專利名稱：Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物新用途技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)的年發(fā)病率約6 16/100000人，約占腦卒中總發(fā)病率的6 8%，顱內(nèi)動脈瘤破裂是自發(fā)性SAH的主要原因。腦血管疫攣(cerebral vasospasm, CVS)是蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后常見而危險(xiǎn)的并發(fā)癥，?？梢饑?yán)重的腦組織缺血或遲發(fā)性缺血性腦損害，甚至導(dǎo)致腦梗死，是致死或致殘的主要原因之一。有研究表明，動脈瘤性SAH發(fā)病后，約30%-70% 的患者產(chǎn)生血管造影顯示的血管痙攣，其中20% 30%的患者出現(xiàn)臨床癥狀，雖經(jīng)積極治療，有癥狀的患者中仍有32% 67%出現(xiàn)腦梗死，最終15% 20%會因卒中致殘或因缺血而死亡。近年來國內(nèi)外學(xué)者在血管痙攣和SAH的治療方面取得了一定的進(jìn)展，使腦血管痙攣的病死率和致殘率大為降低。但目前引起腦血管痙攣的確切發(fā)病機(jī)制仍未明確，各種治療方法均不甚理想，因此如何防治CVS是降低SAH后致殘率和致死率的關(guān)鍵。動脈瘤性SAH后CVS的確切病理機(jī)制目前仍不十分清楚，治療上也因此缺乏針對性。臨床上對于SAH后CVS的防治方法主要有手術(shù)清除血凝塊、腦脊液持續(xù)外引流等預(yù)防措施和3H治療、鈣離子拮抗劑的應(yīng)用等治療措施，但效果均不理想。由于CVS是多因素、多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果，因而防治的關(guān)鍵在于能夠同時(shí)針對不同的機(jī)制逆轉(zhuǎn)其發(fā)生和發(fā)展的過程?，F(xiàn)階段亟需一種能夠控制動脈瘤性SAH后CVS的治療手段來減輕腦血管痙攣的影響。Cystatin C是一種低分子量、堿性非糖化蛋白質(zhì)，分子量為13. 3KD,由120個(gè)氨基酸殘基組成，等電位9. 3，由CST3基因編碼，為半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族2中的成員，也稱為胱抑素C，Y-微量蛋白及Y-后球蛋白，可由機(jī)體所有有核細(xì)胞產(chǎn)生，無組織學(xué)特異性，產(chǎn)生率恒定。Cystatin C廣泛存在于人類的體液中,在腦脊液中濃度最高,約占2 4%，是血液中的5. 5倍。Cystatin C在生理?xiàng)l件下的重要功能是抑制內(nèi)源性的半胱氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶B、H、L和二肽基肽酶等)的活性。腦脊液中的Cystatin C主要來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和脈絡(luò)叢。Cystatin C因其分子量小，能自由通過腎小球?yàn)V過膜，幾乎完全被腎小管重吸收且不被分泌，其血中濃度不受炎癥、肌肉量、腎小管分泌因素的影響，因此，能替代肌酐成為一種新的反映GFR的理想標(biāo)志物而在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。除此之外，Cystatin C在生理?xiàng)l件下的重要功能是抑制內(nèi)源性的半胱氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶B、H、L和二肽基肽酶等)的活性。它在機(jī)體中有著廣泛的生物學(xué)作用，可以阻止死亡細(xì)胞或惡性細(xì)胞漏出的細(xì)胞內(nèi)酶對周圍組織的破壞，并具有促生長活性、炎癥下調(diào)、抗病毒、抗細(xì)菌等功能。它參與了眾多各式各樣的疾病的進(jìn)程，如腫瘤、腎病、糖尿病、癲癇、神經(jīng)變性疾病等。有研究證明它在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有神經(jīng)保護(hù)功能如遺傳性大腦淀粉樣血管病、短暫性前腦缺血、腦梗塞和癲癇癥等。Tizon等實(shí)驗(yàn)證明，夕卜源性Cystatin C通過抑制哺乳動物雷帕霉素祀蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路誘導(dǎo)自曬,從而對小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用，而Cystatin C的神經(jīng)保護(hù)作用可被3_MA (3-甲基腺嘌呤，一種自噬阻斷劑)阻斷，認(rèn)為Cystatin C通過誘導(dǎo)自曬在腦保護(hù)中起重要作用。目前針對SAH后自噬的作用主要集中在早期腦損傷方面，但CystatinC對顱內(nèi)血管痙攣是否有防治作用，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明因此而來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的新用途，揭示了一種蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的新治療途徑。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是
一種Cystatin C在制備用于治療腦血管痙攣的藥物組合物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述腦血管痙攣為蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣。優(yōu)選的,所述藥物組合物包含藥學(xué)上有效量的Cystatin C和藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選的，所述腦血管痙攣為動脈瘤性自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣。本發(fā)明技術(shù)方案通過枕大池注藥法來研究半胱氨酸蛋白酶抑制劑CXCystatin C)能否對SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦血管痙攣有防治作用，并測定LC3和Beclin-I等自噬指標(biāo)來研究這種作用與自噬的相關(guān)性，以期為探討蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的作用機(jī)制及治療提供更多的理論依據(jù)。本發(fā)明通過SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后自噬在基底動脈壁的表達(dá)情況，研究經(jīng)枕大池注入半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Cystatin C，CysC)對SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦血管痙攣的干預(yù)作用，并分析其與自噬的相關(guān)性。本發(fā)明采用五十只SD大鼠隨機(jī)分為對照組(A組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血組(B組)、安慰劑組(C組)、Cystatin C低濃度治療組(DL組)和CystatinC高濃度治療組(DH組),每組10只。各組動物均在全麻下行常規(guī)手術(shù)操作，SAH組、安慰劑組和Cystatin C治療組的動物取自體非抗凝股動脈血O. 3ml注入枕大池即一次注血法制作SAH動物模型，而對照組經(jīng)枕大池注入O. 3ml生理鹽水，安慰劑和治療組在枕大池注血前30分鐘分別注入生理鹽水O. Iml和Cystatin C水溶劑O. Iml (其中低濃度和高濃度組劑量分別為2 μ g/0. Iml和10yg/0. 1ml)。各組于術(shù)后48小時(shí)處死動物取腦基底動脈及周圍腦干組織行病理檢查，測定基底動脈血管內(nèi)徑周長和血管壁厚度，應(yīng)用自噬標(biāo)記抗體LC3和Beclin-I對各組基底動脈組織進(jìn)行免疫組化和Western blot檢測。采用單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，SAH組和安慰劑組中大鼠基底動脈內(nèi)徑周長較對照組明顯縮短(P
<O. 01)，血管壁厚度明顯增加(P < O. 01)，管腔狹窄，內(nèi)膜皺褶，平滑肌細(xì)胞肥大；CysC治療組中基底動脈內(nèi)徑周長增大，管壁增厚程度減輕，與SAH組對比有顯著性差異(P
<O. 01)，在高濃度治療組更明顯，與低濃度組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。免疫組化顯示，在對照組中基底動脈的內(nèi)膜、中膜只可觀察到極少數(shù)的LC3和Beclin-I陽性表達(dá)，在SAH和安慰劑組中LC3和Beclin-I陽性的表達(dá)增加，在低濃度和高濃度治療組內(nèi)膜和中膜可觀察到大量LC3和Beclin-I陽性表達(dá),外膜也可見到散在的染色信號。Westernblot結(jié)果顯示LC3和Beclin-I在對照組是低表達(dá)的，而在SAH組及安慰劑組表達(dá)明顯增高，其LC3/GAPDH、Beclin-l/GAPDH值與對照組比較，P < O. 05。而在CysC治療組，LC3和Beclin-I的表達(dá)進(jìn)一步增高，以CysC高濃度組更明顯，與SAH組比較，P < O. 01，與CysC低濃度組相比，P < O. 05。本發(fā)明中，可將本發(fā)明中的Cystatin C采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備成適用于胃腸道給藥或非胃腸道給藥的藥物制劑，本發(fā)明優(yōu)選將Cystatin C制備成適用于胃腸道給藥的藥物制劑，其制劑形式可以為常規(guī)片劑或膠囊劑或控釋、緩釋制劑。在本發(fā)明中CystatinC藥物組合物的藥物制劑中，根據(jù)不同的制劑形式或制劑規(guī)格，所述組合物在制劑中的含量可以為質(zhì)量計(jì)為1°/Γ99%，優(yōu)選為109Γ90%;本發(fā)明所述的藥學(xué)上可接受的載體為組合物中制劑使用的輔料可采用本領(lǐng)域常規(guī)的輔料，以不和本發(fā)明活性成分發(fā)生反應(yīng)或不影響本發(fā)明藥物的療效為前提，所述制劑的制備方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法進(jìn)行制備。 本發(fā)明中，組合物的制備方法沒有限制，Cystatin C直接做成制劑，或者分別或/和輔料混合后做成制劑，然后安裝本領(lǐng)域常規(guī)的方式進(jìn)行包裝，與其他輔料混合制成制劑。本發(fā)明中的藥物組合物的給藥劑量根據(jù)給藥對象、給藥途徑或藥物的制劑形式不同可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兓?，但以保證該藥物組合物在哺乳動物體內(nèi)能夠達(dá)到有效的血藥濃度為前提。相對于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明通過構(gòu)建大鼠枕大池一次注血模型，能夠觀察到基底動脈發(fā)生明顯的細(xì)胞形態(tài)改變、管壁的增厚以及管腔的狹窄，提示SAH后存在CVS。由于自噬在正常大鼠基底動脈壁的表達(dá)是低水平的。而SAH后自噬在基底動脈壁的表達(dá)上調(diào)，提示自噬可能參與了 CVS的病理過程。經(jīng)枕大池注入Cystatin C能誘導(dǎo)自噬在基底動脈壁的高表達(dá)，對SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣有防治作用，并且這種作用與Cystatin C濃度存在正相關(guān)性。Cystatin C對SAH后腦血管痙攣具有顯著抑制的效果，可以用來改善SAH后腦血管痙攣。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖I為A組的大鼠基底動脈血管的HE染色檢查；圖2為B組的大鼠基底動脈血管的HE染色檢查；圖3為C組的大鼠基底動脈血管的HE染色檢查；圖4為DL組的大鼠基底動脈血管的HE染色檢查；圖5為DH組的大鼠基底動脈血管的HE染色檢查；圖6為各組SD大鼠基底動脈內(nèi)徑周長直方圖(單位μ m);圖7為各組SD大鼠基底動脈管壁厚度直方圖(單位μ m);圖8為各組SD大鼠基底動脈Western blot檢查結(jié)果；圖9為各組SD大鼠基底動脈LC3和Beclin-I表達(dá)的變化(/GAPDH)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例Cystatin C對SAH后腦血管痙攣的影響一、試驗(yàn)I. I實(shí)驗(yàn)對象健康SD大鼠(Sprague-Dawley rat) 50只，雄性，體重300 350g,清潔級，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。喂養(yǎng)條件如下五只一籠，室溫20°C左右，濕度50-60%，通風(fēng)良好，自由攝食攝水，術(shù)前禁食12小時(shí)但不禁水。I. 2主要試劑和儀器I. 2. I常規(guī)試劑 Cystatin C( 100 μ g,人尿提純,Enzo Life Sciences,瑞士)、4% 多聚甲醒、PBS 液，安爾碘，DAB顯色劑、生理鹽水、蒸餾水、10%水合氯醛、無水酒精。I. 2. 2HE及免疫組化試劑蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(武漢博士德公司)，內(nèi)有蘇木素染色液和伊紅染色液。二步法兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒(上海拜力生物科技有限公司)，主要成分為=A 液(ChemMate EnVision + /HRP), B 液(DAB 緩沖稀釋液)，C 液(DAB 原液)?？笲eclin-I和抗LC3抗體-一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。I. 2. 3實(shí)驗(yàn)設(shè)備石蠟切片機(jī)(Leica 3215，德國)、自動脫水機(jī)(Leica 1020，德國)、石蠟包埋機(jī)(BMJ-III，中國，常州)、01ympus BX40型光學(xué)顯微鏡、圖像攝影軟件(L0GENE-I Path PRT診斷報(bào)告工作站)、液氮罐(成都金鳳液氮容器有限公司)、大鼠實(shí)驗(yàn)操作臺(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦神經(jīng)研究室提供)、醫(yī)用冰箱(青島海爾公司)、手術(shù)器械一套等。I. 3實(shí)驗(yàn)分組及動物模型的制作I. 3. I實(shí)驗(yàn)分組選擇健康雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為A、B、C、DL、DH 5組，每組IO只。A組(對照組)暴露環(huán)枕筋膜及股動脈，穿刺枕大池釋放腦脊液O. 3ml，取O. 3ml生理鹽水緩慢注入枕大池，頭低30°俯臥位30min，然后縫合傷口。B組(SAH組)暴露環(huán)枕筋膜及股動脈，穿刺枕大池釋放腦脊液O. 3ml，取自體非抗凝股動脈血O. 3ml緩慢注入枕大池，頭低30°俯臥位30min，然后縫合傷口。C組(SAH+安慰劑組)暴露環(huán)枕筋膜及股動脈，穿刺枕大池釋放腦脊液O. 3ml，經(jīng)枕大池注入生理鹽水O. Iml, 30分鐘后取自體非抗凝股動脈血O. 3ml緩慢注入枕大池，頭低30°俯臥位30min，然后縫合傷口。DL組(SAH+低濃度藥物組)暴露環(huán)枕筋膜及股動脈，穿刺枕大池釋放腦脊液O. 3ml，經(jīng)枕大池注入Cystatin C水溶液O. Iml (濃度為2 μ g/0. Iml )，30分鐘后取自體非抗凝股動脈血O. 3ml緩慢注入枕大池，頭低30°俯臥位30min，然后縫合傷口。DH組(SAH+高濃度藥物組)暴露環(huán)枕筋膜及股動脈，穿刺枕大池釋放腦脊液O. 3ml，經(jīng)枕大池注入Cystatin C水溶液O. Iml (濃度為10 μ g/0. Iml )，30分鐘后取自體非抗凝股動脈血O. 3ml緩慢注入枕大池，頭低30°俯臥位30min，然后縫合傷口。
I. 3. 2術(shù)前準(zhǔn)備SD大鼠，電子稱重儀，安爾碘，手術(shù)刀、剪、鑷和拉鉤，lml、5ml注射器，24G靜脈留置套管針，10%水合氯醛，500ml容器+輸液管，托盤，4%中性多聚甲醛，生理鹽水。I. 3. 3手術(shù)步驟根據(jù)Gules 法[Gules I, Satoh M, Clower B R, et al. Comparison ofthree rat models of cerebral vasospasm[J].Am J Physiol Heart CircPhysiol, 2002, 283(6) :H2551_H2559]經(jīng)枕大池一次注血制備大鼠SAH模型手術(shù)前12小時(shí)對SD大鼠禁食不禁飲，術(shù)前4小時(shí)禁飲，10 %水合氯醛按
0.4ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，頸枕交界區(qū)和腹股溝區(qū)備皮、消毒。大鼠俯臥位，于枕外隆突以下約0. 5cm正中直切口，鈍性分離，逐步暴露枕骨、環(huán)椎及環(huán)枕膜，大鼠改仰臥位，于腹股溝區(qū)剪開長約Icm大小切口，暴露、分離出股動脈，并置人24G留置針。大鼠改為俯臥位，·用Iml注射器針頭刺破環(huán)枕膜并稍稍向前推進(jìn)至枕大池，回抽并釋放清涼腦脊液約0. 3m,用Iml注射器采集0. 3ml未抗凝股動脈血后即緩慢注入枕大池。注射完畢后用明膠海綿封堵穿刺孔，用慶大霉素沖洗傷口并逐層縫合。然后，大鼠頭低位30°約30min，以利于血液廣泛分布于顱底蛛網(wǎng)膜下隙中。模型制作完畢。各組除枕大池注射內(nèi)容物不同外，其它步驟都一致。將實(shí)驗(yàn)動物保溫復(fù)蘇后給予喂水喂食。并進(jìn)行一般情況與行為學(xué)觀察。I. 4標(biāo)本采集各組實(shí)驗(yàn)動物均于術(shù)后48h，腹腔注射10%水合氯醛過量麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠臺上，開胸暴露心臟，經(jīng)心尖向升主動脈插管灌注，后剪開右心耳，先用生理鹽水250ml加壓沖洗約20分鐘至沖洗液變?yōu)闊o色，再用250ml 4%中性多聚甲醛溶液灌注，至動物四肢抽搐，變硬。斷頭取腦。每組10只標(biāo)本中隨機(jī)選擇5只取基底動脈部位存放于液氮罐中用于Westernblot檢測，另5只取腦干標(biāo)本在4%多聚甲醒溶液中固定24小時(shí)，固定后冠狀切取包括基底動脈中上段腦組織3mm，石蠟包埋后，作HE染色及免疫組化分析。I. 5HE 染色主要試劑是蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(武漢博士德公司)，內(nèi)有蘇木素染色液和伊紅染色液。HE染色步驟(I)將石蠟切片在二甲苯脫蠟10分鐘，2次。(2)切片脫蠟后，依次過100%，100%，95%，90%，85%的酒精至水，每缸各10分鐘。(3)流水沖洗切片3分鐘后，在蘇木素燃料中染色3分鐘，再用流水沖洗2分鐘。(4) I %鹽酸酒精分化20秒，再流水沖洗3分鐘。(5) 10%的稀氨水溶液中反藍(lán)30秒，蒸餾水沖洗I分鐘。(6)在伊紅溶液中染色3分鐘，流水沖洗I分鐘。(7)依次過 85%，90%，95%，100%，100% 的酒精脫水。(8)在二甲苯溶液中透明2分鐘，3次，后用流水沖洗I分鐘。(9)用封片膠封片。I. 6免疫組化染色檢測LC3和Beclin_l
ChemMate EnVision + /HRP/DAB,兔 / 鼠二步法染色步驟(I)常規(guī)脫蠟水化將已在烤箱中干燥過的石蠟切片浸于二甲苯中10分鐘，三次。取出切片置于100%無水乙醇中10分鐘兩次；依次置入90% — 70%各級酒精各3分鐘。取出置于蒸餾水中。(2)抗原修復(fù)切片置于10mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH6. O)中，微波爐加熱(溫度95°C ) 30min,自然冷卻至室溫，PBS液沖洗3次，每次3分鐘。(3)取出蒸餾水中的切片，甩掉并擦干切片上組織周圍的液體，平放于濕盒中，滴加3%過氧化氫，避光孵育15分鐘。蒸餾水沖洗，再將切片置入PBS緩沖液中，浸泡5分鐘，三次。取出切片，甩掉并擦干組織周圍的液體，平放于濕盒中。(4)滴加100微升抗Beclin-I和抗LC3親和純化兔抗體(一抗)于組織上，室溫孵 育30分鐘。用PBS沖洗切片3次，每次3分鐘，取出切片，甩掉并擦干組織周圍的液體，平放于濕盒中。(5)滴加 100 微升 A 液(ChemMateTMEnVision + /HRP) (二抗)于組織上，室溫孵育30分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3分鐘。取出切片，甩掉并擦干組織周圍的液體，平放于濕盒中。(6)滴加預(yù)備好的顯色劑DAB工作液100微升。室溫孵育30分鐘。顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色。(7)各級酒精(70%_100%)脫水，每級3分鐘。取出切片置入二甲苯5分鐘，三次。(8)用封片膠封片。I. 7ffestern blot 檢測 LC3 和 Beclin-1I. 7. I主要儀器玻璃勻漿器(寧波新芝DY89-1)、高速離心機(jī)(湖南湘儀H1650-W)、分光光度儀(上海欣茂UV-7504)、-20°C低溫冰箱、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(上海天能生物)、電泳儀(北京君意JY300C)、多用脫色搖床(蘇州捷美SYC-2101)。I. 7. 2主要試劑單去污劑裂解液(北京普利萊生物)、一抗LC3，BECNl (北京博奧森)、預(yù)染蛋白(Fermentas)、HRP 二抗(GenScript)、內(nèi)參一抗(GenScript)、0. 01mol/L PBS (pH7. 3) >12%分離膠、6%濃縮校、0. 15mol/LNaCl溶液、5XSDS上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、封閉液、TBST、TBS、TEMED、顯影液、定影液、化學(xué)發(fā)光試劑。I. 7. 3ffestern blot 檢測步驟①灌膠與上樣先玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。將12%分離膠，力口入TEMED后立即搖勻即可灌膠。當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。將6%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。取出上樣樣品與5XSDS上樣緩沖液上樣緩沖液按4 :1比例混合，混勻后沸水中煮5min使蛋白變性。加足夠的電泳液后按等量蛋白上樣。電泳，80V跑過濃縮膠后轉(zhuǎn)換電壓至120V，待溴酚蘭跑到膠板底部剛好沒有跑出即可。將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面依次墊海綿墊、濾紙、膠、PVDF膜(經(jīng)甲醇活化)、濾紙、海綿墊；同時(shí)將電泳液換成轉(zhuǎn)移液。將電流調(diào)整到恒流200mA，轉(zhuǎn)移約I. O小時(shí)。取出膜，并做好正反面標(biāo)記，在TBST中清洗I分鐘，然后用封閉液封閉過夜。用封閉液將對應(yīng)的一抗稀釋成一定的濃度(I 300)，內(nèi)參一抗的稀釋終濃度為I :3000，然后溫育I. 5小時(shí)。用TBST清洗3次，每次5分鐘。用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度(1:5000)，然后溫育I. 5小時(shí)。用TBST清洗4次，每次5分鐘。②化學(xué)發(fā)光，顯影，定影先將A和B兩種試劑在試管內(nèi)等體積混合，然后加在PVDF膜的正面，溫育大概2分鐘；然后進(jìn)入暗室，PVDF膜上蓋一層保鮮膜，擦去多余的發(fā)光劑。將膠片壓在保鮮膜上，依照發(fā)光的強(qiáng)度選擇不同的曝光時(shí)間；將膠片放入顯影液中，出現(xiàn)條帶后，立即放入定影液中，流水沖洗膠片后晾干；對膠片進(jìn)行掃描，然后用UVP凝膠圖象處理系統(tǒng)Labw0rks4.6軟件分析目的條帶的灰度值?！. 8檢驗(yàn)觀察I. 8. IHE 染色觀察大鼠基底動脈血管內(nèi)徑周長及血管壁厚度基底動脈在40倍光學(xué)顯微鏡下照相，采用Image-pix) Plus顯微鏡圖像分析系統(tǒng)計(jì)算出血管內(nèi)徑周長及血管壁厚度。通過基底動脈內(nèi)徑周長的比較，判斷血管有無痙攣及痙攣程度。CVS值參照Liszczak法[Liszczak TM, Varsos V G, Black P M, et al. Cerebral arterial constriction after experimentalsubarachnoid hemorrhage is associated with blood components within the arterialwall [J]. J Neurosurg, 1983, 58 (I) : 18-26]，計(jì)算如下CVS值=(注血前BA直徑-注血后BA直徑)/注血前BA直徑X 100% ；CVS 的評價(jià)方法，參照 Handa 方法[Handa Y, Kabuto M, Kobayashi H, et al. Thecorrelation between immunological reaction in the arterial wall and the timecourse of the development of cerebral vasospasm in a primate model[J]. Neurosurgery, 1991，28(4) :542-549]:無 CVS，CVS 值彡 10% ;輕度 CVS，CVS 值 11-30% ;中度 CVS, CVS值 31-50% ;重度 CVS, CVS 值彡 50%oI. 8. 2免疫組化觀察顯微鏡下觀察并攝像，每張切片在高倍鏡(10X20)視野下觀察基底動脈管壁內(nèi)膜、中膜及外膜的染色情況。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)棕色或棕黃色為陽性染色。以無染色為陰性(_)，輕度或局部染色為( + )，全層重度或強(qiáng)烈染色為(+++)，介于兩者之間為(++)。I. 8. 3ffestern blot 結(jié)果觀察用GAPDH為內(nèi)對照，以陽性條帶與內(nèi)對照光密度比值作為陽性條帶的相對表達(dá)。I. 9統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土S)表示，使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組比較用單因素方差分析(one way AN0VA),兩兩比較在總體方差齊的條件下,選用LSD及Dunnett-t法進(jìn)行分析。P〈0. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P〈0. 01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。二、結(jié)果2. I動物存活情況
對照組動物全部成活，SAH組、安慰劑組及高濃度藥物組中分別有2、2、1只大鼠在注血過程中心跳、呼吸停止，經(jīng)心肺按壓無效死亡，死亡原因考慮為注血過程過快或針頭穿刺過深損傷腦干所致。死亡后動物隨機(jī)補(bǔ)充至各組。2. 2動物狀態(tài)及行為學(xué)觀察術(shù)后第一天各組實(shí)驗(yàn)動物精神狀態(tài)比較差，術(shù)后第二天對照組動物精神狀態(tài)及食欲恢復(fù)正常。而SAH組、安慰劑組、藥物處理組動物仍有不同程度的萎靡，毛發(fā)蓬松，頭低位蜷縮狀，活動及飲食減少，小部分大鼠可出現(xiàn)一側(cè)或兩側(cè)球結(jié)膜下出血。2. 3標(biāo)本病理學(xué)檢查2. 3. I大體觀察對照組大鼠腦表面及血管周圍均未見到積血，未見手術(shù)損傷；SAH組、安慰劑組、Cystaitin C處理組均可見在腦干腹側(cè)、基底池、顱底腦表面大量積血，其中以SAH組、安慰 劑組明顯。2. 3. 2基底動脈HE染色結(jié)果，如圖I 圖5所示①形態(tài)學(xué)光鏡下，對照組基底動脈結(jié)構(gòu)正常，管腔呈圓形或橢圓形，管壁較薄，血管內(nèi)膜光整，未見管壁皺褶，管腔面積大，內(nèi)徑長，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)層次清楚，無腫脹、壞死、脫落，內(nèi)彈力層平整，血管平滑肌呈扁平狀；SAH組和安慰劑組基底動脈管壁皺褶，管腔不規(guī)則，收縮明顯，管壁增厚，管腔面積小，直徑短，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變形，部分壞死、脫落，內(nèi)彈力膜迂曲，厚薄不均，部分中膜變厚，平滑肌細(xì)胞排列紊亂；Cystatin C處理組基底動脈管壁有皺褶，但收縮較輕，管腔圓滑，內(nèi)彈力膜結(jié)構(gòu)完整，可見少量內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變形，多數(shù)平滑肌細(xì)胞排列尚整齊。②血管內(nèi)徑周長的變化與對照組相比，SAH組、安慰劑組基底動脈管腔明顯狹窄，P < O. 01，內(nèi)徑周長分別為633. 43±47· 53 μ m，630. 35±31· 01 μ m，表現(xiàn)為中度 CVS。CysC低濃度和高濃度治療組基底動脈內(nèi)徑周長分別為724. 06 土 26. 78 μ m, 814. 16 土 24. 58 μ m，表現(xiàn)為輕度CVS。與SAH組及安慰劑組相比，治療組管腔狹窄程度明顯減輕，其中CysC低濃度治療組與SAH組相比，P < O. 05 ；CysC高濃度治療組與SAH組相比，P < O. 01。CysC高濃度治療組與低濃度治療組相比，管腔狹窄程度進(jìn)一步減輕，P < O. 05，但仍較對照組狹窄，P
<O. 01。見表 2-1，圖 6。③動脈壁厚度變化SAH組、安慰劑組血管壁明顯增厚，與對照組相比，P < O. 01。而CysC治療組使血管增厚程度明顯減輕，與SAH組相比，P < O. 01。CysC高濃度治療組與低濃度治療組相比，血管增厚程度進(jìn)一步減輕，兩者比較，P < O. 05，但管壁仍厚于對照組，P < O. 01。見表 1，圖 7。表I各組大鼠基底動脈內(nèi)徑周長、動脈壁厚度(X土S，μπι)以及CVS程度的比較
權(quán)利要求
1.一種Cystatin C在制備用于治療腦血管痙攣的藥物組合物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述腦血管痙攣為蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物組合物包含藥學(xué)上有效量的Cystatin C和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Cystatin C在制備用于治療腦血管痙攣的藥物組合物中的應(yīng)用。通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cystatin C能誘導(dǎo)自噬在基底動脈壁的高表達(dá)，對SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣有防治作用，并且這種作用與Cystatin C濃度存在正相關(guān)性。Cystatin C對SAH后腦血管痙攣具有顯著抑制的效果，可以用來改善SAH后腦血管痙攣。
文檔編號A61P9/10GK102895658SQ20121030136
公開日2013年1月30日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者王中, 陳罡, 劉一之, 蔡紅法 申請人:蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院