專利名稱：治療感染性與惡性疾病的標靶化學治療藥物的形成方法
技術領域：
本發(fā)明涉及關于ー種融合蛋白，其用于結合前驅藥物以治療癌癥。
背景技術：
人類表皮癌的主要特征在于表皮生長因子受體(EGFR)家族的生長因子與受體的功能活化。由生長因子-生長因子受體(EGF-EGFR axis)所主導的信息傳遞途徑在癌細胞的增生、存活、轉移、與血管新生中扮演了重要的角色(Ciardiello, F. , and Tortora,G. EGFR antagonists in cancer treatment,N Engl J Med 358,1160-1174,2008.)。相對較為安全的前驅藥物5-氟胞卩密唳(5-fluorocytosine, 5-FC)可通過胞U密唳脫氨酶(cytosine deaminase)轉化為常用的化療藥物5_氟尿卩密唳(5-fIuorouraciI, 5-FU)。相較于 5-FC, 5-FU 的毒性為 1000 倍(Miller, C. R.，Williams, C. R.，Buchsbaum,D. J. , and Gillespie, G. Y. Intratumoral5-fluorouraciI produced by cytosinedeaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental humanglioblastomas, Cancer Res 62, 773-780, 2002 ；Hamstra, D. A. , Rice, D. J. , Fahmy, S.,Ross, B.D. , and Rehemtulla, A. Enzyme/prodrug therapy for head and neck cancerusing a catalytically superior cytosine deaminase, Hum Gene Ther 10,1993—2003,1999.)。許多表皮生長因子受體過度表達的癌癥，例如頭頸癌、胰臟癌、大腸直腸癌等，經常以5-FU治療。然而5-FU的高全身毒性為重要問題。因此，需要標靶型前驅藥物/藥物系統(tǒng)以將化療藥物集中于腫瘤所在位置。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供ー種融合蛋白，其與前驅藥物結合以治療癌癥，其中所述的融合蛋白包含(i)配體，其與選自由促血管生成素(Angiopoietin)、大腦衍生神經營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor)、睫狀神經營養(yǎng)因子(Ciliary NeurotrophicFactor)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor)、纖維母細胞生長因子(FibroblastGrowth Factor)、神經膠質衍生神經營養(yǎng)因子(Glial Derived Neurotrophic Factor)、肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor)、調蛋白(Heregulin)、類胰島素生長因子(Insulin-like Growth Factor)、介白素(Interleukin)、角質細胞生長因子(Keratinocyte Growth Factor)、巨嗷細胞發(fā)炎蛋白(Macrophage InflammatoryProtein)、巨嗷細胞趨化蛋白(Macrophage Chemoattractant Protein)、神經生長因子(Nerve growth factor)、神經營養(yǎng)因子(Neurotrophin)、血小板衍生生長因子(PlateletDerived Growth Factor)、色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium Derived Factor)、血小板因子(Platelet Factor)、基質細胞衍生因子(Stromal Cell Derived Factor)、干細胞因子(Stem Cell Factor)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(Tissue inhibitorof metalloproteinase)、轉型生長因子(Transforming Growth Factor)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor)、以及血管內皮生長因子(Vascular Endothelial GrowthFactor)所組成群組的生長因子受體特異性結合；(ii)前驅藥物酵素，其可將所述的前驅藥物轉化為活性藥物成分；以及(iii)連接子，其位于該配體與該前驅藥物酵素之間。在一實施例中，本發(fā)明提供此處所述的融合蛋白與前驅藥物結合以制備用于治療癌癥的藥物組合物的用途。在另ー實施例中，本發(fā)明提供ー種DNA建構體，其包含(i) ー編碼與生長因子受體特異性結合的配體的核苷酸序列，其中該配體選自由促血管生成素、大腦衍生神經營養(yǎng)因子、睫狀神經營養(yǎng)因子、表皮生長因子、纖維母細胞生 長因子、神經膠質衍生神經營養(yǎng)因子、肝細胞生長因子、調蛋白、類胰島素生長因子、介白 素、角質細胞生長因子、巨噬細胞發(fā)炎蛋白、巨噬細胞趨化蛋白、神經生長因子、神經營養(yǎng)因子、血小板衍生生長因子、色素上皮衍生因子、血小板因子、基質細胞衍生因子、干細胞因子、基質金屬蛋白酶組織抑制因子、轉型生長因子、腫瘤壞死因子、以及血管內皮生長因子所組成的群組；以及(ii) 一編碼前驅藥物酵素的核苷酸序列。


實施例顯示于附圖中用以說明本發(fā)明。然而應理解的是，本發(fā)明不限于此處所顯示的較佳實施例。在附圖中圖I為本發(fā)明的酵母菌表達建構體(yeast expression constructs)的示意圖。圖2a 為 pPICZ-a -Fcy-hEGF-myc-hiS6 的 DNA 建構體與序列(4198bp)。圖2b 為 pPICZ-a -Fcy-Fur-hEGF-myc-his6 的 DNA 建構體與序列(4951bp)。圖2c為針對酵母菌表達宿主而優(yōu)化的pPICZ- a -Fcy- (VPGVG) 2-hEGF-cMyc_KKKRKV-6His (4213bp)的DNA建構體與序列。圖2d 為 pPICZ-a -Fcy-hVEGFa-myc_his6 的 DNA 建構體與序列(4384bp)。圖2e 為 pPICZ-a -Fcy-Fur-hVEGFa-myc_his6 的 DNA 建構體與序列(5137bp)。圖3為本發(fā)明的E. coli表達建構體(E. coli expression constructs)的不意圖。圖4a 為 pET56-Fcy-hEGF-His6 的 DNA 建構體與序列(5785bp)。圖4b 為 pET56-Fcy-Fur-hEGF-His6 的 DNA 建構體與序列(6538bp)。圖4c 為 pET56-Fcy-hVEGFa_His6 的 DNA 建構體與序列(5971bp)。圖4d 為 pET56-Fcy-Fur-hVEGFa-His6 的 DNA 建構體與序列(6742bp)。圖4e 為 pET56-Fcy-Fur-hVEGFc-His6 的 DNA 建構體與序列(6685bp)。圖4f 為 pET56-Fcy-mVEGFa-His6 的 DNA 建構體與序列(5977bp)。圖4g 為 pET56-Fcy-Fur-mVEGFa-His6 的 DNA 建構體與序列(6730bp)。圖4h 為 pET56-Fcy-Fur-mVEGFc_His6 的 DNA 建構體與氛基酸序列(6685bp)。圖5顯示經純化的his6標記的Fcy、hEGF、以及Fcy-hEGF的考馬斯藍(Coomassieblue)染色凝膠與西方墨點法的結果。圖6顯示(a)經純化的蛋白與經固定的表皮生長因子受體(EGFR)于體外結合的示意圖，以及(b)his6標記的Fey、hEGF、以及Fcy-hEGF與EGFR于體外結合的飽和曲線(saturation curves)與親和カ(affinity)。圖7顯示流式細胞分析的結果，用以評估抗EGFR抗體、經純化的his6標記的Fey、hEGF、以及Fcy-hEGF 與 A431 (a)、MCF_7 (b)、MDA_468 (c)、以及MDA-231 (d)細胞的結合程度。圖8顯示通過經純化的Fcy與Fcy-hEGF于體外將5_FC轉化為5_FU的酵素活性結果。圖9a至圖9d顯示MTT分析的結果，其用以評估受到Fcy-hEGF與5-FC影響的A431、MDA-468、MDA-231、MCF-7、以及 HUVEC 的細胞存活率。圖10顯示通過Fcy-EGF增進5_FC細胞毒性的結果。 圖11顯示MTT分析的結果，其用以評估在遞增濃度的5-FC存在下受到Fcy-hEGF影響的HCT116與LS174T的細胞存活率。圖12顯示5-FC結合Fcy-hEGF對于HCT116大腸癌于體內生長的抑制效果。圖13為癌癥標靶前驅藥物-生長因子融合建構體的克隆策略，其中“生長因子”部分的DNA序列可編碼選自下列蛋白所組成群組的任一者促血管生成素(Angiopoietin)、大腦衍生神經營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor)、睫狀神經營養(yǎng)因子(Ciliary Neurotrophic Factor)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor)、纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor)、神經膠質衍生神經營養(yǎng)因子(GlialDerived Neurotrophic Factor)、肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor)、調蛋白(Heregulin)、類膜島素生長因子(Insulin-like Growth Factor)、介白素(Interleukin)、角質細胞生長因子(Keratinocyte Growth Factor)、巨嗷細胞發(fā)炎蛋白(MacrophageInflammatory Protein)、巨嗷細胞趨化蛋白(Macrophage Chemoattractant Protein)、神經生長因子(Nerve growth factor)、神經營養(yǎng)因子(Neurotrophin)、血小板衍生生長因子(Platelet Derived Growth Factor)、色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium DerivedFactor)、血小板因子(Platelet Factor)、基質細胞衍生因子(Stromal Cell DerivedFactor)、干細胞因子(Stem Cell Factor)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(Tissueinhibitor of metalloproteinase)、轉型生長因子(Transforming Growth Factor)、月中瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor)、以及血管內皮生長因子(Vascular EndothelialGrowth Factor);以及“前驅藥物酵素”部分的DNA序列可編碼選自由下列蛋白所組成群組的任一者酒精脫氫酶(Alcohol dehydrogenase)、減性憐酸酶(Alkaline phosphatase)、乙型內酰胺酶-lactamase)、乙型葡糖苷酸酶-glucoronidase)、羧酸酯酶(Carboxyesterases)、羧妝酶A (Carboxypeptidase A)、羧妝酶G2 (Carboxypeptidase G2)、胞啼唳脫氨酶(Cytosine deaminase)、胞啼唳脫氨酶尿啼唳磷酸核糖轉移酶(Cytosinedeaminase-uracil phosphor ibosy I transferase)、糖苷酶(Glycosidases)、石肖為還原酶(Nitroreductase)、青霉素酸胺酶(Penicillin amidase)、胸腺啼卩定激酶(thymidinekinase)0
具體實施例方式除非另有定義，此處所使用的技術性與科學性詞匯具有本發(fā)明所屬技術領域的技術人員所共同理解的意義。除非另有定義，當用于此處時下列詞匯具有所認定的意義。此處所使用的冠詞“一”或“該”代表其語法上的意義為ー或大于ー(亦即至少為一)。舉例而言，一元素代表一元素或大于一元素。用于此處時,一 “個體”為具有癌癥或可能具有癌癥的任何動物，例如哺乳類且尤其包含人類。
此處所使用的詞匯“聚勝肽”指通過勝肽鍵連結的氨基酸殘基所組成的分子或聚合物。聚勝肽可由使用例如自動聚勝肽合成儀而合成。此處所使用的詞匯“蛋白”典型地代表大型聚勝肽?！皠匐摹钡湫偷卮磔^短的聚勝肽。當用于此處吋，“融合蛋白”為透過結合編碼ニ個或多個原始為不同蛋白的基因所創(chuàng)造的蛋白。當用于此處吋，“前驅藥物”指在給藥時，必須歷經前驅藥物酵素的化學轉化才成為活性藥劑的化合物。當用于此處吋，“前驅藥物酵素”為能夠將前驅藥物轉化為活性藥劑的酵素。當用于此處吋，“連接子”為短片段的聚勝肽。當用于此處吋，“聚核苷酸”或“核酸”指核苷酸單元組成的聚合物。聚核苷酸包含自然產生的核酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)以及核酸類似物，包含非自然合成的核酸，例如重組聚核苷酸。聚核苷酸可利用例如自動DNA合成儀來合成。詞匯“核酸”典型地代表大型聚核苷酸。將被理解的是，當以DNA序列代表核苷酸序列時(亦即A、T、C、G)，其同時包含RNA序列(亦即A、U、C、G)，其中U取代T。詞匯“cDNA”代表與mRNA互補或完全一致的DNA，無論是單股或雙股形式。此處所使用的詞匯“編碼”代表聚核苷酸中特定核苷酸序列的固有性質(例如基因、cDNA、或mRNA)，以在生物過程中作為其它聚合物與巨分子的模板，該聚合物與巨分子具有核苷酸(亦即rRNA、tRNA、與mRNA)的定義序列、或是氨基酸的定義序列，以及由此產生的生物性質。因此，若由一基因轉錄所產生的mRNA于細胞或其它生物系統(tǒng)中進行轉譯而產生蛋白，則該基因可為此蛋白的編碼。所屬技術領域的技術人員可理解的是，由于基因密碼簡并的結果，因此許多不同的聚核苷酸與核酸可編碼出相同的聚勝肽。亦可理解的是，所屬技術領域的技術人員可使用常規(guī)使用的技術取代核苷酸而不影響所述聚核苷酸所編譯出的聚勝肽序列，此反映了欲表達此聚勝肽的任何特定宿主有機體的密碼子使用偏好。因此，除非另有特別指出，否則“可編譯氨基酸序列的聚核苷酸”包含可編譯出相同氨基酸序列的任何互為簡并的聚核苷酸序列。編碼蛋白與RNA的聚核苷酸可包含內含子(intixm)。此處所使用的詞匯“重組聚核苷酸”意指具有非自然性相互結合序列的聚核苷酸。重組聚核苷酸可以載體(vector)的形式存在?！拜d體”可包含目標核苷酸序列以及調控序列。載體可用以表達給定的核苷酸序列或維持給定的核苷酸序列以將此序列復制、操控、或是于不同位置間轉移(例如于不同有機體之間)。載體可為了上述的目的而導入適合的宿主細胞。載體的范例包含但不限于質體(plasmid)、黏質體(cosmid)、YAC、或PAC。典型地，在載體中給定的核苷酸序列與調控序列操作性地連結，故當載體導入宿主細胞中時，給定的核苷酸序列可在調控序列的控制下于宿主細胞中表達。舉例而言，調控序列可包含促進子(promoter)、起始密碼子(start codon)、復制區(qū)(replication region)序列、增強子(enhancer)、操縱子(operator)序列、分泌信號(secretion signal)序列(例如IL2信號勝肽)、以及其它調控序列。較佳地，載體可進ー步包含標記序列(例如抗生素抗性標記序列)以便于進行篩選。氨基酸可由三字母或單字母表達。表I列出了標準氨基酸縮寫。表I :標準氨基酸縮寫
氨基酸rwirr^i
Alanine(丙氨酸)AlaA
Arginine (精氨酸)ArgR
Asparagine (天冬醜氨酸)AsnN Aspartic acid(天冬氨酸)AspD
Cysteine (半胱氨酸)CysC
Glutamic acid(谷氨酸)GluE
Glutamine (谷氨酰氨)GlnQ
Glycine(甘氨酸)GlyG
Histidine (組氨酸)HisH
Isoleucine(異亮氨酸)IleI
Leucine (亮氨酸)LeuL
Lysine (賴氨酸)LysK
Methionine (甲硫氨酸)MetM
Phenylalanine(苯丙氨酸)PheF
Proline(脯[氨酸)ProP
Serine (絲氨酸)SerS
Threonine (蘇氨酸)ThrT
Tryptophan (色氨酸)TrpW
Tyrosine (酪氨酸)TyrY
Valine(繳氨酸)ValV
本發(fā)明的特征在于一與前驅藥物結合以治療癌癥的融合蛋白，其中該融合蛋白包含(i)與生長因子受體(growth factor receptor)特異性結合的配體(ligand),其選自由促血管生成素、大腦衍生神經營養(yǎng)因子、睫狀神經營養(yǎng)因子、表皮生長因子、纖維母細胞生長因子、神經膠質衍生神經營養(yǎng)因子、肝細胞生長因子、調蛋白、類胰島素生長因子、介白素、角質細胞生長因子、巨噬細胞發(fā)炎蛋白、巨噬細胞趨化蛋白、神經生長因子、神經營養(yǎng)因子、血小板衍生生長因子、色素上皮衍生因子、血小板因子、基質細胞衍生因子、干細胞因子、基質金屬蛋白酶組織抑制因子、轉型生長因子、腫瘤壞死因子、以及血管內皮生長因子所組成的群組；(ii)前驅藥物酵素，其可將該前驅藥物轉化為活性藥物成分；以及(iii)連接子，其位于該配體與該前驅藥物酵素之間。根據本發(fā)明的ー實施例，該融合蛋白包含的前驅藥物酵素選自由酒精脫氫酶、堿性磷酸酶、こ型內酰胺酶、こ型葡糖苷酸酶、羧酸酯酶、羧肽酶A、羧肽酶G2、胞嘧啶脫氨酶、胞嘧啶脫氨酶尿嘧啶磷酸核糖轉移酶、糖苷酶、硝基還原酶、青霉素酰胺酶、胸腺嘧啶激酶所組成的群組。
在本發(fā)明的一實施例中，該前驅藥物酵素位于該融合蛋白的氨基端且該配體位于該融合蛋白的羧基端。在本發(fā)明的特定實施例中，該配體為表皮生長因子(EGF)或血管內皮細胞生長因子(VEGF)。具體地說，此處所使用的”配體”具有選自由SEQ ID NO = Il(EGF)與SEQ ID NO 2-5 (VEGF)所組成群組的氨基酸序列。根據ー實施例，用以治療癌癥的前驅藥物為5-FC且前驅藥物酵素為胞嘧啶脫氨酶或與尿嘧啶磷酸核糖轉移酶融合的胞嘧啶脫氨酶。具體地說，此處所使用的“前驅藥物酵素”具有SEQ ID NO 6( “胞嘧啶脫氨酶”或“Fey”)或SEQ ID NO 7( “與尿嘧啶磷酸核糖轉移酶融合的胞嘧啶脫氨酶”或“Fcy-Fur”)的氨基酸序列。在本發(fā)明的一實施例中，該融合蛋白具有選自由SEQ ID NO : 8 (Fcy-hEGF)、SEQID NO 9 (Fcy-Fur-hEGF), SEQ ID NO 10 (Fcy- (VPGVG) 2-hEGF-cMyc-KKKRKV), SEQ ID NO:ll(Fcy-hVEGFa)、SEQ ID NO : 12 (Fcy-Fur-hVEGFa)、SEQ ID NO :13 (Fcy-hEGF)、SEQ ID NO:14 (Fcy-Fur-hEGF)、SEQ ID NO : 15 (Fcy-hVEGFa)、SEQ ID NO :16 (Fcy-Fur-hVEGFa)、SEQ IDNO 17(Fcy-Fur-hVEGFc)、SEQ ID NO 18 (Fcy-mVEGFa)、SEQ ID NO 19 (Fcy-Fur-mVEGFa)、以及SEQ ID NO 20 (Fcy-Fur-mVEGFc)所組成群組的氨基酸序列。在另ー實施例中，本發(fā)明提供一種此處所描述的融合蛋白與前驅藥物結合以制備用于癌癥治療的醫(yī)藥組合物的用途。在又一實施例中，本發(fā)明提供ー種DNA建構體包含(i) ー編碼與生長因子受體特異性結合的配體的核苷酸序列，其中該配體為選自由促血管生成素、大腦衍生神經營養(yǎng)因子、睫狀神經營養(yǎng)因子、表皮生長因子、纖維母細胞生長因子、神經膠質衍生神經營養(yǎng)因子、肝細胞生長因子、調蛋白、類胰島素生長因子、介白素、角質細胞生長因子、巨噬細胞發(fā)炎蛋白、巨噬細胞趨化蛋白、神經生長因子、神經營養(yǎng)因子、血小板衍生生長因子、色素上皮衍生因子、血小板因子、基質細胞衍生因子、干細胞因子、基質金屬蛋白酶組織抑制因子、轉型生長因子、腫瘤壞死因子、以及血管內皮生長因子所組成的群組；以及(ii) 一編碼前驅藥物酵素的核苷酸序列。根據本發(fā)明另ー實施例，該DNA建構體包含編碼前驅藥物酵素的核苷酸序列，其選自由酒精脫氫酶、堿性磷酸酶、こ型內酰胺酶、こ型葡糖苷酸酶、羧酸酯酶、羧肽酶A、羧肽酶G2、胞嘧啶脫氨酶、胞嘧啶脫氨酶尿嘧啶磷酸核糖轉移酶、糖苷酶、硝基還原酶、青霉素酰胺酶、胸腺嘧啶激酶所組成的群組。在本發(fā)明的特定實例中，與生長因子受體特異性結合的配體的核苷酸序列編碼為選自由 SEQ ID NO SEQ ID NO 21 (EGF)與 SEQ ID NO 22-25 (VEGF)所組成的群組。在本發(fā)明的特定實例中，編碼前驅藥物酵素的核苷酸序列為SEQ ID NO 26 (Fcy)或 SEQ ID NO 27 (Fcy-Fur)。在本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明的DNA建構體具有選自由SEQ ID NO 28 (Fcy-hEGF)、SEQ ID NO 29 (Fcy-Fur-hEGF), SEQ ID NO 30 (Fcy- (VPGVG) 2-hEGF-cMyc-KKKRKV)、SEQ ID NO :31 (Fcy-hVEGFa)、SEQ ID NO 32 (Fcy-Fur-hVEGFa), SEQ ID NO:33 (Fcy-hEGF)、SEQ ID NO 34 (Fcy-Fur-hEGF)、SEQ ID NO 35 (Fcy-hVEGFa)、SEQ ID NO 36 (Fcy-Fur-hVEGFa)、SEQ ID NO :37 (Fcy-Fur-hVEGFc)、SEQ ID NO :38 (Fcy-mVEGFa)、SEQID NO :39 (Fcy-Fur-mVEGFa)、以及 SEQ ID NO :40 (Fcy-Fur-mVEGFc)所組成群組的核苷酸序列。本發(fā)明將以接下來的實施例進ー步說明，其提供以為示范的目的而非用以限制。實施例I :于酵母菌表達載體中 Fcy-hEGF-myc-hiS6、Fcy_Fur-hEGF-myc-his6、hEGF-myc_his6、以及 Fcy-myc_his6 的 DNA 克隆表達Fcy與Fur的基因序列使用來自酵母菌的cDNA基因庫作為模板并以PCR加以擴增，其中人類EGF與VEGF使用源自人類癌癥細胞株SK0V3-ip I的cDNA基因庫作為模板并以PCR加以擴增。PCR的產物以限制酶BamHI與EcoRI處理，其目標序列已由PCR引子導入，且連接至以相同限制酶BamHI與EcoRI切割的蛋白表達載體pPICZ-a。Fcy與hEGF是個別克隆到此載體中，位于氨基端的a -分泌信號勝肽(a -secreting signalpeptide)之后,其中羧基端為已內建于pPICZ-a載體中的c_myc與六組氨酸(myc_his6)標簽以便于蛋白辨識與純化。另ー個Fcy的PCR產物于5’與3’兩端均具有BamHI辨識序列，將此產物以BamHI切割后與同樣以BamHI切割的pPIC-a -hEGF-myC-his6建構體接合，pPIC-a-hEGF-myC-his6在以BamHI切割后先以小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)處理避免載體再度接合。于酵母菌表達載體 pPICZ-a 中 Fcy-hEGF-myc-hiS6、Fcy-Fur-hEGF-myc_his6、hEGF-myc_his6、以及Fcy-myc_his6的示意圖如圖I所示。圖2a至圖2e顯示圖2a pPICZ- a -Fcy-hEGF-myc-hiS6 (4198bp)、圖 2bpPICZ_a -Fcy-Fur-hEGF-myc-his6 (495lbp)、圖2c 針對酵母菌表達優(yōu)化的建構體 pPICZ- a -Fcy- (VPGVG) 2-hEGF-cMyc-KKKRKV_6His (4213bp)、圖 2d pPICZ- a -Fcy-hVEGF-myc-his6 (4384bp)、以及圖 2e pPICZ- a -Fcy-Fur-hVEGF-myc-his6(5137bp)所獲得核苷酸與氨基酸序列的圖譜。實施例2:于細菌表達載體中 Fcy-hEGF-myc-hi S6、Fcy-Fur-hEGF-myc_his6、hEGF-myc_his6、以及 Fcy-myc_his6 的 DNA 克隆為了探討除了酵母菌之外宿主中的蛋白表達，發(fā)明人建構了與Fcy或Fcy-Fur融合的生長因子，例如EGF或VEGF。圖3顯示E. coli表達載體pET56中Fcy-hEGF(或VEGF) -hi s6, Fcy-Fur-hEGF (或 VEGF)-hi S6、hEGF (或 VEGF)-hi S6、以及 Fcy_his6 融合基因的示意圖。與酵母菌表達建構體的克隆策略相似，所需的融合基因以PCR擴增且以不同組的限制酶NcoI與XhoI切割。經切割的片段克隆到以相同限制酶切割的載體pET56中。所獲得的建構體顯示于圖4a至圖4h中。實施例3 Fcy-hEGF-myc-hiS6> hEGF-myc_his6、以及 Fcy-myc_his6 的表達與純化于pPICZ-a 建構體中的 Fcy-hEGF-myc-hiS6、hEGF-myc-hiS6、或 Fcy-myc-hiS6 轉型(transformed)到野生型X-33畢赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)中，于含有zeocin抗生素(200 u g/mL)的洋菜培養(yǎng)盤上培養(yǎng)3到4天直到出現菌落。以抗c_myc的抗體偵測篩選高蛋白表達的各個菌落。為了大量表達，將篩選出的菌落接種于含有0. 5升BMD培養(yǎng)基的搖瓶中、培養(yǎng)至OD6tltl為8-10、且每日添加甲醇以誘導蛋白表達。誘導3天之后，收集含有蛋白的培養(yǎng)基且于注入鎳樹脂管柱(nickel-resin column) (Qiagen)之前先行過濾。將管柱以10倍管柱體積且含有5mM咪唑(imidazole)的PBS清洗，且使用AKTAprimeplus純化系統(tǒng)(人KTAprime plus purification system)增加咪唑的濃度以洗漆出蛋白。此蛋白以考馬斯藍(Coomassie blue)染色的SDS-PAGE凝膠(圖5右側)以及利用c-myc特異性抗體進行西方墨點分析加以鑒定(圖5左側)。
實施例4 Fcy-hEGF-myc-hiS6> hEGF-myc-hiS6> 以及 Fcy-myc_his6 與經純化的EGFR的體外結合圖6顯示測量Fcy-hEGF-myc-hi S6與固定在ELISA盤上經過純化的EGFR于體外結合的示意圖。Fcy-hEGF-myc-hi S6、hEGF-myc-hi S6 > 以及 Fcy-myc_his6 與固定在ELISA盤上經過純化的EGFR的體外結合使用標記HRP (辣根過氧化酶)的抗His6抗體測量。Fcy-hEGF-myc-hiS6以及hEGF-myc_his6與EGFR的結合親和力分別為5nM與9nM,而Fcy-myc-hi S6與EGFR之間則無法辨識有結合(圖6右側)。實施例5 :Fcy-hEGF-myc_his6、hEGF-myc-hiS6> 以及 Fcy-myc_his6 結合具有不同EGFR表達量的細胞A431、MDA-468、MDA-231、以及MCF-7細胞中EGFR的表達量以熒光活化細胞分選儀(FACS)進行分析。將細胞表面以抗EGFR抗體cetuximab (爾必得舒(erbitux))染色,接著以標記FITC的抗人類IgG抗體結合cetuximab。為了測試經過純化的Fcy-hEGF-myc-hiS6、hEGF-myc-hiS6、以及 Fcy-myc_his6 與 EGFR 的結合能力，將 A431、MCF-7、MDA-468、以及MDA-231分別與標記有his6的蛋白共同培養(yǎng)I小吋。稍后將細胞與標記FITC的his6特異性抗體共同培養(yǎng)，接著進行FACS分析。熒光強度代表由cetuximab偵測到的EGFR量、或是與癌癥細胞連結具hiS6標記的蛋白量(見圖7)。實施例6 Fcy-hEGF-myc-hiS6 與 Fcy-myc_his6 的體外酵素活性Fcy-hEGF與Fcy的酵素活性通過測量5-FU的產量而測得。將50nanomoIe的Fcy-hEGF-myc-his6(I. 25mg)或 Fcy-myc_his6(0. 75mg)加入 37°C含有遞增 5-FC 濃度(O、0. 03、0. 1、0. 3、1、與3mM)的0. 3ml PBS中以啟動5-FC轉換為5-FU。每3分鐘抽取2 yl的反應物且使用NanoDrop 2000分光亮度計(Thermo Scientific)測量5-FC與5-FU的熒光強度。5-FU的濃度通過Senter等人推導的公式[5_FU]mM = 0. 185x A255-0. 049xA290測量 255nm 與 290nm 的吸光值加以計算(Senter, P. D.，Su, P. C.，Katsuragi, T.，Sakai, T.，Cosand, ff. L. , Hellstrom,I. ,and Helistrom，K. E. (1991)Generation of 5—fluorouraci丄from 5-fluorocytosine by monoclonal antibody—cytosine deaminase conjugates,Bioconjug Chem 2,447-451)。不同濃度的 5-FC 下 5-FU 的生成率(V)是使用 Graphpadprism 5軟件(圣地雅哥，美國)適配至Michaelis-Menten equation,如圖8所不。純化的Fcy-hEGF與Fcy蛋白對5-FC的km值分別為0. 25及0. 49mM。5-FU生成的Vmax對于Fcy-hEGF與Fcy蛋白分別為177及mrnin-1。實施例I MTT分析以測量經過Fcy-hEGF與5-FC處理的A431、MDA-468、HUVEC,MDA-231、以及MCF-7的細胞存活率為了驗證 5-FC/Fcy-hEGF-myc-hi S6 對于細胞存活率的效果，A431、MDA-468、HUVEC、MDA-231、與 MCF-7 于 0. lmg/ml 的 5-FC 存在下與遞增濃度的 Fcy-hEGF-myc-hiS6 共同培養(yǎng)(圖9a與圖9d)，同時另ー個實驗使用固定量的FCy-hEGF-myC-his6(0. 2iig/ml)與遞增濃度的5-FC(0-lmg/ml)進行(圖9b與圖9c)。在添加蛋白與5-FC達3天之后，培養(yǎng)于96 孔培養(yǎng)盤中的細胞以 MTT (3- (4, 5-Dimethylthiazol_2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoIiumbromide)分析存活率。將25 的MTT溶液(5mg/ml于PBS中)添加至96孔培養(yǎng)盤。作用2小時之后，移除MTT溶液、以PBS清洗細胞、且接著添加0. Iml萃取緩沖液(20%十二烷基硫酸鈉于50%ニ甲基甲酰氨中)。在37°C經過4小時作用之后，使用盤式讀取儀(Bio-Rad)于570nm測量吸光值，并以萃取緩沖液作為對照。相較于EGFR表達較少的HUVEC、MDA_231、 與 MCF-7，5-FC 與 Fcy-hEGF-myc-hiS6 對于 EGFR 過度表達的 MDA-468 與 A431 的 IC5tl 較低(見圖10)。實施例8 =MTT分析以測量表達EGFR的大腸癌細胞LS174T及HCT116受Fcy-hEGF與5-FC抑制的細胞存活率與實施例7相似，以MTT分析測量受到Fcy-hEGF (0. 2 U g/ml)與遞增濃度5-FC影響的表達EGFR大腸癌細胞LS174T與HCTl 16的細胞存活率。當5-FC的IC5tl分別為2. 5 y g/ml (10 PM)與6. 0 ii g/ml (24 ii M)時，可觀察到對于LS174T與HCT116細胞有顯著的效果。具體如圖11所示。實施例9 Fcy-hEGF/5-FC于體內抑制HCT116的生長使用過度表達EGFR的大腸癌細胞HCT116進行動物實驗。將細胞以皮下接種于balb/c裸鼠的后背雙側。當腫瘤于2周后到達3-5mm的長度時,姆3天以20 y g的Fcy或Fcy-hEGF處理小鼠。小鼠姆天注射IOmg的5_FC(500mg/kg)。2種處理組別的腫瘤尺寸如圖12所示。相較于Fcy, Fcy-hEGF呈現較佳的抗腫瘤效果(p = 0. 03)。實施例10 :癌癥標靶前驅藥物-生長因子融合蛋白的示意圖除了顯示于圖I到圖4a_4h中的建構體，亦可建構如圖13所示同時包含生長因子與前驅藥物酵素的DNA建構體及其所生蛋白?！吧L因子”部分的DNA序列可編碼選自由促血管生成素、大腦衍生神經營養(yǎng)因子、睫狀神經營養(yǎng)因子、表皮生長因子、纖維母細胞生長因子、神經膠質衍生神經營養(yǎng)因子、肝細胞生長因子、調蛋白、類胰島素生長因子、介白素、角質細胞生長因子、巨噬細胞發(fā)炎蛋白、巨噬細胞趨化蛋白、神經生長因子、神經營養(yǎng)因子、血小板衍生生長因子、色素上皮衍生因子、血小板因子、基質細胞衍生因子、干細胞因子、基質金屬蛋白酶組織抑制因子、轉型生長因子、腫瘤壞死因子、以及血管內皮生長因子所組成群組的其中任一者?！扒膀屗幬锝退亍辈糠值腄NA序列可編碼選自由酒精脫氫酶、堿性磷酸酶、こ型內酰胺酶、こ型葡糖苷酸酶、羧酸酯酶、羧肽酶A、羧肽酶G2、胞嘧啶脫氨酶、胞嘧啶脫氨酶尿嘧啶磷酸核糖轉移酶(在酵母菌中為Fcy-Fur)、糖苷酶、硝基還原酶、青霉素酰胺酶、及胸腺嘧啶激酶所組成群組的其中任一者。
權利要求
1.一種用于治療癌癥的融合蛋白，其特征在于，用干與癌癥治療的前驅藥物結合，其中該融合蛋白包含 (i)配體，其與選自由促血管生成素(Angiopoietin)、大腦衍生神經營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor)、睫狀神經營養(yǎng)因子(Ciliary NeurotrophicFactor)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor)、纖維母細胞生長因子(FibroblastGrowth Factor)、神經膠質衍生神經營養(yǎng)因子(Glial Derived Neurotrophic Factor)、肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor)、調蛋白(Heregulin)、類胰島素生長因子(Insulin-like Growth Factor)、介白素(Interleukin)、角質細胞生長因子(Keratinocyte Growth Factor)、巨嗷細胞發(fā)炎蛋白(Macrophage InflammatoryProtein)、巨嗷細胞趨化蛋白(Macrophage Chemoattractant Protein)、神經生長因子(Nerve growth factor)、神經營養(yǎng)因子(Neurotrophin)、血小板衍生生長因子(PlateletDerived Growth Factor)、色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium Derived Factor)、 血小板因子(Platelet Factor)、基質細胞衍生因子(Stromal Cell Derived Factor)、干細胞因子(Stem Cell Factor)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(Tissue inhibitorof metalloproteinase)、轉型生長因子(Transforming Growth Factor)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor)、以及血管內皮生長因子(Vascular Endothelial GrowthFactor)所組成群組的生長因子受體特異性結合； (ii)前驅藥物酵素，其可將該前驅藥物轉化為活性藥物成分；以及 (iii)連接子(linker)，其位于該配體與該前驅藥物酵素之間。
2.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，該前驅藥物酵素選自由酒精脫氫酶(Alcohol dehydrogenase)、減性憐酸酶(Alkaline phosphatase)、乙型內酉先胺酶(& -lactamase)、乙型葡糖苷酸酶(P -glucoronidase)、羧酸酯酶(Carboxyesterases)、羧妝酶A (Carboxypeptidase A)、羧妝酶G2 (Carboxypeptidase G2)、胞啼唳脫氨酶(Cytosinedeaminase)、胞啼卩定脫氨酶尿啼卩定憐酸核糖轉移酶(Cytosine deaminase-uracilphosphor ibosy I transferase)、糖苷酶(Glycosidases)、硝基還原酶(Nitroreductase)、青霉素酰胺酶(Penicillin amidase)、胸腺啼卩定激酶(thymidine kinase)所組成的群組。
3.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，該前驅藥物酵素位于該融合蛋白的氨基端，且該配體位于該融合蛋白的羧基端。
4.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，該配體為表皮生長因子(EGF)。
5.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，該配體為血管內皮生長因子(VEGF)。
6.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，用于癌癥治療的前驅藥物為5-氟胞啼唳(5-fluorocytosine)，且該前驅藥物酵素為胞啼卩定脫氨酶(cytosine deaminase)或與尿啼卩定磷酸核糖轉移酶(uracil phosphor ibosy I transferase)融合的胞啼唳脫氨酶(cytosine deaminase)。
7.根據權利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，該配體具有SEQID NO: I所示的氨基酸序列。
8.根據權利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，該配體具有SEQID NO :2-5所組成群組的氨基酸序列。
9.根據權利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，該前驅藥物酵素具有SEQID N0:6或SEQ ID NO 7所不的氣基酸序列。
10.根據權利要求3的融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白具有選自由SEQID NO 8-20所組成群組的氨基酸序列。
11.一種權利要求I所述的融合蛋白結合前驅藥物用以制備癌癥治療的醫(yī)藥組合物的用途。
12.—種DNA建構體，其特征在于，包含 (i)ー編碼與生長因子受體特異性結合的配體的核苷酸序列，其中該配體選自由促血管生成素、大腦衍生神經營養(yǎng)因子、睫狀神經營養(yǎng)因子、表皮生長因子、纖維母細胞生長因子、神經膠質衍生神經營養(yǎng)因子、肝細胞生長因子、調蛋白、類胰島素生長因子、介白素、角質細胞生長因子、巨噬細胞發(fā)炎蛋白、巨噬細胞趨化蛋白、神經生長因子、神經營養(yǎng)因子、血小板衍生生長因子、色素上皮衍生因子、血小板因子、基質細胞衍生因子、干細胞因子、基質金屬蛋白酶組織抑制因子、轉型生長因子、腫瘤壞死因子、以及血管內皮生長因子所組成的群組；以及 (ii)一編碼前驅藥物酵素的核苷酸序列。
13.根據權利要求12所述的DNA建構體，其特征在干，該前驅藥物酵素選自由酒精脫氫酶、堿性磷酸酶、こ型內酰胺酶、こ型葡糖苷酸酶、羧酸酯酶、羧肽酶A、羧肽酶G2、胞嘧啶脫氨酶、胞嘧啶脫氨酶尿嘧啶磷酸核糖轉移酶、糖苷酶、硝基還原酶、青霉素酰胺酶、胸腺嘧啶激酶所組成的群組。
14.根據權利要求12所述的DNA建構體，其特征在于，編碼與生長因子受體特異性結合的配體的核苷酸序列選自由SEQ ID NO :21-25所組成的群組。
15.根據權利要求13所述的DNA建構體，其特征在于，編碼前驅藥物酵素的核苷酸序列為 SEQ ID NO 26 或 SEQ ID NO :27。
16.根據權利要求12所述的DNA建構體，其特征在于，該DNA建構體具有選自由SEQIDNO 28-40所組成群組的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療感染性與惡性疾病的標靶化學治療藥物的形成方法，一種融合蛋白，其與前驅藥物結合而用于癌癥治療，其中該融合蛋白包含(i)配體，其與生長因子受體特異性結合，(ii)前驅藥物酵素，其可將該前驅藥物轉換為活性藥物成分，以及(iii)鏈結子，其位于該配體與該前驅藥物酵素之間。本發(fā)明亦提供一種DNA建構體，其包含(i)編碼與生長因子受體特異性結合的配體的核苷酸序列，以及(ii)編碼前驅藥物酵素的核苷酸序列。
文檔編號A61P35/00GK102807620SQ20121018104
公開日2012年12月5日 申請日期2012年6月4日 優(yōu)先權日2011年6月2日
發(fā)明者藍耿立, 施易升, 顏上惠, 張正, 藍耿欣 申請人:臺北榮民總醫(yī)院