專利名稱：一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及本 方法涉及從一種水果中制備黃酮的方法，尤其是涉及一種從軟棗獼 猴桃中制備黃酮的方法。
背景技術(shù)：
軟棗獼猴桃Ucii/^Wia arguta Sieb. et Zucc)又名軟棗子、獼猴梨、藤瓜和藤棗，為 獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)多年生落葉藤本植物，分布于東北、華 北、山東、西北及長江流域，其中東北南部山區(qū)較多見。果實可食用，多汁，酸甜適口，風(fēng)味獨 特。營養(yǎng)價值很高，含大量維生素C、B族維生素、氨基酸、類胡蘿卜素、多糖、黃酮等多種營 養(yǎng)成分。黃酮類化合物是一類植物中分布很廣而且重要的多酚類天然產(chǎn)物，具有廣泛的藥 理活性，如抗氧化作用、抗菌抗病毒作用、消炎作用、提高機體免疫力、抗腫瘤、降血壓、降血 月旨、防治心腦血管疾病和保肝護肝等生理功能。但是，從東北野生軟棗獼猴桃中制備黃酮化 合物還未見報道，這對了解軟棗獼猴桃黃銅組成與結(jié)構(gòu)，以及為今后軟棗獼猴桃綜合開發(fā) 利用帶來了一些問題。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的
本發(fā)明提供了一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其目的在于了解軟棗獼猴桃黃酮組成 與結(jié)構(gòu)，為軟棗獼猴桃綜合開發(fā)利用提供支持。2、技術(shù)方案
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行
a、粗提將軟棗獼猴桃鮮果烘干、粉碎、過50 100目篩，采用體積分?jǐn)?shù)為60 80%乙 醇浸溶，液料比為1:5 10 g/mL，300 500w超聲處理20min，超聲處理，50 60°C水浴提 取，離心取上清液，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液；
b、除雜將步驟a中得到的粗提液減壓濃縮，加入無水乙醇生成沉淀，取上清液，減壓 濃縮后依次用石油醚、正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃 酮提取液；
C、初步分離用HPD-600大孔吸附樹脂對步驟b中的軟棗獼猴桃總黃酮提取液進行初 步分離，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為洗脫劑，收集洗脫液；
d、聚酰胺柱色譜分離純化將步驟c中收集的洗脫液減壓濃縮后進行聚酰胺柱色譜層 析，依次用水、甲醇_水梯度洗脫，甲醇_水的體積比1 :9 4 :6，分段接收，洗脫流分冷凍 干燥成軟棗獼猴桃總黃酮干粉；
e、對步驟d中的軟棗獼猴桃總黃酮干粉進行制備色譜分離，得軟棗獼猴桃各黃酮組分 純品。上述步驟a中于50 60°C水浴提取3h，提取物混合液于3 6°C，9000 11000 r/min離心10 20 min，取上清液，殘渣用體積分?jǐn)?shù)為60 80%的乙醇溶液再次浸溶，水 浴后離心，合并兩次提取液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液。
上述步驟b中除雜按以下步驟進行
(1)生成沉淀除 雜向步驟a中得到的粗提液中加入無水乙醇至乙醇體積百分比濃度 達到80%以上，使大量多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀與黃酮分開，去除沉淀，留上清液備用；
(2)液液萃取除雜將步驟(1)中的上清液減壓濃縮得浸膏，加水混懸后，依次用石油 醚和正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，減壓濃縮，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃酮提取 液。在步驟(2)中依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相無色為止，正丁醇 萃取3次。在步驟c中進行初步分離時，向步驟b中得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液中加入 少量乙醇，至乙醇體積百分比濃度達到25 35%后上樣，先用蒸餾水沖洗至洗脫液無色澄 清，再次去除糖類和蛋白質(zhì)等其它雜質(zhì)，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，收集洗 脫液，減壓濃縮后備用。步驟d中用聚酰胺柱色譜分離純化時，將步驟c中洗脫液減壓濃縮后得到的軟 棗獼猴桃總黃酮提取液緩慢倒入已處理好的聚酰胺填料的柱色譜(120cm*8cm，聚酰胺粉 500g)中，充分吸附30min后按極性由高到低，依次用水、甲醇-水按體積比1 :9 4 :6的 梯度洗脫，各梯度洗脫液均洗脫至無色為止，分段接收，洗脫流分，冷凍干燥得到純度較高 的軟棗獼猴桃總黃酮干粉。步驟d中甲醇-水按體積比為1 :9、2 :8、3 :7和4 :6的梯度洗脫。上述步驟e中進行軟棗獼猴桃黃酮制備色譜分離時，將步驟d中經(jīng)聚酰胺柱色譜 分離得到的軟棗獼猴桃總黃酮干粉用甲醇溶解成25 35g/L的溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過 濾后進樣；制備液相色譜的分離條件流動相甲醇-水體積比為45 :55，流速3. 0 7. OmL/ min，上樣量600yL，柱溫為30°C，檢測波長為340nm，分離時間為50 70min，即得軟棗獼 猴桃各黃酮組分純品。3、優(yōu)點及效果
本發(fā)明為了解決對軟棗獼猴桃黃酮組成與結(jié)構(gòu)的確定，以及對軟棗獼猴桃綜合開發(fā)利 用尋求途徑的問題，從軟棗獼猴桃果實成分方面進行研究，經(jīng)過長期的試驗，研制出這種從 軟棗獼猴桃中制備黃酮的方法，可最大程度保留軟棗獼猴桃黃酮含量，較好地解決了從果 實中制備黃酮的方法問題，從而了解軟棗獼猴桃黃酮組成與結(jié)構(gòu)，為軟棗獼猴桃綜合開發(fā) 利用提供支持。通過實施，可以得到三種黃酮單組分。本發(fā)明的方法具有可操作性強，制備 效果好，所用試劑毒性較小，安全等優(yōu)點。


圖1為本發(fā)明的色譜圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明 一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行 a、粗提將軟棗獼猴桃鮮果烘干、粉碎、過50 100目篩，采用體積分?jǐn)?shù)為60 80%乙 醇浸溶，混合均勻，液料比為1 5 10 g/mL, 300 500w超聲處理20min，50 60°C水浴提 取，離心取上清液，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液。b、除雜將步驟a中得到的粗提液減壓濃縮，加入無水乙醇生成沉淀，取上清液，減壓濃縮后依次用石油醚、正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，得到進一步純化的軟棗獼猴桃 總黃酮提取液。C、初步分離用HPD-600大孔吸附樹脂對步驟b中的軟棗獼猴桃總黃酮提取液進 行初步分離，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為洗脫劑，收集洗脫液。d、聚酰胺柱色譜分離純化將步驟c中收集的洗脫液減壓濃縮后進行聚酰胺柱色 譜層析，依次用水、甲醇-水梯度洗脫，甲醇-水的體積比1 :9 4 :6，分段接收，洗脫流分 冷凍干燥成軟棗獼猴桃總黃酮干粉。e、對步驟d中的軟棗獼猴桃總黃酮干粉進行制備色譜分離，得軟棗獼猴桃各黃酮 組分純品。上述步驟a中于50 60°C水浴提取3h，提取物混合液于3 6°C，9000 11000 r/min離心10 20 min，取上清液，殘渣用體積分?jǐn)?shù)為60 80%的乙醇溶液再次浸溶，水 浴后離心，合并兩次提取液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液。上述步驟b中除雜按以下步驟進行
(1)生成沉淀除雜向步驟a中得到的粗提液中加入無水乙醇至乙醇體積百分比濃度 達到80%以上，此時使大量多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀與黃酮分開，達到除雜目的，去除 沉淀，留上清液備用。(2)液液萃取除雜將步驟(1)中的上清液減壓濃縮得浸膏，加水混懸后，依次用 石油醚和正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，減壓濃縮，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃酮 提取液。在步驟(2)中依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相無色為止，正丁醇 萃取3次。在步驟c中進行初步分離時，向步驟b中得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液中加入 少量乙醇，至乙醇體積百分比濃度達到25 35%后上樣，這樣做有助于黃酮溶解，先用蒸餾 水沖洗至洗脫液無色澄清，再次去除糖類和蛋白質(zhì)等其它雜質(zhì)，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的 乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后備用。步驟d中用聚酰胺柱色譜分離純化時，將步驟c中洗脫液減壓濃縮后得到的軟 棗獼猴桃總黃酮提取液緩慢倒入已處理好的聚酰胺填料的柱色譜(120cm*8cm，聚酰胺粉 500g)中，充分吸附30min后按極性由高到低，依次用水、甲醇-水(1 :9 4 :6，V/V)梯度 洗脫，即先用水洗脫后，再用甲醇-水的體積比依次按照1 :9 4 :6的比例分四次梯度洗 脫，各梯度洗脫液均洗脫至無色為止，分段接收，之所以先用水洗脫，再用甲醇-水洗脫，是 因為這樣比單獨用水洗脫或者單獨用甲醇洗脫得到的黃酮含量大很多；用分析型高效液相 色譜儀檢測，當(dāng)溶劑組成即甲醇與水的體積比依次取為1 :9、2 :8、3 :7、4 6時得到的黃酮 含量大，各比例洗脫液中各個黃酮單組分含量有所不同，說明黃酮有一定的極性，且各個黃 酮單組分極性也各不相同。水-甲醇梯度洗脫液經(jīng)高效液相色譜檢測主要含有7個色譜峰 分離較為理想，適合于制備型液相色譜制備。將甲醇與水的比例為1 :9 4 :6的四份洗脫 液洗脫流分，減壓濃縮后，冷凍干燥得到純度較高的軟棗獼猴桃總黃酮干粉。將步驟d中經(jīng)聚酰胺柱色譜分離得到的軟棗獼猴桃總黃酮干粉用甲醇溶解成 25 35g/L的溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后進樣；制備液相色譜的分離條件流動相甲 醇-水(45 :55，V/V)，流速3.0 7. OmL/min，上樣量600 μ L，柱溫為30°C，檢測波長為340nm，采用上述條件能夠達到良好分離，分離時間為50 70min，即得軟棗獼猴桃各黃酮 組分純品。圖1中所示的色譜圖接收3個流分。 實施例1
一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行 a、粗提將軟棗獼猴桃鮮果烘干、粉碎、過80目篩，加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇浸溶，此 時黃酮溶解度最佳，混合均勻，液料比為1:8 g/mL, 300w超聲處理20min，于55°C水浴提取 3h，提取物混合液于4°C，10000 r/min離心15 min，取上清液，殘渣用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙 醇溶液再次浸溶，水浴后離心，合并兩次提取液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得到軟棗獼猴 桃總黃酮粗提液。b、除雜按以下步驟進行
(1)生成沉淀除雜向步驟a中得到的粗提液中加入無水乙醇至乙醇體積百分比濃度 達到80%以上，此時使大量多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀與黃酮分開，達到除雜目的，去除 沉淀，留上清液備用；
(2)液液萃取除雜將步驟(1)中的上清液減壓濃縮得浸膏，加水混懸后，依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相無色為止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減 壓濃縮，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃酮提取液。C、初步分離用HPD-600大孔吸附樹脂對步驟b中的軟棗獼猴桃總黃酮提取液進 行初步分離，向步驟b中得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇體積百 分比濃度達到30%后上樣，先用蒸餾水沖洗至洗脫液無色澄清，再次去除糖類和蛋白質(zhì)等 其它雜質(zhì)，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后備用。d、聚酰胺柱色譜分離純化將步驟c中收集的洗脫液減壓濃縮后進行聚酰胺柱色 譜層析，將洗脫液減壓濃縮后得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液緩慢倒入已處理好的聚酰胺 填料的柱色譜(120cm*8cm，聚酰胺粉500g)中，充分吸附30min后按極性由高到低，依次用 水、甲醇-水(1 :9、2 :8、3 :7、4 :6，V/V)梯度洗脫，各梯度洗脫液均洗脫至無色為止，分段接 收，將上述四份洗脫液洗脫流分，減壓濃縮后，冷凍干燥得到純度較高的軟棗獼猴桃總黃酮 干粉。e、將步驟d中經(jīng)聚酰胺柱色譜分離得到的軟棗獼猴桃總黃酮干粉用甲醇溶解成 30g/L的溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后進樣；制備液相色譜的分離條件流動相甲醇_水 (45 :55，V/V)，流速5. OmL/min,上樣量600 μ L，柱溫為30°C，檢測波長為340nm，分離時間為 60min,即得軟棗獼猴桃各黃酮組分純品。實施例2
一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行 a、粗提將軟棗獼猴桃鮮果烘干、粉碎、過50目篩，加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇浸溶，混合 均勻，液料比為1 5 g/mL, 500w超聲處理20min，于50°C水浴提取3h，提取物混合液于3°C， 9000 r/min離心10 min，取上清液，殘渣用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后離 心，合并兩次提取液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液。b、除雜按以下步驟進行
(1)生成沉淀除雜向步驟a中得到的粗提液中加入無水乙醇至乙醇體積百分比濃度 達到80%以上，此時使大量多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀與黃酮分開，達到除雜目的，去除沉淀，留上清液備用；
(2)液液萃取除雜將步驟(1)中的上清液減壓濃縮得浸膏，加水混懸后，依次用石油 醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相無色為止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減 壓濃縮，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃酮提取液。C、初步分離用HPD-600大孔吸附樹脂對步驟b中的軟棗獼猴桃總黃酮提取液進 行初步分離，向步驟b中得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇體積百 分比濃度達到25%后上樣，先用蒸餾水沖洗至洗脫液無色澄清，再次去除糖類和蛋白質(zhì)等 其它雜質(zhì)，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后備用。d、聚酰胺柱色譜分離純化將步驟c中收集的洗脫液減壓濃縮后進行聚酰胺柱色 譜層析，將洗脫液減壓濃縮后得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液緩慢倒入已處理好的聚酰胺 填料的柱色譜(120cm*8cm，聚酰胺粉500g)中，充分吸附30min后按極性由高到低，依次用 水、甲醇-水(1 :9、2 :8、3 :7、4 :6，V/V)梯度洗脫，各梯度洗脫液均洗脫至無色為止，分段接 收，將上述四份洗脫液洗脫流分，減壓濃縮后，冷凍干燥得到純度較高的軟棗獼猴桃總黃酮 干粉。e、將步驟d中經(jīng)聚酰胺柱色譜分離得到的軟棗獼猴桃總黃酮干粉用甲醇溶解成 25g/L的溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后進樣；制備液相色譜的分離條件流動相甲醇-水 (45 :55，V/V)，流速7. OmL/min,上樣量600 μ L，柱溫為30°C，檢測波長為340nm，分離時間為 50min,即得軟棗獼猴桃各黃酮組分純品。實施例3
一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行 a、粗提將軟棗獼猴桃鮮果烘干、粉碎、過100目篩，加入體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇浸溶，混 合均勻，液料比為1:10 g/mL，400w超聲處理20min，于60°C水浴提取3h，提取物混合液于 60C，11000 r/min離心20 min,取上清液，殘渣用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液再次浸溶，水 浴后離心，合并兩次提取液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液。b、除雜按以下步驟進行
(1)生成沉淀除雜向步驟a中得到的粗提液中加入無水乙醇至乙醇體積百分比濃度 達到80%以上，此時使大量多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀與黃酮分開，達到除雜目的，去除 沉淀，留上清液備用；
(2)液液萃取除雜將步驟(1)中的上清液減壓濃縮得浸膏，加水混懸后，依次用石油 醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相無色為止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減 壓濃縮，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃酮提取液。C、初步分離用HPD-600大孔吸附樹脂對步驟b中的軟棗獼猴桃總黃酮提取液進 行初步分離，向步驟b中得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇體積百 分比濃度達到35%后上樣，先用蒸餾水沖洗至洗脫液無色澄清，再次去除糖類和蛋白質(zhì)等 其它雜質(zhì)，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后備用。d、聚酰胺柱色譜分離純化將步驟c中收集的洗脫液減壓濃縮后進行聚酰胺柱色 譜層析，將洗脫液減壓濃縮后得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液緩慢倒入已處理好的聚酰胺 填料的柱色譜(120cm*8cm，聚酰胺粉500g)中，充分吸附30min后按極性由高到低，依次用 水、甲醇-水(1 :9、2 :8、3:7、4:6，V/V)梯度洗脫，各梯度洗脫液均洗脫至無色為止，分段接收，將上述四份洗脫液洗脫流分，減壓濃縮后，冷凍干燥得到純度較高的軟棗獼猴桃總黃酮 干粉。e、將步 驟d中經(jīng)聚酰胺柱色譜分離得到的軟棗獼猴桃總黃酮干粉用甲醇溶解成 35g/L的溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后進樣；制備液相色譜的分離條件流動相甲醇-水 (45 :55，V/V)，流速3. OmL/min,上樣量600 μ L，柱溫為30°C，檢測波長為340nm，分離時間為 70min,即得軟棗獼猴桃各黃酮組分純品。實施例4
一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行 a、粗提將軟棗獼猴桃鮮果烘干、粉碎、過60目篩，加入體積分?jǐn)?shù)為65%乙醇浸溶，混合 均勻，液料比為1 6 g/mL, 350w超聲處理20min，于52°C水浴提取3h，提取物混合液于5°C， 9500 r/min離心12min，取上清液，殘渣用體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后離 心，合并兩次提取液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液。b、除雜按以下步驟進行
(1)生成沉淀除雜向步驟a中得到的粗提液中加入無水乙醇至乙醇體積百分比濃度 達到80%以上，此時使大量多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀與黃酮分開，達到除雜目的，去除 沉淀，留上清液備用；
(2)液液萃取除雜將步驟(1)中的上清液減壓濃縮得浸膏，加水混懸后，依次用石油 醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相無色為止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減 壓濃縮，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃酮提取液。C、初步分離用HPD-600大孔吸附樹脂對步驟b中的軟棗獼猴桃總黃酮提取液進 行初步分離，向步驟b中得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇體積百 分比濃度達到28%后上樣，先用蒸餾水沖洗至洗脫液無色澄清，再次去除糖類和蛋白質(zhì)等 其它雜質(zhì)，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后備用。d、聚酰胺柱色譜分離純化將步驟c中收集的洗脫液減壓濃縮后進行聚酰胺柱色 譜層析，將洗脫液減壓濃縮后得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液緩慢倒入已處理好的聚酰胺 填料的柱色譜(120cm*8cm，聚酰胺粉500g)中，充分吸附30min后按極性由高到低，依次用 水、甲醇-水(1 :9、2 :8、3:7、4:6，V/V)梯度洗脫，各梯度洗脫液均洗脫至無色為止，分段接 收，將上述四份洗脫液洗脫流分，減壓濃縮后，冷凍干燥得到純度較高的軟棗獼猴桃總黃酮 干粉。e、將步驟d中經(jīng)聚酰胺柱色譜分離得到的軟棗獼猴桃總黃酮干粉用甲醇溶解成 27g/L的溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后進樣；制備液相色譜的分離條件流動相甲醇-水 (45 :55，V/V)，流速6. OmL/min，上樣量600yL，柱溫為30°C，檢測波長為340nm，分離時間為 55min,即得軟棗獼猴桃各黃酮組分純品。實施例5
一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行 a、粗提將軟棗獼猴桃鮮果烘干、粉碎、過70目篩，加入體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸溶，混合 均勻，液料比為1 7 g/mL, 450w超聲處理20min，于58°C水浴提取3h，提取物混合液于3°C， 10500 r/min離心19 min，取上清液，殘渣用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后 離心，合并兩次提取液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液。
b、除雜按以下步驟進行
(1)生成沉淀除雜向步驟a中得到的粗提液中加入無水乙醇至乙醇體積百分比濃度達到80%以上，此時使大量多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀與黃酮分開，達到除雜目的，去除 沉淀，留上清液備用；
(2)液液萃取除雜將步驟(1)中的上清液減壓濃縮得浸膏，加水混懸后，依次用石油 醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相無色為止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減 壓濃縮，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃酮提取液。C、初步分離用HPD-600大孔吸附樹脂對步驟b中的軟棗獼猴桃總黃酮提取液進 行初步分離，向步驟b中得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇體積百 分比濃度達到32%后上樣，先用蒸餾水沖洗至洗脫液無色澄清，再次去除糖類和蛋白質(zhì)等 其它雜質(zhì)，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后備用。d、聚酰胺柱色譜分離純化將步驟c中收集的洗脫液減壓濃縮后進行聚酰胺柱色 譜層析，將洗脫液減壓濃縮后得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液緩慢倒入已處理好的聚酰胺 填料的柱色譜(120cm*8cm，聚酰胺粉500g)中，充分吸附30min后按極性由高到低，依次用 水、甲醇-水(1 :9、2 :8、3:7、4:6，V/V)梯度洗脫，各梯度洗脫液均洗脫至無色為止，分段接 收，將上述四份洗脫液洗脫流分，減壓濃縮后，冷凍干燥得到純度較高的軟棗獼猴桃總黃酮 干粉。e、將步驟d中經(jīng)聚酰胺柱色譜分離得到的軟棗獼猴桃總黃酮干粉用甲醇溶解成 33g/L的溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后進樣；制備液相色譜的分離條件流動相甲醇-水 (45 :55，V/V)，流速4. OmL/min，上樣量600yL，柱溫為30°C，檢測波長為340nm，分離時間為 65min,即得軟棗獼猴桃各黃酮組分純品。實施例6
一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行 a、粗提將軟棗獼猴桃鮮果烘干、粉碎、過90目篩，加入體積分?jǐn)?shù)為72%乙醇浸溶，混合 均勻，液料比為1 9 g/mL, 500w超聲處理20min，于55°C水浴提取3h，提取物混合液于4°C， 10000 r/min離心17 min，取上清液，殘渣用體積分?jǐn)?shù)為72%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后 離心，合并兩次提取液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液。b、除雜按以下步驟進行
(1)生成沉淀除雜向步驟a中得到的粗提液中加入無水乙醇至乙醇體積百分比濃度 達到80%以上，此時使大量多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀與黃酮分開，達到除雜目的，去除 沉淀，留上清液備用；
(2)液液萃取除雜將步驟(1)中的上清液減壓濃縮得浸膏，加水混懸后，依次用石油 醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相無色為止，正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減 壓濃縮，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃酮提取液。C、初步分離用HPD-600大孔吸附樹脂對步驟b中的軟棗獼猴桃總黃酮提取液進 行初步分離，向步驟b中得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇體積百 分比濃度達到26%后上樣，先用蒸餾水沖洗至洗脫液無色澄清，再次去除糖類和蛋白質(zhì)等 其它雜質(zhì)，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后備用。d、聚酰胺柱色譜分離純化將步驟c中收集的洗脫液減壓濃縮后進行聚酰胺柱色譜層析，將洗脫液減壓濃縮后得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液緩慢倒入已處理好的聚酰胺 填料的柱色譜(120cm*8cm，聚酰胺粉500g)中，充分吸附30min后按極性由高到低，依次用 水、甲醇-水(1 :9、2 :8、3 :7、4 :6，V/V)梯度洗脫，各梯度洗脫液均洗脫至無色為止，分段接 收，將上述四份洗脫液洗脫流分，減壓濃縮后，冷凍干燥得到純度較高的軟棗獼猴桃總黃酮 干粉。 e、將步驟d中經(jīng)聚酰胺柱色譜分離得到的軟棗獼猴桃總黃酮干粉用甲醇溶解成 31g/L的溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后進樣；制備液相色譜的分離條件流動相甲醇-水 (45 :55，V/V)，流速5. OmL/min,上樣量600 μ L，柱溫為30°C，檢測波長為340nm，分離時間為 60min,即得軟棗獼猴桃各黃酮組分純品。本發(fā)明這種干法提取軟棗獼猴桃黃酮的方法與之前所采用的濕法提取軟棗獼猴 桃黃酮的方法相比，其優(yōu)點在于比較干法提取和濕法提取，軟棗獼猴桃黃酮提取率相當(dāng)， 但干法提取更加節(jié)省溶劑用量，這在工業(yè)化生產(chǎn)中意義尤其巨大。軟棗獼猴桃含水量在86% 左右，以IOOg為例，濕法提取按料液比l:8g/mL需要溶劑800mL，用量很大；而干法提取法 將鮮果烘干后只剩下十幾克，如按料液比1:8，所需溶劑僅為一百二三十毫升，溶劑用量節(jié) 省至少600mL，在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中可較大程度減少溶劑用量，有效降低生產(chǎn)成本，采取 此方法提取黃酮具有廣闊的開發(fā)前景。
權(quán)利要求
1.一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行a、粗提將軟棗獼猴桃鮮果烘干、粉碎、過50 100目篩，體積分?jǐn)?shù)60 80%乙醇浸 溶,液料比為1:5 10 g/mL, 300 500w超聲處理20min，50 60°C水浴提取，離心取上 清液，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液；b、除雜將步驟a中得到的粗提液減壓濃縮，加入無水乙醇生成沉淀，取上清液，減壓 濃縮后依次用石油醚、正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃 酮提取液；C、初步分離用HPD-600大孔吸附樹脂對步驟b中的軟棗獼猴桃總黃酮提取液進行初 步分離，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為洗脫劑，收集洗脫液；d、聚酰胺柱色譜分離純化將步驟c中收集的洗脫液減壓濃縮后進行聚酰胺柱色譜層 析，依次用水、甲醇-水梯度洗脫，甲醇-水的體積比1 :9 4 6,分段接收，洗脫流分冷凍 干燥成軟棗獼猴桃總黃酮干粉；e、對步驟d中的軟棗獼猴桃總黃酮干粉進行制備色譜分離，得軟棗獼猴桃各黃酮組分 純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于步驟a中于 50 60°C水浴提取3h，提取物混合液于3 6°C，9000 11000 r/min離心10 20 min, 取上清液，殘渣用體積分?jǐn)?shù)60 80%的乙醇溶液再次浸溶，水浴后離心，合并兩次提取液， 并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得到軟棗獼猴桃總黃酮粗提液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于步驟b中除 雜按以下步驟進行(1)生成沉淀除雜向步驟a中得到的粗提液中加入無水乙醇至乙醇體積濃度達到80% 以上，使大量多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀與黃酮分開，去除沉淀，留上清液備用；(2)液液萃取除雜將步驟(1)中的上清液減壓濃縮得浸膏，加水混懸后，依次用石油 醚和正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，減壓濃縮，得到進一步純化的軟棗獼猴桃總黃酮提取 液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于在步驟(2)中 依次用石油醚和正丁醇萃取，石油醚萃至石油醚相無色為止，正丁醇萃取3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于在步驟c中 進行初步分離時，向步驟b中得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液中加入少量乙醇，至乙醇體 積濃度達到25 35%后上樣，先用蒸餾水沖洗至洗脫液無色澄清，然后用體積分?jǐn)?shù)為70% 的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于步驟d中用 聚酰胺柱色譜分離純化時，將步驟c中洗脫液減壓濃縮后得到的軟棗獼猴桃總黃酮提取液 緩慢倒入已處理好的聚酰胺填料的柱色譜中，充分吸附30min后按極性由高到低，依次用 水、甲醇-水按體積比1 :9 4 :6的梯度洗脫，各梯度洗脫液均洗脫至無色為止，分段接收， 洗脫流分，冷凍干燥得到純度較高的軟棗獼猴桃總黃酮干粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于將步驟d 中經(jīng)聚酰胺柱色譜分離得到的軟棗獼猴桃總黃酮干粉用甲醇溶解成25 35g/L的溶液， 0. 45 μ m微孔濾膜過濾后進樣；制備液相色譜的分離條件流動相甲醇-水體積比為45 ，流速3.0 7. OmL/min，上樣量600μ ，柱溫為30°C，檢測波長為340nm，分離時間為 50 70min，即得軟棗獼猴桃各黃酮組分純品。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，其特征在于步驟d中 甲醇-水按體積比為1 :9、2 :8、3 :7和4:6的梯度洗脫。
全文摘要
本發(fā)明提供一種軟棗獼猴桃黃酮的制備方法，將軟棗獼猴桃鮮果經(jīng)過粗提、除雜、初步分離、聚酰胺柱色譜分離純化、對分離純化后的軟棗獼猴桃總黃酮干粉進行制備色譜分離得軟棗獼猴桃各黃酮組分純品。該方法適合從軟棗獼猴桃中提取分離純化制備黃酮，可操作性強，制備效果好。通過本發(fā)明方法的實施，可以了解軟棗獼猴桃黃酮組成及結(jié)構(gòu)，為軟棗獼猴桃綜合開發(fā)利用提供支持。
文檔編號A61P29/00GK102078345SQ20111000679
公開日2011年6月1日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者劉長江, 欒云峰, 王菲 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)