專利名稱：一種預(yù)防羅非魚鏈球菌病的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚用疫苗，特別涉及一種預(yù)防羅非魚鏈球菌病的疫苗。
背景技術(shù)：
羅非魚(Tilapia)為一種中小型魚,它是世界水產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)科研培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚類，且被譽(yù)為未來(lái)動(dòng)物性蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，原產(chǎn)于非洲，屬于麗鯛科之熱帶魚類，和鱸魚相似。羅非魚是我國(guó)重要的出口型經(jīng)濟(jì)魚類之一，其健康養(yǎng)殖的意義重大。但是，近年來(lái)在廣東、海南、福建等羅非魚主產(chǎn)區(qū)大規(guī)模的爆發(fā)羅非魚鏈球菌病， 波及范圍廣，病害控制難，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)病魚表現(xiàn)為精神、食欲很差，體色發(fā)黑，離群打轉(zhuǎn)游動(dòng)，部分病魚出現(xiàn)晶狀體混濁，眼球突出甚至脫落的現(xiàn)象；疾病的發(fā)病率接近40%，死亡量與氣溫呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性，氣溫在35°C以上時(shí)發(fā)病魚的死亡率可高達(dá)100%，養(yǎng)殖戶的損失慘重，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2009年該病對(duì)華南地區(qū)羅非魚養(yǎng)殖造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)7億人民幣。據(jù)調(diào)查，羅非魚病害往年已有發(fā)生，然而往年都能以氟苯尼考等藥物很快控制，但近年來(lái)的病害來(lái)勢(shì)兇猛，因耐藥性等原因，藥物控制效果差，養(yǎng)殖戶損失慘重。“羅非魚”作為海南人工養(yǎng)殖首要魚種，若不能有效地預(yù)防和控制疾病的發(fā)生及蔓延，海南將面臨“無(wú)魚可養(yǎng)”的局面。因此，安全有效的治療方式對(duì)于拯救海南羅非魚養(yǎng)殖業(yè)顯得迫在眉睫，疫苗免疫不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，是一種安全、有效、環(huán)保的方法，引起鏈球病菌的病原菌有海豚鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、副乳房鏈球菌、格式乳球菌等。申請(qǐng)?zhí)?00580013779.X，發(fā)明名稱“無(wú)乳鏈球菌疫苗”的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種疫苗，其中包含免疫有效量的分離β溶血性無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的完整滅活細(xì)胞和β溶血性無(wú)乳鏈球菌培養(yǎng)物的濃縮提取物，菌株是保藏號(hào)為NRRL Β-30608和NRRL Β-30607的無(wú)乳鏈球菌，根據(jù)實(shí)施例表2可以得知，將該疫苗以注射的方式免疫時(shí)，保護(hù)率為7(Γ80%，以浸泡的方式免疫時(shí)，保護(hù)率為34 35%，該專利申請(qǐng)公開(kāi)的疫苗實(shí)質(zhì)上是滅活無(wú)乳鏈球菌與外毒素的二聯(lián)疫苗，其安全性差，接種重量為5g的羅非魚會(huì)致死；申請(qǐng)?zhí)?01010207289. 6，發(fā)明名稱羅非魚二聯(lián)鏈球菌滅活疫苗的制備方法的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種羅非魚二聯(lián)鏈球菌滅活疫苗，菌種是保藏號(hào)CCTCCN0 M209279的海豚鏈球菌，以及保藏號(hào)為CCTCCN0 M209278的無(wú)乳鏈球菌，二者等比例混合制成羅非魚二聯(lián)鏈球菌滅活疫苗，胸腔或者腹腔注射免疫，保護(hù)率為85%左右，但用該無(wú)乳鏈球菌制備的單一疫苗的保護(hù)率卻并不高?，F(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的使用無(wú)乳鏈球菌制備的疫苗均是二聯(lián)疫苗，制備方法復(fù)雜、成本高，存在安全性問(wèn)題，需要尋找更為安全、成本低的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的疫苗和新菌株。
本發(fā)明疫苗，它是由無(wú)乳鏈球菌〔Streptococcus agaJaciiae)和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成。所述疫苗包含致免疫有效量的滅活的無(wú)乳鏈球菌以及藥學(xué)上可接受的輔料或者載體。所述的無(wú)乳鏈球菌是保藏號(hào)為ATCC51487無(wú)乳鏈球菌或者保藏號(hào)為CCTCC NO M2011271的無(wú)乳鏈球菌WR-6。
分離株 WR-6,鑒定為無(wú)乳鏈球菌"m&^Streptococcus agalactiae WR-6),于 2011 年7月28日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué))，保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011271。 所述致免疫有效量為不低于IX 106CFU/ml ;優(yōu)選地，所述的致免疫有效量為lX106-lX108CFU/ml。所述輔料或者載體為水或吸附劑。所述水為生理鹽水或蒸餾水，所述吸附劑是沸石或硅藻土。本發(fā)明還提供了前述疫苗在制備預(yù)防羅非魚鏈球菌病的藥物中的用途。其中，所述的預(yù)防羅非魚鏈球菌病的藥物是通過(guò)口服、注射或者浸泡的方式給藥的。本發(fā)明還提供了一種聯(lián)合用藥物，它包含前述的疫苗以及透皮吸收促進(jìn)劑且任選一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料或載體。其中，所述透皮吸收劑為氮酮，或莨菪堿。本發(fā)明最后提供了一種無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)菌株,它是由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011271的無(wú)乳鏈球菌WR-6。本發(fā)明疫苗，用福爾馬林滅活無(wú)乳鏈球菌菌液即得，注射免疫的保護(hù)率高達(dá)90%，用10倍正常注射劑量的疫苗攻毒時(shí)，未出現(xiàn)異常，為臨床提供了一種新的、安全、保護(hù)率高、制備方法簡(jiǎn)單、成本低廉的無(wú)乳鏈球菌單聯(lián)疫苗，可用于預(yù)防無(wú)乳鏈球菌引起的鏈球菌病。本發(fā)明保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011271的無(wú)乳鏈球菌WR-6滅活制備的單聯(lián)疫苗的保護(hù)率高，臨床應(yīng)用前景良好。


圖116S rDNA擴(kuò)增結(jié)果，I :空白對(duì)照；2 :鑒定樣品；M DL2000DNA maker。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I菌株的分離鑒定I、實(shí)驗(yàn)材料與方法I. I實(shí)驗(yàn)材料待鑒定的細(xì)菌從海南文昌的患病羅非魚體內(nèi)分離，分離培養(yǎng)基為BHI，培養(yǎng)溫度為37°C，編號(hào)為 WR-6。試劑耗材16S rDNA通用擴(kuò)增試劑盒(TAKARA)、BHI培養(yǎng)基、細(xì)菌生化微量鑒定管(杭州天和生物試劑有限公司)、Taq DNA聚合酶(TAKARA)、瓊脂糖(TianGen)、DL2000DNAmaker (TianGen)。I. 2實(shí)驗(yàn)方法I. 2. I革蘭氏染色劑觀察
取過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮斜面一支，用接種環(huán)挑取少量菌體，涂在滴有少量無(wú)菌生理鹽水的載玻片上，進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。I. 2. 216S rDNA的擴(kuò)增與分析以提取的細(xì)菌基因組DNA作為模板，使用16S rDNA通用擴(kuò)增引物擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA全長(zhǎng)(PCR體系及擴(kuò)增程序如下)，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化系統(tǒng)純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。使用RDP數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI Blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行16S rDNA序列比對(duì)分析，得到細(xì)菌的種屬。PCR 體系
權(quán)利要求
1.一種疫苗，其特征在于它是由無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的疫苗，其特征在于所述疫苗包含致免疫有效量的滅活的無(wú)乳鏈球菌以及藥學(xué)上可接受的輔料或者載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述無(wú)乳鏈球菌是保藏號(hào)為ATCC51487無(wú)乳鏈球菌或者保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011271的無(wú)乳鏈球菌WR-6。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述致免疫有效量為不低于IXlO6CFU/ml ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于所述致免疫有效量為IX IO6^l X IO8CFU/ml ο
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述輔料或者載體為水或吸附劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于所述水為生理鹽水或蒸餾水，所述吸附劑是沸石或硅藻土。
8.權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的疫苗在制備預(yù)防羅非魚鏈球菌病的藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述的預(yù)防羅非魚鏈球菌病的藥物是通過(guò)ロ服、注射或者浸泡的方式給藥的。
10.ー種聯(lián)合用藥物，包含權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的疫苗以及透皮吸收促進(jìn)劑且任選ー種或多種藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于所述透皮吸收劑為氮酮，或莨菪堿。
12.一種無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae),其特征在于它是由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011271的無(wú)乳鏈球菌WR-6。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種疫苗，它是由無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成；本發(fā)明公開(kāi)了該疫苗在制備預(yù)防羅非魚鏈球菌病的藥物中的用途，以及一種聯(lián)合用藥物；本發(fā)明還公開(kāi)了一種新的無(wú)乳鏈球菌菌株。本發(fā)明疫苗可有效刺激羅非魚產(chǎn)生抗鏈球菌病的免疫力，預(yù)防羅非魚鏈球菌病，保護(hù)率高，有較高的實(shí)用價(jià)值和良好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A61K39/09GK102847146SQ20121033726
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者肖丹, 汪開(kāi)毓, 陽(yáng)濤 申請(qǐng)人:通威股份有限公司