專利名稱：一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊及其制備工藝。
背景技術(shù)：
腫瘤的生長發(fā)展可分為血管前期和血管化期。在腫瘤形成的早期-瘤體內(nèi)并無血管生長，此為血管前期。這時(shí)-腫瘤生長依靠氧營養(yǎng)物質(zhì)的彌散來維持-一般僅能長到2-3 毫米。此期腫瘤細(xì)胞的增生和凋亡處于平衡狀態(tài)。此時(shí)腫瘤生長緩慢，可持續(xù)多年，相當(dāng)于臨床上的原位癌，幾乎不發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤的進(jìn)一步生長有賴于隨后的血管新生表型啟動(dòng)，促使腫瘤形成新生血管-進(jìn)入血管化期。此期腫瘤組織主要以血流灌注的方式獲取營養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞呈指數(shù)生長，且凋亡減少，導(dǎo)致腫瘤生長加速。新生血管也為腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移提供了有利條件。血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)是血小板源生長因子超家族中的一員，目前主要包括 VEGF-A、胎盤生長因子、VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D和VEGF-E，VEGF-A是其中最重要的成員。 VEGF通過其受體VEGFR介導(dǎo)下游信號的傳導(dǎo)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，分化成熟，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移，并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞合成和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，加速基質(zhì)降解以及趨化炎癥細(xì)胞等，最終促使新毛細(xì)血管生成和功能成熟。在組織缺氧的情況下，HIF_la(缺氧誘導(dǎo)因子-Ια)和MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)等細(xì)胞因子會(huì)促進(jìn) VEGF的表達(dá)和分泌。VEGF不僅能誘導(dǎo)癌血管生成，促進(jìn)癌生長，還可能參與癌細(xì)胞耐藥性的形成。因此VEGF是抗癌藥物最重要的靶點(diǎn)。適體是功能相當(dāng)于抗體的DNA或RNA片段，能夠?qū)Π蟹肿舆M(jìn)行特異性識別和結(jié)合， 并有效抑制靶分子的生物學(xué)活性。適體的應(yīng)用前景更為廣泛。目前針對血液疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤等疾病的診斷與治療方面的適體研究已經(jīng)在進(jìn)行中，一些適體制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，專門用于治療黃斑變性的靶向作用于VEGF的適體藥物(Macugen)已經(jīng)上市。適體是核酸分子，在體內(nèi)極易被核酸酶降解而表現(xiàn)出極大的不穩(wěn)定性，并且會(huì)通過腎臟迅速排出體外而來不及發(fā)揮其功能，嚴(yán)重限制了它在治療領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。目前尚無理想的方法解決適體的體內(nèi)穩(wěn)定性問題。但研究表明這個(gè)問題可以通過對它進(jìn)行適當(dāng)修飾得以改善，修飾后的適體穩(wěn)定性和抗降解能力增強(qiáng)，從而在血漿中穩(wěn)定存在的時(shí)間也明顯延長。這種修飾技術(shù)可分為兩大類分子內(nèi)修飾和分子外修飾。分子內(nèi)修飾是通過一些化學(xué)方法，將影響體內(nèi)穩(wěn)定性的基團(tuán)，用另一些相應(yīng)的基團(tuán)取代。修飾的對象有糖環(huán)、堿基和磷酸，其中以糖環(huán)的修飾最為普遍。將氟、氨基和2’ -氧-甲基基團(tuán)引入戊糖糖環(huán)上的2'位，可以顯著增加適體的抗核酸酶降解特性。此外，由于體液中的核酸酶只識別D型糖環(huán)而對L型糖環(huán)無作用，所以可通過將D型糖環(huán)修飾成L型糖環(huán)達(dá)到抗核酸酶降解的目的。除糖環(huán)修飾外，還可進(jìn)行堿基和磷酸的修飾。分子內(nèi)修飾雖可以提高適體在體內(nèi)的穩(wěn)定性，但在臨床治療方面還不能保證足夠的藥代動(dòng)力學(xué)特征，因?yàn)檫m體在靜脈注射后幾分鐘內(nèi)就可能通過腎臟排泄而被清除。要解決該問題可將它與某些具有生物相容性，但沒有生物活性的大分子連接，延長其在體內(nèi)的作用時(shí)間，即分子外修飾。聚乙二醇(PEG)與適體共價(jià)結(jié)合，能防止其快速被血漿清除。Pegaptanib (Ng EWM，等。Nature Reviews Drug Discovery 2006, 5 123-132)即采用了該技術(shù)。但如此修飾的核苷酸可以循環(huán)進(jìn)入宿主的 DNA，從而引發(fā)安全隱患。聚乙二醇偶聯(lián)后，Pegaptanib體內(nèi)半衰期提高至10小時(shí)左右，但如用于腫瘤治療，仍然需要每天注射給藥。采用緩釋制劑技術(shù)也應(yīng)當(dāng)是長期維持適體藥物在體內(nèi)有效濃度的方法之一，但對于適體藥物，何種制劑最適合仍無明確方法和技術(shù)。本發(fā)明即為適體藥物的緩慢釋藥提供了可行方法。微囊內(nèi)包裹的活性成分，即可以靶向作用于VEGF的適體藥物。該適體藥物可以阻礙VEGF與受體的結(jié)合，從而抑制腫瘤的新生血管生成。經(jīng)微囊包裹后，適體藥物可以緩慢釋放，在體內(nèi)維持穩(wěn)定的血藥濃度，克服了常規(guī)制劑使用劑量大，作用時(shí)間短，需反復(fù)用藥的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊及其制備工藝。 本發(fā)明解決了適體藥物的緩釋問題，可以明顯提高藥物的體內(nèi)活性。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊，采用人血白蛋白包裹適體藥物形成微囊，該微囊的粒徑為150-350nm，在體內(nèi)外緩慢釋放內(nèi)含的適體藥物。所述的適體藥物為抗血管內(nèi)皮生成因子165(VEGF165)的適體藥物，具有抑制腫瘤新生血管生成的活性。一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的制備工藝，包括如下步驟將適體藥物溶解于人血白蛋白水溶液中，以無水乙醇為凝聚劑使適體藥物包裹于白蛋白內(nèi)形成微囊， 微囊表面經(jīng)戊二醛交聯(lián)使微囊固化，得到可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊。所述的制備步驟優(yōu)選為將所述的人血白蛋白溶于生理鹽水，調(diào)節(jié)pH至7. 8-8. 2， 加入適體藥物使完全溶解；滴加無水乙醇至上述溶液，使微囊析出；微囊經(jīng)戊二醛溶液固化，以生理鹽水反復(fù)洗滌，超聲震蕩混勻，經(jīng)0. 45微米濾膜過濾，得到可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊。所述的人血白蛋白與適體藥物的加入的重量比為1000-100000 1，生理鹽水與人血白蛋白之間加入的重量比為5-20 1，無水乙醇與人血白蛋白之間加入的重量比為10-100 1，戊二醛溶液的濃度為6%，戊二醛溶液與人血白蛋白之間加入的重量比為 0. 5-10 1，pH 為 7. 5-8. 5。所述的人血白蛋白與適體藥物的加入的重量比優(yōu)選為為10000 1，生理鹽水與人血白蛋白之間加入的重量比為20 1，無水乙醇與人血白蛋白之間加入的重量比為 20 1，戊二醛溶液的濃度為6%，戊二醛溶液與人血白蛋白之間加入的重量比為1 2，pH 為 7. 8-8. 2。所述的可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊用注射用水將其溶解成適體含量為 10mg/ml的溶液，溶液中加入甘露醇至100mg/ml，無菌過濾，冷凍干燥即得可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的凍干粉針。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明篩選并優(yōu)化了適體藥物微囊的制劑工藝。該工藝解決了適體藥物的緩釋問題，可以緩慢釋放適體藥物，明顯提高藥物的體內(nèi)活性，克服了常規(guī)制劑需要反復(fù)給藥，病人依從性低的缺陷，體內(nèi)藥效也顯著提高。


圖1是本發(fā)明的抗VEGF165適體藥物結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)圖；圖2是本發(fā)明的微囊的電鏡照片；圖3是本發(fā)明實(shí)施例中微囊化適體藥物體外釋藥曲線；圖4是本發(fā)明實(shí)施例中肺癌模型小鼠腫瘤生長曲線；給藥組1為未微囊化適體藥物組(每日給藥)，給藥組2為微囊化適體藥物組(每3日給藥1次)，給藥組3為微囊化適體藥物組(每日給藥1次)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1適體微囊的制備本實(shí)施例所使用的適體是具有抗VEGF165活性的適體，適體序列與Pegaptanib — 致，由寶生物(大連)公司制備。微囊的制備方法為取100克人白蛋白(購于上海萊士血液制品股份有限公司) 溶于2升生理鹽水中，室溫?cái)嚢杈鶆?。以NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0后，加入IOmg適體藥物，使完全溶解。滴加無水乙醇至上述溶液中，總加入無水乙醇體積為2升。邊滴加便攪拌，攪拌速度為lOOOrpm。無水乙醇添加完畢后繼續(xù)攪拌1小時(shí)。靜止，析出微囊。經(jīng)離心收集微囊， 加入50ml 6%的戊二醛溶液固化微囊0. 5小時(shí)。離心收集微囊，以生理鹽水洗滌，反復(fù)此過程3次。最后，以IOOml生理鹽水懸浮微囊，超聲震蕩半小時(shí)。經(jīng)0. 45微米濾膜過濾后備用。本實(shí)施例篩選并優(yōu)化了適體藥物微囊的制劑工藝。該工藝解決了適體藥物的緩釋問題， 可以緩慢釋放適體藥物，明顯提高藥物的體內(nèi)活性，克服了常規(guī)制劑需要反復(fù)給藥，病人依從性低的缺陷，體內(nèi)藥效也顯著提高。實(shí)施例2適體微囊的制備本實(shí)施例所使用的適體是具有抗VEGF165活性的適體，適體序列與Pegaptanib — 致，由寶生物(大連)公司制備。取1克人白蛋白(購于上海萊士血液制品股份有限公司)溶于10毫升生理鹽水中，室溫?cái)嚢杈鶆颉Ｒ訬aOH調(diào)節(jié)pH至8. O后，加入Img適體藥物，使完全溶解。滴加無水乙醇至上述溶液中，總加入無水乙醇體積為100毫升。邊滴加便攪拌，攪拌速度為lOOOrpm。 無水乙醇添加完畢后繼續(xù)攪拌1小時(shí)。靜止，析出微囊。經(jīng)離心收集微囊，加入IOml 6%的戊二醛溶液固化微囊0.5小時(shí)。離心收集微囊，以生理鹽水洗滌，反復(fù)此過程3次。最后， 以IOml生理鹽水懸浮微囊，超聲震蕩半小時(shí)。經(jīng)0.45微米濾膜過濾后備用。本實(shí)施例工藝解決了適體藥物的緩釋問題，可以緩慢釋放適體藥物，明顯提高藥物的體內(nèi)活性，克服了常規(guī)制劑需要反復(fù)給藥，病人依從性低的缺陷，體內(nèi)藥效也顯著提高。實(shí)施例3取1克人白蛋白(購于上海萊士血液制品股份有限公司)溶于5毫升生理鹽水中，室溫?cái)嚢杈鶆?。以NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0后，加入0. Olmg適體藥物，使完全溶解。滴加無水乙醇至上述溶液中，總加入無水乙醇體積為10毫升。邊滴加便攪拌，攪拌速度為lOOOrpm。 無水乙醇添加完畢后繼續(xù)攪拌1小時(shí)。靜止，析出微囊。經(jīng)離心收集微囊，加入5ml 6%的戊二醛溶液固化微囊0.5小時(shí)。離心收集微囊，以生理鹽水洗滌，反復(fù)此過程3次。最后， 以IOml生理鹽水懸浮微囊，超聲震蕩半小時(shí)。經(jīng)0.45微米濾膜過濾后備用。本實(shí)施例工藝解決了適體藥物的緩釋問題，可以緩慢釋放適體藥物，明顯提高藥物的體內(nèi)活性，克服了常規(guī)制劑需要反復(fù)給藥，病人依從性低的缺陷，體內(nèi)藥效也顯著提高。實(shí)施例4適體微囊的檢測①取實(shí)施例1-3得到的微囊，電鏡下檢測，可見實(shí)施例1顆粒大小均勻(圖2)。實(shí)施例2-3得到的微囊顆粒與實(shí)施例1類似。②對實(shí)施例1得到的微囊的適體包裹率進(jìn)行測定。按照公式(適體初始量-上清內(nèi)適體殘余量)/適體初始量，計(jì)算包裹率。結(jié)果3批制劑的包裹率在51-59%之間。實(shí)施例2得到的微囊適體包裹率為31%，實(shí)施例3得到的微囊適體包裹率為 63%。③對實(shí)施例1-3得到的微囊的粒徑進(jìn)行測定，結(jié)果粒徑分布為150-350nm。實(shí)施例5取實(shí)施例1中制備的微囊，測定其體外釋藥曲線。釋藥介質(zhì)采用生理鹽水，測定時(shí)間為48小時(shí)，釋藥曲線見圖3?？梢娫?小時(shí)內(nèi)累積釋藥率為30%，然后每6小時(shí)釋藥10%左右。最大釋藥率為 90%左右。前2小時(shí)的30%表現(xiàn)為藥物的突釋現(xiàn)象，之后表現(xiàn)為零級釋放，可維持2天左
右ο實(shí)施例6取實(shí)施例1得到的微囊，以注射用水溶解成適體含量為10mg/ml的溶液，溶液中加入甘露醇至100mg/ml，無菌過濾。按照常規(guī)凍干工藝?yán)鋬龈稍铮玫絻龈煞坩?。?shí)施例5取6-7周齡裸鼠，體重(20±》g，雌性。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為2. 5X 107mL。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色測定細(xì)胞活性后，取200微升細(xì)胞懸液接種于裸鼠右背側(cè)近腋部皮下。接種7天后，將小鼠隨機(jī)分為4組。第一組為模型組，每日皮下注射生理鹽水0. 5ml/只。第2組為給藥組1，每日皮下注射未微囊化適體藥物，劑量為100微克/kg。第3組為給藥組2，每3日皮下注射微囊化適體藥物，劑量為 100微克/kg。第4組為給藥組3，每3日皮下注射微囊化適體藥物，劑量為300微克/kg。從抑瘤曲線(圖4)可知，適體藥物經(jīng)微囊化后藥效明顯提高。微囊化適體藥物每 3日給藥一次，總劑量降低為原1/3，其藥效即相當(dāng)于原型藥物(未微囊化)。微囊化適體藥物每3日給藥，總劑量相同，其抑瘤效果則顯著提高。實(shí)施例7微囊制備工藝參數(shù)的優(yōu)化。1)ρΗ對粒徑的影響取1克人白蛋白溶于20毫升生理鹽水中，室溫?cái)嚢杈鶆?。以HCl或NaOH分別調(diào)節(jié)pH至6. 0，7. 0，8. 0，9. 0，加入0. Img適體藥物，使完全溶解。滴加無水乙醇至上述溶液中， 總加入體積為40毫升。邊滴加便攪拌，攪拌速度為lOOOrpm。無水乙醇添加完畢后繼續(xù)攪拌1小時(shí)。靜止，析出微囊。經(jīng)離心收集微囊，加入0.5ml 5%的戊二醛溶液固化微囊0.5 小時(shí)。離心收集微囊，以生理鹽水洗滌，反復(fù)此過程3次。最后，以Iml生理鹽水懸浮微囊， 超聲震蕩半小時(shí)。經(jīng)0. 45微米濾膜過濾后，測定粒徑，如表1所示，表1為不同pH條件下微囊粒徑范圍表。由表1可見，在堿性范圍微囊粒徑在納米級。在pH值7. 5和8. 5范圍內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在7. 8-8. 2范圍內(nèi)，可以將粒徑有效控制在400nm之內(nèi)。2)戊二醛用量在對微囊進(jìn)行固化處理時(shí)，分別選用戊二醛濃度為3%，6%，9%和12%。發(fā)現(xiàn)高濃度條件下固化迅速，但粒徑偏大。低濃度固化不徹底，釋藥速度偏快。以6%的濃度進(jìn)行固化，得到的微囊在粒徑和釋藥速率方面均較理想。3)適體用量微囊制備方法除適體用量外，均與1)中方法相同。適體用量范圍為0. Olmg-Img0 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0. Img之下藥物包裹率均在50%之上，但超過0. Img后，包裹率則迅速降低。 所以選用0. Img0表 權(quán)利要求
1.一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊，其特征在于采用人血白蛋白包裹適體藥物形成微囊，該微囊的粒徑為150-350nm，在體內(nèi)外緩慢釋放內(nèi)含的適體藥物。
2.如權(quán)利要求1所示的一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊，其特征在于所述的適體藥物為抗血管內(nèi)皮生成因子165(VEGF16Q的適體藥物，具有抑制腫瘤新生血管生成的活性。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的制備工藝，其特征在于包括如下步驟將適體藥物溶解于人血白蛋白水溶液中，以無水乙醇為凝聚劑使適體藥物包裹于白蛋白內(nèi)形成微囊，微囊表面經(jīng)戊二醛交聯(lián)使微囊固化，得到可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊。
4.如權(quán)利要求3所述的一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的制備工藝，其特征在于所述的制備步驟為將所述的人血白蛋白溶于生理鹽水，調(diào)節(jié)PH至7. 8-8. 2，加入適體藥物使完全溶解；滴加無水乙醇至上述溶液，使微囊析出；微囊經(jīng)戊二醛溶液固化，以生理鹽水反復(fù)洗滌，超聲震蕩混勻，經(jīng)0. 45微米濾膜過濾，得到可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微^ ο
5.如權(quán)利要求3或4所述的一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的制備工藝，其特征在于所述的人血白蛋白與適體藥物的加入的重量比為1000-100000 1，生理鹽水與人血白蛋白之間加入的重量比為5-20 1，無水乙醇與人血白蛋白之間加入的重量比為10-100 1，戊二醛溶液的濃度為6%，戊二醛溶液與人血白蛋白之間加入的重量比為 0. 5-10 1，pH 為 7. 5-8. 5。
6.如權(quán)利要求5所述的一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的制備工藝，其特征在于所述的人血白蛋白與適體藥物的加入的重量比為10000 1，生理鹽水與人血白蛋白之間加入的重量比為20 1，無水乙醇與人血白蛋白之間加入的重量比為20 1，戊二醛溶液的濃度為6%，戊二醛溶液與人血白蛋白之間加入的重量比為1 2，pH為7. 8-8. 2。
7.如權(quán)利要求3或4所述的一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的制備工藝，其特征在于所述的可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊用注射用水將其溶解成適體含量為 10mg/ml的溶液，溶液中加入甘露醇至100mg/ml，無菌過濾，冷凍干燥即得可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的凍干粉針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊及其制備工藝，采用人血白蛋白包裹適體藥物形成微囊，該微囊的粒徑為150-350nm，在體內(nèi)外緩慢釋放內(nèi)含的適體藥物。本發(fā)明解決了適體藥物的緩釋問題，可以明顯提高藥物的體內(nèi)活性。
文檔編號A61K47/42GK102416008SQ20111037530
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月22日
發(fā)明者刁勇, 林俊生, 王立強(qiáng) 申請人:華僑大學(xué)