專利名稱：治療吉非替尼耐藥性癌癥的方法
治療吉非替尼耐藥性癌癥的方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年2月2日，申請(qǐng)?zhí)枮?00680011003. 9的、發(fā)明名稱和本發(fā)明相同的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
上皮細(xì)胞癌，例如，前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、脾癌、睪丸癌、胸腺癌等，是以上皮細(xì)胞的異常加速生長(zhǎng)為特征的疾病。此加速生長(zhǎng)最初引起腫瘤形成。最后，也可發(fā)生轉(zhuǎn)移至不同的器官部位置。雖然在多種癌癥的診斷和治療方面已取得進(jìn)展，但是這些疾病仍然導(dǎo)致顯著的死亡率。肺癌是工業(yè)國(guó)家中導(dǎo)致癌癥死亡的首要原因。開始在肺中的癌癥，依據(jù)細(xì)胞在顯微鏡下的表現(xiàn)，被分為兩種主要類型，非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌(鱗片細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌癥)擴(kuò)散至其它器官一般比小細(xì)胞肺癌慢。約75%的肺癌病例被歸類為非小細(xì)胞肺癌(如，腺癌)，而其它25%的肺癌病例為小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)為美國(guó)、日本和西歐癌癥致死的主要原因。對(duì)于晚期疾病的患者而言，化學(xué)療法在生存率方面提供適度的幫助，但是付出顯著毒性的代價(jià)，強(qiáng)烈需要特異性地靶向涉及腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因損傷的治療劑(Schiller JH等，N Engl J Med, 346 =92-98, 2002) 0表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)為在上皮細(xì)胞表面表達(dá)的170千道爾頓(kDa)膜結(jié)合蛋白質(zhì)。EGFR為許多蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(一組細(xì)胞周期調(diào)節(jié)分子)的生長(zhǎng)因子受體家族。(ff. J. Gullick等，1986, Cancer Res. ,46 :285-292)。當(dāng) EGFR 的配體(或者EGF或者TGF-α )結(jié)合至胞外域時(shí)，使EGFR活化,導(dǎo)致受體的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域自動(dòng)磷酸化(S. Cohen等，1980，J. Biol. Chem.，255 :4834-4842 ；A. B. Schreiber 等，1983，J. Biol. Chem.，258 846-853)。EGFR為生長(zhǎng)促進(jìn)致癌基因，erbB或ErbBl的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其為家族即原癌基因(protooncogenes)的ERBB家族的一個(gè)成員，相信在人類許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。尤其是，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭癌、頸癌和胃癌以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中觀察到EGFR增強(qiáng)的表達(dá)。致癌基因的ERBB家族編碼四種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的跨膜受體，即EGFR、HER-2/neu(erbB2)、HER_3 (erbB3)和HER_4(erbB4)。臨床上，已有報(bào)告腫瘤中的ERBB致癌基因擴(kuò)增和/或受體過度表達(dá)與疾病復(fù)發(fā)和患者預(yù)后差相關(guān)，以及與療法的響應(yīng)相關(guān)。(L. Harris等，1999, Int. J. Biol. Markers, 14 :8_15 ;和 J. Mendelsohn 和 J. Baselga, 2000, Oncogene,19 :6550-6565)。EGFR由以下三個(gè)基本結(jié)構(gòu)域組成，即胞外域(ECD,其為糖基化的(glycosylated)并且含具有兩個(gè)富含半胱氨酸區(qū)域的配體-結(jié)合袋(binding pocket);短跨膜結(jié)構(gòu)域和具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。跨膜區(qū)域?qū)⑴潴w-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接。氨基酸和DNA序列分析以及EGFR的非糖基化形式的研究表明，EGFR蛋白質(zhì)主鏈質(zhì)量為 132kDa,具有 1186 個(gè)氨基酸殘基(A. L. Ullrich 等，1984，Nature, 307 :418-425 ；J. Downward 等，1984，Nature, 307 :521-527 ；C. R. Carlin 等，1986，MoI. Cell. Biol.，6 257-264 ;和 F. L. V. Mayes 和 M. D. ffaterfield, 1984，The EMB0J.，3 :531-537)。EGF或TGF- α與EGFR的結(jié)合激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并且導(dǎo)致細(xì)胞增殖。EGFR分子的二聚、構(gòu)象變化和內(nèi)化(internalization)起傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的作用，引起細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)(G. Carpenter 和 S. Cohen, 1979, Ann. Rev. Biochem. ,48 193-216)。影響生長(zhǎng)因子受體功能調(diào)節(jié)或?qū)е率荏w和/或配體過度表達(dá)的遺傳學(xué)改變，引起細(xì)胞增殖。另外，已確定EGFR在細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的增強(qiáng)、蛋白質(zhì)分泌、新血管形成、癌癥細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療劑和放射線的入侵、轉(zhuǎn)移和耐藥性方面起作用。(M. -J. Oh等，2000，Clin. Cancer Res.，6 :4760-4763)。已經(jīng)鑒定多種EGFR抑制劑，包括一些已經(jīng)正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的用于治療各種癌癥的EGFR抑制劑。至于近期的概要，參見de Bono, J.S.和Rowinsky，E. K. (2002)，" TheErbB Receptor Family A Therapeutic Target For Cancer" , Trends in MolecularMedicine,8,S 19-26。一批在癌癥治療中用于治療干涉的有前景的標(biāo)靶，包括HER-激酶軸的成員。它們?cè)趯?shí)體上皮腫瘤例如前列腺、肺和乳腺腫瘤中經(jīng)常向上調(diào)節(jié)，在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中也向上調(diào)節(jié)。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是HER-激酶軸的一個(gè)成員，并且已經(jīng)是開發(fā)多種不同的癌 癥療法的選擇目標(biāo)。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)在這些療法當(dāng)中，因?yàn)槔野彼釟埢目赡嫘粤姿峄癁镋GFR通路激活所必需。換言之，EGFR-TKIs阻滯細(xì)胞表面受體是造成引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的觸發(fā)和/或維持細(xì)胞信號(hào)通路的原因。特別是，相信這些抑制劑干擾EGFR激酶結(jié)構(gòu)域，稱為HER-I。在更有前景的EGFR-TKIs中，有三個(gè)系列的化合物喹唑啉、吡啶并嘧啶和吡咯并嘧啶。在臨床開發(fā)中兩個(gè)更先進(jìn)的化合物包括吉非替尼(Gefitinib)(由AstraZenecaUK Ltd.開發(fā)的化合物ZD 1839 ;可以IRESSA的商標(biāo)名獲得；以下稱"IRESSA")和埃羅替尼(Erlotinib)(由 Genentech, Inc.和 OSI Pharmaceuticals, Inc.開發(fā)的化合物0SI-774，可以TARCEVA的商標(biāo)名獲得；以下稱"TARCEVA");兩者均產(chǎn)生令人鼓舞的臨床結(jié)果。以IRESSA和TARCEVA兩者進(jìn)行的常規(guī)癌癥治療包括每天分別口服給予不超過500mg化合物。在2003年5月，IRESSA是這些產(chǎn)物中第一個(gè)進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)的藥物，此時(shí)它被批準(zhǔn)用于晚期非小細(xì)胞肺癌患者的治療。IRESSA為通過直接抑制在EGFR分子上酪氨酸激酶磷酸化發(fā)揮功效的口服活性喹唑啉。其競(jìng)爭(zhēng)三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致HER-激酶軸的抑制。IRESSA反應(yīng)的確切機(jī)制尚不完全明白，然而，研究提示，EGFR的存在是是其作用的必要的先決條件。在使用這些化合物中顯著的局限是，其接受者可在最初對(duì)療法的反應(yīng)之后產(chǎn)生對(duì)它們治療效應(yīng)的耐藥，或它們可不對(duì)EGFR-TKI s起任何可檢測(cè)到級(jí)別的反應(yīng)。對(duì)于EGFR-TKIs的反應(yīng)率在不同人種組別中各異。在低端EGFR-TKI反應(yīng)者，在某些人群中，僅百分之10-15%的晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)EGFR激酶抑制劑有反應(yīng)。因此，對(duì)IRESSA和TARCEVA潛在敏感的分子學(xué)機(jī)制的更好的理解，將非常有益于對(duì)那些最有可能從這樣療法中獲益的患者的靶向療法。本領(lǐng)域明顯需要對(duì)癌癥，且特別是上皮細(xì)胞癌的滿意治療，所述癌癥有例如肺癌，卵巢癌、乳腺癌、腦癌、結(jié)腸癌和前列腺癌，其整合TKI療法的利益并克服由患者表現(xiàn)出的無應(yīng)答。這樣的治療可對(duì)患者，且尤其是老年患者(他們中癌癥特別常見)的健康產(chǎn)生極大的影響。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，不可逆性EGFR抑制劑在對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼療法不再響應(yīng)的患者中有效治療癌癥。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥性癌癥的方法。在該實(shí)施方案中，在初始給予吉非替尼和/或埃羅替尼治療之后的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)患者癌癥的發(fā)展。癌癥的發(fā)展是對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼治療耐藥的癌癥的指示，并且給予患者包含不可逆性表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑的藥用組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，不可逆性EGFR抑制劑為EKB-569、HKI-272或HKI-357。或者，不可逆性EGFR抑制劑可為結(jié)合至EGFR (SEQ ID NO I)的半胱氨酸797的任何化合物。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展。例如，可通過對(duì)癌癥的目測(cè)(visual inspection)諸如,X-線、CT掃描或MRI監(jiān)測(cè)其發(fā)展。或者,可通過檢測(cè)腫瘤生物標(biāo)記物監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展。在一個(gè)實(shí)施方案中，在整個(gè)癌癥治療的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)患者。例如，通過分析第二時(shí)間點(diǎn)癌癥的發(fā)展并將此分析與第一時(shí)間點(diǎn)的分析比較，可監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展。第一時(shí)間點(diǎn)可在吉非替尼和/或埃羅替尼初始治療之前或之后，而第二時(shí)間點(diǎn)在第一點(diǎn)之后。癌癥的增大的生長(zhǎng)表示癌癥的發(fā)展。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過分析癌癥的大小監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由采用X-線、CT掃描或MRI對(duì)癌癥進(jìn)行目測(cè)，分析癌癥的大小。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過檢測(cè)腫瘤生物標(biāo)記物監(jiān)測(cè)癌癥的大小。
在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是上皮細(xì)胞癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、食道癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌癥和膀胱癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，在其它的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)癌癥的大小，并且其它的時(shí)間點(diǎn)是在第二時(shí)間點(diǎn)之后。在一個(gè)實(shí)施方案中，較晚的時(shí)間點(diǎn)在之前的時(shí)間點(diǎn)至少2個(gè)月之后。在一個(gè)實(shí)施方案中，較晚的時(shí)間點(diǎn)在前面的時(shí)間點(diǎn)至少6個(gè)月之后。在一個(gè)實(shí)施方案中,較晚的時(shí)間點(diǎn)在前面的時(shí)間點(diǎn)之后至少10個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，較晚的時(shí)間點(diǎn)在前面的時(shí)間點(diǎn)之后
至少一年。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，所述方法包括給予患者包含不可逆性EGFR抑制劑的藥用組合物，所述患者在EGFR上有突變，即在SEQ ID. NO. I的790位置(T790M)上的蘇氨酸被甲硫氨酸置換。T790M突變賦予對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼治療的耐藥性。
圖的簡(jiǎn)述

圖1A-1B顯示來自兩名獲得性吉非替尼耐藥的NSCLC患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移損傷中的EGFR序列分析。圖IA顯示病例I的序列分析。EGFR中的T790M突變存在于發(fā)展臨床吉非替尼耐藥之后的復(fù)發(fā)肝損傷。(左)在診斷時(shí)在原發(fā)性肺損傷中沒有檢測(cè)到突變。(右)原發(fā)性肺腫瘤和復(fù)發(fā)肝損傷均包含(harbor) L858R吉非替尼-敏感性突變。值得注意的是，L858R突變以期望的雜合的突變比例存在于原發(fā)性和復(fù)發(fā)損傷兩者中，然而與野生型等位基因比較，T790M在低水平上是可檢測(cè)的。在同樣的描記圖象(tracing)中顯示多型性(G/A)證明非克隆PCR產(chǎn)物中的兩個(gè)等位基因的等價(jià)物再現(xiàn)(SEQ ID NOS 3&4分別按出現(xiàn)順序公開)。圖IB顯示病例2的序列分析。T790M突變存在于少數(shù)吉非替尼-耐藥細(xì)胞中。(左)T790M突變或者在肺原發(fā)性腫瘤中或者在來自該病例的八個(gè)復(fù)發(fā)肝損傷中，用測(cè)序非克隆PCR產(chǎn)物未能檢測(cè)。在鄰近多型性(G/Α)的雜合性證實(shí)來自這些樣本的兩個(gè)EGFR等位基因的擴(kuò)增。雜合的吉非替尼-敏感性突變，L861Q，在原發(fā)性肺腫瘤以及八個(gè)復(fù)發(fā)肝損傷中的每一個(gè)以期望的比例被檢測(cè)到(SEQ ID NOS 3&5分別按出現(xiàn)順序公開)。圖2A-2C顯示支氣管肺泡癌細(xì)胞系中獲得對(duì)吉非替尼性耐藥和對(duì)不可逆性ERBB家族抑制劑的持續(xù)敏感性。圖2A顯示由酪氨酸激酶抑制劑對(duì)支氣管肺泡癌癥細(xì)胞系增殖的抑制，該細(xì)胞 系具有野生型EGFR(NCI-H1666)(其在EGFR(NCI_H1650)中激活delE746-A750突變)或NCI-H1650 (G7和Cll)的兩個(gè)代表性的吉非替尼-耐藥亞克隆?？赡嫘砸种苿┘翘婺崤c不可逆性抑制劑HKI-357的作用比較。用其它不可逆性抑制劑觀測(cè)到可比性結(jié)果。通過在暴露于指定的藥物濃度72h后，于5% FCS中和100ng/ml EGFR 一起培養(yǎng)后，經(jīng)結(jié)晶紫染色，測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表四個(gè)樣本的平均值。圖2B顯示EGFR可逆性抑制劑吉非替尼、EGFR不可逆性抑制劑EKB-569和兩個(gè)EGFR和ERBB2不可逆性雙重抑制劑HKI-272和HKI-357的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2C顯示在以不同濃度的吉非替尼或不可逆性ERBB抑制劑EKB-569處理之后產(chǎn)生的藥物-耐藥性NCI-HI 650細(xì)胞。在抑制劑存在下培養(yǎng)12天之后集落染色。圖3A-3D顯示對(duì)吉非替尼-耐藥細(xì)胞中的EGFR和ERBB2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和改變的受體轉(zhuǎn)運(yùn)的持續(xù)依賴。圖3A顯示在帶有野生型EGFR(NCI-H1666)的支氣管肺泡細(xì)胞系中、EGFR和ERBB2的siRNA-介導(dǎo)的敲除后的細(xì)胞生存能力，與在EGFR(NCI_H1650)中具有激活的delE746-A750突變和兩個(gè)吉非替尼-耐藥的衍生物(G7和Cll)的細(xì)胞的生存能力進(jìn)行比較。用雙鏈RNA處理72h之后計(jì)數(shù)存活的細(xì)胞，顯示為用非特性siRNA處理的細(xì)胞相關(guān)的分?jǐn)?shù)，按一式三份樣本計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。圖3B顯示在用遞增濃度的吉非替尼或不可逆性抑制劑HKI-357處理、隨后用EGF進(jìn)行2_h脈沖的細(xì)胞中，抑制下游效應(yīng)器AKT和MAPK (ERK)的EGFR自動(dòng)磷酸化(Y1068)和磷酸化。將親代細(xì)胞系NCI-H1650與代表性的吉非替尼-耐藥系G7比較?？偟腁KT和MAPK作為對(duì)照顯示；對(duì)于在這些細(xì)胞中檢測(cè)的較低限的總EGFR水平，使用微管蛋白作為荷載對(duì)照。圖3C顯示與敏感性NCI-H1650親代細(xì)胞系比較，在吉非替尼-耐藥NCI-H 1650 (G7)細(xì)胞中的改變的EGFR內(nèi)化現(xiàn)象。在加入配體后5和20min時(shí)，使用若丹明標(biāo)記的EGF標(biāo)記EGFR。在NCI-H1650 (G7)細(xì)胞中EGFR的增強(qiáng)的內(nèi)化現(xiàn)象在20min時(shí)最明顯(Zeiss顯微鏡，x 63放大倍率)。圖3D顯示自NCI-H1650親代細(xì)胞內(nèi)化的EGFR以及經(jīng)生物素化和追蹤(chase)超過20min脈沖標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白之后的耐藥衍生物G7的免疫印跡。將NCI-H1650(G7)細(xì)胞中的增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)EGFR與不改變的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體(TR)內(nèi)化現(xiàn)象進(jìn)行比較。圖4A-4B顯示不可逆性ERBB抑制劑在抑制T790M EGFR突變體中的效力。圖4A顯示吉非替尼和兩個(gè)不可逆性抑制劑(HKI-357和HKI-272)抑制EGFR自動(dòng)磷酸化(Y1068)和NCI-H1975支氣管肺泡細(xì)胞系(包含致敏性突變(L858R)和與耐藥相關(guān)聯(lián)的突變(T790M)兩者)中的下游效應(yīng)器AKT和MAPK (ERK)的磷酸化的能力的比較?？侲GFR、AKT和MAPK顯示為荷載對(duì)照。圖4B顯示與吉非替尼比較，用三個(gè)不可逆性ERBB家族抑制劑對(duì)包含L858R和T790M突變的NCI-H1975細(xì)胞增殖的抑制。圖5顯示EGFR的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)和氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。圖6顯示如同吉非替尼，HKI 357和EKB 569 (標(biāo)識(shí)為"Wyeth")被證明對(duì)包含EGFR突變的NSCLC細(xì)胞的增強(qiáng)的細(xì)胞殺傷能力，但又不同于吉非替尼，在體外不易于產(chǎn)生對(duì)這些藥物耐藥的克隆并且它們保留其對(duì)抗吉非替尼-耐藥克隆的效力。
發(fā)明詳述
耐吉非替尼和埃羅替尼的癌癥吉非替尼(由AstraZeneca UK Ltd.開發(fā)的化合物ZD 1839 ;可以IRESSA的商標(biāo)名獲得)和埃羅替尼(由Genentech, Inc.和OSI Pharmaceuticals, Inc.開發(fā)的化合物0SI-774，可以TARCEVA的商標(biāo)名獲得)，在非小細(xì)胞肺癌(NSCLCs)的病例中，產(chǎn)生令人驚奇的臨床反應(yīng)，所述癌在EGF受體(EGFR) (1-3)中包含激活性突變，為這些ATP結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的標(biāo)靶(4，5)。這些酪氨酸激酶抑制劑的效力既可由與這些突變相關(guān)的ATP裂解(cleft)的改變(該突變導(dǎo)致這些藥物增強(qiáng)對(duì)突變體激酶的抑制作用)引起，又可由這些癌癥細(xì)胞對(duì)于由突變體受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強(qiáng)的生存信號(hào)的生物學(xué)依賴性(一種被描述為“致癌基因依賴(addiction) ”的現(xiàn)象引起(6,7)。 雖然對(duì)于吉非替尼和埃羅替尼兩者的治療反應(yīng)可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2-3年，在大多數(shù)NSCLC病例中的反應(yīng)平均持續(xù)時(shí)期僅6-8個(gè)月(8-10)。獲得性藥物耐藥的潛在的機(jī)制尚不很清楚。以此類推，用伊馬替尼(imatinib) (GLEEVEC)抑制涉及慢性髓細(xì)胞白血病(CMLs)的BCR-ABL激酶、牽涉胃腸道基質(zhì)瘤(GISTs)的C-KIT激酶和特發(fā)性嗜酸粒細(xì)胞增多綜合征(HES)的FIP1L1-PDGFR-α激酶，繼發(fā)性激酶結(jié)構(gòu)域突變可有效地抑制藥物結(jié)合(11-16)。然而，復(fù)發(fā)性NSCLC不易于進(jìn)行活組織檢查；因此，僅有限的臨床標(biāo)本可用于分析。最近，報(bào)告吉非替尼或埃羅替尼療法之后六例復(fù)發(fā)疾病的三個(gè)病例中，在EGFR激酶結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)單一繼發(fā)性突變，Τ790Μ(17,18)。類似于EGFR密碼子790的BCR-ABL的密碼子315，在伊馬替尼-耐藥CML中經(jīng)常突變(11，12)，和C_XJr(密碼子670)和FIPlLl-PDGFR-a(密碼子674)中相應(yīng)的殘基突變分別與伊馬替尼-耐藥的GIST和HES相關(guān)(15，16)。早期體外對(duì)EGFR抑制劑耐藥的模型表明，野生型受體中的密碼子790突變將類似地抑制由EGFR酪氨酸激酶抑制劑的抑制作用(19)。最近，含激活性突變的轉(zhuǎn)染的EGFR蛋白與T790M取代作用一起顯示降低由吉非替尼和埃羅替尼的抑制作用(17，18)。雖然T790M突變似乎對(duì)在一些NSCLC病例中的獲得性耐藥產(chǎn)生作用，但是其在缺乏繼發(fā)性EGFR突變的病例中的治療失敗的潛在機(jī)制仍然不清楚。與細(xì)胞質(zhì)激酶BCR-ABL對(duì)比，由膜結(jié)合EGFR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及復(fù)雜的配體結(jié)合通路、受體與ERBB2和其它家族成員的同源二聚現(xiàn)象(homodimerization)和雜源二聚現(xiàn)象(heterodimerization),隨后是內(nèi)化現(xiàn)象和配體_結(jié)合受體的再循環(huán)或泛素(ubiquitin)介導(dǎo)的受體降解(20)。認(rèn)為在內(nèi)化過程發(fā)生重要的EGF-依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其也與在細(xì)胞內(nèi)囊泡中低PH下的EGFR復(fù)合體的離解相關(guān)。這樣，多重因素調(diào)節(jié)由受體進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的強(qiáng)度和質(zhì)量，并且EGFR運(yùn)輸?shù)母淖兣cEGF-依賴細(xì)胞性反應(yīng)的調(diào)節(jié)密切關(guān)聯(lián)(20)。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即吉非替尼耐藥性癌癥可包括那些其中T790M EGFR突變僅存在于耐藥腫瘤細(xì)胞亞組和那些其中沒有觀察到T790M突變，但觀察到增強(qiáng)的EGFR內(nèi)化現(xiàn)象的癌癥。本發(fā)明還基于以下發(fā)現(xiàn)，即與受體共價(jià)交聯(lián)的不可逆性EGFR抑制劑在抑制伴T790M突變的癌癥中有效，以及在具有可使這樣的癌癥對(duì)用吉非替尼和/或埃羅替尼治療耐藥的改變的EGFR傳輸?shù)陌┌Y中有效。因此，本發(fā)明提供包括給予不可逆性EGFR抑制劑的治療吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥性癌癥的方法。治療患者的方法在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療吉非替尼/埃羅替尼耐藥性癌癥的方法。該方法包括給予需要此種治療的患者有效量的某些不可逆性EGFR抑制劑，包括EKB-569 (4-苯胺基喹啉-3-臆；Greenberger 等，IlthNCI-EORTC-AACR Symposium onNew Drugs in Cancer Therapy,阿姆斯特丹，2000 年 11 月 7-10 日，摘要 388 ；ffyeth) >HKI-357 (4-苯胺基喹啉-3-腈的衍生物；Tsou 等，J. Med. Chem. 2005,48 :1107-1131 ；Wyeth)和 / 或 HKI-272 (4_ 苯胺基喹啉-3-臆的衍生物；Rabindran 等，Cancer Res. 2004,64,3958-3965 ;Wyeth)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括給予需要此種治療的患者有效量的EKB-569的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括給予需要此種治療的患者有效量的HKI-357的方法。該治療還可包括治療的組合，包括，但不限于酪氨酸激酶抑制劑與其它的酪氨酸激酶抑制劑、化學(xué)療法、放射療法等的組合。 采用在Lynch等，2004 ；350 =2129-2139描述中的方法，可將癌癥最初診斷為吉非替尼/埃羅替尼敏感性或預(yù)測(cè)為吉非替尼/埃羅替尼敏感性。通過存在于腫瘤的EGFR突變，包括，例如，與750 (丙氨酸)中突變結(jié)合的殘基747 (賴氨酸)至749 (谷氨酸)的缺失、殘基747(賴氨酸)至750(丙氨酸)的缺失、于殘基858處的精氨酸代替亮氨酸、于殘基861處的谷酰胺代替亮氨酸，可預(yù)測(cè)吉非替尼/埃羅替尼敏感性。在用吉非替尼和/或埃羅替尼開始治療后，可將癌癥診斷為吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥?；蛘?，在用這些化合物初始治療之前，可將癌癥診斷為吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥。腫瘤中的吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥性可發(fā)生在吉非替尼和/或埃羅替尼治療之后，如，6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。或者，在用吉非替尼和/或埃羅替尼開始治療不到6個(gè)月之后，可診斷腫瘤的吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥。通過在吉非替尼和/或埃羅替尼治療期間監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展，可完成吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥的診斷。通過比較開始治療后各時(shí)間點(diǎn)之間的腫瘤狀況，或通過比較開始治療后時(shí)間點(diǎn)與吉非替尼和/或埃羅替尼初始治療之前時(shí)間點(diǎn)之間的腫瘤狀況，可確定腫瘤的發(fā)展。在用吉非替尼和/或埃羅替尼治療期間，可通過目測(cè)，例如，采用放射線照相術(shù)，例如，X-線、CT掃描或技術(shù)人員已知的其它監(jiān)測(cè)方法，包括癌癥的心悸或監(jiān)測(cè)腫瘤生物標(biāo)記物水平的方法，監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展。在用吉非替尼和/或埃羅替尼治療期間的癌癥的發(fā)展，表明對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥。腫瘤生物標(biāo)記物水平的提高，表明腫瘤發(fā)展。因而，在用吉非替尼和/或埃羅替尼治療期間腫瘤生物標(biāo)記物水平提高，表明對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥。檢測(cè)到新的腫瘤或檢測(cè)到轉(zhuǎn)移，表明腫瘤發(fā)展。腫瘤收縮停止，表明腫瘤發(fā)展。癌癥的生長(zhǎng)由例如，腫瘤尺寸增大、轉(zhuǎn)移或檢測(cè)到新的癌癥和/或腫瘤生物標(biāo)記物水平提高表示。通過測(cè)試來自患者循環(huán)或其它體液的、在循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞的與吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥相關(guān)的突變存在，可監(jiān)測(cè)吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥的發(fā)生。來自患者腫瘤細(xì)胞中的與吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥相關(guān)的突變的存在，是吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥腫瘤的指示。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者的腫瘤包含指示吉非替尼和/或埃羅替尼敏感性的突變，然而它對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼治療是耐藥的。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者的腫瘤包含指示吉非替尼和/或埃羅替尼敏感性的突變，和包含指示吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥的突變，如，T790M突變，即在EGFR中，甲硫氨酸(methione)殘基取代天然的蘇氨酸殘基，如增強(qiáng)的EGFR內(nèi)化現(xiàn)象。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者的腫瘤不包含指示吉非替尼和/或埃羅替尼敏感性的突變和不包含指示吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥的突變，如，EGFR中的T790M突變，如，增強(qiáng)的EGFR內(nèi)化現(xiàn)象。當(dāng)與藥物的給予相連時(shí)，“有效量”指對(duì)至少統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義的部分患者導(dǎo)致有益效應(yīng)的量，所述效應(yīng)為諸如癥狀的改善、治愈、減輕疾病負(fù)擔(dān)、縮減腫決或細(xì)胞數(shù)量、延長(zhǎng)生命、改善生活質(zhì)量或通常由熟悉治療特殊類型的疾病或病癥的醫(yī)生確認(rèn)為積極的其它效應(yīng)。所使用活性成分的有效劑量可依具體使用的化合物、給藥模式、和被治療的病癥的嚴(yán)重程度不同而異。技術(shù)人員注意到用于每一個(gè)患者的有效劑量可依疾病嚴(yán)重程度、個(gè)體遺傳變異或代謝速率不同而變化。然而，通常，當(dāng)以約O. 5-約1000mg/kg體重的每天劑 量，任選一天2-4次分劑量或以緩釋形式給予本發(fā)明化合物時(shí)，得到滿意的結(jié)果。計(jì)劃每天總劑量約Ι-lOOOmg，可優(yōu)選約2-500mg。適宜于內(nèi)服的的劑型包括與藥學(xué)上可接受的固體或液體載體緊密混合的約O. 5-1000mg的活性化合物?？烧{(diào)整該給藥方案以提供最佳的治療效應(yīng)。例如，可每天給予多次分劑量或可依治療情形的緊急情況的指示按比例減少劑量。給藥途徑可為靜脈內(nèi)(I. V·)、肌肉內(nèi)(I.M·)、皮下(S.C)、皮內(nèi)(I.D·)、腹腔(I.P.)、鞘內(nèi)(I.T.)、胸膜內(nèi)、子宮內(nèi)、直腸、陰道、局部、腫瘤內(nèi)等。通過注射或整個(gè)時(shí)間漸進(jìn)輸液和可通過蠕動(dòng)方式傳輸可胃腸外給予本發(fā)明化合物。可通過透過粘膜或透皮方式給藥。對(duì)于透過粘膜或透皮給藥，在配方中應(yīng)用適當(dāng)?shù)臐B透屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常為本領(lǐng)域所知，并且包括，例如，用于透過粘膜給藥的膽汁鹽類和梭鏈孢酸(fusidic acid)衍生物。再有，可應(yīng)用清潔劑以促進(jìn)滲透。透過粘膜給藥可通過鼻噴霧劑，例如，或使用栓劑。對(duì)于口服給藥，將本發(fā)明化合物配制成常規(guī)的口服給藥形式諸如膠囊劑、片劑和滋補(bǔ)劑。對(duì)于局部給藥，將藥用組合物(激酶活性抑制劑)配制成本領(lǐng)域通常已知的軟膏齊U、藥膏、凝膠劑或乳膏劑。本發(fā)明的治療用組合物，如不可逆性EGFR抑制劑，例如，如通過單位劑量注射經(jīng)常規(guī)靜脈給藥。當(dāng)用于指本發(fā)明的治療用組合物時(shí)，術(shù)語“單位劑量”指適宜作為單一劑量給患者的物理上不連續(xù)的單位，每一單位含經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生預(yù)想治療效應(yīng)的預(yù)定量的活性物質(zhì)以及與之組合的所需的稀釋劑，即載體或媒介物。以與劑型相協(xié)調(diào)的方式以及以有效治療量給予組合物。將要給予的量和次數(shù)取決于被治療患者、利用活性成分的患者系統(tǒng)的容量和想要的治療效應(yīng)的程度。需要給予的活性成分的精確量取決于執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷并且根據(jù)每一個(gè)體而不同。本文描述了用于實(shí)施本發(fā)明方法的治療用組合物，如，不可逆性EGFR抑制劑?？蓱?yīng)用通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何制劑或藥物傳遞系統(tǒng)，其含有適合預(yù)定用途的活性成分。對(duì)于口服、直腸、局部或胃腸外(包括吸入、皮下、腹腔、肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi))給藥的適宜的藥學(xué)上可接受的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。所述載體必須為藥學(xué)上可接受的，其意思是與制劑中的其它成分適配并且對(duì)其接受者沒有害處。如本文所使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”、“生理學(xué)上可耐受的”及其文法上的變化，在它們指組合物、載體、稀釋劑和反應(yīng)劑時(shí)，交替使用并且代表該物質(zhì)能夠是給予的，或者對(duì)于哺乳動(dòng)物不產(chǎn)生不想要的生理效應(yīng)。適宜胃腸外給藥的制劑便利地包括活性化合物滅菌水溶液制劑，其優(yōu)選為與接受者的血液等滲。因而，這樣的制劑可便利地含蒸餾水、在蒸餾水或鹽水中的5%右旋糖。有用的制劑還包括含化合物的濃縮溶液或固體，其用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尩玫缴鲜鲞m宜胃腸外給藥的溶液劑。對(duì)于腸道給藥，可以不連續(xù)的單位將化合物與惰性載體混合，例如膠囊劑、扁囊齊U、片劑或糖錠劑，每一個(gè)含預(yù)定量的活性化合物；如粉劑或顆粒劑；或含水的或不含水的液體混懸劑或溶液劑，如，糖衆(zhòng)劑、酏劑、乳劑或頓服劑(draught)。適宜載體可為淀粉或糖粉和包括滑潤(rùn)劑、矯味劑、粘合劑及其它相同性質(zhì)的原料?？扇芜x與一種或多種助劑一起，通過壓制或模制，制備片劑。通過使以自由流動(dòng)形式如粉狀或顆粒狀存在的活性化合物，任選與助劑如粘合劑、滑潤(rùn)劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合，在適宜的機(jī)器中壓制，可制備壓制片劑。通過將粉狀的活性化合物與任 何適宜載體的混合物，在適宜的機(jī)器中模制，可制備模制片劑。通過加入活性化合物至濃縮的糖，如蔗糖的水溶液中，可制備糖漿劑或混懸劑，其中還可加入任何助劑。這樣的助劑可包括矯味劑、阻止糖結(jié)晶的試劑或增加任何其它成分溶解的試劑，如多元醇，例如，丙三醇或山梨醇。用于直腸給藥的制劑可作為伴有作為栓劑基質(zhì)的常規(guī)的載體，如可可脂或Witepsol S55 (Dynamite Nobel Chemical, Germany 的商標(biāo))的栓劑形式存在。用于口服給藥的制劑可含有增強(qiáng)劑?？诜山邮艿奈赵鰪?qiáng)劑包括表面活性劑諸如十二烷基硫酸鈉、棕櫚酰肉毒堿、聚乙二醇單十二醚_9、磷脂酰膽堿、環(huán)糊精及其衍生物；膽汁鹽類諸如脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鹽和夫西地酸鈉；螯合劑包括EDTA、檸檬酸和水楊酸鹽；和脂肪酸(如，油酸、十二酸、?；舛緣A、單和雙甘油酯)。其它口服吸收的增強(qiáng)劑包括苯扎氯銨、芐索氯銨、CHAPS (3-(3-膽酰氨基丙基)_ 二甲銨基-I-丙磺酸鹽)、Big-CHAPS (N, N-雙(3-D-葡糖酰氨基丙基)_膽胺)、三氯叔丁醇、辛苯昔醇_9、芐醇、苯酚類、甲酚和烷基醇。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的口服吸收的增強(qiáng)劑是十二烷基硫酸鈉。或者，可以脂質(zhì)體或微球(或微粒)的形式給予本化合物。制備用于向患者給藥的脂質(zhì)體或微球的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。美國(guó)專利號(hào)4，789，734描述了脂質(zhì)體中包囊生物原料的方法，其內(nèi)容通過引用結(jié)合于本文。重要的是，將所述原料溶解于水溶液中，加入適當(dāng)?shù)牧字椭|(zhì)，如果需要再加上表面活性劑，并且需要時(shí)對(duì)原料進(jìn)行透析或超聲處理。已知的方法的綜述由 G. Gregoriadis,第 14 章，"Liposomes, " Drug Carriersin Biology and Medicine,第 287-341 頁(yè)(Academic 出版社，1979)提供。由聚合體或蛋白質(zhì)形成的微球?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟悉，并且其可被定制適合于通過胃腸道直接進(jìn)入血流?；蛘?，可將該化合物整合(incorporated)，并且將微球或微球合成物植入，以用于在數(shù)天至數(shù)月的時(shí)期內(nèi)緩慢釋放。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4，906，474、4，925，673 和 3，625，214 和 Jein, TIPS 19 :155-157 (1998)，其內(nèi)容通過引用結(jié)合于本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的酪氨酸激酶抑制劑配制成適合尺寸的脂質(zhì)體或微粒，以在靜脈給藥后聚集在毛細(xì)血管床。當(dāng)將脂質(zhì)體或微粒放入缺血組織周圍的毛細(xì)血管床時(shí)，可局部給予藥物至可為最有效的位點(diǎn)。靶向缺血組織的適宜的脂質(zhì)體一般小于約200納米并且也典型地為單層囊泡脂質(zhì)體(vesicle),如在例如Baldescliweiler的題目為"Liposomal targeting of ischemic tissue"的美國(guó)專利號(hào) 5，593，688 中所公開的，其內(nèi)容通過引用結(jié)合于本文。優(yōu)選的微粒為從生物可降解的聚合體，諸如聚乙醇酸(polyglycolide)、聚乳酸及其共聚物制備的微粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)包括想要的藥物釋放速率和想要的劑量的各種因素可易于確定適當(dāng)?shù)妮d體系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由導(dǎo)管(catheter)將制劑直接給藥到血管內(nèi)部?？衫?，通過導(dǎo)管的孔給藥。在那些其中活性化合物具有相對(duì)長(zhǎng)的半衰期(大約I天至I周或更長(zhǎng))的實(shí)施方案中，制劑可納入生物可降解的聚合性水凝膠，諸如那些在Hubbell等的美國(guó)專利號(hào)5，410，016中公開的那樣?？蓪⑦@些聚合性水凝膠傳遞至組織內(nèi)腔里并且在聚合體降解時(shí)活性化合物隨時(shí)間推移而釋放。如果需要，聚合性水凝膠可具有包含分散在其中的活性化合物的微?；蛑|(zhì)體，除非有另一個(gè)機(jī)制提供活性化合物的控制釋放。該制劑可便利地以單位劑型存在并且可用制藥領(lǐng)域熟悉的任何方法制備。所有方 法均包括將活性化合物與組成一種或多種助劑的載體混合的步驟。通常，通過將活性化合物與液體載體或細(xì)微粉碎的固體載體均勻地和密切地混合，然后，如果需要，將所述產(chǎn)物定型為想要的單位劑型，制備該制劑。該制劑還可包含一個(gè)或多個(gè)應(yīng)用于藥物制劑領(lǐng)域的任選的助劑，如，稀釋劑、緩沖齊 、矯味劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、滑潤(rùn)劑、助懸劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等。本方法中的化合物(即不可逆性EGFR抑制劑)可以向呼吸道給藥的形式如鼻吸劑或氣霧劑或用于噴霧器的溶液劑或如用于吹入的細(xì)微粉末存在，其單獨(dú)或與惰性載體諸如乳糖混合。在這樣的情況下，活性化合物的粒子適宜具有小于50微米，優(yōu)選小于10微米，更優(yōu)選為2-5微米的直徑。一般用于鼻腔給藥時(shí)，弱酸pH將是優(yōu)選的。優(yōu)選本發(fā)明組合物的pH為約3-5，更優(yōu)選為約3. 5-約3. 9和最優(yōu)選為3. 7。通過加入適當(dāng)?shù)乃嶂T如鹽酸實(shí)現(xiàn)pH的調(diào)節(jié)。含溶解或分散于其中的活性成分的藥用組合物的制劑，為本領(lǐng)域熟知的且不需限于制劑。典型地這樣的組合物被制備成可注射的或者液體溶液劑或者混懸劑，然而，也可制備適宜用于溶液劑或者混懸劑的固體形式，其在使用之前溶于液體。也可使制劑乳化。可將活性成分以適宜用于本文描述的治療方法的量，與藥學(xué)上可接受的并且與活性成分適配的賦形劑混合。適宜賦形劑為，例如，水、鹽水、右旋糖、丙三醇、乙醇等及其組合。再有，如果需要，組合物可含少量的增強(qiáng)活性成分效力的輔助物質(zhì)諸如潤(rùn)濕劑或乳化齊U、pH緩沖劑等。本發(fā)明不可逆性激酶抑制劑可包括其成分的藥學(xué)上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括與無機(jī)酸諸如，例如，鹽酸或磷酸，或諸如乙酸、酒石酸、扁桃酸這樣的有機(jī)酸等形成的酸加成鹽(與多肽的游離氨基形成)。與游離羧基形成的鹽還可衍生自無機(jī)堿，例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵和諸如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等此類有機(jī)堿。生理學(xué)上可耐受的載體為本領(lǐng)域所熟悉。作為實(shí)例的液體載體為不含除活性成分和水之外物質(zhì)的滅菌水溶液，或含緩沖液諸如生理PH值的磷酸鈉、生理鹽水或兩者，諸如磷酸鹽-緩沖鹽水的滅菌水溶液。再有，水性載體可含一種以上的緩沖鹽，以及鹽例如氯化鈉和氯化鉀、右旋糖、聚乙二醇和其它溶質(zhì)。
液體組合物還可含除水之外的以及排斥水的液相。作為實(shí)例的這樣的其它液相為丙三醇、植物油諸如棉子油和水-油乳狀液。
定義術(shù)語“ErbB 1”、“表皮生長(zhǎng)因子受體”和“EGFR”可在本文中交互使用，并且指的是如在，例如在Carpenter等.Ann. Rev. Biochem. 56 :881-914(1987)中公開的天然序列EGFR，包括其變體(如在Humphrey等· PNAS(USA)87 :4207-4211 (1990)中的刪除突變體EGFR)。erbBl指編碼EGFR蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。如本文所使用的，EGFR蛋白已作為由erbBl基因(GenBank 檢索號(hào) NM_005228 (SEQ ID NO :2))編碼的 GenBank 檢索號(hào) NP_005219 (SEQID NO. 1)公開。erbBl/EGFR的核苷酸和氨基酸序列可在圖5中找到。如本文所使用的術(shù)語“激酶活性增加的核酸變異”指基因的核苷酸序列中的變異(即突變)導(dǎo)致激酶活性增強(qiáng)。增強(qiáng)的激酶活性是在核酸中變異的直接結(jié)果并且與基因所編碼的蛋白質(zhì)相關(guān)。 如本文所使用的術(shù)語“藥物”或“化合物”，指給予患者以治療或預(yù)防或控制疾病或病癥的化學(xué)實(shí)體或生物制品，或化學(xué)實(shí)體或生物制品的組合?；瘜W(xué)實(shí)體或生物制品優(yōu)選，但不必是低分子量化合物，而是也可為較大的化合物，例如，核酸、氨基酸的低聚體或碳水化合物包括但不限于蛋白質(zhì)、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNAs、脂蛋白、適體、其修飾體及其組合。如本文所使用的，術(shù)語“有效的”和“效力”包括藥理學(xué)效應(yīng)和生理學(xué)上安全兩者。藥理學(xué)效應(yīng)指在患者中產(chǎn)生所需生物學(xué)效應(yīng)的治療能力。生理學(xué)上安全指由給予治療導(dǎo)致的在細(xì)胞、器官和/或生物水平的毒性水平或其它不利的生理學(xué)上效應(yīng)(通常指副作用)?！拜^差效應(yīng)”意指治療導(dǎo)致在治療學(xué)上顯著較低水平的藥理學(xué)效應(yīng)和/或在治療學(xué)上較高水平的不利的生理學(xué)上效應(yīng)?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟悉的任何多種方法，從特殊的生物樣本分離核酸分子，所選擇的具體分離過程與特定的生物樣本相適應(yīng)。例如，應(yīng)用凍融(freeze-thaw)和堿裂解法,可從固體材料得到核酸分子；應(yīng)用加熱和堿裂解法，可從尿中得到核酸分子；以及可應(yīng)用蛋白酶 K 提取法從血液中得到核酸(Rolff, A 等· PCR :Clinical Diagnostics and Research,Springer(1994)。如本文所使用的，在受治療者或患者中的“癌癥”指存在具有特征性的典型致癌細(xì)胞的細(xì)胞，諸如不受控制的增殖、不死性(immortality)、具轉(zhuǎn)移潛力、快速生長(zhǎng)和增殖率和某些特征性形態(tài)學(xué)特征。在某些情況下，癌癥細(xì)胞將以腫瘤形式存在，或這樣的細(xì)胞可局部存在于動(dòng)物體內(nèi)或作為獨(dú)立細(xì)胞在血流中循環(huán)。
實(shí)施例化合物。本文使用的化合物，包括如在以下文獻(xiàn)中描述的EKB-569、HKI-357和HKI-272 :美國(guó)專利號(hào) 6，002，008 ；Greenberger 等，Proc. 11th NCI-EORTC-AACR Symposiumon New Drugs in Cancer Therapy, Clinical. Cancer Res. Vol. 6 Supplement, Nov.2000,ISSN 1078-0432 ;Rabindran 等，Cancer Res. 64 :3958-3965 (2004) ;Holbro 和 Hynes，Ann.Rev. Pharm. Tox. 44 :195-217 (2004)；和 Tejpar 等，J. Clin. Oncol. ASCO Annual MeetingProc. Vol. 22，No. 14S :3579 (2004) 0
復(fù)發(fā)NSCLC分析和吉非替尼-耐藥NCI-H1650細(xì)胞產(chǎn)生。征得適當(dāng)同意后，將尸體解剖得到復(fù)發(fā)NSCLC臨床樣本。分析非克隆PCR產(chǎn)物之后，對(duì)EGFR的完整激酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行測(cè)序。對(duì)外顯子20的多重克隆測(cè)序以檢測(cè)密碼子790。通過采用染料終止劑化學(xué)(BI⑶YE版本I. I, Applied Biosystems)的單個(gè)外顯子自動(dòng)測(cè)序和用雙向測(cè)序的側(cè)翼內(nèi)含子(flanking intronic)序列(PCR條件按要求可得到)，對(duì)吉非替尼-耐藥克隆中的EGFR (外顯子 1-28)、ERBB2(外顯子 1-24)、PTEN(外顯子(Qxons) 1-9)、Kras (密碼子 12、13和61)和p53 (外顯子5-8)以及親代NCI-H1650細(xì)胞系進(jìn)行突變分析。在ABI3100測(cè)序儀(Applied Biosystems)上進(jìn)行 測(cè)序反應(yīng)和通過采用SEQUENCE NAVIGATOR和FACTURA軟件(Applied Biosystems)分析電泳圖。為產(chǎn)生NCI-H1650細(xì)胞的耐藥亞克隆，用甲磺酸乙酯(EMS ;600 μ g/ml)處理這些細(xì)胞，使恢復(fù)72h，然后接種于20 μ M吉非替尼中，密度為每10-cm2盤6χ104個(gè)細(xì)胞。與不可逆性抑制劑比較，這些細(xì)胞對(duì)吉非替尼相對(duì)耐藥，這可通過在不同藥物濃度存在下，將5χ104個(gè)細(xì)胞接種于5% FCS和100ng/ml EGF(Sigma)的六孔盤中實(shí)現(xiàn)，隨后在用4%甲醒固定細(xì)胞 72h 后，用 0. I %結(jié)晶紫染色，用 Odyssey Infrared Imaging System(LI-C0RBiosciences, Lincoln, NE)對(duì)細(xì)胞群定量。對(duì)于微小干預(yù)RNA(siRNA)敲除實(shí)驗(yàn)，用革巴向EGFR、ERBB2 (兩個(gè) SMART 庫(kù)(pool)來自 Dharmacon，Lafayette, CO)的雙鏈 RNA 寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或使用X-treme基因轉(zhuǎn)染反應(yīng)劑(Roche Applied Science)進(jìn)行非特異性控制(LRTlB)。72h后，細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色，并用Odyssey紅外線掃描儀分析。免疫印跡和信號(hào)傳導(dǎo)研究。由增加吉非替尼或不可逆性抑制劑濃度對(duì)EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的抑制通過以下實(shí)驗(yàn)確定將9x IO4個(gè)細(xì)胞接種于24-孔盤，將藥物加入含5%FCS的培養(yǎng)基中15min，隨后用100ng/ml EGF脈沖2_h，收獲溶解產(chǎn)物。于2x凝膠荷載緩沖液中制備溶解產(chǎn)物，經(jīng)超聲波處理，煮沸，然后用10% SDS/PAGE分離，隨后通過電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜并進(jìn)行免疫印跡。所用的抗體為磷酸化-EGFR Y1068和磷酸化促有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)、磷酸化-AKT(BioSource International, Camarillo, CA)和總 EGFR、MAPK、AKT 和微管蛋白(Santa Cruz Biotechnology)。EGFR內(nèi)化現(xiàn)象分析。為了用熒光顯微鏡方法證明EGFR的內(nèi)化現(xiàn)象，將細(xì)胞生長(zhǎng)在蓋玻片上并與lng/ml重組人(rh)EGF(分子探針，Eugene，0R) —起培養(yǎng)多個(gè)時(shí)間間隔，之后固定于4%多聚甲醒中l(wèi)Omin。用PBS洗漆蓋玻片并用ProLong Gold抗衰減(antifade)反應(yīng)劑(分子探針)封片(mounted)。為通過細(xì)胞表面生物素化使EGFR內(nèi)化現(xiàn)象量化，將細(xì)胞生長(zhǎng)至融合，用環(huán)己酰胺(cyclohexamide)預(yù)處理,于冰上用磺基琥拍酰亞氨基_2_(生物素基酰氨基(biotinamido))乙基-I, 3-二硫代丙酸酯(磺基(sulfo)-NHS-SS-生物素；Pierce) I. 5mg/ml 培養(yǎng) Ih,并用封閉緩沖液(50nM NH4CL/ImM MgCl2A) ImM CaCl2 在 PBS 中)洗滌以猝滅游離的磺基-NHS-SS-生物素，然后再用PBS洗滌數(shù)次。然后將細(xì)胞于37°C培養(yǎng)基中培養(yǎng)多個(gè)時(shí)間間隔以使生物素化的分子內(nèi)化，于冰上用谷胱甘肽溶液(50mM谷胱甘肽/75mM NaCl/75mM Na0H/l% BSA)洗滌兩次20min，從細(xì)胞表面剝離所有生物素基團(tuán)，然后刮下細(xì)胞并將其溶解于用NaF、正釩酸鈉和蛋白酶抑制劑補(bǔ)充的500 μ M放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)緩沖液(25mM Tris-HCl，pH 7. 4，用 150mM NaCL/0. 1% SDS/1% Triton X-100)。將細(xì)胞提取液離心，將上清液與鏈霉抗生物素珠(Sigma)孵育以收集生物素化的蛋白，然后通過 SDS/PAGE 和免疫印跡,用抗-EGFR 抗體(SC-03, Santa Cruz Biotechnology)或抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體(Santa Cruz Biotechnology),對(duì)生物素化的蛋白進(jìn)行分析。結(jié)果和討論對(duì)吉非替尼獲得性耐藥的復(fù)發(fā)性肺癌的分析。在兩個(gè)患者中發(fā)生復(fù)發(fā)的對(duì)吉非替尼-耐藥的NSCLC，其腫瘤在診斷時(shí)已經(jīng)包含EGFR激酶的激活的突變并且已經(jīng)顯示引人注目的對(duì)藥物的最初臨床反應(yīng)(I)。在兩個(gè)病例中，初始治療后1-2年，在肝中發(fā)展的轉(zhuǎn)移疾病導(dǎo)致患者死亡。在病例I中，尸檢時(shí)得到大部肝轉(zhuǎn)移的分析表明，致敏EGFR突變(L858R)的持續(xù)以及存在新的獲得性T790M突變(圖IA)。有趣的是，非克隆的PCR產(chǎn)物的分析顯示，最初L858R突變以與存在于所有腫瘤細(xì)胞中的雜合突變相一致的豐度存在，而在約五分之一豐度的相應(yīng)的野生型等位基因見到繼發(fā)性T790M突變。因而，這種與耐藥相關(guān)的突變似乎僅存在于在復(fù)發(fā)腫瘤的部分細(xì)胞中。病例2涉及吉非替尼療法失敗后的八個(gè)在肝中明顯的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。在所有這些獨(dú)立 的損傷中，致敏的L861Q EGFR突變以期望的雜合突變的比率存在。通過對(duì)來自任何這些轉(zhuǎn)移的非克隆PCR產(chǎn)物的分析，未檢測(cè)到繼發(fā)性EGFR突變。然而，在PCR產(chǎn)物亞克隆之后，發(fā)現(xiàn)在四個(gè)轉(zhuǎn)移腫瘤分析中的兩個(gè)(T790M，自損傷I測(cè)序的50個(gè)克隆中的2個(gè)和自損傷2測(cè)序的56個(gè)克隆中的I個(gè))中，T790M突變以非常低的頻率存在，但從兩個(gè)其它復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(自損傷3測(cè)序的55個(gè)克隆中的O個(gè)和自損傷4測(cè)序的59個(gè)克隆中的O個(gè))或原發(fā)性腫瘤(75個(gè)克隆中的O個(gè))中未能發(fā)現(xiàn)(圖W和表I)?？傊@些結(jié)果與之前T790M突變存在于某些但不是所有的獲得性吉非替尼耐藥(7個(gè)腫瘤中的3個(gè)；參見參考文獻(xiàn)17、18和21)病例的報(bào)告一致。此外，如前所指出的(18)，即使在某些具有這種耐藥相關(guān)突變的病例中，似乎僅存在于小部分復(fù)發(fā)損傷中的腫瘤細(xì)胞中。這些觀察提示，耐藥的其它的機(jī)制涉及到?jīng)]有繼發(fā)性EGFR突變的病例中，并且這樣的機(jī)制與在其它病例中的T790M突變共同存在。具對(duì)不可逆性抑制劑敏感的吉非替尼-耐藥細(xì)胞系的產(chǎn)生。鑒于EGFR-突變體NSCLC的臨床反應(yīng)和伴這些突變(2、6、22、23)的NSCLC細(xì)胞系的增強(qiáng)的吉非替尼-敏感性之間非常相關(guān)，以及可利用的得自復(fù)發(fā)患者的臨床樣本受限，本申請(qǐng)人建立體外吉非替尼耐藥模型。本申請(qǐng)人在20 μ M吉非替尼中，或者預(yù)先暴露或者沒有預(yù)先暴露在誘變劑甲磺酸乙酯下，培養(yǎng)具有EGFR激酶(delE746-A750)的框內(nèi)缺失(in-frame deletion)的支氣管肺泡癌細(xì)胞系NCI-H1650。與表達(dá)野生型EGFR (6)的某些NSCLC系比較，該細(xì)胞系表現(xiàn)出100倍增強(qiáng)的對(duì)吉非替尼的敏感性。而絕大多數(shù)這些細(xì)胞被20 μ M吉非替尼有效殺滅，在 1(Τ5的頻率易于觀察到耐藥的克隆，不論是否用誘變劑處理。分離出四十九個(gè)獨(dú)立的耐藥克隆，顯示對(duì)吉非替尼的敏感性平均減低50倍(圖2Α)。所有這些顯示，沒有EGFR表達(dá)變化的致敏性突變的持續(xù)性，和都沒有獲得性的繼發(fā)性EGFR突變或在ERBB2、p53、Kras或PTEN中的新突變。吉非替尼-耐藥克隆證明對(duì)相關(guān)的苯胺基喹唑啉類抑制劑具有相當(dāng)?shù)哪退幮?。然而，引人注目的是，它們表現(xiàn)出對(duì)ERBB家族(圖2A)的三個(gè)抑制劑的持續(xù)敏感性為EGFR和ERBB2 (對(duì)于EGFR, IC50值分別為92和34nM,和對(duì)于ERBB2,分別為59和33nM)的雙重抑制劑的HKI-272 (24)和HKI-357 (參考文獻(xiàn)25中的化合物7f)，和EGFR (對(duì)于EGFR，IC50值為39nM和對(duì)于ERBB2, IC50值為I. 3 μ M)選擇性抑制劑的ΕΚΒ-569 (26) (Wyeth)(圖2Β)。此三個(gè)藥物均為不可逆性抑制劑，最可能經(jīng)由與EGFR催化性結(jié)構(gòu)域中的cys797殘基或ERBB2的cys805共價(jià)鍵合。如同吉非替尼，與表達(dá)野生型受體的細(xì)胞比較，這些化合物證明對(duì)包含EGFR突變的NSCLC細(xì)胞的殺滅力增強(qiáng)(圖2A)。然而，和吉非替尼形成對(duì)照，對(duì)抗耐藥克隆易于產(chǎn)生，即使在高的藥物濃度時(shí)，本申請(qǐng)人未能建立在約10 μ M濃度對(duì)不可逆性抑制劑耐藥的細(xì)胞克隆，即使在甲磺酸乙酯的誘變之后(圖2C)。吉非替尼-耐藥細(xì)胞依賴于EGFR和ERBB2表達(dá)。為了洞察吉非替尼耐藥性的獲得和對(duì)不可逆性抑制劑的持續(xù)敏感性的機(jī)制，本申請(qǐng)人首先確定是否對(duì)于它們的生存能力而言，耐藥細(xì)胞系依然依賴于EGFR。本申請(qǐng)人之前已經(jīng)表明，siRNA-介導(dǎo)的EGFR的敲除在包含突變體EGFRs的細(xì)胞中觸發(fā)細(xì)胞凋亡，但是不在具野生型等位基因的細(xì)胞中觸發(fā)細(xì)胞凋亡(6)。有顯著意義的是，在用siRNA靶向的EGFR轉(zhuǎn)染之后，親代NCI-H1650細(xì)胞及其吉非替尼-耐藥衍生物顯示可比性地降低細(xì)胞生存力(圖3Α)。因而，吉非替尼-耐藥的獲得不包括下游效應(yīng)器的不依賴EGFR的激活。因?yàn)棣Е?272和ΗΚΙ-357靶向EGFR和ERBB2兩者，本申請(qǐng)人還試驗(yàn)此相關(guān)受體的抑制。NCI-H1650及其吉非替尼-耐藥衍生物中的ERBB2的敲除還引起生存能力的喪失(圖3Α)，提示EGFR-ERBB2雜二聚體在包含EGFR突變的腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基本生存信號(hào)中的作用。僅由不可逆性抑制劑所致EGFR的抑制似乎足以誘導(dǎo) 吉非替尼-耐藥細(xì)胞的凋亡，如被主要靶向EGFR的ΕΚΒ-569的效力所證明(26)。然而，鑒于通過使用siRNA靶向EGFR和ERBB2的潛在補(bǔ)充效應(yīng)和靶向這些家族成員的不可逆性抑制劑的可用性，雙重抑制的潛在利益得到考慮。經(jīng)由介導(dǎo)其增殖和生存通路的EGFR的下游效應(yīng)器，本申請(qǐng)人比較吉非替尼和不可逆性ERBB家族抑制劑對(duì)抑制信號(hào)傳導(dǎo)的能力。在抑制EGFR自動(dòng)磷酸化(在殘基Υ1068檢測(cè))中，和包含delE746-A750EGFR突變的親代NCI-H1650細(xì)胞中的AKT和MAPK磷酸化中，HKI-357的效力未吉非替尼的10倍(圖3B)。在吉非替尼-耐藥衍生物，NCI-H1650 (G7)中，吉非替尼表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)亟档鸵种艫KT磷酸化的效應(yīng)，一種關(guān)聯(lián)吉非替尼響應(yīng)的關(guān)鍵EGFR信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)器(6)，相反，HKI-357被證明具有持續(xù)活性(圖3B)。吉非替尼-耐藥克隆中的改變的EGFR內(nèi)化現(xiàn)象。鑒于EGFR中的繼發(fā)性突變的缺乏和吉非替尼-耐藥細(xì)胞對(duì)siRNA-介導(dǎo)的EGFR的抑制的持續(xù)易感性，本申請(qǐng)人試驗(yàn)在吉非替尼-耐藥細(xì)胞中由可逆性和不可逆性抑制劑對(duì)EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的分化抑制的潛在機(jī)制是否可能與受體傳輸?shù)母淖兿嚓P(guān)，這種傳輸已被充分證明為EGFR-依賴信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)器
(20)。確實(shí)，與藥物-敏感性親代細(xì)胞比較，如采用熒光素-標(biāo)記的EGF內(nèi)化現(xiàn)象(圖3C)和細(xì)胞質(zhì)生物素化EGFR的定量)兩者所檢測(cè)的，NCI-H1650-衍化的耐藥細(xì)胞的EGFR傳輸?shù)姆治鲎C明與EGFR內(nèi)化現(xiàn)象的增強(qiáng)一致(圖3D。這樣的效應(yīng)沒有在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體中觀察至1J，提示此不是來自在所有受體過程(receptor processing)中普遍改變的結(jié)果。盡管需要進(jìn)行進(jìn)一步的工作闡釋EGFR傳輸中此種改變的準(zhǔn)確機(jī)制，但該復(fù)雜過程中已經(jīng)牽涉到許多調(diào)節(jié)蛋白，這些結(jié)果提示吉非替尼抑制EGFR激活的能力危及這些細(xì)胞，而不可逆性抑制劑的作用為可不可檢測(cè)地受到影響。由不可逆性抑制劑引起的T790M EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的抑制和增強(qiáng)的細(xì)胞殺傷力。由不可逆性ERBB抑制劑的對(duì)EGFR信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)的抑制產(chǎn)生這樣的可能性，即這些藥物也可在包含EGFR中的T790M繼發(fā)性突變的細(xì)胞的情況中表現(xiàn)持續(xù)活性。因此本申請(qǐng)人測(cè)試這些抑制劑對(duì)包含EGFR中的L858R和T790M突變的NCI-H1975支氣管肺泡癌細(xì)胞系的效應(yīng)
(18)。有意義的是，該細(xì)胞系源自沒有用EGFR抑制劑治療的患者，表明該突變不是獨(dú)特地與獲得性藥物抵抗相關(guān)。在抑制配體-引起的EGFR自動(dòng)磷酸化及其下游信號(hào)傳導(dǎo)中，當(dāng)通過AKT和MAPK磷酸化測(cè)定時(shí)，HKI-357和HKI-272均比吉非替尼明顯地更為有效(圖AA)。類似地，所有三個(gè)不可逆性抑制劑在該細(xì)胞系中，在其對(duì)吉非替尼耐藥的條件下抑制增殖(圖4B)。因而，不可逆性ERBB抑制劑似乎在包含T790M EGFR的細(xì)胞中以及在伴有野生型受體的改變的傳輸?shù)募?xì)胞中有效。本申請(qǐng)人的結(jié)果確認(rèn)EGFR中的T790M突變作為繼發(fā)性突變的報(bào)告，該突變之前發(fā)生于包含激活性突變的敏感性NSCLCs中，與獲得性耐藥的出現(xiàn)相關(guān)(17，18)。然而，該突變僅存在于一個(gè)亞組病例中，即使包含T790M突變的腫瘤可僅包含一小部分具有該突變的細(xì)胞。這些觀察意味著多重耐藥機(jī)制可共同存在于最初對(duì)吉非替尼或類似的可逆性EGFR抑制劑有反應(yīng)之后的復(fù)發(fā)腫瘤中。此外，這些發(fā)現(xiàn)提示不依賴T790M的耐藥機(jī)制，如果不比在賦予藥物抵抗中的T790M取代本身更有效，也可能是相同的，并可解釋為什么復(fù)發(fā)腫瘤幾乎不表現(xiàn)對(duì)于T790M的克隆狀態(tài)(clonality) (17，18)。獲得性吉非替尼耐藥的體外機(jī)制不顯著頻繁涉及繼發(fā)性EGFR突變，而是與改變的受體傳輸相關(guān)。然而，應(yīng)該指出的是，本申請(qǐng) 人沒有測(cè)試在所有本申請(qǐng)人體外建立的耐藥克隆中的EGFR傳輸，并且可能在某些克隆中存在可對(duì)吉非替尼耐藥起作用的另外的機(jī)制。雖然如此，事實(shí)上所有吉非替尼-耐藥克隆表現(xiàn)出對(duì)不可逆性ERBB抑制劑的可比較的敏感性。本申請(qǐng)人的結(jié)果表明競(jìng)爭(zhēng)性EGFR抑制劑諸如吉非替尼(其效力受到體外耐藥性快速發(fā)展的限制)與不可逆性抑制劑(對(duì)其的獲得性耐藥似乎很少見)之間顯著不同(圖2C)。本申請(qǐng)人推測(cè)耐藥細(xì)胞中的配體-結(jié)合的EGFR的增強(qiáng)內(nèi)化現(xiàn)象，可與在細(xì)胞內(nèi)囊泡的低pH下吉非替尼-EGFR復(fù)合體的離解(dissociation)關(guān)聯(lián)。與此對(duì)照，受體的不可逆性交聯(lián)將不受這樣的受體傳輸?shù)母淖兊挠绊?。在缺乏藥物情況下細(xì)胞經(jīng)過傳代最多至20代后，對(duì)吉非替尼的獲得性耐藥穩(wěn)定持續(xù)，提示調(diào)節(jié)EGFR轉(zhuǎn)換(turnover)的基因的遺傳或外遺傳的改變可解釋此現(xiàn)象。因?yàn)槭荏w傳輸不容易通過采用可用的臨床樣本進(jìn)行研究，所以在可能的臨床相關(guān)性之前進(jìn)行這樣的基因改變的鑒定可能是必須的。雖然如此，這樣的機(jī)制可對(duì)EGFR中不具有繼發(fā)性突變的復(fù)發(fā)疾病患者體內(nèi)獲得性吉非替尼-耐藥起作用。不可逆性ERBB抑制劑還似乎在克服由T790M突變介導(dǎo)的吉非替尼耐藥性中有效，所述突變推測(cè)為不論這種重要?dú)埢母淖兣c否，因維護(hù)抑制劑結(jié)合所傳輸?shù)男?yīng)。當(dāng)在進(jìn)行此工作時(shí)，另一種EGFR不可逆性抑制劑[CL-387，785，Calbiochem(27)]顯示抑制T790MEGFR突變體的激酶活性(17)。在T790M的條件下的CL-387，785的效力被認(rèn)為是在苯胺基團(tuán)3號(hào)位置上缺乏氯(chloride)的結(jié)果，所述基團(tuán)存在于吉非替尼中并且推定在空間上阻礙對(duì)在密碼子790上突變體甲硫氨酸的結(jié)合。然而，EKB-569、HKI-272和HKI-357均在苯胺環(huán)的該位置上具有氯部分，提示它們的共享的對(duì)EGFR不可逆結(jié)合能力或許解釋它們的效力，而不是缺乏與T790M的特異性空間上相互作用(24-26)。因而，除了 T790M突變外，可證明這些不可逆性抑制劑在包括多種耐藥機(jī)制中也是廣泛有效的。
表I. EGFR T790M突變?cè)诓±?的復(fù)發(fā)腫瘤中以非常低的頻率存在克隆數(shù)
腫瘤 T790M突變體—~野生型原發(fā)性O(shè)75
復(fù)發(fā)I248
復(fù)發(fā)2I55
復(fù)發(fā)3O55
復(fù)發(fā)4O59大量克隆的PCR產(chǎn)物測(cè)序揭示，四例肝損傷中的兩例的少數(shù)等位基因含T790M突 變。本說明書全文中引用的參考文獻(xiàn)通過對(duì)其全文的引用結(jié)合于本文。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.治療患者吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥性癌癥的方法，所述方法包括給予對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼治療耐藥的癌癥患者含不可逆性表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑的藥用組合物，其中，所述患者為復(fù)發(fā)的吉非替尼和/或埃羅替尼反應(yīng)者。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑選自EKB-569、HKI-272和HKI-357。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑是HKI-272。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑結(jié)合于SEQID NO :2所示的EGFR的半胱氨酸797。
5.權(quán)利要求I的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑結(jié)合于EGFR的半胱氨酸773。
6.權(quán)利要求I的方法，其中所述癌癥是上皮細(xì)胞癌。
7.權(quán)利要求I的方法，其中所述癌癥是胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、食道癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌癥和膀胱癌。
8.權(quán)利要求I的方法,其中施用劑量包含以約O.5-約1000mg/kg體重的每天劑量，任選一天2-4次分劑量或以緩釋形式給予。
9.權(quán)利要求I的方法，其中給藥途徑包括靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給藥、腹腔給藥、鞘內(nèi)給藥、胸膜內(nèi)給藥、子宮內(nèi)給藥、直腸給藥、陰道給藥、局部給藥、透過粘膜給藥、透皮給藥給藥、通過注射或整個(gè)時(shí)間漸進(jìn)輸液，通過蠕動(dòng)方式傳輸胃腸外給藥、腫瘤內(nèi)給藥。
10.治療癌癥的方法，包括下述步驟 i)向癌癥患者施用吉非替尼和/或埃羅替尼；和 ii)在出現(xiàn)癌癥發(fā)展指征時(shí)向患者施用不可逆性表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑； 所述患者正在進(jìn)行進(jìn)一步的癌癥治療，包含化療，放療或其它酪氨酸激酶抑制劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑選自EKB-569、HKI-272和HKI-357。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑是HKI-272。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑結(jié)合于SEQID NO 2所示的EGFR的半胱氨酸797。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑結(jié)合于EGFR的半胱氨酸773。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述癌癥是上皮細(xì)胞癌。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述癌癥是胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、食道癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌癥和膀胱癌。
17.權(quán)利要求10的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑與可逆性EGFR抑制劑同時(shí)給予。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述可逆性EGFR抑制劑是吉非替尼或埃羅替尼。
19.權(quán)利要求10的方法，其中施用劑量包含以約O.5-約1000mg/kg體重的每天劑量，任選一天2-4次分劑量或以緩釋形式給予。
20.權(quán)利要求10的方法，其中給藥途徑包括靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給藥、腹腔給藥、鞘內(nèi)給藥、胸膜內(nèi)給藥、子宮內(nèi)給藥、直腸給藥、陰道給藥、局部給藥、透過粘膜給藥、透皮給藥給藥、通過注射或整個(gè)時(shí)間漸進(jìn)輸液，通過蠕動(dòng)方式傳輸胃腸外給藥、腫瘤內(nèi)給藥。
21.一種治療癌癥的方法，所述方法包括給予癌癥患者有效量的含HKI-272的藥用組合物，所述患者在SEQ ID NO :1所示的EGFR上有突變，其中所述突變?yōu)樵?90位置上的蘇氨酸被甲硫氨酸置換。
22.權(quán)利要求21的方法,其中所述癌癥是上皮細(xì)胞癌。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述癌癥是胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、食道癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌癥和膀胱癌。
24.權(quán)利要求21的方法，其中施用劑量包含以約O.5-約1000mg/kg體重的每天劑量，任選一天2-4次分劑量或以緩釋形式給予。
25.權(quán)利要求21的方法，其中給藥途徑包括靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給藥、腹腔給藥、鞘內(nèi)給藥、胸膜內(nèi)給藥、子宮內(nèi)給藥、直腸給藥、陰道給藥、局部給藥、透過粘膜給藥、透皮給藥給藥、通過注射或整個(gè)時(shí)間漸進(jìn)輸液，通過蠕動(dòng)方式傳輸胃腸外給藥、腫瘤內(nèi)給藥。
26.治療復(fù)發(fā)的吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥性癌癥患者的方法，包括下述步驟 i)確定患者中的癌癥復(fù)發(fā)，開始對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼產(chǎn)生反應(yīng)性；和 ii)給予癌癥患者有效量的含HKI-272的藥用組合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中施用劑量包含以約O.5-約1000mg/kg體重的每天劑量，任選一天2-4次分劑量或以緩釋形式給予。
28.權(quán)利要求26的方法，其中給藥途徑包括靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給藥、腹腔給藥、鞘內(nèi)給藥、胸膜內(nèi)給藥、子宮內(nèi)給藥、直腸給藥、陰道給藥、局部給藥、透過粘膜給藥、透皮給藥給藥、通過注射或整個(gè)時(shí)間漸進(jìn)輸液，通過蠕動(dòng)方式傳輸胃腸外給藥、腫瘤內(nèi)給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥性癌癥的方法。在用吉非替尼和/或埃羅替尼治療后監(jiān)測(cè)癌癥患者的癌癥發(fā)展。癌癥的發(fā)展指示癌癥對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥。一旦表明癌癥在發(fā)展，則給予患者含不可逆性表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑的藥用組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，不可逆性EGFR抑制劑是EKB-569、HKI-272和HKI-357。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102886045SQ20121032813
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2006年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者D.哈伯, D.W.貝爾, J.E.塞特爾曼, R.索爾德拉, N.G.戈丁-海曼, E.L.夸克, S.K.拉賓蘭 申請(qǐng)人:綜合醫(yī)院公司, 惠氏公司