專利名稱：鴨傳染性漿膜炎二價滅活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防由1、2型鴨疫里默氏桿菌引起的鴨傳染性漿膜炎的油 乳劑疫苗制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA))引起鴨 的一種呼吸系統(tǒng)重要傳染病。鴨傳染性漿膜炎anfectious serositis)是由鴨疫里默氏 桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的鴨的一種慢性或急性敗血性接觸性傳染性疾 病，又稱鴨疫里默氏桿菌病、新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥。主要侵害雛鴨、雛鵝、以及雛火 雞等多種雛禽，以2 7周齡鴨最易感，主要表現(xiàn)為漿膜炎、纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊 炎、腦膜炎等。由于本病的高死亡率和高淘汰率目前已經(jīng)成為嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)的疾病之一。對鴨疫里默氏桿菌的血清型分類始于1969年，Harry采用試管凝集試驗鑒定出16 個血清型(A P)，幾年后美國國立動物疾病中心采用沉淀試驗鑒定出7個血清型，以阿拉 伯?dāng)?shù)字命名為1 7型，考慮到命名的標準化以及將來新型的增加，1982年Bisgarrd建議 用阿拉伯?dāng)?shù)字對血清型進行命名，將已有的血清型命名為1 13型。在此基礎(chǔ)上Sandhu 和Leister對血清型重新進行整理，加上新發(fā)現(xiàn)的血清型取名為1 17型，加上后來Lon 等報道的18、19型和I^athansophon等報道的20、21型，至此世界上報道的RA血清型共有 21型。2003年我國四川農(nóng)業(yè)大學(xué)程安春教授等報道了 22 25四個新的血清型，進一步豐 富了該病的病原學(xué)的研究。由于各型毒力有所差異，型間交叉保護性極差或缺少，因此對某 地區(qū)本病的預(yù)防，最好方法是制備與當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)型疫苗，才能獲得最佳的免疫效果。(1、程安 春，等.我國鴨疫里默氏桿菌血清型調(diào)查及新血清型的發(fā)現(xiàn)[J].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué) 分會第十一次學(xué)術(shù)研討會論文集，2004，453-457.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用免疫原性良好的鴨疫里默氏桿菌1型YBYN株、2型TOSD株分 別接種于適宜培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)甲醛溶液滅活后，加入油佐劑混合乳化制成。用于預(yù) 防由1型和2型鴨疫里默氏桿菌引起的鴨傳染性漿膜炎。一、生產(chǎn)用菌株1.菌株來源制造和檢驗用鴨疫里默氏桿菌1型YBYN株、2型TOSD株由本發(fā)明人分離、鑒定、保 存和供應(yīng)，該兩株已于2011年2月25日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué) 院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號YBSD株 為 CGMCC No. 4614，YBYN 株為 CGMCC No. 4615。2.毒株特點(1)形態(tài)本菌為革蘭氏陰性(G-)小桿菌，有莢膜、無芽孢、無鞭毛，常單個存在， 少數(shù)呈雙排列，偶見呈長絲狀排列，涂片經(jīng)瑞氏染色，可見部分菌體兩端濃染。
(2)生化特性過氧化氫酶、氧化酶、精氨酸脫羧酶試驗為陽性，能緩慢液化明膠， 靛基質(zhì)、VP、甲基紅、檸檬酸利用、硝酸鹽還原試驗為陰性，不產(chǎn)生硫化氫，不發(fā)酵葡萄糖、蔗 糖、乳糖、麥芽糖。(3)培養(yǎng)特性本菌在普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上不生長。初次分離培養(yǎng)， 需要供給5% 10%的C02。將本菌接種于巧克力瓊脂、含3%小牛血清的胰蛋白胨大豆瓊 脂(改良TSA配方見附注2)，置5% 10% C02、37°C培養(yǎng)M 48小時，可生長出圓形微 隆起、表面光滑、直徑1 2mm無色素菌落。在5%綿羊鮮血瓊脂平板上生長但不溶血。在 含有3%小牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)M小時，呈上下一致輕微渾濁， 管底有少量沉淀，無菌膜。(4)血清型YBYN株為鴨疫里默氏桿菌1型JBSD株為鴨疫里默氏桿菌2型。(5)最小致病菌量能使10只1月齡健康易感鴨至少7只發(fā)病的最小致病菌量分 別為YBYN 株為 1 X IO9CFU, YBSD 株為 2X l(fCFU。(6)免疫原性用鴨疫里默氏桿菌YBYN JBSD株滅活菌液按水相油相=1 2的 比例分別制備單價油乳劑滅活疫苗(滅活前各型活菌含量約為lX109CFU/ml)，分別頸部皮 下注射3-7日齡健康易感鴨10只，0.3ml/只，另設(shè)兩個非免疫對照組，每組各10只。免疫 后14日，連同相同飼養(yǎng)條件下的對照鴨各一組，分別用相應(yīng)的YBYN株JBSD株新鮮菌液腿 部肌肉注射攻毒Iml (TOYN株活菌含量約為2X 109CFU/ml，TOSD株活菌含量約為4X IO8CFU/ ml)，觀察10日，每株菌攻毒后對照組應(yīng)至少8只發(fā)病(發(fā)病判定標準詳見附注1)，免疫組 應(yīng)至少8只保護。二、鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗的生產(chǎn)方法，主要是1.采用發(fā)酵罐分別培養(yǎng)YBYN菌株JBSD菌株。先將半合成肉湯培養(yǎng)基(胰蛋白胨 大豆肉湯粉5g、氯化鈉5g、牛肉浸膏5g、水解乳蛋白5g、7水硫酸鎂0. 5g、瓊脂粉12g、溶于 IOOOml無離子水中，加熱溶化后調(diào)pH至7. 0 7. 2，121°C高壓20min后，待冷卻至55°C左 右，按無菌要求加入經(jīng)抽濾無菌的維生素&lml。對發(fā)酵罐進行滅菌，待溫度降至37 38°C時，將2 8°C保存的二級種子液分別按2% 2. 5%加入到發(fā)酵罐內(nèi)。培養(yǎng)溫度控制 在37 38°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100 200r/min，pH為7. 2，罐壓為0. 03 0. 05Pa，容氧量為 40%，培養(yǎng)9 10小時收獲，留樣檢驗，置2 8°C保存，不超過5日。2.根據(jù)活菌計數(shù)結(jié)果，將滅活的鴨疫里默氏桿菌1、2型菌液均稀釋成約 6X109CFU/ml后等量混合。3.按常規(guī)方法制備成油乳劑滅活疫苗。本發(fā)明的詳細描述一、疫苗制備1.生產(chǎn)用種子制備(1) 一級種子繁殖與鑒定將YBYN株、YBSD株的凍干菌種分別接種于巧克力瓊脂 平板上，置5 % 10 % CO2、37 °C培養(yǎng)20小時，選典型菌落接種于含3 %小牛血清的TSA瓊脂 斜面，37°C培養(yǎng)M小時，然后接種于TSA肉湯，37°C振蕩培養(yǎng)M小時，按15%加入滅菌甘油 混勻，定量分裝，注明菌株名稱、裝量、分裝日期，經(jīng)純粹檢驗合格后，作為一級種子，"200C 保存，保存期不超過3個月。(2) 二級種子繁殖將一級種子劃線接種到3%小牛血清的TSA瓊脂平板，37°C培養(yǎng)M小時，挑選典型菌落(或菌苔)接種于TSA肉湯，37°C振蕩培養(yǎng)M小時，經(jīng)純粹檢驗 后，作為二級種子。在2 8°C保存，應(yīng)不超過48小時。2.菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵罐分別培養(yǎng)YBYN菌株JBSD菌株。先將半合成肉湯培養(yǎng)基 進行滅菌，待溫度降至37 38°C時，將2 8°C保存的二級種子液分別按2% 2. 5%加入 到發(fā)酵罐內(nèi)。培養(yǎng)溫度控制在37 38°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100 200r/min，pH為7. 2，罐壓為 0. 03 0. 05Pa,容氧量為40%，培養(yǎng)9 10小時收獲，留樣檢驗，置2 8°C保存，不超過5曰。3.活菌計數(shù)取培養(yǎng)9 IOh的菌液1ml，按(中國獸藥典委員會.中華人民共和 國獸藥典二〇〇五年版(三部).中國農(nóng)業(yè)出版社，2006，本發(fā)明簡稱《中國獸藥典》)附錄 方法進行活菌計數(shù)，各型活菌含量均應(yīng)不低于6 X 109CFU/ml。4.滅活將檢驗合格的菌液導(dǎo)入滅活罐中，按菌液體積的0.3%加入甲醛溶液， 37°C攪拌滅活20小時，置2 8°C保存，不超過7日。5.疫苗制備(1)水相配制取滅菌的吐溫-804份、無菌檢驗合格的菌液96份，導(dǎo)入配液罐中， 開啟攪拌電機，勻速攪拌至吐溫-80完全溶解。(2)油相制備取注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸鋁1份加入油相制備罐 中，開啟攪拌電機，勻速攪拌，同時開啟導(dǎo)熱油開關(guān)，125°C加熱30min，冷卻后，導(dǎo)入貯油罐 中備用。(3)乳化取油相2份置于乳化罐內(nèi)，開動電機低速攪拌，同時緩緩加入水相1份， 再以4000r/min乳化30min。乳化后，取樣IOml,以3000r/min離心15min，應(yīng)不分層；若有 分層現(xiàn)象，應(yīng)重新乳化1次。(4)分裝定量分裝，加蓋密封。二、疫苗的安全試驗1.鴨傳染性漿膜炎二價滅活疫苗對靶動物的一次單劑量接種的安全性試驗用本 發(fā)明人按本法試制的200801、200802、200803三批鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗對3 7 日齡健康易感鴨(購自青島平度)進行一次單劑量接種安全性試驗，0. :3ml/只，觀察14日， 記錄疫苗接種對試驗鴨的安全性。試驗結(jié)果表明，本實驗室試制的200801、200802、200803 批疫苗接種后，試驗鴨的精神、飲食與對照鴨無明顯差異，接種后14日疫苗吸收良好。說明 我們試制的疫苗一次單劑量接種3 7日齡健康易感鴨是安全的(詳見表1)。表1試驗鴨一次單劑量接種安全性試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鴨傳染性漿膜炎二價滅活疫苗，其特征是該疫苗含有經(jīng)甲醛溶液滅活的鴨疫里 默氏桿菌1型YBSD株菌、2型YBYN株菌及常規(guī)的礦物油佐劑，該兩株已于2011年2月25日 送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心保藏，保藏編號YBSD株為CGMCC No. 4614，TOYN株為CGMCCNo. 4615。
2.一種鴨傳染性漿膜炎二價滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于(1)采用機械攪拌發(fā)酵罐分別培養(yǎng)1、2型鴨疫里默氏桿菌菌液采用發(fā)酵罐分別培養(yǎng) YBYN菌株JBSD菌株。先將半合成肉湯培養(yǎng)基進行滅菌，待溫度降至37 38°C時，將2 8°C保存的二級種子液分別按2% 2. 5%加入到發(fā)酵罐內(nèi)。培養(yǎng)溫度控制在37 38°C，攪 拌轉(zhuǎn)速為100 200r/min，pH為7. 2，罐壓為0. 03 0. 05Pa，溶氧量為40%，培養(yǎng)9 10 小時收獲，留樣檢驗，置2 8°C保存，不超過5日；(2)根據(jù)活菌計數(shù)結(jié)果，將滅活的1、2型鴨疫里默氏桿菌菌液均稀釋成約6XIO9CFU/ ml后等量混合；(3)按常規(guī)方法制備成礦物油佐劑滅活疫苗。
3.按照權(quán)利要求2所述的一種鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于 其中所使用半合成肉湯培養(yǎng)基是胰蛋白胨大豆肉湯粉5g、氯化鈉5g、牛肉浸膏5g、水解乳 蛋白5g、七水硫酸鎂0. 5g、溶于IOOOml無離子水中，加熱溶化后調(diào)pH至7. 0 7. 2，121°C 高壓20分鐘后，待冷卻至55°C左右，按無菌要求加入經(jīng)抽濾無菌的維生素B1Iml1全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨傳染性漿膜炎二價滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好的鴨疫里默氏桿菌1型YBYN株、2型YBSD株分別接種于適宜培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)甲醛溶液滅活后，加入油佐劑混合乳化制成。用于預(yù)防由1型和2型鴨疫里默氏桿菌引起的鴨傳染性漿膜炎。此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期長等優(yōu)點。
文檔編號A61K39/02GK102125687SQ20111005425
公開日2011年7月20日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者杜元釗, 申洪銀, 程增青, 胡瀟, 范根成, 郭玉廣, 馬爽 申請人:青島易邦生物工程有限公司