血管中膜結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架，即實驗樣(53mg)。實驗樣中bFGF、TGF-β I及TOGF-BB的含量分別為4.39 μ g、
4.28μ g 和 30.26 μ go
[0072]對照樣I的制備:將PGC (GA/CL = 50/50，mol/mol)(數(shù)均分子量為5萬)配制成濃度為8%三氯甲烷溶液640μ 1，澆鑄到光滑的大小為3X3cm2四氟乙烯槽中，室溫下使溶劑揮發(fā)，得到表面光滑無孔的致密結(jié)構(gòu)膜，作為對照樣I。
[0073]對照樣2的制備:將PGC(GA/CL = 50/50，mol/mol)(數(shù)均分子量為5萬)配制成濃度為8%苯溶液640 μ 1，并加入30 μ I水混合均勻，澆鑄到3X3cm2 PDMS表面具有平行排列溝槽的PDMS上，溝寬為50微米，溝槽深度5微米，槽間距為5微米，冷凍干燥使溶劑揮發(fā)，然后在功率為20W，氨氣氛下等離子體處理10分鐘，然后浸泡在2ml濃度為0.1%膠原溶液中，I小時后取出洗滌后，得到表面既具平行排列的微米級溝槽、又具納米拓撲結(jié)構(gòu)的多孔膜狀物，作為對照樣2。
[0074]釋放實驗:支架浸泡在包含I %牛血清蛋白的磷酸緩沖液(pH 7.4)里，每隔一定時間后收集釋放介質(zhì)，采用ELISA方法測定其中的生長因子的量。實驗結(jié)果顯示:荷載在仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功 能的血管組織工程支架上的三種生長因子均能持續(xù)釋放，bFGF能持續(xù)釋放18天，釋放量為86%;TGF-13 I能持續(xù)釋放25天，釋放量為82%;PDGF_BB能持續(xù)釋放8天,釋放量為85%。
[0075]體外細胞培養(yǎng):將牛大動脈平滑肌細胞分別種植到對照樣1、對照樣2和實驗樣上。實驗結(jié)果顯示:在對照樣I上，平滑肌細胞和細胞外基質(zhì)呈無規(guī)組織形態(tài)；培養(yǎng)3天后，牛大動脈平滑肌細胞在實驗樣上的增殖明顯大于在兩種對照樣上的增殖，細胞沿著溝槽方向取向生長，而且平滑肌細胞骨架蛋白也沿著溝槽方向取向分布和聚集。培養(yǎng)15天后，牛大動脈平滑肌細胞的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)和hl-calponin等分化標志蛋白表達在實驗樣上最強。此研究結(jié)果表明在這種仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的血管組織工程支架上，培養(yǎng)血管平滑肌細胞在早期能夠保持細胞的合成表型，使細胞快速生長和繁衍，而后期能使合成表型的細胞向收縮表型轉(zhuǎn)換，從而使再生的血管具有生理活性和阻止新內(nèi)膜的形成。
[0076]實施例4、制備仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架
[0077]第一步:載生長因子TGF-β I明膠顆粒的制備:按照實施例1的方法制備明膠顆粒。選取IOOmg粒徑為600-1000納米明膠顆粒浸泡在500 μ I濃度為400 μ g/ml的TGF- β I溶液中2小時，離心洗滌并冷凍干燥后，得到載TGF-β I的明膠顆粒，負載在IOOmg明膠顆粒上的 TGF- β I 為 159.34 μ g。
[0078]第二步:載生長因子I3DGF-BB 二氧化硅納米顆粒制備:按照實施例3的方法制備二氧化硅納米顆粒。取平均粒徑為50nm的IOOmg 二氧化硅浸泡在500 μ I濃度為300 μ g/ml的TOGF-BB溶液中2小時，離心洗滌并冷凍干燥后，得到載I3DGF-BB的二氧化硅納米顆粒，負載在IOOmg 二氧化硅顆粒上的I3DGF-BB為106.53 μ g。[0079]第三步:將PLGA(L-LA/GA = 30/70，mol/mol)(數(shù)均分子量為15萬)溶解在苯和四氫呋喃的混合溶劑(體積比為1:1)中，配制成濃度為3%溶液640 μ 1，并加入30 μ I水混合均勻，加入載TGF- β I的明膠納米顆粒5mg、和載TOGF-BB的二氧化硅納米粒子5mg，攪拌均勻，澆鑄到大小為3X 3cm2，表面具有平行排列溝槽的PDMS上，溝寬為50微米，溝槽深度5微米，槽間距為5微米。冷凍干燥使溶劑揮發(fā)，得到表面具有平行排列的微米級溝槽的多孔膜狀物，膜厚度為70微米。
[0080]第四步:在功率為20W，二氧化碳氣氛下等離子體處理20分鐘，然后浸泡在2ml濃度為50 μ g/ml的bFGF中，I小時后取出薄膜并用水洗滌三遍，得到仿天然血管中膜結(jié)構(gòu)與功能的血管組織工程支架，即實驗樣(25mg)。實驗樣中bFGF、TGF-β I及TOGF-BB的含量分別為 56.30 μ g、5.33 μ g 和 30.26 μ g。
[0081]對照樣I的制備:將PLGA(L-LA/GA = 30/70，mol/mol)(數(shù)均分子量為15萬)溶解在氯仿中，配制成濃度為3%的氯仿溶液640μ 1，并澆鑄到光滑的大小為3X3cm2四氟乙烯槽中，室溫下使溶劑揮發(fā)，得到表面光滑無孔的致密結(jié)構(gòu)膜，作為對照樣I。
[0082]對照樣2的制備:將PLGA (L-LA/GA = 30/70，mol/mol)(數(shù)均分子量為15萬)溶解在苯和四氫呋喃的混合溶劑(體積比為1:1)中，配制成濃度為3%溶液640 μ 1，并加Λ 30 μ I水混合均勻，澆鑄到大小為3 X 3cm2，表面具有平行排列溝槽的PDMS上，溝寬為50微米，溝槽深度5微米，槽間距為5微米。冷凍干燥使溶劑揮發(fā)，然后在功率為20W，二氧化碳氣氛下等離子體處理20分鐘，得到表面既具平行排列的微米級溝槽、又具納米拓撲結(jié)構(gòu)的多孔膜狀物，作為對照樣2。
[0083]釋放實驗:支架浸泡在包含I %牛血清蛋白的磷酸緩沖液(pH 7.4)里，每隔一定時間后收集釋放介質(zhì)，采用ELISA方法測定其中的生長因子的量。實驗結(jié)果顯示:荷載在仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的血管組織工程支架上的三種生長因子均能持續(xù)釋放，bFGF能持續(xù)釋放7天，釋放量為72% J GF-β I能持續(xù)釋放27天，釋放量為79% ；PDGF-BB能持續(xù)釋放20天，釋放量為85%。
[0084]體外細胞培養(yǎng):將牛大動脈平滑肌細胞分別種植到對照樣1、對照樣2和實驗樣上。實驗結(jié)果顯示:在對照樣I上，平滑肌細胞和細胞外基質(zhì)呈無規(guī)組織形態(tài)；培養(yǎng)3天后，牛大動脈平滑肌細胞在實驗樣上的增殖明顯大于在兩種對照樣上的增殖，細胞沿著溝槽方向取向生長，而且平滑肌細胞骨架蛋白也沿著溝槽方向取向分布和聚集。培養(yǎng)15天后，牛大動脈平滑肌細胞的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)和hl-calponin等分化標志蛋白表達在實驗樣上最強。此研究結(jié)果表明在這種仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的血管組織工程支架上，培養(yǎng)血管平滑肌細胞在早期能夠保持細胞的合成表型，使細胞快速生長和繁衍，而后期能使合成表型的細胞向收縮表型轉(zhuǎn)換，從而使再生的血管具有生理活性和阻止新內(nèi)膜的形成。
【權(quán)利要求】
1.一種制備仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架的方法，包括下述步驟:1)制備載生長因子A的納米顆粒和載生長因子B的納米顆粒；或制備同時載生長因子A和生長因子B的納米顆粒；所述納米顆粒為可降解納米顆粒； 2)配制生物可降解聚合物的溶液，并向所述溶液中加入步驟I)制備的載生長因子A的納米顆粒和載生長因子B的納米顆?；蛲瑫r載生長因子A和生長因子B的納米顆粒，攪拌均勻后澆鑄到刻有平行排列溝槽的模具中，冷凍干燥去除溶劑，得到荷載生長因子A和B且表面具有平行排列的溝槽的膜狀多孔支架； 3)對所述膜狀多孔支架進行表面處理，使其表面具有納米拓撲結(jié)構(gòu)； 4)在步驟3)處理后的膜狀多孔支架上荷載生長因子C，得到所述仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架； 其中，所述生長因子A、生長因子B、生長因子C各不相同，但均為可促進血管中膜再生的生長因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I)中所述納米顆粒選自下述任意一種:明膠納米顆粒、膠原納米顆粒和二氧化娃納米顆粒； 所述明膠納米顆粒和膠原納米顆粒的粒徑均為400-1000納米；所述二氧化硅納米顆粒的粒徑為30-300納米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述生長因子A、生長因子B、生長因子C均選自下述任意一種:bFGF、PDGF-BB和TGF- β I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中`任一項所述的方法，其特征在于:步驟2)中所述生物可降解聚合物為聚內(nèi)酯，所述聚內(nèi)酯具體選自下述任意一種單體形成的均聚物和至少兩種單體形成的共聚物中的任意一種:乙交酯、L-乳酸、DL-乳酸和己內(nèi)酯； 步驟2)中所述生物可降解聚合物的質(zhì)量與載生長因子A的納米顆粒和載生長因子B的納米顆粒質(zhì)量之和的比為0.8-20，所述生物可降解聚合物與同時載生長因子A和生長因子B的納米顆粒的質(zhì)量比為0.8-20。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于:步驟2)中所述生物可降解聚合物的溶液的濃度為2.0-9.0g/100ml ； 所述生物可降解聚合物的溶液中的溶劑是由第一溶劑和第二溶劑組成的混合溶劑；其中，第一溶劑選自下述至少一種:二氧六環(huán)、苯和四氫呋喃，第二溶劑選自下述至少一種:丙酮、三氯甲烷、乙醇和水；所述混合溶劑中所述第二溶劑的體積含量為2.0-10.0%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于:步驟2)中所述刻有平行排列溝槽的模具中溝槽的寬為10-200微米，溝槽深為2-50微米，相鄰溝槽的間距為2-30微米。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于:步驟3)中對所述膜狀多孔支架進行表面處理的方法選自下述至少一種:等離子體處理法、水解處理法和等離子體處理-生物大分子錨定法； 所述等離子體處理-生物大分子錨定法中所采用的生物大分子選自下述任意一種:膠原、陽離子化明膠和層粘連蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于:在步驟3)處理后的膜狀多孔支架上荷載生長因子C的方法為等離子體處理-生長因子錨定法或大分子自組裝法。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于:所述仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架中生長因子A、生長因子B和生長因子C的質(zhì)量含量為0.001-0.5%。
10.權(quán)利要求1-9中任一項所述方法制備得到的仿天然血管中膜層結(jié)構(gòu)與功能的組織工程支架 。
【文檔編號】A61L27/54GK103656758SQ201210363899
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月26日
【發(fā)明者】沈紅, 吳德成, 楊飛, 王身國 申請人:中國科學院化學研究所