專利名稱：一種從金醋中分離金醋多肽提取物的方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食用醋中活性組分的分離方法，具體的講，涉及一種采用膜分離技術(shù)從金醋中分離獲得金醋多肽提取物的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
短鏈多肽在生命過程中所起的作用比氨基酸更加積極，人體內(nèi)蛋白質(zhì)合成分解代謝過程。近幾年的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人體吸收蛋白質(zhì)的主要形式不是以氨基酸，而是以短肽的形式吸收的，這是人體吸收蛋白質(zhì)機制研究的重大突破，具有如下特點1、不需消化，直接吸收。通常，短肽是人體自身合成的，是人體講所吃的營養(yǎng)進(jìn)行酶促水解。在體外已經(jīng)合成好了，進(jìn)入人體后不需進(jìn)行二次降解，直接吸收。2、吸收迅速，口服劑如同針劑?？诜M(jìn)入人體，其速度如同火箭一樣，有的科學(xué)家把它稱為“生物導(dǎo)彈”，快速地穿過人體的口腔、胃，直接進(jìn)入小腸，被小腸吸收，最終進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)、器官及細(xì)胞組織，迅速發(fā)揮其生理作用和生物學(xué)功能。3、以完整的形式吸收。短肽自身有一層保護(hù)膜，人服用時，不會受到人體中的促酶、胰酶、淀粉酶、消化酶、胃蛋白酶及消化系統(tǒng)中的酸堿物質(zhì)的損害或二次水解，短肽是以完整的形式被人體吸收和利用的。4、短肽具有百分之百被人體吸收的特點。吸收后，不會有任何排泄物，全部被人體吸收和利用。5、短肽具有主動被人體吸收的特點。短肽自身具有極強的活性和能量，它的主動吸收、迫使吸收，就是自身的活性和能量在起作用。因此，它在被人體吸收時，不是人體要耗費自身的能量去吸收它，而是多肽以自身的能量讓人體吸收。6、短肽具有優(yōu)先被人體吸收的特點。人體平常所食的營養(yǎng)物質(zhì)，在吸收上，與短肽的競爭中，短肽具有優(yōu)先吸收的特點，這與其主動吸收的特點是分不開的。7、短肽在被人體吸收時，對氨基酸有保護(hù)作用。可保護(hù)氨基酸不受破壞，因此，肽與氨基酸的混合物是人體吸收蛋白質(zhì)的最佳吸收機制。8、短肽在人體中表現(xiàn)出載體的作用。可將人平常所食的營養(yǎng)物質(zhì)，特別是鈣等對人體有益的微量元素，吸附、粘貼、裝載在本體上。9、短肽可在人體中起運輸工具的作用?？蓪⑷似匠Ｋ车母鞣N營養(yǎng)物質(zhì)吸附在本體上后，然后運載輸送到人體各個細(xì)胞、器官、組織，通本體一起被人體吸收和利用，發(fā)揮各自不同的功能作用。10、短肽被人體吸收后，在人體中起著信使作用。它作為神經(jīng)遞質(zhì)傳遞信息，讓人體各系統(tǒng)、器官、組織發(fā)揮各自和整體作用?！吧轿骼详惔住笔俏覈拇竺字?，國家原產(chǎn)地域保護(hù)產(chǎn)品。食醋的主要成分是醋酸，化學(xué)名稱是乙酸，結(jié)構(gòu)簡式為CH3cooh。釀醋主要是以糧食為原料及菌種發(fā)酵。經(jīng)過糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵及后續(xù)消毒滅菌、加工包裝而成，具有色香味俱佳的特點。金醋是老陳醋傳統(tǒng)釀造工藝與高科技改良工藝相結(jié)合釀得的產(chǎn)品，它富含多種維生素和10余種對人體有益營養(yǎng)的有機酸及人體不可缺少的微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，其中20 余種人體必需氨基酸的含量遠(yuǎn)高于普通老陳醋。與此同時，氨基酸在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被譽為“人體黃金”，它是構(gòu)建生物機體的眾多生物活性大分子之一，是一切生命之原。在金醋的研發(fā)基礎(chǔ)上衍生出一系列功能醋、保健醋、生物醋、日化醋系列金醋高端產(chǎn)品，標(biāo)志著山西老陳醋走向創(chuàng)新的開始，這一偉大的科技成果將引領(lǐng)人類健康革命的趨向。金醋系列產(chǎn)品挖掘人類保健秘方，精選綠色谷物和名貴中藥材為主要原料，采用傳統(tǒng)工藝和現(xiàn)代生物工程技術(shù)精心釀造而成，不添加任何防腐成分。其色如琥珀，入口香濃純熟、綿軟甜酸、熏香撲鼻，品后醋香持久，回味生津，且酸度達(dá)到6度以上，比一般老陳醋存儲時間更長。其食療、藥用價值非常，對上百種疾病均有極好的輔助療效，是男女老幼皆宜的防病強身延年益壽的保健佳品。它具有降低高血脂、高血壓、高血粘、高膽固醇的功效，并能緩解預(yù)防各種心腦血管疾病和各種慢性病，諸如活血通絡(luò)、清理軟化血管、疏通微循環(huán)，對中老年人，尤其是對患有慢性病或多種慢性病者有顯著的保健作用。如果對金醋中的成分進(jìn)行分析分離，以獲得更多的金醋短肽分子或多肽分子的組合物，這樣可以更加提高金醋的利用價值。雖然食用金醋、老陳醋或各種醋酸飲料具有很好的保健功能，但在食用過程中也存在諸多問題第一，由于金醋或老陳醋中有機酸的含量較高，總酸含量至少在5%以上，pH值較低，只有2. 7左右，如此高的酸度直接服用對牙齒、口腔以及胃粘膜有較大的刺激作用，很多消費者難以接受，也不宜長期定量的服用，并且長期喝醋也容易引起牙齒的腐蝕和脫鈣寸。第二，有些特定體質(zhì)或身體條件不好的人不能食用金醋或老陳醋。例如，患有胃潰瘍、膽囊炎、腎炎、低血壓、膽石癥、骨損傷等疾病的人不宜吃醋；胃酸過多的人也不宜喝醋； 空腹時不宜吃醋。這種情況限制了金醋或老陳醋的應(yīng)用。第三，金醋或老陳醋以及制備的醋酸飲料還存在攜帶不便的問題，并且其中黃酮等成分的存在導(dǎo)致容易被氧化而不能長期保存。中國發(fā)明專利CN100467036C公開了一種山楂醋酸軟膠囊的制備方法，其利用不飽和的植物油與飽和植物油的混合油對濃縮山楂醋酸進(jìn)行乳化改性成為穩(wěn)定的乳化物料， 并被包裹于明膠皮層中而得到軟膠囊，但該專利中并沒有涉及金醋或山西老陳醋中功能性產(chǎn)品的分離及其制備方法。劉軍等在《微孔膜過濾在食醋生產(chǎn)中應(yīng)用的研究》一文公開了利用微孔膜過濾提高食醋的澄清度和降低了微生物含量的技術(shù)方案，但是并沒有改變食醋的酸度和色率，也沒有公開能夠分離出其他功能產(chǎn)品的方法。本發(fā)明的目的在于將利用現(xiàn)代科技手段將金醋或山西老陳醋開發(fā)成適合不同人群的功能性產(chǎn)品，以提高金醋的利用價值和金醋對人類的效用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中金醋應(yīng)用過程中的限制，開發(fā)適用于不同人群的金醋產(chǎn)品， 以及更好發(fā)揮金醋的保健功效，本發(fā)明提供了一種從金醋中分離不同金醋多肽提取物的方法。此方法操作簡便、成本低廉，分離得到的金醋多肽提取物可以進(jìn)一步加工成食品、保健品或藥品。本發(fā)明所述的金醋多肽提取物是指在金醋中提取的含有多肽組分的提取物，該提取物還含有總酸、全糖和銨鹽。在膜分離技術(shù)中，以壓力差為推動力的膜過濾可區(qū)分為超濾膜過濾、微孔膜過濾和逆滲透膜過濾三類。它們的區(qū)分是根據(jù)膜層所能截留的最小粒子尺寸或分子量大小。以膜的額定孔徑范圍作為區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)時，則微孔膜(MF)的額定孔徑范圍為0.02 10 μ m;超濾膜(UF)為0. 001 0. 02 μ m ；逆滲透膜(RO)為0. 0001 0. 001 μ m。經(jīng)過反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)， 本發(fā)明從金醋中分離獲得金醋多肽提取物的方法中優(yōu)選為將待分離的金醋進(jìn)行超濾處理， 超濾膜最適于金醋溶液中溶質(zhì)的分離和增濃。因此，本發(fā)明提供了一種采取膜分離技術(shù)分離金醋中的生物活性組分金醋多肽提取物的方法，更具體地講，就是利用不同分子量的超濾膜將待分離的金醋進(jìn)行超濾處理。 本發(fā)明的一種從金醋中分離獲得金醋多肽提取物的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，它包括如下步驟第一步，將待分離金醋原液中的乙酸濃度調(diào)節(jié)至3% 5%之間，用微孔濾膜過濾去除金醋中殘留不溶物，得濾液一；第二步，用截流分子量為350Da的超濾膜超濾濾液一，將分子量大于350Da的組分截留得濾液二，收集分子量小于350Da的組分得濾液三；第三步，用截流分子量為3500Da的超濾膜超濾濾液二，將分子量大于3500Da的成分截留得到濾液四，收集分子量在350Da 3500Da的組分得濾液五；第四步，濾液三、濾液四和濾液五分別通過濃縮而得到金醋多肽提取物A、金醋多肽提取物B和金醋多肽提取物C。膜過濾是以壓力為驅(qū)動力，在被處理金醋原液流經(jīng)表面具有孔徑的不對稱的結(jié)構(gòu)濾膜時，可以實現(xiàn)不同分子量物質(zhì)的分離。膜過濾處理金醋原液操作方便、可靠性高、不發(fā)生相變、能耗低，并且分離效率高。一方面，本發(fā)明對上述第二步中的超濾的條件進(jìn)行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述方法中， 所述的第二步中的超濾的條件為(1)超濾的進(jìn)液口壓力為1.0-2. 5MPa Pa，出液口壓力為1. 0-2. OMPa，超濾初期采用較低壓力，然后慢慢升壓；在超濾過程中，采用周期性壓力波動，壓力波動差為
0.1-0. 2MPa ；(2)料液流速為1. 5-4. Om/s，超濾過程中，采用周期性流量波動，流速波動差為
1.0-2. 5m/s ；(3)在超濾系統(tǒng)中間歇通入高壓惰性氣體，形成氣液脈沖流，周期為1-2小時通氣一次，每次1分鐘；(4)料液溫度為40-55攝氏度；(5)料液 pH 值為 2. 0-3. 5 ；(6)當(dāng)料液原液被濃縮1/15-1/10時，再加入水或稀醇溶液超濾1_2次；(7)反沖洗條件反沖洗壓力為1. 5-2. OMPa,反沖洗周期為1_2小時，反沖洗時間為4-lOmin，當(dāng)將超濾組件并聯(lián)使用交替反沖的方法時，其中一套或幾套進(jìn)行正常的超濾并分流出一部分濾液來反沖另外一套或幾套組件的超濾膜，間隔一段時間后交換進(jìn)行，一般
6是工作10-20分鐘，反沖2-5分鐘；(8)化學(xué)清洗周期為1-2個月，化學(xué)清洗藥劑一般為稀酸、稀堿或表面活性劑，清洗工作壓力0. 05-1. OMPa，在化學(xué)清洗劑清洗后，再用水沖洗至近中性。作為本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明對上述第三步中的超濾的條件進(jìn)行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述方法中，所述的第三步中的超濾的條件為(1)超濾的進(jìn)液口壓力為0. 5-2. OMPa,出液口壓力為0. 2-1. 5MPa，超濾初期采用較低壓力，然后慢慢升壓，在超濾過程中，采用周期性壓力波動，壓力波動差為
0.15-0.25MPa ；(2)料液流速為1. 0-3. Om/s，超濾過程中，采用周期性流量波動，流速波動差為
1.0-1. 5m/s ；(3)在超濾系統(tǒng)中間歇通入高壓惰性氣體，形成氣液脈沖流，周期為1-2小時通氣一次，每次5分鐘；(4)料液溫度為35-55攝氏度；(5)料液 pH 值為 3. 5-6. 0 ；(6)當(dāng)料液原液被濃縮1/15-1/10時，再加入水或稀醇溶液超濾1_2次；(7)反沖洗條件反沖洗壓力為1. 5-3. 5MPa,反沖洗周期為1_2小時，反沖洗時間為2-lOmin，當(dāng)將超濾組件并聯(lián)使用交替反沖的方法時，其中一套或幾套進(jìn)行正常的超濾并分流出一部分濾液來反沖另外一套或幾套組件的超濾膜，間隔一段時間后交換進(jìn)行，一般是工作10-25分鐘，反沖1-3分鐘。(8)化學(xué)清洗周期為1-2個月，化學(xué)清洗藥劑一般為稀酸、稀堿或表面活性劑，清洗工作壓力0. 05-1. 2MPa，在化學(xué)清洗劑清洗后，再用水沖洗至近中性。本發(fā)明所提供的分離工藝主要是根據(jù)山西金醋中生物活性分子的分子量對金醋的成分進(jìn)行分離。經(jīng)過本發(fā)明所提供的分離方法分離后，金醋中生物活性分子將被分成三個部分含有分子量小于350Da多肽分子的組分，即金醋多肽提取物A ；分子量大于3500Da 多肽分子的組分，即金醋多肽提取物B ；含有分子量在350 3500Da之間的多肽分子的組分，即金醋多肽提取物C。優(yōu)選地，可以進(jìn)一步將金醋多肽提取物A改造成綠色有機酸類食品添加劑，制成新式水果醋飲料；將金醋多肽提取物B用于用于制作咀嚼片；將金醋多肽提取物C制成口服液或靜脈注射液原料。作為本發(fā)明的第一種功能性產(chǎn)品的制備，就是將濾液三進(jìn)行濃縮獲得金醋多肽提取物A (含有分子量小于350Da多肽分子的組分)，進(jìn)一步制備成綠色有機酸類食品添加劑或新式水果醋飲料。作為本發(fā)明的第二種功能性產(chǎn)品的制備，就是將上述制備方法中的濾液四進(jìn)行濃縮，即得到金醋多肽提取物B (含有分子量大于3500Da多肽分子的生物活性組分)，然后制備成的咀嚼片。由于金醋多肽提取物B中含有大量未被消化的大肽段，蛋白質(zhì)及少量糖類， 營養(yǎng)成分豐富，但其在正常情況不容易被生物體快速吸收，考慮將其作成咀嚼片的方式用于人體保健。金醋多肽提取物B原料凍干粉末呈塊狀，有黏性，有一定的吸濕性，可以用于干法制片，具體過程如下首先將金醋多肽提取物B干燥品用粉碎機粉碎，過100目篩；然后，加輔料，包括但不限于金醋多肽提取物B干燥品、微粉硅膠、微晶纖維素和乳糖中的一種或多種；最后，混合均勻后進(jìn)行壓片，制備獲得咀嚼片。作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，本發(fā)明的咀嚼片中含有金醋多肽提取物B、微粉硅膠和微晶纖維素，并且金醋多肽提取物B 微粉硅膠微晶纖維=10 1 2;作為本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例，本發(fā)明的咀嚼片中含有金醋多肽提取物B、微粉硅膠、微晶纖維素和乳糖，并且金醋多肽提取物B 微晶纖維素乳糖=10 2 2。根據(jù)成片情況看，以上配方壓成的片劑成型較好，基本符合條件。但有兩處可繼續(xù)改進(jìn)第一，由于原料有一定吸濕性，故可考慮加上包衣；第二，由于制出的片劑口感一般， 考慮加入一定量的食用香精作為矯味劑。作為本發(fā)明的第三種功能性產(chǎn)品的制備，就是將上述方法中濾液五進(jìn)行濃縮得到金醋多肽提取物C(含有分子量為350-3500Da多肽分子的組分)?；诙屉脑谌梭w內(nèi)部的重要作用，本發(fā)明人將金醋多肽提取物C制備成口服液。在本發(fā)明所采用的技術(shù)方案中，我們從眾多的可藥用的輔料中選擇了丙二醇、甘油、乙醇、聚乙二醇-300、聚乙二醇-400中的一種或其兩種作為本發(fā)明的必備輔料成分。我們在實驗過程中意外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金醋多肽提取物C的溶液在含有上述的任一種或兩種輔料存在的情況下，金醋多肽提取物C對光和熱的穩(wěn)定性顯著提高。另外，在本發(fā)明技術(shù)方案的制劑配方中，蔗糖、甜蜜素、阿斯巴甜或香精等矯味劑的加入，大大改善了金醋多肽提取物C 口服溶液的口感，這是我們結(jié)合金醋多肽提取物C本身的理化性質(zhì)和苦味特性，通過大量實驗，從眾多可藥用的輔料中選擇出來的口感最好的矯味劑。苯甲酸鈉、尼泊金類、山梨酸及其鉀鹽和鈣鹽等防腐劑的加入可有效防止藥液中細(xì)菌的滋生。本發(fā)明的制備工藝為將處方量的穩(wěn)定劑置于適宜的容器中，加入處方量的金醋多肽提取物C，水浴加熱使其溶解，再將處方量添加劑用少量水溶解后，加入到上述的含藥混合溶液中，加水至全量，攪拌均勻，過濾，分裝滅菌即得。本發(fā)明提供的金醋多肽提取物C 口服溶液的用法用量為口服，每日三次，一次 5mg-1000mg(含有分子量為350_3500Da多肽分子的組分)。本發(fā)明金醋多肽提取物C(含有分子量為350-3500Da多肽分子的組分)口服溶液的優(yōu)點在于藥物以分子狀態(tài)分散在介質(zhì)中，分散度大、吸收快，能迅速發(fā)揮藥效；服用方便，易于分劑量，特別適用于老年患者，能減少藥物的刺激性，有利于提高藥物的生物利用度。避免普通制劑在胃腸道局部藥物濃度過高，刺激胃腸粘膜等缺點，減少不良反應(yīng)，提高患者用藥的依從性，具有服用方便、吸收快、生物利用度高等特點。發(fā)明人還將分子量在含有金醋多肽提取物C制備成靜脈注射液形式，本發(fā)明的所述的靜脈注射液劑含有金醋多肽提取物C和藥物可接受的載體。本發(fā)明多提供的靜脈注射液具有穩(wěn)定性高，復(fù)溶性好的特點。金醋多肽提取物C的水溶性較差，我們通過大量的實驗篩選出下面的輔料成分和合適的范圍，運用下面的制備工藝，有效的解決了金醋多肽提取物C中多肽分子的組分復(fù)溶后澄明度不合格的問題。金醋多肽提取物C的組分凍干粉針劑的載體可以選自甘露醇、乳糖、右旋糖苷20、右旋糖苷60、右旋糖苷80、NaCl、葡萄糖、山梨醇中的一種或多種。金醋多肽提取物C和藥物可接受的載體之間的重量比可以是 1 0.1-10，優(yōu)選為1 1-5。金醋多肽提取物C在注射液中的含量規(guī)格是1-lOOmg，金醋多肽提取物C組分的含量規(guī)格優(yōu)選為5mg、10mg、20mg、50mg。
本發(fā)明所述注射液的制備方法，包括下列步驟(1)除熱原在注射用水加入注射用活性炭于60-200°C加熱30-40分鐘濾過；(2)配制藥液將金醋多肽提取物C加注射用水適量，溶解，加入藥物可接受載體， 加注射用水到規(guī)定量；(3)除菌將步驟b的濾液用除菌濾器進(jìn)行正壓除菌濾過；(4)灌裝用管制西林瓶進(jìn)行無菌灌裝；(5)注射液滅菌；(6)質(zhì)檢。本發(fā)明還對上述注射液的制備方法進(jìn)行了優(yōu)選，優(yōu)選地，它包括如下步驟(1)除熱原；注射用水中加入注射劑用活性炭，在60-200°C加熱30分鐘，用濾膜過濾，收集濾液，備用；(2)配制藥液稱取原料，加乳酸適量溶解，加上述注射用水，濃度為0. 2g/ml。然后，加入經(jīng)過規(guī)定量的預(yù)先經(jīng)過除菌除熱原處理的藥物可接受的載體混勻，再加注射用水至規(guī)定體積；(3)除菌將上述濾液按無菌操作法用除菌濾器進(jìn)行正壓除菌濾過，用0.22 μ M微孔濾膜過濾，濾液進(jìn)行熱原檢查和半成品含量檢查然后分裝；(4)罐裝管制西林瓶的處理選用截留分子量為1萬至20萬的超濾膜(平均孔徑為2nm到0. 1 μ m)，除去相對分子質(zhì)量為幾萬至幾百萬的熱原，則應(yīng)再使用熱原吸附劑除去小分子質(zhì)量的熱原，包括相對分子量約2000的類脂A ；罐裝在100級潔凈區(qū)進(jìn)行灌裝， 加塞；(5)注射液的滅菌濕熱滅菌，壓力125MPa，滅菌20min ；(6)質(zhì)檢澄明度檢查、熱原檢測(參見2010版藥典，鱟試劑檢測)、無菌檢測(參見2010版藥典，主要為將注射劑加入培養(yǎng)基中無菌條件下培養(yǎng)14天，不得見到有細(xì)菌出現(xiàn))。本發(fā)明的注射劑具有穩(wěn)定性好，療效優(yōu)良，使用方便的特點，比水針劑具有更好的穩(wěn)定性，以下通過實驗說明本發(fā)明的有益效果?？傊?，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)優(yōu)勢1、采用膜過濾工藝分離金醋中的生物活性成分，可最大限度的保證分離得到成分的生物活性，使其營養(yǎng)價值和醫(yī)藥價值不受影響。2、膜過濾工藝操作簡單，重現(xiàn)性高，不僅可以保證各個批次之間的工藝穩(wěn)定性，更具有價格低廉等優(yōu)勢。3、采用本分離工藝可以使350 3500Da的多肽組分中寡肽含量占到金醋中的寡肽含量的50%左右，分離效率較高。4、本分離工藝所得的三種金醋多肽提取物，均可作為新的功能性產(chǎn)品開發(fā)的原料，為金醋的深層次加工提供了良好的借鑒效果，開拓了進(jìn)醋的品牌影響。
具體實施例方式以下通過具體實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實施例。在本發(fā)明的范圍內(nèi)或者在不脫離本發(fā)明的內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)，對本發(fā)明所述的金醋多肽提取物、制備方法和用途僅僅進(jìn)行名稱上的變更、替換，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實施例1 一種從金醋中分離獲得金醋多肽提取物的方法第一步，將待分離金醋原液中的乙酸濃度調(diào)節(jié)至3% 5%之間，用微孔濾膜過濾去除金醋中殘留不溶物，得濾液一；第二步，用截流分子量為350Da的超濾膜超濾濾液一，將分子量大于350Da的組分截留得濾液二，收集分子量小于350Da的組分得濾液三；超濾的條件為(1)超濾的進(jìn)液口壓力為1. 5MPa,出液口壓力為1. 2MPa，超濾初期采用較低壓力， 然后慢慢升壓；在超濾過程中，采用周期性壓力波動，壓力波動差為0. 1-0. 15MPa ；(2)料液流速為1. 5 3. 5m/s，超濾過程中，采用周期性流量波動以便在膜通道內(nèi)產(chǎn)生脈動或不穩(wěn)定流，流速波動差為1. 5 2. Om/s ；(3)在超濾系統(tǒng)中間歇通入高壓惰性氣體，如氮氣或氬氣，形成氣液脈沖流，周期為2小時通氣一次，每次1分鐘；(4)料液溫度為45攝氏度；(5)料液 pH 值為 2. 5 ；(6)當(dāng)料液原液被濃縮1/15-1/10時，再加入水或稀醇溶液超濾1次，稀醇溶液為 0. 5%的乙醇。(7)反沖洗條件反沖洗壓力為1. 5-2. OMPa,反沖洗周期為1小時，反沖洗時間為 %iin，當(dāng)將超濾組件并聯(lián)使用交替反沖的方法時，其中一套或幾套進(jìn)行正常的超濾并分流出一部分濾液來反沖另一套或幾套組件的超濾膜，間隔一段時間后交換進(jìn)行，一般是工作 10分鐘，反沖2分鐘；(8)化學(xué)清洗周期為1個月，化學(xué)清洗藥劑稀堿，稀堿為0. 4%的氫氧化鈉溶液，清洗工作壓力0. 05-1. OMPa，在化學(xué)清洗劑清洗后，再用水沖洗至近中性。第三步，用截流分子量為3500Da的超濾膜超濾濾液二，將分子量大于3500Da的成分截留得到濾液四，收集分子量在350Da 3500Da的組分得濾液五；超濾的條件為(1)超濾的進(jìn)液口壓力為0. 8MPa,出液口壓力為0. 5MPa，超濾初期采用較低壓力， 然后慢慢升壓，在超濾過程中，采用周期性壓力波動，壓力波動差為0. 15-0. 20MPa ；(2)料液流速為2. 0 3. Om/s，超濾過程中，采用周期性流量波動以便在膜通道內(nèi)產(chǎn)生脈動或不穩(wěn)定流，流速波動差為1. 0 1. 5m/s ；(3)在超濾系統(tǒng)中間歇通入高壓惰性氣體，如氮氣或氬氣，形成氣液脈沖流，周期為2小時通氣一次，每次5分鐘；(4)料液溫度為45攝氏度；(5)料液 pH 值為 4. 5 ；(6)當(dāng)料液原液被濃縮1/15-1/10時，再加入水或稀醇溶液超濾2次；(7)反沖洗條件反沖洗壓力為1. 5-3. 5MPa,反沖洗周期為2小時，反沖洗時間為 2-lOmin，當(dāng)將超濾組件并聯(lián)使用交替反沖的方法時，其中一套或幾套進(jìn)行正常的超濾并分流出一部分濾液來反沖另一套或幾套組件的超濾膜，間隔一段時間后交換進(jìn)行，一般是工作25分鐘，反沖3分鐘。
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(8)化學(xué)清洗周期為2個月，化學(xué)清洗藥劑一般為稀酸、稀堿或表面活性劑，清洗工作壓力0. 05-1. OMPa，在化學(xué)清洗劑清洗后，再用水沖洗至近中性。第四步，濾液三、濾液四和濾液五分別通過濃縮而得到金醋多肽提取物A、金醋多肽提取物B和金醋多肽提取物C。經(jīng)過檢測金醋多肽提取物C中含有金醋多肽45. 00%，總酸17. 78%，全糖(以葡萄糖計)36. 22%，銨鹽1.00%。實施例2 —種從金醋中分離獲得金醋多肽提取物的方法第一步，將待分離金醋原液中的乙酸濃度調(diào)節(jié)至3% 5%之間，用微孔濾膜過濾去除金醋中殘留不溶物，得濾液一；第二步，用截流分子量為350Da的超濾膜超濾濾液一，將分子量大于350Da的組分截留得濾液二，收集分子量小于350Da的組分得濾液三；超濾的條件為(1)超濾的進(jìn)液口壓力為1.5MPa，出液口壓力為1. 2MPa，超濾初期采用較低壓力， 然后慢慢升壓；在超濾過程中，采用周期性壓力波動，壓力波動差為0. 1-0. 2MPa ；(2)料液流速為1. 5 4. Om/s，超濾過程中，采用周期性流量波動以便在膜通道內(nèi)產(chǎn)生脈動或不穩(wěn)定流，流速波動差為1. 0 2. 5m/s ；(3)在超濾系統(tǒng)中間歇通入高壓惰性氣體，如氮氣或氬氣，形成氣液脈沖流，周期為1-2小時通氣一次，每次1分鐘；(4)料液溫度為45攝氏度；(5)料液 pH 值為 2.5 ；(6)當(dāng)料液原液被濃縮1/15-1/10時，再加入水或稀醇溶液超濾1_2次。(7)反沖洗條件反沖洗壓力為1. 5-2. OMPa，反沖洗周期為1_2小時，反沖洗時間為4-lOmin，當(dāng)將超濾組件并聯(lián)使用交替反沖的方法時，其中一套或幾套進(jìn)行正常的超濾并分流出一部分濾液來反沖另一套或幾套組件的超濾膜，間隔一段時間后交換進(jìn)行，一般是工作10-20分鐘，反沖2-5分鐘；(8)化學(xué)清洗周期為1-2個月，化學(xué)清洗藥劑一般為稀酸、稀堿或表面活性劑，清洗工作壓力0. 05-1. OMPa，在化學(xué)清洗劑清洗后，再用水沖洗至近中性。第三步，用截流分子量為3500Da的超濾膜超濾濾液二，將分子量大于3500Da的成分截留得到濾液四，收集分子量在350Da 3500Da的組分得濾液五；超濾的條件為(1)超濾的進(jìn)液口壓力為0. 8MPa,出液口壓力為0. 5MPa，超濾初期采用較低壓力， 然后慢慢升壓，在超濾過程中，采用周期性壓力波動，壓力波動差為0. 15-0. 25MPa ；(2)料液流速為1. 0 3. Om/s，超濾過程中，采用周期性流量波動以便在膜通道內(nèi)產(chǎn)生脈動或不穩(wěn)定流，流速波動差為1. 0 1. 5m/s ；(3)在超濾系統(tǒng)中間歇通入高壓惰性氣體，如氮氣或氬氣，形成氣液脈沖流，周期為1-2小時通氣一次，每次5分鐘；(4)料液溫度為45攝氏度；(5)料液 pH 值為 4. 5;(6)當(dāng)料液原液被濃縮1/15-1/10時，再加入水或稀醇溶液超濾1_2次；
(7)反沖洗條件反沖洗壓力為1. 5-3. 5MPa，反沖洗周期為1_2小時，反沖洗時間為2-lOmin，當(dāng)將超濾組件并聯(lián)使用交替反沖的方法時，其中一套或幾套進(jìn)行正常的超濾并分流出一部分濾液來反沖另一套或幾套組件的超濾膜，間隔一段時間后交換進(jìn)行，一般是工作10-25分鐘，反沖1-3分鐘。(8)化學(xué)清洗周期為1-2個月，化學(xué)清洗藥劑一般為稀酸、稀堿或表面活性劑，清洗工作壓力0. 05-1. 2MPa，在化學(xué)清洗劑清洗后，再用水沖洗至近中性。第四步，濾液三、濾液四和濾液五分別通過濃縮而得到金醋多肽提取物A、金醋多肽提取物B和金醋多肽提取物C。經(jīng)過檢測金醋多肽提取物C中含有金醋多肽50. 30%，總酸15. 78%，全糖(以葡萄糖計)33. 22 %，銨鹽0. 70 %。實施例3: 口服液的制備
金醋多肽提取物C
乙醇蔗糖
苯甲酸鈉尼泊金甲酯香精
50mg IOml 60g 1.2g 2. 5g 0. 5g
加水至1000ml 制備工藝處方量的穩(wěn)定劑置于適宜的容器中，加入實施例2制備的金醋多肽提取物C (即含有分子量在350-3500Da之間的多肽分子的組分，下同)，水浴加熱使其溶解，再將處方量添加劑用少量水溶解后，加入到上述的含藥混合溶液中，加水至全量，攪拌均勻， 過濾，分裝滅菌即得。
實施例4 口服液制備
金醋多肽提取物C
聚乙:
-300
蔗糖
尼泊金乙酯
制備工藝同實施例1。 實施例5 口服液制備
25mg 200ml 70g 1.5g 加水至1000ml金醋多肽提取物C200mg
聚乙二醇-300300ml
阿斯巴甜IOg
加水至IOOOml制備工藝同實施例1。實施例6 金醋多肽提取物C注射劑金醋多肽提取物C IOOg右旋糖苷2050g加注射用水至 IOOOml第一，除熱原注射用水中加入注射劑用活性炭，在60-200°C加熱30分鐘，用濾膜過濾，收集濾
液，備用。第二，配制藥液稱取實施例2制備的金醋多肽提取物C，加乳酸適量溶解，加上述注射用水，濃度為0. 2g/ml。然后，加入經(jīng)過規(guī)定量的預(yù)先經(jīng)過除菌除熱原處理的藥物可接受的載體混勻， 再加注射用水至規(guī)定體積。第三，除菌將上述濾液按無菌操作法用除菌濾器進(jìn)行正壓除菌濾過，用0. 22μΜ微孔濾膜過濾，濾液進(jìn)行熱原檢查和半成品含量檢查然后分裝。第四，罐裝管制西林瓶的處理選用截留分子量為1萬至20萬的超濾膜(平均孔徑為2nm到 0. 1 μ m)，除去相對分子質(zhì)量為幾萬至幾百萬的熱原，則應(yīng)再使用熱原吸附劑除去小分子質(zhì)量的熱原，包括相對分子量約2000的類脂A。罐裝在100級潔凈區(qū)進(jìn)行灌裝，加塞。第五，注射液的滅菌；濕熱滅菌，壓力125MPa，滅菌20min第六，質(zhì)檢澄明度檢查、熱原檢測(參見2010版藥典，鱟試劑檢測)、無菌檢測 (參見2010版藥典，主要為將注射劑加入培養(yǎng)基中無菌條件下培養(yǎng)14天，不得見到有細(xì)菌出現(xiàn))。實施例7 金醋多肽提取物C注射劑金醋多肽提取物C 50g乳糖50g加注射用水至IOOOml除輔料與實施例6不同外，其他同實施例6。實施例8金醋多肽提取物B的咀嚼片金醋多肽提取物B5g
微晶纖維素30g
甘露醇60g
氧化鐵紅1. 5
4%PVPK3。乙醇溶液40g 硬脂酸鋅 Ig制備工藝取實施例2制備的金醋多肽提取物B作為原料，將金醋多肽提取物B、 氧化鐵紅先過120目篩，微晶纖維素、甘露醇過100目篩，然后將氧化鐵紅與金醋多肽提取物B按等量遞加法混合均勻，混合后過100目篩2次，然后將上述的混合粉再與甘露醇按等量遞加法混合均勻，每次混合后過80目篩，然后將所有內(nèi)加的原輔料加入4% PVPK30乙醇溶液制粒，干燥后加入處方量的硬脂酸鋅混合均勻，壓片即得。實施例7金醋多肽提取物B咀嚼片的制備
金醋多肽提取物B5g
微晶纖維素30g
甘露醇60g
氧化鐵紅1. 5
4%PVPK3。乙醇溶液40g
硬脂酸鋅Ig制備工藝取實施例2制備的金醋多肽提取物B作為原料，將金醋多肽提取物B、 氧化鐵紅先過120目篩，微晶纖維素、甘露醇過100目篩，然后將氧化鐵紅與金醋多肽提取物B按等量遞加法混合均勻，混合后過100目篩2次，然后將上述的混合粉再與甘露醇按等量遞加法混合均勻，每次混合后過80目篩，然后將所有內(nèi)加的原輔料加入4% PVPK30乙醇溶液制粒，干燥后加入處方量的硬脂酸鋅混合均勻，壓片即得。實施例8金醋多肽提取物C對STZ糖尿病小鼠糖化血紅蛋白的影響1、實驗?zāi)康谋狙芯客ㄟ^觀察金醋多肽提取物C對鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠糖化血紅蛋白的影響，以探討金醋多肽提取物C對糖尿病的療效。2、動物模型的建立選用SD大鼠90只，雄性，體重Q50 士 20)g，由中山大學(xué)動物實驗中心提供。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，禁食12h，按照65mg/kg腹腔內(nèi)一次性注射鏈脲佐菌素(STZ)。STZ 臨用前用枸櫞酸鈉緩沖液(0. lmol/L, PH4. 5)配制成2%的STZ注射劑，IOmin內(nèi)用完。全部大鼠在同一動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飲食。連續(xù)喂養(yǎng)2周，測血糖和糖化血紅蛋白，其中糖尿病大鼠(DM大鼠)的選擇標(biāo)準(zhǔn)需同時滿足如下三個條件大鼠血糖高于16.7mmol/L。3、分組與給藥成模DM大鼠隨機分成一個模型組和6個給藥組，另外增設(shè)1個正常組，正常組選用SD大鼠，每組10只，各組均采取灌胃給藥方式。具體分組及給藥如下正常對照組灌胃同體積的純化水；模型對照組灌胃同體積的羧甲基纖維素鈉；吡格列酮組灌胃ang/(kg. d)吡格列酮金醋多肽提取物C低劑量組灌胃200mg/(kg.d)實施例2制備的金醋多肽提取物 C；金醋多肽提取物C中劑量組灌胃400mg/(kg.d)實施例2制備的金醋多肽提取物 C；金醋多肽提取物C高劑量組灌胃400mg/(kg.d)實施例2制備的金醋多肽提取物 C04、實驗方法與指標(biāo)檢測DM大鼠模型成功后，繼續(xù)喂養(yǎng)12周，期間按照上述給藥方案進(jìn)行給藥，并進(jìn)行嚴(yán)密觀察。末次給藥后，大鼠取血，邁瑞全自動生化分析儀檢測血糖；使用日本TOSOH公司 HLC-723G7糖化血紅紅蛋白分析儀檢測糖化血紅蛋白。收集數(shù)據(jù)，用SPSS12. 0軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異性顯著比較用t檢驗。血糖水平是衡量糖尿病的指標(biāo)，血糖濃度越大表示糖尿病的病情越嚴(yán)重；糖化血紅蛋白水平與糖尿病的惡化程度正相關(guān)。5.實驗結(jié)果5. 1金醋多肽提取物C對DM大鼠血糖的影響實驗結(jié)果表明(具體參見表1)與模型組比較，各治療組在降低血糖方面具有極顯著性性差異。這表明本發(fā)明提取分離的金醋多肽提取物C具有降低血糖的功效。表1金醋多肽提取物C對DM大鼠血糖的影響
權(quán)利要求
1.一種從金醋中分離金醋多肽提取物的方法，其特征在于它包括如下步驟第一步，將待分離金醋原液中的乙酸濃度調(diào)節(jié)至3% 5%之間，用微孔濾膜過濾去除金醋中殘留不溶物，得濾液一；第二步，用截流分子量為350Da的超濾膜超濾濾液一，將分子量大于350Da的組分截留得濾液二，收集分子量小于350Da的組分得濾液三；第三步，用截流分子量為3500Da的超濾膜超濾濾液二，將分子量大于3500Da的成分截留得到濾液四，收集分子量在350Da 3500Da的組分得濾液五；第四步，濾液三、濾液四和濾液五分別通過濃縮而得到金醋多肽提取物A、金醋多肽提取物B和金醋多肽提取物C。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二步中的超濾的條件為(1)超濾的進(jìn)液口壓力為1.0-2. 5MPa,出液口壓力為1. 0-2. OMPa，超濾初期采用較低壓力，然后慢慢升壓；在超濾過程中，采用周期性壓力波動，壓力波動差為0. 1-0. 2MPa ；(2)料液流速為1.5-4. Om/s，超濾過程中，采用周期性流量波動，流速波動差為 1. 0-2. 5m/s ；(3)在超濾系統(tǒng)中間歇通入高壓惰性氣體，形成氣液脈沖流，周期為1-2小時通氣一次，每次1分鐘；(4)料液溫度為40-55攝氏度；(5)料液pH 值為 2. 0-3. 5 ；(6)當(dāng)料液原液被濃縮1/15-1/10時，再加入水或稀醇溶液超濾1-2次；(7)反沖洗條件反沖洗壓力為1.5-2.OMPa，反沖洗周期為1_2小時，反沖洗時間為 4-lOmin，當(dāng)將超濾組件并聯(lián)使用交替反沖的方法時，其中一套或幾套進(jìn)行正常的超濾并分流出一部分濾液來反沖另外一套或幾套組件的超濾膜，間隔一段時間后交換進(jìn)行，一般是工作10-20分鐘，反沖2-5分鐘；(8)化學(xué)清洗周期為1-2個月，化學(xué)清洗藥劑一般為稀酸、稀堿或表面活性劑，清洗工作壓力0. 05-1. OMPa，在化學(xué)清洗劑清洗后，再用水沖洗至近中性。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第三步中的超濾的條件為(1)超濾的進(jìn)液口壓力為0.5-2. OMPa,出液口壓力為0. 2-1. 5MPa，超濾初期采用較低壓力，然后慢慢升壓，在超濾過程中，采用周期性壓力波動，壓力波動差為0. 15-0. 25MPa ；(2)料液流速為1.0-3.Om/s，超濾過程中，采用周期性流量波動，流速波動差為 1. 0-1. 5m/s ；(3)在超濾系統(tǒng)中間歇通入高壓惰性氣體，形成氣液脈沖流，周期為1-2小時通氣一次，每次5分鐘；(4)料液溫度為35-55攝氏度；(5)料液pH 值為 3. 5-6. 0 ；(6)當(dāng)料液原液被濃縮1/15-1/10時，再加入水或稀醇溶液超濾1-2次；(7)反沖洗條件反沖洗壓力為1.5-3.5MPa，反沖洗周期為1_2小時，反沖洗時間為 2-lOmin，當(dāng)將超濾組件并聯(lián)使用交替反沖的方法時，其中一套或幾套進(jìn)行正常的超濾并分流出一部分濾液來反沖另外一套或幾套組件的超濾膜，間隔一段時間后交換進(jìn)行，一般是工作10-25分鐘，反沖1-3分鐘。(8)化學(xué)清洗周期為1-2個月，化學(xué)清洗藥劑一般為稀酸、稀堿或表面活性劑，清洗工作壓力0. 05-1. 2MPa，在化學(xué)清洗劑清洗后，再用水沖洗至近中性。
4.一種食品添加劑，它包括如權(quán)利要求1所述的金醋多肽提取物A。
5.一種咀嚼片，它包含如權(quán)利要求1所述的金醋多肽提取物B。
6.如權(quán)利要求5所述的咀嚼片，其特征在于它還含有微粉硅膠和微晶纖維素。
7.如權(quán)利要求6所述的咀嚼片，其特征在于，金醋多肽提取物B微粉硅膠微晶纖維 =10 1 2。
8.一種口服液，它包含如權(quán)利要求1所述的金醋多肽提取物C。
9.如權(quán)利要求7所述的口服液，其特征在于，它含有防腐劑，還含有丙二醇、甘油、乙醇、聚乙二醇-300和聚乙二醇-400中的一種或其兩種。
10.一種注射液，它包含如權(quán)利要求1所述的金醋多肽提取物C。
11.如權(quán)利要求1、8或9所述的金醋多肽提取物C在制備治療糖尿病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從金醋中分離獲得金醋多肽提取物的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中金醋應(yīng)用過程中的限制，開發(fā)適用于不同人群的金醋產(chǎn)品，以及更好發(fā)揮金醋的保健功效，本發(fā)明提供了一種從金醋中分離不同金醋多肽提取物的方法，具體涉及使用特定超濾膜處理的工藝將金醋中的多肽提取物按照350Da以下，350-3500Da之間和大于3500Da分為三種不同的金醋多肽提取物。該方法操作簡便、成本低廉，分離得到的金醋多肽提取物可以進(jìn)一步加工成食品、保健品或藥品。
文檔編號A61P3/10GK102276687SQ20111017977
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者王建忠 申請人:王建忠