專利名稱：植物發(fā)酵提取物及其粉末以及其組合物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于獲得可添加到與包括人在內(nèi)的哺乳動物(具體是家畜、寵物動物等)、鳥類(具體是飼養(yǎng)的雞、寵物鳥等)，兩棲類動物、爬行動物、魚(具體是水養(yǎng)的魚、寵物魚等)和無脊椎動物相關(guān)的藥物、動物藥物、準(zhǔn)藥物、化妝品、食品、功能性食品、飼料和沐浴劑中的安全的免疫增強(qiáng)劑的發(fā)酵和培養(yǎng)的方法、生產(chǎn)植物發(fā)酵提取物的方法、通過發(fā)酵和培養(yǎng)方法得到的含有免疫增強(qiáng)劑的植物發(fā)酵提取物、從植物發(fā)酵提取物得到的含有免疫增強(qiáng)劑的粉末和含有植物發(fā)酵提取物的植物發(fā)酵提取物組合物。
背景技術(shù)：
為包括人在內(nèi)的哺乳動物(具體是家畜、寵物動物等)、禽類(具體是飼養(yǎng)的雞、寵物鳥等)、兩棲類動物、爬行動物、魚(具體是水養(yǎng)的魚、寵物魚等)和無脊椎動物建立包括預(yù)防感染技術(shù)的疾病預(yù)防和治療方法迫在眉睫。而且，迫切需要不僅能實現(xiàn)上述目的而且可不用化學(xué)物質(zhì)、沒有環(huán)境污染、不產(chǎn)生抗性細(xì)菌和不在人體內(nèi)蓄積的方法。本發(fā)明人等針對上述問題，發(fā)現(xiàn)來源于植物的免疫增強(qiáng)劑，例如小麥的水提取物可安全地實現(xiàn)疾病預(yù)防和治療作用(專利文獻(xiàn)1，非專利文獻(xiàn)I)。同樣為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)可使用從小麥的共生細(xì)菌成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)中得到的低分子量脂多糖(非專利文獻(xiàn)2)。同時，近來研究已經(jīng)表明脂多糖以外的多種物質(zhì)顯示出免疫增強(qiáng)效果，這些含有免疫增強(qiáng)劑的天然材料已經(jīng)引起了關(guān)注。微生物發(fā)酵技術(shù)不但在食品領(lǐng)域還在廣泛領(lǐng)域被普遍運用。發(fā)酵廣泛用于包括葡萄酒的酒類生產(chǎn)、醬油和豆醬生產(chǎn)、如奶酪的發(fā)酵奶制品生產(chǎn)和藥物生產(chǎn)。用來發(fā)酵的微生物有許多，米麥芽(真菌)酵母和乳酸菌是具有代表性的，但使用革蘭氏陰性細(xì)菌是罕有報導(dǎo)的。一般而言，發(fā)酵是一種有機(jī)物在微生物作用下分解的現(xiàn)象，廣意上是指通過微生物生產(chǎn)有用的物質(zhì)(非專利文獻(xiàn)3)。使用微生物發(fā)酵的典型包括葡萄酒釀制。葡萄酒釀制是用附在葡萄皮上面的葡萄酒酵母的發(fā)酵技術(shù)，其產(chǎn)品是酒精。在使用微生物發(fā)酵技術(shù)中，已經(jīng)知道使用革蘭氏陰性細(xì)菌的發(fā)酵有用甲烷細(xì)菌的甲烷發(fā)酵、用醋酸菌的醋酸發(fā)酵和用運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)從龍舌蘭塊莖中得到こ醇的發(fā)酵(龍舌蘭酒發(fā)酵)，但是對使用可食用植物作為原料和使用以與該植物有共生關(guān)系為特征的微生物來發(fā)酵培養(yǎng)的方面知之甚少，且從未關(guān)注過將免疫增強(qiáng)劑作為發(fā)酵產(chǎn)品。再進(jìn)一歩，以生產(chǎn)免疫增強(qiáng)劑為目的的發(fā)酵和培養(yǎng)方法從來未受關(guān)注。一方面，當(dāng)使用微生物進(jìn)行發(fā)酵時，通常發(fā)酵底物的營養(yǎng)條件要滿足微生物的成長。即，必需存在可供微生物作為營養(yǎng)的物質(zhì)，即含有充分的諸如葡萄糖和果糖的單糖作為碳源。因此，像葡萄這樣含有豐富果糖的水果不需要任何加工即可用作發(fā)酵底物。不過在其他情況下，微生物發(fā)酵需要預(yù)處理如加熱和酶處理。例如，上面講到的運動發(fā)酵單胞菌是龍舌蘭酒發(fā)酵中使用的微生物。在這種情況下，通過加熱從非食用植物龍舌蘭塊莖中得到的多糖，使之分解成可發(fā)酵的單糖，隨后這些單糖由微生物發(fā)酵得到發(fā)酵產(chǎn)品酒精。因此，用典型的微生物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時，諸如淀粉的多糖不適合作為發(fā)酵底物。例如，已有報道成團(tuán)泛菌不能分解淀粉(非專利文獻(xiàn)4)。我們已經(jīng)證明小麥粉的水提物中含有增強(qiáng)免疫性的活性成分(非專利文獻(xiàn)5)。我們也證明了食用谷物(小麥，稻米)、海藻(褐藻、海帶、羊棲菜(褐藻)和紫菜)和豆類(大豆和赤豆)含有這種活性成分(非專利文獻(xiàn)6)。已被發(fā)現(xiàn)這種生物活性對人類和小鼠的疾病(糖尿病、高脂血、遺傳性過敏皮炎、癌癥)有預(yù)防作用，還能有效預(yù)防魚、甲殼綱動物和雞的感染(專利文獻(xiàn)I，非專利文獻(xiàn)I)。不過，想要通過小麥粉的水提物得到上述效果，必須攝取大量的小麥粉?！矫?，成團(tuán)泛菌是與小麥共生生存的細(xì)菌，因為這種細(xì)菌向小麥提供了磷和氮，它被認(rèn)為對小麥培育有用(非專利文獻(xiàn)7)。同時，成團(tuán)泛菌不僅在小麥上也在梨和蘋果表皮上沉積。在歐洲已經(jīng)證明了當(dāng)這種細(xì)菌沉積時，可預(yù)防由真菌引起的腐爛病，正在進(jìn)行用 這種細(xì)菌作無毒、環(huán)保殺真菌劑的開發(fā)(非專利文獻(xiàn)8)。共生現(xiàn)象是這樣定義的“異種生物體一起生存的現(xiàn)象。在這種情況下，通常就意味著經(jīng)常保持行為上的或生理上的緊密關(guān)系。因此，這并非僅指在同一生活環(huán)境下生存的概念。依據(jù)對共生伴侶而言的生命意義和重要性、關(guān)系的可持續(xù)性和共生伴侶的空間位置，共生現(xiàn)象分類和劃分成不同的種類。通常，共生現(xiàn)象根據(jù)從共生對象處得到好處/壞處的有無，主要分為互利共生、偏利共生和寄生。三類”(非專利文獻(xiàn)9)。已經(jīng)知道成團(tuán)泛菌從任何地區(qū)任何小麥中可分離得到(非專利文獻(xiàn)5)，也可從水果中分離得到(非專利文獻(xiàn)10，11)。已有報告說成團(tuán)泛菌通過產(chǎn)生抗生素保護(hù)植物免受真菌和其他細(xì)菌侵害(非專利文獻(xiàn)12，13)并且進(jìn)行固磷和固氮(非專利文獻(xiàn)7)。因此，成團(tuán)泛菌一直被認(rèn)為存在于植物中并扮演了ー個有利于植物的角色。這樣，它的生存方式被視為是“共生”而不是“寄生”。另外，我們已經(jīng)證明增強(qiáng)免疫性的活性成分存在于成團(tuán)泛菌中。我們還發(fā)現(xiàn)從這種細(xì)菌中獲得的低分子量脂多糖對人類和小鼠的疾病(糖尿病、高脂血、遺傳性過敏皮炎、癌癥)有預(yù)防作用，還對魚、甲殼綱動物和雞的感染有預(yù)防作用(專利文獻(xiàn)3，非專利文獻(xiàn)2)。在這種情況下，我們有了ー個構(gòu)想，就是建立ー個用成團(tuán)泛菌生產(chǎn)植物發(fā)酵提取物的方法，以此作為安全、廉價地生產(chǎn)免疫增強(qiáng)劑的方法。也就是，我們關(guān)注(I)使用培養(yǎng)液中所含的主要蛋白成分來源于植物的的培養(yǎng)基，低成本培養(yǎng)成團(tuán)泛菌，同時發(fā)酵植物成分以及(2)制備富含包含有成團(tuán)泛菌的植物或發(fā)酵產(chǎn)品的材料，從而著眼于為包括人在內(nèi)的哺乳動物(具體是家畜、寵物動物等)、禽類(具體是飼養(yǎng)的雞、寵物鳥等)、兩棲類動物、爬行動物、魚類(具體是水產(chǎn)養(yǎng)殖的魚、寵物魚等)和無脊椎動物開發(fā)藥物、動物用藥物、準(zhǔn)藥物、化妝品、功能性食品、食品、飼料和沐浴劑。不過這并不意味著與植物共生生存的微生物能夠直接用植物成分例如來源于可食用植物的原料作為發(fā)酵底物。例如，小麥粉是淀粉和小麥粉中存在的相似成分的復(fù)合有機(jī)物，但是分離出的與小麥共生生存的微生物成團(tuán)泛菌隔著小麥外皮并不與之直接接觸。這樣，不能通過細(xì)菌與小麥的共生關(guān)系證明成團(tuán)泛菌是否能發(fā)酵和用小麥粉培養(yǎng)。事實上，根本不知道，也無報告說成團(tuán)泛菌能夠同化小麥粉。相反地，根據(jù)公知事實，已經(jīng)記述了成團(tuán)泛菌不能用小麥淀粉來作為發(fā)酵底物。
植物中含有的糖類經(jīng)常保留為淀粉的形式，這點在可食用植物中很顯著，特別是可食用谷物。通常，微生物沒有高度同化淀粉的功能。在這點上，已經(jīng)知道一部分兼性革蘭氏陰性細(xì)菌能夠發(fā)酵淀粉。例如已知Erwinia能同化淀粉。不過在所述的這個發(fā)酵中，當(dāng)發(fā)酵淀粉時，希望的是通過添加可在另ー個最佳培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)的微生物以利用該微生物的淀粉酶活性，從未想過聯(lián)合進(jìn)行使用淀粉實施培養(yǎng)本身和發(fā)酵。在常規(guī)技術(shù)中，它被看作僅以有效利用微生物淀粉酶活性為目的的發(fā)酵，沒有計劃用淀粉作為底物來培養(yǎng)微生物。一方面，在本發(fā)明實施例中，公開了ー種除了用淀粉作為唯一碳源的微生物培育以外的發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)，本發(fā)明與常規(guī)技術(shù)的重要區(qū)別在于本實施例不僅僅是發(fā)酵而是發(fā)酵和培養(yǎng)。在另一方面，如果某特定微生物保留了分解淀粉的功能，這并不直接表明該微生物能用淀粉作底物來生長。在培養(yǎng)上，在也以微生物生長為目的的情況下，在培養(yǎng)開始時加入的微生物數(shù)量是極少的。在這情況下，即使微生物輕微具有淀粉酶活性，該活性對于充分分解底物而言太微弱，無法實現(xiàn)微生物的生長。事實上，人們認(rèn)為許多微生物不能用淀粉作為唯一碳源而生長。

但是，如果用成團(tuán)泛菌在主要成分是小麥粉的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵和培養(yǎng)，低成本地生產(chǎn)富含免疫增強(qiáng)劑的植物發(fā)酵提取物(在下文中，將用成團(tuán)泛菌在主要成分是小麥粉的培養(yǎng)基中發(fā)酵和培養(yǎng)而生產(chǎn)出的植物發(fā)酵提取物稱為小麥發(fā)酵提取物)，作為具體的例子，應(yīng)該能夠為畜牧業(yè)在水產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域提供環(huán)保、安全的可有效預(yù)防感染的藥物、動物用藥物、準(zhǔn)藥物、化妝品、食品、功能性食品、飼料和沐浴劑。本發(fā)明是以上述的成團(tuán)泛菌用小麥粉作為底物生長的發(fā)現(xiàn)為契機(jī)并且進(jìn)行了大量實驗而完成的。本發(fā)明提供的植物發(fā)酵提取物是ー個總稱，其包括進(jìn)行發(fā)酵和培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液本身、通過固/液分離培養(yǎng)液而得到的液體成分和對固/液分離得到的固體成分進(jìn)行提取而得到的液體成分等。也就是說，植物發(fā)酵提取物包括根據(jù)本發(fā)明所述發(fā)酵和培養(yǎng)方法獲得的培養(yǎng)液本身、和用全部或部分培養(yǎng)液可能制備得到的所有提取物。這自然不用說，植物發(fā)酵提取物能通過干燥成植物發(fā)酵提取物粉末或在適當(dāng)溶液含有生理鹽水的磷酸鹽緩沖液中將植物發(fā)酵提取物粉末溶解成任意濃度而被利用。[專利文獻(xiàn)I]日本未審查專利申請公報No.H 3-218466[專利文獻(xiàn)2]日本未審查專利申請公報Νο·Η8-198902[專利文獻(xiàn)3]W0 00/57719[專利文獻(xiàn)4]日本未審查專利申請公報NO.H6-78756[專利文獻(xiàn)5]日本未審查專利申請公報NO.H4-187640[專利文獻(xiàn)6]日本未審查專利申請公報No.H4-49240[專利文獻(xiàn)7]日本未審查專利申請公報Νο·Η4-99481[專利文獻(xiàn)8]日本未審查專利申請公報No.H 5-155778[非專利文獻(xiàn) I] Inagawa, H. et al. , Biotherapy 5 (4)，p617_621，1991[非專利文獻(xiàn)2] Soma G. et al. ,“Tumor necrosis Factor :Molecular andCellular Biology and Clinical Relevance” p203_220，1993[非專利文獻(xiàn) 3] Yamada T. et al. ,iiSeibutsugaku Jiten” 3rded.，ρ1021，1983[非專利文獻(xiàn) 4] Gavini，F(xiàn). et al.，Int. J. Syst. BacterioI.，39，p337_345，1989
[非專利文獻(xiàn) 5]Nishizawa T. et al.，Chem. Pharm. Bull. ,40(2)，p479_483,1992[非專利文獻(xiàn) 6] Inagawa H. et al.，Chem. Pharm. Bull. ,40(4)，ρ994_997,1992[非專利文獻(xiàn) 7]Neilson A. H. , J. Appl. Bacteriol.，46 (3)，p483_491，1979[非專利文獻(xiàn)8]Nunes C. et al. , Int. J. Food Microbiol.，70 (1-2)，p53_61，2001[非專利文獻(xiàn)9]Yamada T. et al. ,“Seibutsugaku Jiten”3rded.，ρ287_288，1983[非專利文獻(xiàn) 10] Nunes C. et al.，J. Appl. Microbiol.，92 (2)，p247_255，2002[非專利文獻(xiàn) ll]Asis C. A. Jr. et al. , Lett. Appl. Microbial. ,38(1), pl9~23,2004
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發(fā)明內(nèi)容
[發(fā)明所要解決的問題]如前面所述，免疫增強(qiáng)劑多為包含在植物本身中和與植物共生生存的微生物的成分或者產(chǎn)物中。因此，想要獲得來源于攝食安全的天然產(chǎn)品的免疫增強(qiáng)劑，從可食用植物本身中提取成分(例如，鱟陽性糖脂類，專利文獻(xiàn)I)或有效培養(yǎng)與可食用植物共生生存的微生物來獲得其成分或產(chǎn)物(例如，低分子量脂多糖。專利文獻(xiàn)2)是有用的。但是，在可食用植物中的免疫增強(qiáng)劑含量是非常低的，想要通過食用來達(dá)到免疫增強(qiáng)作用，就必須攝取極其大量的食物，而且，一般不容易保持免疫增強(qiáng)劑適當(dāng)?shù)臄z取量。這樣，并不能指望這種效果。此外，從植物中提取免疫增強(qiáng)劑并用作食品或藥物時，需要高成本，并實用性差。一方面，當(dāng)關(guān)注在與植物共生生存的微生物吋，與小麥共生的細(xì)菌成團(tuán)泛菌含有作為有效成分對免疫刺激有效的低分子量脂多糖。但是，到目前為止，為了提取低分子量脂多糖，需用昂貴的培養(yǎng)基來培養(yǎng)成團(tuán)泛菌，培養(yǎng)基中所含的主要蛋白如NZ胺、胰蛋白胨或水解酪蛋白氨基酸來源于動物。因此價廉地提供可廣泛使用的免疫增強(qiáng)劑是有困難的。同吋，不能否認(rèn)可能混入諸如來源于BSE動物的未知有害物。鑒于上述問題，本發(fā)明目的在于提供可使用安全的材料，價廉和有效地獲得免疫增強(qiáng)劑的發(fā)酵和培養(yǎng)方法；通過該方法得到的植物發(fā)酵提取物、從植物發(fā)酵提取物中得到的植物發(fā)酵提取物粉末和含有植物發(fā)酵提取物粉末的植物發(fā)酵提取物組合物。[解決問題的方法]本發(fā)明中的發(fā)酵和培養(yǎng)方法的特征在于，用專門與植物共生生存的兼性厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌發(fā)酵來源于可食用植物原料，同時培養(yǎng)兼性厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌。通過用兼性厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌以淀粉為碳源發(fā)酵可實現(xiàn)用簡單的方法進(jìn)行發(fā)酵和培養(yǎng)。希望兼性厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌是兼性厭氧桿菌。兼性厭氧桿菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)。兼性厭氧桿菌屬于泛菌屬(Pantoea)、沙雷氏菌屬(Serratia)或腸桿菌屬(Enterobacter)。
通過使用兼性厭氧桿菌成團(tuán)泛菌，可以以淀粉為碳源。希望可食用植物是食用谷物、海藻、豆類或其混合物。還希望來源于食用谷物的原料是小麥粉，米粉，小麥麥麩粉，米糠或酒糟。特別是因為小麥粉含有作為蛋白質(zhì)來源的谷蛋白，所以甚至在不使用來源于動物的原料的情況下也可以有效地發(fā)酵和培養(yǎng)。希望來源于海藻的原料是褐藻粉，裙帶菜(裙帶菜孢子葉)粉或海帶粉。當(dāng)來源于豆類的原料是豆腐渣滓時，它富含蛋白質(zhì)。因而，甚至在不使用來源于動物的原料的情況下也可以有效地發(fā)酵和培養(yǎng)。發(fā)明中植物發(fā)酵提取物的特征在于是由發(fā)酵和培養(yǎng)的方法獲得的。發(fā)明中植物發(fā)酵提取物粉末的特征在于是由發(fā)酵和培養(yǎng)的方法獲得的。 發(fā)明中植物發(fā)酵提取物組合物的特征在于組合了植物發(fā)酵提取物或植物發(fā)酵提取物粉末。植物發(fā)酵提取物組合物可以是藥物，動物用藥物，準(zhǔn)藥物，化妝品，食品，功能性食品，飼料或沐浴劑。希望植物發(fā)酵提取物有以下的理化性質(zhì)。植物發(fā)酵提取物甚至在多粘菌素B存在的情況下顯示出巨噬細(xì)胞活化能力。植物發(fā)酵提取物具有免疫增強(qiáng)作用。[發(fā)明效果]根據(jù)本發(fā)明，因為可在不含有來源于動物的成分的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所以不存在來源于動物成分的雜質(zhì)的污染。因此，不可能有未知有害物質(zhì)例如來源于BSE污染，并且可以提供安全性高和廉價地生產(chǎn)能用于多種預(yù)期用途的植物發(fā)酵提取物的制造方法和安全、廉價地提供了含有免疫增強(qiáng)劑的植物發(fā)酵提取物或植物發(fā)酵提取物粉末；而且可以提供培養(yǎng)液；免疫增強(qiáng)劑和提取物和提取物粉末；以及含有提取物或提取物粉末的藥物、動物用藥物、準(zhǔn)藥物、化妝品、食品、功能性食品、飼料和沐浴劑。這是未曾被想到也沒有從常規(guī)發(fā)酵技術(shù)的發(fā)現(xiàn)中輕易地推測到的事實，即用專門與植物共生生存的兼性厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌發(fā)酵來自于可食用植物的材料，同時培養(yǎng)兼性厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌，實現(xiàn)以簡單的方法進(jìn)行發(fā)酵和培養(yǎng)。特定物質(zhì)可用從巨噬細(xì)胞是否產(chǎn)生TNF(TNF誘導(dǎo)活性)作為顯示免疫增強(qiáng)效果的指示劑。而且，可用產(chǎn)生的TNF的量對免疫增強(qiáng)效果定量。因此，用來源于小麥粉的鱟陽性植物糖脂類和來源于成團(tuán)泛菌的低分子量脂多糖檢測巨噬細(xì)胞的TNF的產(chǎn)生。通過用多粘菌素B處理來源于小麥粉的鱟陽性植物糖脂類和來源于成團(tuán)泛菌的低分子量脂多糖來終止巨噬細(xì)胞中的TNF的產(chǎn)生?？墒?，很多實施例顯示甚至當(dāng)用多粘菌素B處理本發(fā)明的植物發(fā)酵提取物吋，TNF仍從巨噬細(xì)胞中產(chǎn)出。這表明發(fā)酵和培養(yǎng)獲得的植物發(fā)酵提取物具有性質(zhì)不同于用作原料的植物本身和發(fā)酵所用的微生物本身中的成分所產(chǎn)生的免疫增強(qiáng)效果的免疫增強(qiáng)效果。


圖I是含有小麥發(fā)酵提取物的飼料抑制錦鯉皰疹出現(xiàn)的結(jié)果示意圖。
具體實施例方式在下文詳細(xì)描述適合本發(fā)明的實施方案。I.用成團(tuán)泛菌生產(chǎn)植物發(fā)酵提取物方法的基本特征本發(fā)明中，我們第一次發(fā)現(xiàn)用淀粉作為碳源成團(tuán)泛菌能直接生長，并且發(fā)明了使用成團(tuán)泛菌廉價地生產(chǎn)富含作為發(fā)酵產(chǎn)物和培養(yǎng)產(chǎn)物的免疫增強(qiáng)劑的小麥發(fā)酵提取物的方法。據(jù)此能為有效預(yù)防人類感染和在畜業(yè)及水業(yè)提供環(huán)保安全的準(zhǔn)藥物、化妝品、食品、功能性食品和飼料。I :成團(tuán)泛菌的分離將小麥粉懸浮于水中，取上清液涂布于L肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，然后培養(yǎng)，出現(xiàn)微生物菌落。在這些菌落中，用標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定微生物。例如，通過篩選革蘭氏染色陰性、葡萄糖厭氧代謝反應(yīng)陽性和氧化酶活性陰性的菌落和使用ID測試/EB-20(日水制藥制造)篩選出與標(biāo)準(zhǔn)成團(tuán)泛菌具有相同性質(zhì)的那些菌落?？蓮奈锢砘瘜W(xué)研究所，生物資源中心獲得標(biāo) 準(zhǔn)的成團(tuán)泛菌(非專利文獻(xiàn)4)。在下面的描述中，除非另外指定，百分比是重量值。2 :免疫增強(qiáng)活性評價在本實施方案中，作為小麥發(fā)酵提取物顯現(xiàn)的免疫增強(qiáng)效果的指示劑，通過巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF產(chǎn)評價定對巨噬細(xì)胞的活化能力。3 :來源于成團(tuán)泛菌的低分子量脂多糖希望含有通過成團(tuán)泛菌發(fā)酵和培養(yǎng)而得到的作為免疫增強(qiáng)的活性成分之一的來源于成團(tuán)泛菌的低分子量脂多糖。低分子量脂多糖具有比一般使用的高分子量型脂多糖(典型脂多糖)更顯著的安全性和更高的生物活性。因而，測定低分子量脂多糖的含量。專利文獻(xiàn)2詳細(xì)描述了低分子量脂多糖。本實施例涉及小麥發(fā)酵提取物，但本發(fā)明不意味著植物局限于小麥以及免疫增強(qiáng)劑局限于低分子量脂多糖?？捎霉椒ㄅ囵B(yǎng)成團(tuán)泛菌(專利文獻(xiàn)2，非專利文獻(xiàn)8)，但培養(yǎng)基所含蛋白的主要成分來源于動物，培養(yǎng)基成本高。而且，當(dāng)功能性食品和功能性飼料被給予動物或經(jīng)皮使用時，在食品安全方面存在以BSE為代表的來源于動物的雜質(zhì)污染的問題，除此之外，生產(chǎn)成本高而且方法實用性差。因而，作為為獲得具有免疫增強(qiáng)作用的安全廉價的天然產(chǎn)物的大量研究的結(jié)果，本發(fā)明人完成了如實施例所示的用成團(tuán)泛菌發(fā)酵和培養(yǎng)以獲小麥發(fā)酵提取物的方法。培養(yǎng)基所含蛋白的主要成分以往來源于動物，但本發(fā)明用的是來源于植物的。典型地，將通過用消化酶分解蛋白例如來源于牛奶的酪蛋白得到的產(chǎn)物加入培養(yǎng)液中。這種情況下，每升培養(yǎng)基的基本成本是約250日元，但如果這能用小麥粉替代，基本成本變?yōu)榧s16日元。尚未見高度濃縮并協(xié)同地融合來源于植物的免疫增強(qiáng)活性和與之共生微生物的免疫增強(qiáng)活性二者的發(fā)酵。發(fā)明的內(nèi)容將在下面實施例中描述，但本發(fā)明不局限于以本實施例所描述的成團(tuán)泛菌作為微生物，也不局限于以小麥作為可食用植物或以小麥粉作為原料。本發(fā)明也能適用于通過典型方法從其他富含免疫增強(qiáng)劑的可食用植物中獲得的原料，例如褐藻、可食用谷物(包括小麥粉、米粉、小麥麥麩粉、米糠或來源于食用谷物原料的酒糟)、海藻(包括褐藻粉、裙帶菜粉或來源于海藻原料的海帶粉)和豆類(包括來源于豆類原料的豆腐渣滓)。眾所周知這些植物含有蛋白和糖類。這些植物能適用于成團(tuán)泛菌的發(fā)酵和培養(yǎng)。眾所周知本土細(xì)菌(indigenous bacteria),例如沙雷氏菌屬或腸桿菌屬(Enterobacter)的細(xì)菌與這些植物共生生存(非專利文獻(xiàn)4)。當(dāng)然發(fā)酵用的微生物包括與這些植物共生生存的兼性厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌。II :本發(fā)明重點總結(jié)(I)小麥發(fā)酵提取物作為通過小麥、與之共生的細(xì)菌成團(tuán)泛菌和它們的組合產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物的融合而得到的具有免疫增強(qiáng)作用的物質(zhì)，是新的，但本發(fā)明不局限于此。(2)用革蘭氏陰性細(xì)菌成團(tuán)泛菌生產(chǎn)植物發(fā)酵提取物是新的，但本發(fā)明不局限于此。III :生產(chǎn)小麥發(fā)酵提取物的具體方法(I)通過標(biāo)準(zhǔn)方法從小麥粉中分離出成團(tuán)泛菌(非專利文獻(xiàn)I)。一旦分離和鑒定，細(xì)菌可被保存在50%的甘油中。

(2)制備O. 05 5%食鹽，O. 005 Imol磷酸鹽緩沖液，或混合鹽溶液(O. 5 10%磷酸ニ氫鈉、O. 05 5%磷酸ー氫鉀、O. 05 5%氯化鈉、O. 05 5%氯化銨)。(3)小麥粉以O(shè). 05 10%的濃度懸浮于水中。(4)制備O. 2 3mol氯化鎂溶液。(5)制備O. 2 3mol氯化鈣溶液。(6)某些情況下，(2) (5)的溶液用高壓鍋等滅菌。(7)⑵ (5)的溶液以適當(dāng)劑量混合，加水制得O. I 5%的小麥粉懸浮液。某些情況下，通過加堿性溶液或酸性溶液使PH為中性。(8)某些情況下，通過向(7)中按每升培養(yǎng)基加10 50000單位加入淀粉酶，并在10 80°C溫育I 24小時以此可以部分消化小麥淀粉。(9)將在(I)中分離的成團(tuán)泛菌加入(7)或(8)。(10)使(9)在I 40°C發(fā)酵。某些情況下，發(fā)酵容器可以靜置或振搖?；蛘呖梢蚤g隔幾小時進(jìn)行攪拌。(11)使(10)發(fā)酵6小時至一周。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行時，小麥粉溶液變成黃色。(12) (11)發(fā)酵期間可以選加堿性溶液，使pH為中性，也可以加小麥粉懸浮液或無機(jī)鹽。(13)終止發(fā)酵,通過離心(1000 5000rpm, 10 60分鐘)收集作為沉淀的固體成分。沉淀可以直接當(dāng)作小麥粉發(fā)酵產(chǎn)物用于飼料或用作與飼料混合的原材料。(14)在生產(chǎn)小麥發(fā)酵提取物時，懸浮(13)于水或鹽緩沖液中，在80 140°C加熱10分鐘 6小時。可以通過離心或過濾除去固體成分?？梢栽偌尤胨螓}緩沖液到除去的固體成分中重復(fù)加熱提取幾次。(15)根據(jù)所期望的用途，可將在(14)中生產(chǎn)的小麥發(fā)酵提取物進(jìn)ー步簡單純化。就是以鹽例如氯化鈉以最終濃度O. 05 lmol/L加到(14)的提取物中，隨即以提取物I 3倍的量加入溶劑例如こ醇，沉淀出現(xiàn)?？梢酝ㄟ^離心收集該沉淀。沉淀可以進(jìn)一歩用溶劑例如こ醇洗滌。當(dāng)它被干燥時，可制得粉末。A.涉及生產(chǎn)小麥發(fā)酵提取物方法的實施例[實施例I]成團(tuán)泛菌在小麥粉培養(yǎng)基中的生長研究為了證實用小麥粉作為碳源能否使與小麥本土共生的細(xì)菌成團(tuán)泛菌生長，對小麥粉固體培養(yǎng)基中的成團(tuán)泛菌生長進(jìn)行檢測。(I)制得作為碳源含有O. 5%的小麥粉的M9瓊脂培養(yǎng)基。(2)從LB瓊脂培養(yǎng)基中挑出的一個成團(tuán)泛菌菌落，將其懸浮于Iml PBS中。繼而將其稀釋10倍 10，000倍，將O. Iml的每個等分接種到(I)中M9瓊脂培養(yǎng)基。(3)37°C培養(yǎng)6天后，觀察到菌落的出現(xiàn)。結(jié)果，在以稀釋10000倍的O. Iml接種的有蓋培養(yǎng)皿中觀察到約300個菌落。這證實了成團(tuán)泛菌能利用小麥粉作碳源。[實施例2]小麥發(fā)酵提取物的生產(chǎn)

(I)向O. 5g小麥粉中加入(5ml)蒸懼水以懸浮,加O. Iml懸浮液到L肉湯瓊脂培
養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)過夜。(2)分離黃色菌落，通過標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定細(xì)菌，分離成團(tuán)泛菌，將其懸浮于50%的甘油溶液中，在冰箱中保存。將貯存物的一部分用于LB瓊脂培養(yǎng)基上，其在37°C靜置以制得成團(tuán)泛菌的單獨菌落。(3) 2升培養(yǎng)瓶中，加入64g磷酸ニ氫鈉七水合物，15g磷酸ー氫鉀，2. 5g氯化鈉，及5g氯化銨，然后加入純化水制得總體積I升(無機(jī)鹽混合溶液)。向13. Ig氯化鎂ニ水合物加入純化水制得總體積IOOml (氯化鎂溶液)。向11. Ig氯化鈣加入純化水制得總體積IOOml (氯化|丐溶液)。純化水(4L)加到ー個5L錐形瓶中(純化水)。上述溶液和純化水都通過高壓鍋滅菌(Τ0ΜΥ 83-325，120で，20分鐘)。(4)小麥粉(24g)(日清制粉公司制造)和純化水加到ー個IL錐形瓶中制得總體積600ml。在同樣高壓滅菌后，加入3mg α -淀粉酶(SIGMA，桿菌屬，酶活性為1500 3000単位/mg蛋白)，65°C水浴加熱12小時(淀粉酶處理的小麥粉溶液)。(5)所制備的溶液以表I所不的數(shù)量置于ー個3L滅菌過的搖瓶中制得小麥粉培養(yǎng)基。[表 I]
無機(jī)鹽混合溶液__200ml
純化水550ml
淀粉酶處理的小麥粉溶液 200ml
氯化鎂溶液__2.0ml
氯化鈣溶液_Γ O- Iml(6)接種物的準(zhǔn)備將ー個從在⑵的小麥粉中分離出的成團(tuán)泛菌菌落加到IOml與先前準(zhǔn)備的(5)成分相同的小麥粉培養(yǎng)基中，在37°C輕柔攪拌發(fā)酵過夜(12 15小吋)來準(zhǔn)備用于小麥粉發(fā)酵的接種物。(7)全部量的(6)加入(5)中，在37°C攪拌發(fā)酵20 30小吋。發(fā)酵液的pH通過加氨水調(diào)節(jié)校準(zhǔn)到PH 7。無菌下，150ml淀粉酶處理的小麥粉溶液加入到37. 5ml無機(jī)鹽混合溶液中，同樣地發(fā)酵20 30小時。重復(fù)同樣的操作發(fā)酵總計65 80小時。(8)離心小麥粉發(fā)酵溶液(日立，高速冷凍離心機(jī)，SCR-20B,5000rpm,20分鐘，4°C )，收集沉淀。(9)向(8)的沉淀中加入磷酸鹽緩沖液，懸浮制得總體積100ml，等分的每33ml移入ー個50ml離心管中，沸水浴加熱提取30分鐘。加熱終止后，溶液冷卻至室溫，離心(日立，高速冷凍離心機(jī)，SCR-20B, IOOOOrpm, 20分鐘，20°C )。離心后，82ml淺黃色上清液傾注
到另一容器中收集起來。(10)向80ml (9)的上清液中加入氯化鈉溶液(8. 9ml，5mol)。當(dāng)加入178mlこ醇時，出現(xiàn)白色混濁。將其在冰箱(_90°C)中靜置過夜，再將溶液離心(日立，高速冷凍離心機(jī)，SCR-20B，10000rpm，20分鐘，4°C )。除去上清液，得到沉淀。向沉淀加入IOml 70%冷こ醇，懸浮后，離心溶液(日立，高速冷凍離心機(jī)，SCR-20B，10000rpm，20分鐘，20°C )，洗滌沉淀。風(fēng)干沉淀并溶解于蒸餾水中，得Ilml小麥發(fā)酵提取物。(11)測量干重將O. 3ml移入一個已稱重的I. 5ml塑料管中，凍結(jié)后，用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，從而稱重7. 45mg。因此，(10)中小麥發(fā)酵提取物干重是每Iml溶液中24. Smg和姆Ilml總量中273mg。(12)用同樣方法獨立地生產(chǎn)小麥發(fā)酵提取物8次，以蛋白定量BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用 Bradford法測量每個樣本中的蛋白量。純化的鱟陽性糖脂類(專利文獻(xiàn)I)和低分子脂多糖(專利文獻(xiàn)2)用作對比物。測量結(jié)果如表2所示。表2-5和表7中，小麥發(fā)酵提取物對應(yīng)的數(shù)值表示干燥每Ig上述(10)中所得小麥發(fā)酵提取物所得的mg重量。(13)測量糖含量以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)糖通過苯酚硫酸方法測量糖含量。測量結(jié)果如表3所示。(14)測量核酸含量測量稀釋100倍的樣本在210 340nm的吸收。用260nm的吸收值減320nm的吸收值得到的值以及50 μ g/10D的DNA吸收來計算最大含量。測量結(jié)果如表4所示。(15)通過鱟化驗測量鱟活性物質(zhì)含量為了測量，所用Toxi-color系統(tǒng)由生化學(xué)エ業(yè)公司提供，并且用生化學(xué)エ業(yè)公司的ET-I作標(biāo)準(zhǔn)鱟活性物質(zhì)。測量結(jié)果如表5所示。(16)碘-淀粉反應(yīng)用時將碘試劑1N(向12. 7g碘和25g碘化鉀加入IOml 7欠，混勻，再加水定容至100ml)用水稀釋200倍。將其(5 μ L)加到0. Iml預(yù)先溶解為lmg/mL的小麥發(fā)酵提取物中，混勻。在小麥發(fā)酵提取物中，溶液立即從淺紫變?yōu)樯钭仙?陽性)。在鱟陽性糖脂類和低分子量脂多糖中，同樣的操作沒有導(dǎo)致這樣的顏色變化(陰性)。以上結(jié)果總結(jié)在表6中。上述結(jié)果顯示，顯而易見小麥發(fā)酵提取物在蛋白含量、糖含量、核酸含量(除了鱟陽性糖脂類因為沒有數(shù)據(jù))、鱟陽性物質(zhì)含量和碘-淀粉反應(yīng)方面與鱟陽性糖脂類和低分子量脂多糖不同，很顯然本物質(zhì)是新的。上述結(jié)果簡單總結(jié)在表7中。即本實施例的植物發(fā)酵提取物是新的，其顯示的下列理化性質(zhì)與鱟陽性糖脂類和低分子量脂多糖不同。小麥發(fā)酵提取物顯示蛋白含量5 15 %，糖含量20 45 %，核酸含量10 35 %，鱟陽性物質(zhì)含量10 40 %，碘-淀粉反應(yīng)陽性及甚至在多粘菌素B存在的情況下可顯示巨噬細(xì)胞活化能力。[表2]發(fā)酵提取物的蛋白含量
I _蛋白含量(mg/g)~
小麥發(fā)酵提取物I 60
小麥發(fā)酵提取物2 I 71_
權(quán)利要求
1.植物發(fā)酵提取物制造方法，其特征在于，通過用成團(tuán)泛菌發(fā)酵小麥粉，并且同時培養(yǎng)所述成團(tuán)泛菌，得到植物發(fā)酵提取物。
2.植物發(fā)酵提取物制造方法，其特征在于，通過用成團(tuán)泛菌發(fā)酵褐藻粉、裙帶菜粉、或海帶粉，并且同時培養(yǎng)所述成團(tuán)泛菌，得到植物發(fā)酵提取物。
3.植物發(fā)酵提取物制造方法，其特征在于，通過用成團(tuán)泛菌發(fā)酵豆腐渣滓，并且同時培養(yǎng)所述成團(tuán)泛菌，得到植物發(fā)酵提取物。
4.植物發(fā)酵提取物粉末制造方法，其特征在于，其是通過從根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項所述的植物發(fā)酵提取物制造方法得到的植物發(fā)酵提取物而得到植物發(fā)酵提取物粉末。
5.植物發(fā)酵提取物組合物的制造方法，其特征在于，通過配合根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項所述的植物發(fā)酵提取物制造方法得到的植物發(fā)酵提取物或根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物發(fā)酵提取物粉末制造方法得到的植物發(fā)酵提取物粉末來制造植物發(fā)酵提取物的組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物發(fā)酵提取物組合物的制造方法，其特征在于，所述的植物發(fā)酵提取物組合物是藥物、動物用藥物、準(zhǔn)藥物、化妝品、食品、功能性食品、飼料或沐浴劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物發(fā)酵提取物制造方法、植物發(fā)酵提取物粉末制造方法以及植物發(fā)酵提取物組合物的制造方法，以提供安全和廉價地生產(chǎn)含有高濃度免疫增強(qiáng)劑的植物發(fā)酵提取物方法為目的，本發(fā)明的植物發(fā)酵提取物制造方法，其特征在于，通過用成團(tuán)泛菌發(fā)酵小麥粉、褐藻粉、裙帶菜粉、海帶粉、或豆腐渣滓，并且同時培養(yǎng)所述成團(tuán)泛菌，得到植物發(fā)酵提取物。
文檔編號A61K36/88GK102671009SQ201110295578
公開日2012年9月19日 申請日期2004年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月26日
發(fā)明者杣源一郎, 河內(nèi)千惠, 稻川裕之, 西澤孝志, 高橋幸則 申請人:杣源一郎, 生物醫(yī)學(xué)研究集團(tuán)有限公司