專利名稱：一種CoxA16病毒株和人用CoxA16滅活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種CoxA16病毒株和人用CoxA16滅活疫苗,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A 16 Strain, CoxA16)是引起兒童手足口病(Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)的主要病原之一。CoxA16作為腸道病毒成員之一，在結(jié)構(gòu)上具有典型的核糖核酸病毒特征，包括其表現(xiàn)為單股正鏈的RNA基因組，VPl和VP2、VP3、VP4所構(gòu)成的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)等。該病毒感染人體后通常通過(guò)腸道排泄物一口傳播，在一定情況下，也可經(jīng)呼吸道傳播。該病毒所導(dǎo)致的感染與腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)感染相似，通常表現(xiàn)為手足口出現(xiàn)特征性的皰疹，并伴有一定程度的發(fā)熱感冒癥狀。在感染人群中也有一定比例的重癥患者,重癥時(shí)可以引起神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的病變， 在發(fā)病人群中具有一定的死亡率。目前，已知由該病毒和EV71病毒感染所導(dǎo)致的手足口病在全世界范圍內(nèi)存在。上世紀(jì)90年代以前，在發(fā)達(dá)國(guó)家由于公共衛(wèi)生條件的改善，該病毒感染已幾乎絕跡。但90年代以后，該病毒在全球各地區(qū)的發(fā)病率漸有上升。同時(shí)，由于該病毒的高傳播率和其感染的重癥病人可出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)癥狀，因而它同時(shí)受到了作為生物恐怖因子的相應(yīng)關(guān)注。在上世紀(jì)90年代后期和二十一世紀(jì)初始，該病毒感染在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)和英國(guó)曾出現(xiàn)大范圍的流行，并導(dǎo)致了一定的感染死亡率，從而受到了人們的進(jìn)一步關(guān)注。2008年，我國(guó)安徽省阜陽(yáng)地區(qū)亦出現(xiàn)了較大規(guī)模的流行，而且感染者主要出現(xiàn)在嬰幼兒，因此引起了社會(huì)各界的嚴(yán)重關(guān)切。對(duì)此，我國(guó)衛(wèi)生部自2008年5月起，將手足口病正式列入法定報(bào)告的傳染病種類之中。2009年，我國(guó)手足口病的病原體流行特征，由2008年的以EV71感染為主，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镋V71和CoxA16的共流行，并且這樣的流行特征趨勢(shì)有增無(wú)減。現(xiàn)有的分子流行病學(xué)分析表明，迄今已根據(jù)CoxAie不同毒株VPl的結(jié)構(gòu)基因，將現(xiàn)有毒株劃分為三個(gè)基因型，分別是A、B、C。但其作為特定病原如何感染人體，并引起相應(yīng)的病理過(guò)程這一系列的事件尚無(wú)系統(tǒng)的研究。另外，CoxA16病毒感染還可以導(dǎo)致心肌、心包疾病，并與擴(kuò)張性心肌病的發(fā)生有著直接的關(guān)系。迄今為止，盡管CoxAie病毒感染在我國(guó)各地區(qū)均已引起較多的發(fā)病，但仍無(wú)有效的特異性疫苗應(yīng)用。因此，在強(qiáng)調(diào)提高我國(guó)人口健康質(zhì)量的前提下，相應(yīng)疫苗的研究顯得更為迫切與重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種C0XA16病毒株和人用CoxA16滅活疫苗。本發(fā)明的CoxAie病毒株，于2012年7月17日在位于中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，分類命名為柯薩奇病毒A16 型(GX-20K-D 株)，拉丁文名 Coxsackie A virus type 16，保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 6350，其包括原始種子、主種子和工作種子三個(gè)庫(kù)；所述的病毒核苷酸序列如SEQ Nol所示。本發(fā)明完成了病毒全基因組序列分析，并將其翻譯為蛋白質(zhì)的氨基酸序列。完成了在GenBank中的登記注冊(cè)，GenBank登錄號(hào)為Jn590244。本發(fā)明提供了所述病毒株的制備方法，該方法采用下述順序的步驟
O分尚于手足口病患者的CoxA16病毒株,來(lái)至于患者咽拭子以及少量的皰疫分泌液，經(jīng)無(wú)菌PBS溶液稀釋過(guò)濾后，以混懸吸附方式接種于單層KMB17細(xì)胞，在8 10天發(fā)生病變后，繼續(xù)以KMB17細(xì)胞傳代4代，同時(shí)以 RT-PCR方法獲得病毒全基因組序列，將其翻譯為蛋白質(zhì)的氨基酸序列。2)該病毒株接種人二倍體細(xì)胞株KMB17，出現(xiàn)細(xì)胞病變后收獲病毒，并繼續(xù)在KMB17單層細(xì)胞上進(jìn)行兩輪蝕斑克隆純化過(guò)程，最終挑選蝕斑克隆GX-20K-D作為該病毒毒株。根據(jù)對(duì)該毒株幾個(gè)代次生物學(xué)性狀的綜合比較，并按照國(guó)家藥監(jiān)局有關(guān)疫苗病毒株的管理規(guī)定，將在KMB17細(xì)胞中適應(yīng)克隆篩選并連續(xù)傳代至第10、12、14代分別確定為原始種子、主種子和工作種子代次。3)對(duì)原始種子、主種子、工作種子三個(gè)代次的病毒株分別進(jìn)行了鑒別試驗(yàn)、滴度測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)、支原體檢測(cè)、外源因子檢測(cè)和免疫原性檢定等，證明其具有良好的免疫原性及在KMB17細(xì)胞上的良好繁殖能力，最終形成了 CoxAie病毒的三級(jí)病毒株庫(kù)。本發(fā)明提供了一種含有CoxAie病毒的人用CoxAie滅活疫苗，所述的疫苗由下列成分組成
CoxA16病毒滅活純化抗原IOyg/ ml
蛋白載體5 ug/ml
氫氧化招Img / ml
甘氨酸3mg / ml。本發(fā)明提供了 CoxAie滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟
I)根據(jù)KMB17細(xì)胞生產(chǎn)檢定規(guī)程，挑選生長(zhǎng)致密的第28代KMB17細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，以
O.1%胰酶消化細(xì)胞后，棄去胰酶液，以原培養(yǎng)液體積的4%體積，DMEM懸浮細(xì)胞。2)在上述細(xì)胞懸液中加入本發(fā)明的第14代的CoxA16病毒液，接種量moi O. 02
0.1。混勻后置于37°C，適時(shí)輕輕搖動(dòng)。30min后，將該混懸液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，加入定量細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液，置37°C 3 4天，待細(xì)胞貼壁并完全病變后，收集收獲液。3)病毒收獲液按1:4000比例加入甲醒37°C 3天滅活病毒,滅活完成的病毒液，利用超濾濃縮儀(Watson-MARLOWBREDEL- PM-MPS- 630. 3A24. 0GA)濃縮至適當(dāng)體積，經(jīng)Sapharose 6FF排阻層析柱純化，其純化產(chǎn)物以Lowry法測(cè)定蛋白含量，并以免疫電鏡檢測(cè)其滅活的病毒形態(tài)，繼以SDS-PAGE電泳檢測(cè)其純度。4)將上述滅活病毒原液過(guò)濾除菌后，以磷酸緩沖液調(diào)整稀釋至10μ g/ml，同時(shí)加入Al (OH) 3至終濃度為Img / ml,甘氨酸3mg / ml及具有佐劑效應(yīng)的蛋白載體5ug/ml該產(chǎn)品即為所需的CoxA16滅活疫苗成品。本發(fā)明技術(shù)方案的提出基于下述思路CoxA16作為腸道病毒成員，其疫苗的研制具有多種類似的例子可循，主要的疫苗可能形式包括減毒活疫苗和滅活疫苗，但減毒活疫苗存在著回復(fù)突變、毒力返祖，以及引起其它尚未知曉的疫苗相關(guān)疾病潛在的可能性。因此，作為一種具有安全性和疾病防控應(yīng)急意義的疫苗，滅活疫苗具有相對(duì)的優(yōu)勢(shì)。但其要求該疫苗毒株具有較強(qiáng)的免疫原性和較好的生長(zhǎng)復(fù)制能力。同時(shí)，作為新型的預(yù)防性疫苗，使用合適的細(xì)胞基質(zhì)可提升該疫苗的質(zhì)量品質(zhì)。目前已廣泛使用于滅活疫苗生產(chǎn)制備的傳代細(xì)胞基質(zhì)主要包括兩類一是來(lái)自非洲綠猴腎的Vero細(xì)胞，二是來(lái)自人胚肺的二倍體成纖維細(xì)胞。前者對(duì)病毒疫苗具有較快的生產(chǎn)增殖能力，但因?qū)儆诋愒次锓N細(xì)胞，因此在疫苗的純化制備方面具有較高的質(zhì)量要求。后者盡管在病毒疫苗的生長(zhǎng)復(fù)制支持能力方面相對(duì)較Vero細(xì)胞稍差，但其作為來(lái)源于人的細(xì)胞，具有更好的安全性。在上述前提下，本發(fā)明所描述的CoxAie毒株為來(lái)源于CoxAie感染重癥病人的分離株，具有較強(qiáng)的組織培養(yǎng)生長(zhǎng)能力，同時(shí)在動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)了較好的免疫 原性。而且，已適應(yīng)生長(zhǎng)于人源二倍體細(xì)胞株，在保證具有較高安全性的同時(shí)，也具有較好的增殖復(fù)制能力。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下明顯的有益效果
I)提供了一種可用于制備人CoxAie滅活疫苗的疫苗病毒株，該病毒株至今尚無(wú)同類品問(wèn)世，而且，該病毒株具有有效的免疫原性和在細(xì)胞上較好的生長(zhǎng)復(fù)制能力。2)提供了一種使用KMB17人二倍體細(xì)胞基質(zhì)制備的人CoxA16滅活疫苗
的生產(chǎn)制備方法，該疫苗制品具有良好的免疫原性和安全性。由于本發(fā)明中CoxAie病毒株及所建立的毒種種子庫(kù)系采用人二倍體細(xì)胞株KMB17分離培養(yǎng)并建立的，在制備用于人類預(yù)防疾病的疫苗時(shí)，比采用異源物種細(xì)胞來(lái)制備疫苗具有更高的安全性，也更加符合國(guó)家有關(guān)對(duì)預(yù)防性疫苗研發(fā)及生產(chǎn)用菌毒種的條例和規(guī)定。3)提供了一種混懸吸附技術(shù)方法，以保證CoxAie滅活疫苗病毒株在KMB17細(xì)胞上的有效感染及在該基質(zhì)上的良好生長(zhǎng)。


圖I為該CoxA16病毒病毒株經(jīng)混懸吸附方法接種人二倍體細(xì)胞KMB-17后3_4天即可出現(xiàn)典型細(xì)胞病變現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、折光性增強(qiáng)、腫脹等。圖2為該CoxA16病毒病毒株在KMB17細(xì)胞上的增殖動(dòng)力學(xué)曲線。將第10、12、14、18代次的CoxA16病毒以O(shè). OlMOI接種單層KMB-17細(xì)胞后，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣和滴度分析表明，這四個(gè)代次的病毒均有著類同的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征，其均在第46 72小時(shí)之間達(dá)到增殖聞峰。圖3為不同代次的該CoxAie滅活病毒純化產(chǎn)物的免疫原性檢測(cè)。結(jié)果顯示，四個(gè)代次的滅活病毒在以相同劑量接種小鼠時(shí)所誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)無(wú)明顯差異。圖4小鼠在兩次免疫兩周后讓其所交配所產(chǎn)的乳鼠進(jìn)行腦內(nèi)活毒攻擊實(shí)驗(yàn)表明，與未免疫小鼠所產(chǎn)的乳鼠相比較。經(jīng)該毒株四個(gè)代次滅活純化病毒抗原免疫的小鼠所產(chǎn)的乳鼠均無(wú)死亡，其免疫保護(hù)率為100%。這些結(jié)果證明該毒株在不同代次的病毒滅活抗原均具有免疫原性和免疫保護(hù)性。
具體實(shí)施例方式通過(guò)借助以下實(shí)施例將更加詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明的特點(diǎn)。需要指出的是，以下實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例I 制備CoxA16滅活疫苗病毒株GX-20K-D(一)CoxAie滅活疫苗病毒株GX-20K-D的制備方法，包括以下步驟
I、分尚于手足口病患者的CoxA16病毒株,來(lái)至于患者咽拭子以及少量的皰疫分泌液，經(jīng)無(wú)菌PBS溶液稀釋過(guò)濾后，以混懸吸附方式接種于單層KMB17細(xì)胞，在8 10天發(fā)生病變后，繼續(xù)以KMB17細(xì)胞傳代4代。首先取病毒液1ml，按常規(guī)方法進(jìn)行RT-PCR，分段獲取病毒基因的cDNA序列，并按常規(guī)方法連接該片段進(jìn)入puc-18載體中，進(jìn)行常規(guī)的核苷酸測(cè)序分析，并以此序列在同類基因庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)確證其結(jié)果。2、該病毒株接種人二倍體細(xì)胞株KMB17，出現(xiàn)細(xì)胞病變后收獲病毒，并繼續(xù)在KMB17單層細(xì)胞上進(jìn)行兩輪蝕斑克隆純化過(guò)程，最終挑選蝕斑克隆GX-20K-D作為該病毒毒株。根據(jù)對(duì)該毒株幾個(gè)代次生物學(xué)性狀的綜合比較，并按照國(guó)家藥監(jiān)局有關(guān)疫苗病毒株的管理規(guī)定，將在KMB17細(xì)胞中適應(yīng)克隆篩選并連續(xù)傳代至第10、12、14代分別確定為原始種 子、主種子和工作種子代次。3、對(duì)原始種子、主種子、工作種子三個(gè)代次的病毒株分別進(jìn)行了鑒別試驗(yàn)、滴度測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)、支原體檢測(cè)、外源因子檢測(cè)和免疫原性檢定等，證明其具有良好的免疫原性及在KMB17細(xì)胞上的良好繁殖能力，最終形成了 CoxAie病毒的三級(jí)病毒株庫(kù)。(二)對(duì)CoxA16滅活疫苗病毒株GX-20K-D進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法及檢測(cè)結(jié)果如下
I、該病毒株經(jīng)混懸吸附方法接種人二倍體細(xì)胞株KMB17后3-4天即可出現(xiàn)典型細(xì)胞病
變(CPE)現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、折光性增強(qiáng)、腫脹等，如圖I所示。利用抗CoxAie特異性血清，按I :4稀釋后，與該病毒10倍稀釋液等量混合，37°C放置I小時(shí),再接種Vero細(xì)胞或KMB17細(xì)胞，37°C培養(yǎng)一周后觀察病變結(jié)果，與無(wú)特異血清對(duì)照相比較，抗體中和應(yīng)完全抑制細(xì)胞出現(xiàn)病變。2、該病毒株在KMB17細(xì)胞上的生長(zhǎng)動(dòng)力曲線表明，當(dāng)該病毒以混懸形式接種于KMB17細(xì)胞時(shí)，在12小時(shí)內(nèi)接種細(xì)胞即可出現(xiàn)初步的典型病變，同時(shí)，該病變可在46-72小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)增殖高峰，對(duì)此時(shí)的病毒收獲液進(jìn)行滴度檢測(cè)表明，其滴度通常為6. 5土 O. 25Log CCID50。3、該病毒株按4. 0-4. 5 Log CCID50 /只乳鼠的劑量接種2日齡乳鼠時(shí)，可引起乳鼠在4-5天內(nèi)出現(xiàn)典型的四肢遲緩型麻痹癥狀，用抗CoxAie特異性血清中和該病毒后，可以去除此病毒株致乳鼠麻痹的能力。4、該病毒株經(jīng)1:4000的甲醛滅活后，不再具有感染性，但能夠保留其免疫原性。當(dāng)其以10 μ g/ml抗原蛋白量皮下一次接種小鼠后，可引起小鼠出現(xiàn)滴度可能為16 32的特異性中和抗體，二次接種后可引起小鼠出現(xiàn)滴度可能更高的特異性中和抗體反應(yīng)。5、該病毒株在不同代次的病毒均具有類同的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征，將第10、12、14、18代次的CoxA16病毒以O(shè). OlMOI接種單層KMB-17細(xì)胞后，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣和滴度分析表明，這四個(gè)代次的病毒均有著類同的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征，其均在第46 72小時(shí)之間達(dá)到增殖高峰，如圖2所示。6、該病毒株在不同代次的病毒滅活抗原均具有免疫原性。如圖3所示的不同代次的該CoxAie滅活病毒純化產(chǎn)物的免疫原性檢測(cè)。結(jié)果顯示，四個(gè)代次的滅活病毒在以相同劑量接種小鼠時(shí)所誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)無(wú)明顯差異。7、該病毒株在不同代次的病毒滅活抗原均具有免疫保護(hù)性。如圖4所示，小鼠在兩次免疫兩周后讓其所交配所產(chǎn)的乳鼠進(jìn)行腦內(nèi)活毒攻擊實(shí)驗(yàn)表明，與未免疫小鼠所產(chǎn)的乳鼠相比較。經(jīng)該毒株四個(gè)代次滅活純化病毒抗原免疫的小鼠所產(chǎn)的乳鼠均無(wú)死亡，其免疫保護(hù)率為100%。以上結(jié)果顯示了本發(fā)明的CoxA16病毒株的生物學(xué)特征。實(shí)施例2制備CoxA16滅活疫苗
本實(shí)施例的CoxAie滅活疫苗的制備方法，包括下列步驟
I、根據(jù)KMB17細(xì)胞生產(chǎn)檢定規(guī)程，挑選生長(zhǎng)致密的第28代KMB17細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，以
O.1%胰酶消化細(xì)胞后，棄去胰酶液，以原培養(yǎng)液體積的4%體積，DMEM懸浮細(xì)胞。2、在上述細(xì)胞懸液中加入本發(fā)明的第14代的CoxA16病毒液，加入O. 2-0. 5ml病毒液，其moi為O. 02 O. 1，混勻后置37°C孵育30分鐘，并于其中加以輕搖，隨后將該混懸液體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，加入適量細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)3 4天，待細(xì)胞貼壁后并出現(xiàn)完全病變收獲。3、病毒收獲液按1:4000比例加入甲醒37°C 3天滅活病毒,滅活完成的病毒液，利用超濾濃縮儀(Watson-MARLOWBREDEL- PM-MPS- 630. 3A24. 0GA)濃縮至適當(dāng)體積，經(jīng)Sapharose 6FF排阻層析柱純化，其純化產(chǎn)物以Lowry法測(cè)定蛋白含量，并以免疫電鏡檢測(cè)其滅活的病毒形態(tài)，繼以SDS-PAGE電泳檢測(cè)其純度。4、將上述滅活病毒原液過(guò)濾除菌后，以磷酸緩沖液調(diào)整稀釋至10μ g/ml，同時(shí)加入Al (OH)3至終濃度為Img / ml,甘氨酸3mg / ml及具有佐劑效應(yīng)的蛋白載體5ug/ml該產(chǎn)品即為所需的CoxA16滅活疫苗成品。在制備過(guò)程中，進(jìn)行如下檢測(cè)，病毒收獲物、病毒原液、半成品均為無(wú)異物、無(wú)沉淀的澄清液體，無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)均應(yīng)為陰性，無(wú)異常毒素，PH7. 2-8. O (見(jiàn)表I)。
權(quán)利要求
1.一種CoxA16病毒株,其特征在于,所述的病毒株于2012年7月17日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC保藏，分類命名為Cox病毒A16型，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6350，其包括原始種子、主種子和工作種子三個(gè)庫(kù)；所述的病毒核苷酸序列如SEQNol所不，所述的病毒全基因和蛋白序列的GenBank登錄號(hào)為Jn590244。
2.如權(quán)利要求I所述的CoxAie病毒株的制備方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟 1)分尚于手足口病患者的CoxA16病毒株,來(lái)自于患者咽拭子以及少量的皰疫分泌液，經(jīng)無(wú)菌PBS溶液稀釋過(guò)濾后，以混懸吸附方式接種于單層KMB17細(xì)胞，在8 10天發(fā)生病變后，繼續(xù)以KMB17細(xì)胞傳代4代，同時(shí)以RT-PCR方法獲得病毒全基因組序列，將其翻譯為蛋白質(zhì)的氨基酸序列； 2)該病毒株接種人二倍體細(xì)胞株KMB17，出現(xiàn)細(xì)胞病變后收獲病毒，并繼續(xù)在KMB17單 層細(xì)胞上進(jìn)行蝕斑克隆純化，最終挑選蝕斑克隆GX-20K-D作為該病毒毒株；根據(jù)對(duì)該毒株幾個(gè)代次生物學(xué)性狀的綜合比較，并按照國(guó)家藥監(jiān)局有關(guān)疫苗病毒株的管理規(guī)定，在KMB17細(xì)胞中適應(yīng)克隆篩選并連續(xù)傳代至第10、12、14代分別確定為原始種子、主種子和工作種子代次； 3)對(duì)原始種子、主種子、工作種子三個(gè)代次的病毒株分別進(jìn)行了鑒別試驗(yàn)、滴度測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)、支原體檢測(cè)、外源因子檢測(cè)和免疫原性檢定等，證明其具有良好的免疫原性及在KMB17細(xì)胞上的良好繁殖能力，最終形成了 CoxAie病毒的三級(jí)病毒株庫(kù)。
3.一種含有如權(quán)利要求I所述的CoxA16病毒的人用CoxA16滅活疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人用CoxAie滅活疫苗，其特征在于，所述的疫苗由下列成分組成 CoxA16病毒滅活純化抗原IOyg/ ml 蛋白載體5 ug/ml 氫氧化招Img / ml 甘氨酸3mg / ml。
5.一種制備權(quán)利3或4的CoxAie滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)根據(jù)KMB17細(xì)胞生產(chǎn)檢定規(guī)程，挑選生長(zhǎng)致密的第28代KMB17細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，以O(shè). 1%胰酶消化細(xì)胞后，棄去胰酶液，以原培養(yǎng)液體積的4%體積，DMEM懸浮細(xì)胞； 2)在上述細(xì)胞懸液中加入本發(fā)明的第14代的CoxA16病毒液，接種量moiO. 02 O. I;混勻后置于37°C，適時(shí)輕輕搖動(dòng)；30min后，將該混懸液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，加入定量細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液，置37°C 3 4天，待細(xì)胞貼壁并完全病變后，收集收獲液； 3)病毒收獲液按1:4000比例加入甲醛37°C3天滅活病毒，滅活完成的病毒液，利用超濾濃縮儀濃縮至適當(dāng)體積，經(jīng)Sapharose 6FF排阻層析柱純化,其純化產(chǎn)物以Lowry法測(cè)定蛋白含量，并以免疫電鏡檢測(cè)其滅活的病毒形態(tài)，繼以SDS-PAGE電泳檢測(cè)其純度； 4)將上述滅活病毒原液過(guò)濾除菌后，以磷酸緩沖液調(diào)整稀釋至10μg/ml，同時(shí)加入Al (OH)3至終濃度為Img / ml,甘氨酸3mg / ml及具有佐劑效應(yīng)的蛋白載體5ug/ml該產(chǎn)品即為所需的CoxA16滅活疫苗成品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種CoxA16病毒株，該病毒株分類命名為Cox病毒A16型(GX-20K-D株)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.6350，其包括原始種子、主種子和工作種子三個(gè)庫(kù)；所述的病毒具有SEQNo1所示的核苷酸序列。本發(fā)明具有以下明顯的有益效果1.提供了一種可用于制備人CoxA16滅活疫苗的病毒株，具有有效的免疫原性和在細(xì)胞上較好的生長(zhǎng)復(fù)制能力。2.提供了一種使用KMB17人二倍體細(xì)胞基質(zhì)制備的人CoxA16滅活疫苗的生產(chǎn)制備方法，該疫苗制品具有良好的免疫原性和安全性。3.提供了一種混懸吸附技術(shù)方法，以保證CoxA16滅活疫苗病毒株在KMB17細(xì)胞上的有效感染及在該基質(zhì)上的良好生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61K39/125GK102839159SQ201210328369
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者姜莉, 李琦涵, 董承紅, 劉龍丁, 王晶晶, 謝忠平, 崔萍芳, 王麗春, 劉建生, 邵聰文, 廖蕓, 趙樹(shù)棟 申請(qǐng)人:江蘇康淮生物科技有限公司