專利名稱：一種自固化磷酸鈣微球及其制備方法與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于骨缺損修復醫(yī)用材料領(lǐng)域，特別涉及一種自固化磷酸鈣微球及其制備 方法與應用。
背景技術(shù)：
牙科手術(shù)領(lǐng)域所用到的微球的粒徑通常在0. 25 1mm，在整形外科手術(shù)所用到的 微球直徑通常在1 2mm。為滿足牙科和整形外科手術(shù)中填充和修復的臨床要求，需要開發(fā) 一種粒徑介于0. 25 2mm，具有生物相容性好、可降解性好、可填充性、易于操作和方便載 入功能性成分的骨修復材料微球。表面光潔的Ca-P鹽微球(常見的有HA、^ -TCP或者雙相磷酸鈣陶瓷微球)，由于 具有良好的流動性，便于填充，其規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，使其填充于骨缺損部位后，不易引發(fā)炎 癥反應，且其堆積后形成較多微米級的孔隙結(jié)構(gòu)，有利于新生骨組織的長入，在骨缺損填充 修復和藥物緩釋體系等領(lǐng)域有著明顯的優(yōu)勢，在拔牙窩充填、牙槽骨的擴充及牙周修復等 臨床口腔手術(shù)中得到了實際的應用。通常Ca-P鹽微球在成球后需要進行燒結(jié)才能具有良好的強度，不至于容易碎裂 和崩解。然而，磷酸鈣微球在經(jīng)過燒結(jié)后，難以在微球制備過程中加入功能性組分(如載 藥、生長因子等)。因此，有效提高微球在水溶液中的抗崩解性，同時方便復合功能性成分， 對于充分發(fā)揮微球的骨缺損填充修復和藥物控制釋放功能，實現(xiàn)微球在臨床上的廣泛應用 是十分重要的。為了改善材料在臨床操作中需要的強度和易用性，目前關(guān)于Ca-P鹽微球的制 備，絕大部分都采用了燒結(jié)步驟，限制了微球的載藥性能，影響到材料的降解性能。Liu 等(Fabrication and characterization of porous hydroxyapatite granules, D M Liu, Biomaterials，1996，17 :1955_1957)以 PVB 作為成孔劑，制備了粒徑為 0. 7 4mm 的Ca-P鹽微球，為了增加微球的強度，在1200°C燒掉微球中的PVB。Rodriguez-Lorenzo 等(Fabrication of porous hydroxyapatite bodies by a new directconsolidation method :starch consolidation, L M Rodriguez-Lorenzo, M Vallet-Regi, J M F Ferreira, Journal of Biomedical Material Research. 2002,60 232-240)
脹成孔，制備了包含可溶性淀粉的磷酸鈣懸浮液，隨后在1100°C進行燒結(jié)成球。Vladimir S 等(A method to fabricate porous spherical hydroxyapatitegranules intended for time-controlled drug release,Vladimir S Komleva，Serguei M，et al. Biomaterials, 2002,23:3449-3454.)通過引入明膠作為粘結(jié)劑，制備了羥基磷灰石(HA)載藥微球， 為了防止HA載藥微球在水中崩解，對微球進行燒結(jié)以提高其強度，導致其載藥性能不 { 圭。Junping Zhang 等(In situ generation ofsodium alginate/hydroxyapatite nanocomposite beads as drug controlled releasematrices,Junping Zhang,Qin Wang, Aiqin Wang, et al. Acta Biomaterialia，2009，6 :445_454.)通過 HA/海藻酸鈉體系中的 海藻酸鈉(SA)的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化原位合成HA的方法制得HA微球，有效避免了燒結(jié)，但由于該體系主要依靠HA-SA之間微弱的交聯(lián)鍵合，HA顆粒之間并未形成有效的結(jié)合力，導致 該體系在水中3小時內(nèi)便發(fā)生崩解失效。上述所有的Ca-P鹽微球在進行燒結(jié)處理前，都主要是靠有機粘結(jié)劑的結(jié)合力來 實現(xiàn)成球，Ca-P鹽顆粒之間并無有效的化學鍵合。這種微球若不經(jīng)燒結(jié)處理，在水溶液中 很快便由于有機物溶脹而發(fā)生崩解，導致體系失效；經(jīng)過燒結(jié)處理后，微球的抗崩解性得到 提高，體系可靠性增強，但其可降解性能變差，且作為藥物載體時，只能通過將微球燒結(jié)體 浸泡在藥液中進行物理吸附載藥，其載藥量和包封率會受到嚴重的影響。綜上所述，目前國際上關(guān)于Ca-P鹽微球的研究，都無法很好地將微球的抗崩解性 和可降解性同時結(jié)合起來，也無法實現(xiàn)高的載藥量和包封率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的Ca-P鹽微球無法很好的將微球的抗崩 解性和可降解性同時結(jié)合起來的缺點與不足，提供一種自固化磷酸鈣微球的制備方法。通 過該制備方法得到的自固化磷酸鈣微球能較好地將微球的抗崩解性和可降解性同時結(jié)合起來。本發(fā)明的另一目的在于提供通過所述制備方法得到的自固化磷酸鈣微球。本發(fā)明的再一目的在于提供所述自固化磷酸鈣微球的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種自固化磷酸鈣微球的制備方法，包含 以下步驟(1)將明膠和去離子水混合，于39 60°C、攪拌，直至明膠完全溶解，得到明膠溶 液；(2)將多糖膠和去離子水混合，于39 80°C、攪拌，直至多糖膠完全溶解，得到多 糖膠溶液；(3)將步驟⑴得到的明膠溶液和步驟⑵得到的多糖膠溶液混合，得到明膠/多 糖膠溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液，其中明膠和多糖膠的濃度分別為2 10% (w/v)和 0. 1 5% (w/v)；(4)將步驟(3)得到的明膠/多糖膠溶液與磷酸鈣骨水泥按液固比1. 5 3. OmL/g 充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的自固化磷酸鈣漿體，再以100 500r/min的攪拌速度將自 固化磷酸鈣漿體攪拌分散到-15 10°C的大豆油中，攪拌10 90min后，濾除大豆油，并用 丙酮和酒精反復洗滌微球，初步得到濕微球；將濕微球置于25 70°C、相對濕度為95% 100% (空氣中水蒸氣的百分比)的環(huán)境中養(yǎng)護水化2 7d，干燥，得到自固化磷酸鈣微球。所述的多糖膠優(yōu)選變性淀粉、魔芋膠、黃原膠、槐豆膠、瓜爾豆膠或可溶性殼聚糖 中的至少一種；所述的變性淀粉為氧化淀粉、羧甲基淀粉、羥丙基淀粉、磷酸酯淀粉或醋酸酯淀粉 中的至少一種；所述的磷酸鈣骨水泥指的是本領(lǐng)域中通常使用的磷酸鈣骨水泥，為“磷酸四 鈣_磷酸氫鈣”系統(tǒng)骨水泥、“磷酸二氫鈣_ a -磷酸三鈣_碳酸鈣”系統(tǒng)骨水泥、“磷酸四 鈣-a -磷酸三鈣”系統(tǒng)骨水泥、“磷酸四鈣_ 3 _磷酸三鈣_磷酸二氫鈣”系統(tǒng)骨水泥、“無 定形磷酸鈣_磷酸氫鈣”系統(tǒng)骨水泥或“磷酸氫鈣_ a "磷酸三鈣_碳酸鈣”系統(tǒng)骨水泥中的任一種；步驟(1)中所述的明膠和去離子水優(yōu)選按4 20g/100mL混合，得到的明膠溶液 的濃度為4 20% (w/v)；步驟(2)中所述的多糖膠和去離子水優(yōu)選按0. 2 10g/100mL混合，得到的多糖 膠溶液為 0.2-10% (w/v)；步驟(4)所述洗滌的次數(shù)優(yōu)選為至少三次；一種自固化磷酸鈣微球，由上述制備方法得到；所述自固化磷酸鈣微球的粒徑為 0. 12 2. 61mm ；所述自固化磷酸鈣微球在體外抗崩解性試驗中可以保持6 32h不發(fā)生崩 解，遠高于非燒結(jié)同類Ca-P微球的抗崩解時間；體外降解試驗表明，第一階段為明膠和多 糖膠的降解，時間約1 4周；第二階段為磷酸鈣骨水泥水化產(chǎn)物的降解，在第3周后降解 明顯，最長18周后微球完全降解，自固化磷酸鈣微球的可降解性能優(yōu)于經(jīng)燒結(jié)處理的Ca-P 微球。在微球制備過程中還可對微球進行同步復合藥物或其他功能性成分，研究表明，水溶 性藥物的載藥量可達7. 91%，包封率可達94. 5% ；脂溶性的藥物的載藥量可達3. 58%，包 封率可達71. 5% ；生長因子的包封率可達80%。所述的自固化磷酸鈣微球可作為各種原因引起的骨缺損、骨組織感染區(qū)的填充修 復材料；以及作為牙槽骨缺損填充修復材料及牙槽嵴增高材料、增寬材料等；還可用作為 藥物載體材料；所述自固化磷酸鈣微球作為醫(yī)用骨缺損填充材料，其應用方法為(1)對于無明顯出血的骨缺損部位，可根據(jù)缺損大小，選擇適當粒徑的自固化磷酸 鈣微球直接填滿骨缺損處，然后縫合或用磷酸鈣骨水泥封閉表面后縫合；(2)對于有明顯出血的骨缺損部位，先進行適當止血，然后將自固化磷酸鈣微球與 無毒、降解性良好的高分子粘結(jié)劑(如纖維蛋白膠、黃原膠和槐豆膠)調(diào)制成注射性較好的 糊狀物，再填充至骨缺損部位或通過無針頭直通管狀注射器推注至骨缺損部位，最后進行 縫合處理；(3)在微球制備的調(diào)和漿體過程中可以根據(jù)需要直接加入藥物或生長因子成球， 組成藥物或生長因子釋放系統(tǒng)，也可成球后通過液相吸附的形式載藥，可同時實現(xiàn)骨缺損 填充和藥物控制釋放治療的雙重功效。自固化磷酸鈣(又稱磷酸鈣骨水泥，英文縮寫為“CPC” )具有自固化性和可任意 塑型性，可以方便地在體溫下或室溫下根據(jù)臨床需要制成不同的大小、不同形狀的修復體 (如微球)，而且能夠在微球的制備過程中添加功能性成分，從而獲得更好的骨缺損修復和 治療效果。本發(fā)明以自固化磷酸鈣作為基體，以明膠和多糖膠作為成球粘結(jié)劑，采用反相乳 液法制備一種新型的自固化磷酸鈣微球。明膠是膠原的變性產(chǎn)物，是由18種氨基酸組成 的長鏈多肽，有著良好的生物降解性和無毒性。明膠在常溫干燥的條件下呈固膠態(tài)(干燥 顆粒)，浸入水中吸水膨脹，變成凝膠態(tài)，隨著溫度的升高，在37 42°C變成流體，成為溶膠 態(tài)，且這種轉(zhuǎn)變是可逆的。多糖膠如變性淀粉或黃原膠等，一定溫度下在水中分子鏈得到伸 展，可以發(fā)生糊化，而形成具有粘結(jié)力的糊狀物。自固化磷酸鈣在成球和脫水養(yǎng)護過程除受 明膠、多糖膠溶液的粘結(jié)作用外，還發(fā)生了磷酸鈣顆粒向HA轉(zhuǎn)化的溶解沉淀反應(即磷酸 鈣骨水泥的水化反應)。水化反應過程中，磷酸鈣鹽發(fā)生了溶解，并在顆粒間析出納米HA晶 體，隨著水化過程的進行，HA晶體長大并相互交織橋連在一起，使磷酸鈣鹽顆粒之間開始形
6成三維網(wǎng)絡骨架結(jié)構(gòu)。用反相乳液法制備的自固化磷酸鈣微球在脫水養(yǎng)護處理過程中，漿 體中的液相減少，磷酸鹽的濃度相應增大。由溶度積曲線圖知道，在鈣磷鹽中HA的溶度積 最小，所以HA晶體的析出、長大也會加速，此時漿體塑性流動由于水相粘度的增大，水化產(chǎn) 物的增多和有機粘結(jié)劑的空間位阻作用而終止，產(chǎn)生了凝結(jié)現(xiàn)象。在原來由明膠/多糖膠 溶液(有機粘結(jié)劑和水)所占據(jù)的空間附近形成很多凝膠孔，同時明膠和多糖膠由于失去 水粘附在孔壁的表面，形成了有機/無機雜化體，提高了兩相的結(jié)合強度。顆粒通過兩種機 制結(jié)合在一起，大大增強了微球的抗崩解能力，這種方法所制備的磷酸鈣微球，無需通過燒 結(jié)就具有良好的強度和抗崩解能力，同時作為藥物載體，藥物可以在微球的制備過程中同 步載入，不但藥物的裝載量和包封率高，而且載藥量可以得到精確的控制。本發(fā)明利用磷酸 鈣骨水泥的自固化特性和添加劑的粘結(jié)性，可以有效地避免燒結(jié)，可制備用于牙科和整形 外科的粒徑為0. 25 2mm的自固化磷酸鈣微球，這種微球同時具有良好的抗崩解性和可降 解性，而且可以實現(xiàn)高載藥量和精確載藥的磷酸鈣微球，迄今為止尚未見有報道。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果(1)本發(fā)明首次同時將明膠和多糖膠溶液作為調(diào)和液，調(diào)和磷酸鈣骨水泥，所得到 的磷酸鈣骨水泥的凝結(jié)時間變化不大。明膠和多糖膠不改變原磷酸鈣骨水泥的水化反應和 自行固化特性，固化后水化產(chǎn)物的組成仍然為羥基磷灰石。(2)本發(fā)明利用磷酸鈣骨水泥的自固化特點制備磷酸鈣微球，克服了無自固化能 力又不經(jīng)高溫燒結(jié)制備的磷酸鈣類微球在水溶液中較短時間便發(fā)生崩解的缺點，制備的自 固化磷酸鈣微球抗崩解性能顯著增強，在水中振蕩的至少6h內(nèi)不發(fā)生崩解，而僅僅用高分 子粘結(jié)成球不經(jīng)高溫燒結(jié)的普通非自固化磷酸鈣微球在水中振蕩最長39min便開始發(fā)生 崩解。(3)本發(fā)明所述的自固化磷酸鈣微球的制備無需經(jīng)過燒結(jié)處理，可實現(xiàn)制備過程 中同步載入藥物、生長因子或其它活性功能成分，克服了普通磷酸鈣類微球經(jīng)高溫燒結(jié)后 可降解性降低且無法同步載藥的缺點，并可實現(xiàn)高載藥率、高包封率和精確載藥。(4)本發(fā)明所述自固化磷酸鈣微球的制備方法簡單，具有更優(yōu)良的生物醫(yī)學性能， 可取得更好的臨床應用效果，應用前景更加廣闊。


圖1是實施例1制備的自固化磷酸鈣微球形貌的掃描電子顯微鏡照片。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。實施例1應用明膠和氧化淀粉作為粘結(jié)劑制備自固化磷酸鈣微球的步驟包括(1)將明膠顆粒(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20071019，化學純)以4g/100mL 的比例加入至42°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待明膠顆粒完全溶 解后，得到4% (w/v)的明膠溶液；(2)將氧化淀粉顆粒(上海匯普工業(yè)化學品有限公司，化學純)以0. 2g/100mL的比例加入至39°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待氧化淀粉顆粒完全 溶解后，得到0.2% (w/v)的氧化淀粉溶液；(3)將步驟⑴得到的明膠溶液和步驟⑵得到的氧化淀粉溶液按等體積混合， 得到明膠/氧化淀粉溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液(其中明膠和氧化淀粉的濃度分別為 2% (w/v)和0. 1% (w/v))。在調(diào)和液中按藥物與磷酸鈣粉體的質(zhì)量比為5%的含量加入水 溶性廣譜抗菌素藥物_硫酸慶大霉素，充分混合，得到含硫酸慶大霉素的磷酸鈣骨水泥調(diào) 和液；(4)將步驟(3)得到的明膠/氧化淀粉溶液與無定形磷酸鈣-磷酸氫鈣(其中，無 定形I^Stf丐按 ffang (Control of crystallinity of hydrated products in acalcium phosphate bone cement, Xiupeng Wang, Jiandong Ye, Yingjun Wang, et al. Journal of Biomedical Materials Research, Part A，2007，81A :781_790)介紹的方法合成，磷酸氫鈣 為上海試四赫維化工有限公司生產(chǎn)的分析純試劑，兩者按質(zhì)量比1 1混合得到無定形磷 酸鈣_磷酸氫鈣骨水泥)按液固比1. 5mL/g充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的自固化磷酸鈣 漿體，再以150r/min的攪拌速度將自固化磷酸鈣漿體攪拌分散到-10°C的大豆油中，攪拌 30min后，得到含油小球粒，濾除大豆油，并用丙酮和酒精反復洗滌微球三次，初步得到濕微 球；將濕微球置于37°C、相對濕度為97%的恒溫恒濕箱中養(yǎng)護水化6d，干燥，得到自固化磷 酸鈣微球(下稱CPC微球)。CPC微球的形貌如圖1所示。用激光粒度分析儀測得CPC微球的粒徑范圍為 0. 31 2. 35mm ；通過壓汞法測得微球的孔隙率為41. 3%；通過固定漏斗法測得微球的安息 角為 24. 6° (按照 Sunil K Jain 等在文獻(Calcium silicate basedmicrospheres of repaglinide for gastroretentive floating drug delivery :Preparationand in vitro characterization,Sunil K Jain, A M Awasthi,N K Jain,et al. Journal ofControlled Release 2005(107) 300-309)所介紹的方法測量.下同)；體外藥物釋放試驗表明(分析 方法見《中國藥典》2000年版二部.化學工業(yè)出版社，附錄IV A第866頁)，CPC微球中硫酸 慶大霉素的載藥量為4. 73%，包封率達到94. 5%。按上述4個制備步驟，將其中的明膠/氧化淀粉溶液分別替換成只含2. 1% (w/v) 的明膠溶液和只含2.1% (w/v)的氧化淀粉溶液，以相同的方法分別制備出只含明膠的CPC 微球(含明膠2. 1% (w/v))和只含氧化淀粉的CPC微球(含氧化淀粉2. 1% (w/v)；用HA粉 末(HA 的制備方法按 Guo 等在文獻‘‘Fabrication ofnanostructured hydroxyapatite and analysis of human osteoblastic cellular response. Xingyuan Guo, Julie E Gough， Ping Xiao，et al.Journal of biomedical materialsresearch. Part A 2007，82 (4) 1022-1032”中介紹的方法制備，下同)替代磷酸鈣骨水泥粉末，并按照上述4個制備步驟和 添加劑含量(調(diào)和液中明膠和氧化淀粉的濃度分別為2% (w/v)和0. 1% (w/v))，制備出 相同添加劑含量的非自固化的HA微球。按下面所述的方法對比這4種微球的力學強度、抗 崩解性和可降解性。4種微球均具有一定的力學強度，用手指不能將微球捻碎。分別取8顆粒徑相差不 大的上述4種微球，并用萬能力學試驗機測微球的的平均破壞載荷，測試結(jié)果如表1所示表1微球抗壓性能 選取粒徑范圍在1. 47 1. 88mm的4種微球，分別將其浸泡在裝有去離子水的塑 料瓶中，并將瓶子置于37°C，120r/min的搖床中振蕩，并于一定時間間隔觀察記錄瓶中液 體的渾濁情況，由此考察4種微球的體外抗崩解時間；將4種微球以1. 5mg/mL的比例分 別浸泡在PBS溶液(lOOmM phosphate buffer, 150mM NaCl，廣州市達暉生物技術(shù)有限公 司，pH值7. 2，下同)中振蕩，條件為37°C，120r/min,每隔24h換新鮮PBS，考察4種微球 的體外降解時間(參考王秀鵬等在(Control of crystallinity of hydrated products in a calcium phosphatebone cement, Xiupeng Wang, Jiandong Ye, Yingjun Wang, et al. Journal ofBiomedical Materials Research, Part A, 2007，81A :781_790)中介紹的方 法，下同)。體外抗崩解與體外降解測試結(jié)果如表2所示。表2微球的抗崩解性和可降解性 實施例2應用明膠和羧甲基淀粉作為粘結(jié)劑制備自固化磷酸鈣微球的步驟包括(1)將明膠顆粒(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20071019，化學純)以6g/100mL 的比例加入至39°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待明膠顆粒完全溶 解后，得到6% (w/v)的明膠溶液；(2)將羧甲基淀粉顆粒(廣州市金珠江化學有限公司，化學純)以0. 6g/100mL的 比例加入至40°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待羧甲基淀粉顆粒完 全溶解后，得到0.6% (w/v)的羧甲基淀粉溶液；(3)將步驟⑴得到的明膠溶液和步驟⑵得到的羧甲基淀粉溶液按等體積混合， 得到明膠/羧甲基淀粉溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液(其中明膠和羧甲基淀粉的濃度分 別為3% (w/v)和0.3% (w/v))。在調(diào)和液中按藥物與磷酸鈣粉體的質(zhì)量比為8%的含量 加入水溶性廣譜性抗腫瘤的藥物表柔比星(Epirubicinhydrochloride，EPI)，充分溶解混 合，得到含表柔比星的磷酸鈣骨水泥調(diào)和液；(4)將步驟(3)得到的明膠/羧甲基淀粉溶液與磷酸四鈣-a-磷酸三鈣(其中 磷酸四鈣由鄭治等在文獻“醫(yī)用磷酸鈣骨水泥的制備及性能的實驗研究，鄭治，向其軍，劉 詠等，生物醫(yī)學工程學雜志，2006，23 (5) :1048-1051)”中介紹的方法合成；a-磷酸三鈣從 阿拉丁試劑網(wǎng)購得，1040103，化學純；將兩者按摩爾比1 1混合得到磷酸四鈣-a-磷酸 三鈣骨水泥)按液固比1.8mL/g充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的自固化磷酸鈣漿體，再以100r/min的攪拌速度將自固化磷酸鈣漿體攪拌分散到2°C的大豆油中，攪拌lOmin后，得到 含油小球粒，濾除大豆油，并用丙酮和酒精反復洗滌微球五次，初步得到濕微球；將濕微球 置于25°C、相對濕度為95%的恒溫恒濕箱中養(yǎng)護水化5d，干燥，得到CPC微球。用激光粒度分析儀測得CPC微球的粒徑范圍為0. 22 1. 89mm ；通過壓汞法測得 微球的孔隙率為51. 3% ；通過固定漏斗法測得微球的安息角為27. 4° ；體外藥物釋放試驗 表明(分析方法見“表柔比星殼聚糖微球聯(lián)合微波消融治療小鼠肝移植瘤術(shù)”，楊靜，汪森 明，曹漫明等，中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(8) =1382-1385)，CPC微球中表柔比 星的載藥量為7. 91%，包封率達到91.2%。按上述4個制備步驟，將其中的明膠/羧甲基淀粉溶液分別替換成只含3. 3% (w/ v)的明膠溶液和只含3. 3% (w/v)的羧甲基淀粉溶液，以相同的方法分別制備出只含明膠 的CPC微球(含明膠3.3% (w/v))和只含羧甲基淀粉的CPC微球(含羧甲基淀粉3.3% (w/v)；以HA粉末替代磷酸鈣骨水泥粉末，并按照上述4個步驟和添加劑含量(調(diào)和液中明 膠和羧甲基淀粉的濃度分別為3% (w/v)和0.3% (w/v))，制備出相同添加劑含量的非自 固化的HA微球。按下面所述的方法對比這4種微球的力學強度、抗崩解性和可降解性。4種微球均具有一定的力學強度，用手指不能將微球捻碎，分別取5顆粒徑相差不 大的上述4種微球，并用萬能力學試驗機測微球的的平均破壞載荷，測試結(jié)果如表3所示表3微球抗壓性能 選取粒徑范圍在1. 23 1. 78mm的4種微球，分別將其浸泡在裝有去離子水的塑 料瓶中，并將瓶子置于37°C，120r/min的搖床中振蕩，并與一定時間間隔觀察記錄瓶中液 體的渾濁情況，由此考察4種微球的體外抗崩解時間；將4種微球以1. 5mg/ml的比例分別 浸泡在PBS溶液(lOOmM phosphate buffer，150mMNaCl，廣州市達暉生物技術(shù)有限公司，pH 值7. 2，下同)中振蕩，條件為37°C，120r/min,每隔24h換新鮮PBS，考察4種微球的體外降 解時間。體外抗崩解與體外降解測試結(jié)果如表4所示表4微球的抗崩解性和可降解性 實施例3
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應用明膠和羥丙基淀粉作為粘結(jié)劑制備自固化磷酸鈣微球的步驟包括(1)將明膠顆粒(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20071019，化學純)以8g/100mL 的比例加入至60°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待明膠顆粒完全溶 解后，得到8% (w/v)的明膠溶液；(2)將羥丙基淀粉顆粒(上海匯普工業(yè)化學品有限公司，化學純)以1. 2g/100mL 的比例加入至40°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待羥丙基淀粉顆粒 完全溶解后，得到1.2% (w/v)的羥丙基淀粉溶液；(3)將步驟⑴得到的明膠溶液和步驟⑵得到的羥丙基淀粉溶液按等體積混合， 得到明膠/羥丙基淀粉溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液(其中明膠和羥丙基淀粉的濃度分 別為4% (w/v)和0. 6% (w/v))。在調(diào)和液中按生長因子與磷酸鈣粉體的質(zhì)量比為0. 05% 的濃度加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP) (rhBMP-2，北京百靈克生物科技有限公司)，充分溶解混 合，得到含BMP的磷酸鈣骨水泥調(diào)和液；(4)將步驟(3)得到的明膠/羥丙基淀粉溶液與無定形磷酸鈣-磷酸氫鈣(其 ^ Wang ^ "Control of crystallinity of hydrated products in a calciumphosphate bone cement, Xiupeng Wang, Jiandong Ye, Yingjun Wang, et al. Journal ofBiomedical Materials Research, Part A, 2007，81A :781_790”介紹的方法 合成，磷酸氫鈣為上海試四赫維化工有限公司生產(chǎn)的分析純試劑，兩者按質(zhì)量比1 1混合 得到無定形磷酸鈣_磷酸氫鈣骨水泥)按液固比2. 0mL/g充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的 自固化磷酸鈣漿體，再以400r/min的攪拌速度將自固化磷酸鈣漿體攪拌分散到_15°C的大 豆油中，攪拌45min后，得到含油小球粒，濾除大豆油，并用丙酮和酒精反復洗滌微球五次， 初步得到濕微球；將濕微球置于50°C、相對濕度為97%的恒溫恒濕箱中養(yǎng)護水化2d，干燥， 得到CPC微球。用激光粒度分析儀測得CPC微球的粒徑范圍為0. 12 1. 65mm ；通過壓汞法測得 微球的孔隙率為48. 6% ；通過固定漏斗法測得微球的安息角為22. 3° ；體外藥物釋放試驗 表明(分析方法按照文獻(rh-BMP-2殼聚糖微球的制備及體外檢測，黃鑫，孟國林，劉建等， 中國矯形外科雜志，2009，17 (15) 1172-1174所介紹的方法)，CPC微球中rh-BMP-2的載藥 量為0. 04 %，包封率為80 %。按上述4個制備步驟，將其中的明膠/羥丙基淀粉溶液分別替換成只含4. 6% (w/ v)的明膠溶液和只含4. 6% (w/v)的羥丙基淀粉溶液，以相同的方法分別制備出只含明膠 的CPC微球(含明膠4. 6% (w/v))和只含羥丙基淀粉的CPC微球(含羥丙基淀粉4. 6% (w/v)；以HA粉末替代磷酸鈣骨水泥粉末，并按照步驟上述4個步驟和添加劑含量(調(diào)和液 中明膠和羥丙基淀粉的濃度分別為4% (w/v)和0.6% (w/v)，制備出相同添加劑含量的非 自固化的HA微球。按下面所述的方法對比這4種微球的力學強度、抗崩解性和可降解性。4種微球均具有一定的力學強度，用手指不能將微球捻碎，分別取5顆粒徑相差不 大的上述4種微球，并用萬能力學試驗機測微球的的平均破壞載荷，測試結(jié)果如表5所示表5微球抗壓性能 選取粒徑范圍在1. 17 1. 65mm的4種微球，分別將其浸泡在裝有去離子水的塑 料瓶中，并將瓶子置于37°C，120r/min的搖床中振蕩，并于一定時間間隔觀察記錄瓶中液 體的渾濁情況，由此考察4種微球的體外抗崩解時間；將4種微球以1. 5mg/ml的比例分別 浸泡在PBS溶液(lOOmM phosphate buffer，150mMNaCl，廣州市達暉生物技術(shù)有限公司，pH 值7. 2，下同)中振蕩，條件為37°C，120r/min,每隔24h換新鮮PBS，考察4種微球的體外降 解時間。體外抗崩解與體外降解測試結(jié)果如表6所示表6微球的抗崩解性和可降解性 實施例4應用明膠和磷酸酯淀粉作為粘結(jié)劑制備自固化磷酸鈣微球的步驟包括(1)將明膠顆粒(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20071019，化學純)以10g/100mL 的比例加入至48°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待明膠顆粒完全溶 解后，得到10% (w/v)的明膠溶液；(2)將磷酸酯淀粉顆粒(石家莊市富強精細化工有限公司，化學純)以1.8g/00mL 的比例加入至60°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待磷酸酯淀粉顆粒 完全溶解后，得到1.8% (w/v)的磷酸酯淀粉溶液；(3)將步驟⑴得到的明膠溶液和步驟⑵得到的磷酸酯淀粉溶液按等體積混合， 得到明膠/磷酸酯淀粉溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液(其中明膠和磷酸酯淀粉的濃度分 別為5% (w/v)和0.9% (w/v))；在調(diào)和液中按藥物與磷酸鈣粉體的質(zhì)量比為5%的含量 加入脂溶性抗生素藥物紅霉素，充分溶解混合，得到含紅霉素的磷酸鈣骨水泥調(diào)和液；(4)將步驟(3)得到的明膠/磷酸酯淀粉溶液與磷酸四鈣磷酸三鈣-磷酸二 氫鈣(其中磷酸四鈣由鄭治等在文獻“醫(yī)用磷酸鈣骨水泥的制備及性能的實驗研究，鄭治， 向其軍，劉詠等，生物醫(yī)學工程學雜志，2006，23 (5) :1048-1051”中介紹的方法合成邛-磷 酸三鈣由王玥華等在文獻“用磷酸八鈣前驅(qū)體法制備3 -磷酸三鈣，王玥華，張云，尹光福 等，航天醫(yī)學與醫(yī)學工程，2004，4”中介紹的方法合成；磷酸二氫鈣由阿拉丁試劑網(wǎng)購得， 7758-23-8，化學純；將三者按摩爾比1 1 3. 7混合得到磷酸四鈣-0 -磷酸三鈣-磷酸 二氫鈣骨水泥)按液固比2. lmL/g充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的自固化磷酸鈣漿體，再以300r/min的攪拌速度將自固化磷酸鈣漿體攪拌分散到6°C的大豆油中，攪拌60min后，得 到含油小球粒，濾除大豆油，并用丙酮和酒精反復洗滌微球四次，初步得到濕微球；將濕微 球置于47°C、相對濕度為95 %的恒溫恒濕箱中養(yǎng)護水化7d，干燥，得到CPC微球。用激光粒度分析儀測得CPC微球的粒徑范圍為0. 25 2. 28mm ；通過壓汞法測得微球的孔隙率為61. 4% ；通過固定漏斗法測得微球的安息角為26. 1° ；體外藥物釋放試驗 表明(分析方法按照文獻“紅霉素片釋放度測定法”.傅燕芳，王金芳，李春平，西北藥學雜 志2000，5 213介紹的方法)，微球中紅霉素的載藥量為3. 58%，包封率為71. 5% .按上述4個制備步驟，將其中的明膠/磷酸酯淀粉溶液分別替換成只含5. 9 % (w/ v)的明膠溶液和只含5. 9% (w/v)的磷酸酯淀粉溶液，以相同的方法分別制備出只含明膠 的CPC微球(含明膠5. 9% (w/v))和只含磷酸酯淀粉的CPC微球(含磷酸酯淀粉5. 9% (w/v)；以HA粉末替代磷酸鈣骨水泥粉末，并按照步驟上述4個步驟和添加劑含量(調(diào)和液 中明膠和磷酸酯淀粉的濃度分別為5% (w/v)和0.9% (w/v)，制備出相同添加劑含量的非 自固化的HA微球。按下面所述的方法對比這4種微球的力學強度、抗崩解性和可降解性。4種微球均具有一定的力學強度，用手指不能將微球捻碎，分別取11顆粒徑相差 不大的上述4種微球，并用萬能力學試驗機測微球的的平均破壞載荷，測試結(jié)果如表7所
不表7微球抗壓性能 選取粒徑范圍在1. 36 1. 83mm的4種微球，分別將其浸泡在裝有去離子水的塑 料瓶中，并將瓶子置于37°C，120r/min的搖床中振蕩，并于一定時間間隔觀察記錄瓶中液 體的渾濁情況，由此考察4種微球的體外抗崩解時間；將4種微球以1. 5mg/mL的比例分別 浸泡在PBS溶液(lOOmM phosphate buffer, 150mM NaCl，廣州市達暉生物技術(shù)有限公司， pH值7. 2，下同)中振蕩，條件為37°C，120r/min,每隔24h換新鮮PBS，考察4種微球的體 外降解時間。體外抗崩解與體外降解測試結(jié)果如表8所示表8微球的抗崩解性和可降解性 實施例5
應用明膠和醋酸酯淀粉作為粘結(jié)劑制備自固化磷酸鈣微球的步驟包括(1)將明膠顆粒(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20071019，化學純)以12g/100mL 的比例加入至55°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待明膠顆粒完全溶 解后，得到12% (w/v)的明膠溶液；(2)將醋酸酯淀粉顆粒(石家莊市富強精細化工有限公司，化學純)以 2. 8g/100mL的比例加入至60°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待醋酸 酯淀粉顆粒完全溶解后，得到2. 8% (w/v)的醋酸酯淀粉溶液；(3)將步驟⑴得到的明膠溶液和步驟⑵得到的醋酸酯淀粉溶液按等體積混合， 得到明膠/醋酸酯淀粉溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液(其中明膠和醋酸酯淀粉的濃度分 別為6% (w/v)和 1. 4% (w/v))；(4)將步驟(3)得到的明膠/醋酸酯淀粉溶液與磷酸氫鈣-a-磷酸三鈣-碳酸 鈣(磷酸氫鈣為上海試四赫維化工有限公司生產(chǎn)的分析純試劑；a “磷酸三鈣從阿拉丁試 劑網(wǎng)購得，1040103，化學純；碳酸鈣是由淄博盛華精細化工有限公司生產(chǎn)的；將三者按摩 爾比1 1 0.8混合得到磷酸氫鈣-a-磷酸三鈣-碳酸鈣骨水泥)按液固比2. 2mL/g 充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的自固化磷酸鈣漿體，再以180r/min的攪拌速度將自固化 磷酸鈣漿體攪拌分散到4°C的大豆油中，攪拌90min后，得到含油小球粒，濾除大豆油，并用 丙酮和酒精反復洗滌微球四次，初步得到濕微球；將濕微球置于50°C、相對濕度為100%的 恒溫恒濕箱中養(yǎng)護水化2d，干燥，得到CPC微球。用激光粒度分析儀測得CPC微球的粒徑范圍為0. 33 2. 61mm ；通過壓汞法測得 微球的孔隙率為63. 4% ；通過固定漏斗法測得微球的安息角為23. 8°按上述4個步驟，并將其中的明膠/醋酸酯淀粉溶液分別替換成只含7. 4% (w/v) 的明膠溶液和只含7. 4% (w/v)的醋酸酯淀粉溶液，以相同的方法分別制備出只含明膠的 CPC微球(含明膠7. 4% (w/v))和只含醋酸酯淀粉的CPC微球(含醋酸酯淀粉7. 4% (w/ v)；以HA粉末替代磷酸鈣骨水泥粉末，并按照步驟上述4個步驟和添加劑含量(調(diào)和液中 明膠和醋酸酯淀粉的濃度分別為6% (w/v)和1.4% (w/v)，制備出相同添加劑含量的非自 固化的HA微球。按下面所述的方法對比這4種微球的力學強度、抗崩解性和可降解性。4種微球均具有一定的力學強度，用手指不能將微球捻碎，分別取6顆粒徑上述4 種微球，用萬能力學試驗機測微球的的平均破壞載荷，測試結(jié)果如表9 表9微球抗壓性能 選取粒徑范圍在1. 37 1. 83mm的4種微球，分別將其浸泡在裝有去離子水的塑 料瓶中，并將瓶子置于37°C，120r/min的搖床中振蕩，并于一定時間間隔觀察記錄瓶中液 體的渾濁情況，由此考察4種微球的體外抗崩解時間；將4種微球以1. 5mg/ml的比例分別 浸泡在PBS溶液(lOOmM phosphate buffer，150mMNaCl，廣州市達暉生物技術(shù)有限公司，pH值7. 2，下同)中振蕩，條件為37°C，120r/min,每隔24h換新鮮PBS，考察4種微球的體外降 解時間。體外抗崩解與體外降解測試結(jié)果如表10所示表10微球的抗崩解性和可降解性 實施例6應用明膠和魔芋膠作為粘結(jié)劑制備自固化磷酸鈣微球的步驟包括(1)將明膠顆粒(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20071019，化學純)以14g/100mL 的比例加入至48°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待明膠顆粒完全溶 解后，得到14% (w/v)的明膠溶液；(2)將魔芋膠顆粒(上海匯普工業(yè)化學品有限公司，化學純)以3. 6g/100mL的比 例加入至60°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待魔芋膠顆粒完全溶解 后，得到3. 6% (w/v)的魔芋膠溶液；(3)將步驟⑴得到的明膠溶液和步驟⑵得到的魔芋膠溶液按等體積混合，得到 明膠/魔芋膠溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液(其中明膠和魔芋膠的濃度分別為(w/ v)和 1. 8% (w/v)；(4)將步驟(3)得到的明膠/魔芋膠溶液與磷酸四鈣-磷酸氫鈣(其中磷酸四鈣 由鄭治等在文獻“醫(yī)用磷酸鈣骨水泥的制備及性能的實驗研究，鄭治，向其軍，劉詠等，生物 醫(yī)學工程學雜志，2006，23 (5) :1048-1051”中介紹的方法合成；磷酸氫鈣為上海試四赫維 化工有限公司生產(chǎn)的分析純試劑，將兩者按摩爾比2 3混合得到磷酸四鈣-磷酸氫鈣骨 水泥)按液固比2. 4mL/g充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的自固化磷酸鈣漿體，再以500r/ min的攪拌速度將自固化磷酸鈣漿體攪拌分散到0°C的大豆油中，攪拌lOmin后，得到含油 小球粒，濾除大豆油，并用丙酮和酒精反復洗滌微球五次，初步得到濕微球；將濕微球置于 50°C、相對濕度為98%的恒溫恒濕箱中養(yǎng)護水化3d，干燥，得到CPC微球。用激光粒度分析儀測得CPC微球的粒徑范圍為0. 19 2. 05mm ；通過壓汞法測得 微球的孔隙率為61. 8% ；通過固定漏斗法測得微球的安息角為27. 4° .按上述4個制備步驟，將其中的明膠/魔芋膠溶液分別替換成只含8. 8% (w/v)的 明膠溶液和只含8. 8% (w/v)的魔芋膠溶液，以相同的方法分別制備出只含明膠的CPC微球 (含明膠8. 8% (w/v))和只含魔芋膠的CPC微球(含魔芋膠8. 8% (w/v)；以HA粉末替代 磷酸鈣骨水泥粉末，并按照步驟上述4個步驟和添加劑含量(調(diào)和液中明膠和魔芋膠的濃 度分別為7% (w/v)和1.8% (w/v)，制備出相同添加劑含量的非自固化的HA微球。按下 面所述的方法對比這4種微球的力學強度、抗崩解性和可降解性。4種微球均具有一定的力學強度，用手指不能將微球捻碎，分別取6顆粒徑相差不大的上述4種微球，并用萬能力學試驗機測微球的的平均破壞載荷，測試結(jié)果如表11所
不表11微球抗壓性能 選取粒徑范圍在1. 37 1. 73mm的4種微球，分別將其浸泡在裝有去離子水的塑 料瓶中，并將瓶子置于37°C，120r/min的搖床中振蕩，并于一定時間間隔觀察記錄瓶中液 體的渾濁情況，由此考察4種微球的體外抗崩解時間；將4種微球以1. 5mg/mL的比例分別 浸泡在PBS溶液(lOOmM phosphate buffer, 150mM NaCl，廣州市達暉生物技術(shù)有限公司， pH值7. 2，下同)中振蕩，條件為37°C，120r/min,每隔24h換新鮮PBS，考察4種微球的體 外降解時間。體外抗崩解與體外降解測試結(jié)果如表12所示表12微球的抗崩解性和可降解性 實施例7應用明膠和黃原膠作為粘結(jié)劑制備自固化磷酸鈣微球的步驟包括(1)將明膠顆粒(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20071019，化學純)以16g/100mL 的比例加入至46°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待明膠顆粒完全溶 解后，得到16% (w/v)的明膠溶液；(2)將黃原膠顆粒(上海匯普工業(yè)化學品有限公司，食品級)以4g/100mL的比例 加入至75°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待黃原膠顆粒完全溶解后， 得到4% (w/v)的磷酸酯淀粉溶液；(3)將步驟⑴得到的明膠溶液和步驟⑵得到的黃原膠溶液按等體積混合，得到 明膠/黃原膠溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液(其中明膠和黃原膠的濃度分別為8% (w/ v)和 2% (w/v))；(4)將步驟(3)得到的明膠/黃原膠溶液與磷酸二氫鈣-a-磷酸三鈣-碳酸鈣 (其中磷酸二氫鈣從阿拉丁試劑網(wǎng)購得，7758-23-8，化學純；a -磷酸三鈣從阿拉丁試劑網(wǎng) 購得，1040103，化學純；碳酸鈣是由淄博盛華精細化工有限公司生產(chǎn)的；將三者按摩爾比 1:1: 0.8混合得到磷酸氫鈣-a-磷酸三鈣-碳酸鈣骨水泥)按液固比2. 6mL/g充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的自固化磷酸鈣漿體，再以300r/min的攪拌速度將自固化磷酸鈣 漿體攪拌分散到8°C的大豆油中，攪拌30min后，得到含油小球粒，濾除大豆油，并用丙酮和 酒精反復洗滌微球四次，初步得到濕微球；將濕微球置于37°C、相對濕度為97%的恒溫恒 濕箱中養(yǎng)護水化5d，干燥，得到CPC微球。用激光粒度分析儀測得CPC微球的粒徑范圍為0. 37 2. 28mm ；通過壓汞法測得 微球的孔隙率為65. 4% ；通過固定漏斗法測得微球的安息角為23. 8° .按上述4個制備步驟，將其中的明膠/黃原膠溶液分別替換成只含10% (w/v)的 明膠溶液和只含10% (w/v)的黃原膠溶液，以相同的方法分別制備出只含明膠的CPC微球 (含明膠10% (w/v))和只含黃原膠的CPC微球(含黃原膠10% (w/v)；以HA粉末替代磷 酸鈣骨水泥粉末，并按照步驟上述4個步驟和添加劑含量(調(diào)和液中明膠和黃原膠的濃度 分別為8% (w/v)和2% (w/v)，制備出相同添加劑含量的非自固化的HA微球。按下面所 述的方法對比這4種微球的力學強度、抗崩解性和可降解性。4種微球均具有一定的力學強度，用手指不能將微球捻碎，分別取7顆粒徑相差 不大的上述4種微球，并用萬能力學試驗機測微球的的平均破壞載荷，測試結(jié)果如表13所
不 選取粒徑范圍在1. 43 1. 76mm的4種微球，分別將其浸泡在裝有去離子水的塑 料瓶中，并將瓶子置于37°C，120r/min的搖床中振蕩，并于一定時間間隔觀察記錄瓶中液 體的渾濁情況，由此考察4種微球的體外抗崩解時間；將4種微球以1. 5mg/ml的比例分別 浸泡在PBS溶液(lOOmM phosphate buffer，150mMNaCl，廣州市達暉生物技術(shù)有限公司，pH 值7. 2，下同)中振蕩，條件為37°C，120r/min,每隔24h換新鮮PBS，考察4種微球的體外降 解時間。體外抗崩解與體外降解測試結(jié)果如表14所示表14微球的抗崩解性和可降解性 實施例8應用明膠和槐豆膠作為粘結(jié)劑制備自固化磷酸鈣微球的步驟包括(1)將明膠顆粒(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20071019，化學純)以18g/100mL 的比例加入至58°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待明膠顆粒完全溶 解后，得到18% (w/v)的明膠溶液；(2)將槐豆膠顆粒(上海匯普工業(yè)化學品有限公司，食品級)以4. 8g/100mL的比 例加入至80°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待磷酸酯淀粉顆粒完全 溶解后，得到4. 8% (w/v)的槐豆膠溶液；(3)將步驟(1)得到的明膠溶液和步驟(2)得到的槐豆膠溶液按等體積混合，得到 明膠/槐豆膠溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液(其中明膠和槐豆膠的濃度分別為9% (w/ v)和 2. 4% (w/v))；(4)將步驟(3)得到的明膠/槐豆膠溶液與無定形磷酸鈣-磷酸氫鈣(其 ^ Wang ^"Control of crystallinity of hydrated products in a calciumphosphate bone cement, Xiupeng Wang, Jiandong Ye, Yingjun Wang, et al. Journal ofBiomedical Materials Research, Part A, 2007，81A :781_790”介紹的方法 合成，磷酸氫鈣為上海試四赫維化工有限公司生產(chǎn)的分析純試劑，兩者按質(zhì)量比1 1混合 得到無定形磷酸鈣_磷酸氫鈣骨水泥)按液固比2. 8mL/g充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的 自固化磷酸鈣漿體，再以200r/min的攪拌速度將自固化磷酸鈣漿體攪拌分散到4°C的大豆 油中，攪拌20min后，得到含油小球粒，濾除大豆油，并用丙酮和酒精反復洗滌微球五次，初 步得到濕微球；將濕微球置于50°C、相對濕度為100%的恒溫恒濕箱中養(yǎng)護水化4d，干燥， 得到CPC微球。用激光粒度分析儀測得CPC微球的粒徑范圍為0. 25 2. 03mm ；通過壓汞法測得 微球的孔隙率為58. 3% ；通過固定漏斗法測得微球的安息角為28. 2。.按上述4個制備步驟，將其中的明膠/槐豆膠溶液分別替換成只含11.4% (w/v) 的明膠溶液和只含11. 4% (w/v)的槐豆膠溶液，以相同的方法分別制備出只含明膠的CPC 微球(含明膠11.4% (w/v))和只含槐豆膠的CPC微球(含槐豆膠11.4% (w/v)；以HA粉 末替代磷酸鈣骨水泥粉末，并按照步驟上述4個步驟和添加劑含量(調(diào)和液中明膠和槐豆 膠的濃度分別為9% (w/v)和2.4% (w/v)，制備出相同添加劑含量的非自固化的HA微球。 按下面所述的方法對比這4種微球的力學強度、抗崩解性和可降解性。4種微球均具有一定的力學強度，用手指不能將微球捻碎，分別取4顆粒徑相差 不大的上述4種微球，并用萬能力學試驗機測微球的的平均破壞載荷，測試結(jié)果如表15所
不表15微球抗壓性能 選取粒徑范圍在1. 41 1. 78mm的4種微球，分別將其浸泡在裝有去離子水的塑 料瓶中，并將瓶子置于37°C，120r/min的搖床中振蕩，并于一定時間間隔觀察記錄瓶中液 體的渾濁情況，由此考察4種微球的體外抗崩解時間；將4種微球以1. 5mg/mL的比例分別 浸泡在PBS溶液(lOOmM phosphate buffer, 150mM NaCl，廣州市達暉生物技術(shù)有限公司， pH值7. 2，下同)中振蕩，條件為37°C，120r/min,每隔24h換新鮮PBS，考察4種微球的體 外降解時間。體外抗崩解與體外降解測試結(jié)果如表16所示表16微球的抗崩解性和可降解性 實施例9應用明膠和瓜爾豆膠作為粘結(jié)劑制備自固化磷酸鈣微球的步驟包括(1)將明膠顆粒(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20071019，化學純)以20g/100mL 的比例加入至58°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待明膠顆粒完全溶 解后，得到20% (w/v)的明膠溶液；(2)將瓜爾豆膠顆粒(上海匯普工業(yè)化學品有限公司，食品級)以10g/100mL的比 例加入至42°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待瓜爾豆膠顆粒完全溶 解后，得到10% (w/v)的瓜爾豆膠溶液；(3)將步驟(1)得到的明膠溶液和步驟(2)得到的瓜爾豆膠溶液按等體積混合， 得到明膠/瓜爾豆膠溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液(其中明膠和瓜爾豆膠的濃度分別為 10% (w/v)和 5% (w/v)；(4)將步驟(3)得到的明膠/瓜爾豆膠溶液與磷酸四鈣_磷酸氫鈣(其中磷酸四 鈣由鄭治等在文獻“醫(yī)用磷酸鈣骨水泥的制備及性能的實驗研究，鄭治，向其軍，劉詠等，生 物醫(yī)學工程學雜志，2006，23 (5) :1048-1051”中介紹的方法合成；磷酸氫鈣為上海試四赫 維化工有限公司生產(chǎn)的分析純試劑；將兩者按摩爾比2 3混合得到磷酸四鈣-磷酸氫鈣 骨水泥)按液固比3. 0mL/g充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的自固化磷酸鈣漿體，再以300r/ min的攪拌速度將自固化磷酸鈣漿體攪拌分散到4°C的大豆油中，攪拌lOmin后，得到含油 小球粒，濾除大豆油，并用丙酮和酒精反復洗滌微球四次，初步得到濕微球；將濕微球置于 70°C、相對濕度為100%的恒溫恒濕箱中養(yǎng)護水化3d，干燥，得到CPC微球。用激光粒度分析儀測得CPC微球的粒徑范圍為0. 48 2. 39mm ；通過壓汞法測得 微球的孔隙率為66. 4% ；通過固定漏斗法測得微球的安息角為25. 2。.按上述4個制備步驟，將其中的明膠/瓜爾豆膠溶液分別替換成只含15% (w/v)的明膠溶液和只含15% (w/v)的瓜爾豆膠溶液，以相同的方法分別制備出只含明膠的CPC 微球(含明膠15% (w/v))和只含瓜爾豆膠的CPC微球(含瓜爾豆膠15% (w/v)；以HA粉 末替代磷酸鈣骨水泥粉末，并按照步驟上述4個步驟和添加劑含量(調(diào)和液中明膠和瓜爾 豆膠的濃度分別為10% (w/v)和5% (w/v)，制備出相同添加劑含量的非自固化的HA微 球。按下面所述的方法對比這4種微球的力學強度、抗崩解性和可降解性。
4種微球均具有一定的力學強度，用手指不能將微球捻碎，分別取9顆粒徑相差 不大的上述4種微球，并用萬能力學試驗機測微球的的平均破壞載荷，測試結(jié)果如表17所
不表17微球抗壓性能 選取粒徑范圍在1. 41 1. 83mm的4種微球，分別將其浸泡在裝有去離子水的塑 料瓶中，并將瓶子置于37°C，120r/min的搖床中振蕩，并于一定時間間隔觀察記錄瓶中液 體的渾濁情況，由此考察4種微球的體外抗崩解時間；將4種微球以1. 5mg/mL的比例分別 浸泡在PBS溶液(lOOmM phosphate buffer, 150mM NaCl，廣州市達暉生物技術(shù)有限公司， pH值7. 2，下同)中振蕩，條件為37°C，120r/min,每隔24h換新鮮PBS，考察4種微球的體 外降解時間。體外抗崩解與體外降解測試結(jié)果如表18所示表18微球的抗崩解性和可降解性
成分(固相+液相)性能CPC+明膠/瓜CPC+ 明CPC +瓜爾HA+明膠/瓜爾豆膠膠豆膠爾豆膠明顯崩解的時間96014611247/min完全降解的時間 /d119114108147實施例10應用明膠、黃原膠和可溶性殼聚糖作為粘結(jié)劑制備自固化磷酸鈣微球的步驟包 括(1)將明膠顆粒(國藥集團化學試劑有限公司，F(xiàn)20071019，化學純)以12g/100mL 的比例加入至48°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待明膠顆粒完全溶 解后，得到12% (w/v)的明膠溶液；(2)將黃原膠顆粒(上海匯普工業(yè)化學品有限公司，食品級)以0. 6g/100mL的比 例加入至50°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌，待黃原膠顆粒完全溶解 后，得到0.6% (w/v)的黃原膠溶液；將可溶性殼聚糖顆粒(上海優(yōu)品生化有限公司，化學純)以1.8g/100mL的比例加入至80°C的去離子水中進行充分溶脹，并用攪拌器進行攪拌， 待可溶性殼聚糖顆粒完全溶解后，得到2.0% (w/v)的可溶性殼聚糖溶液；(3)將步驟(1)得到的明膠溶液、步驟(2)得到的黃原膠溶液和可溶性殼聚糖混合 溶液按等體積混合，得到明膠/黃原膠/可溶性殼聚糖溶液，作為磷酸鈣骨水泥調(diào)和液(其 中明膠、黃原膠、可溶性殼聚糖的濃度分別為4% (w/v),0.2% (w/v)和0.6% (w/v)；(4)將步驟(3)得到的明膠/黃原膠/可溶性殼聚糖溶液與無定形磷酸鈣_磷酸氫 鈣(其中無定形磷酸鈣按 Wang 等"Control of crystallinity of hydrated productsin a calcium phosphate bone cement, Xiupeng Wang, Jiandong Ye, Yingjun Wang, et al. Journal of Biomedical Materials Research，PartA，2007，81A :781_790”介紹的方法 合成，磷酸氫鈣為上海試四赫維化工有限公司生產(chǎn)的分析純試劑，兩者按質(zhì)量比1 1混合 得到無定形磷酸鈣_磷酸氫鈣骨水泥)按液固比2. 0mL/g充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的 自固化磷酸鈣漿體，再以200r/min的攪拌速度將自固化磷酸鈣漿體攪拌分散到10°C的大 豆油中，攪拌20min后，得到含油小球粒，濾除大豆油，并用丙酮和酒精反復洗滌微球五次， 初步得到濕微球；將濕微球置于50°C、相對濕度為100%的恒溫恒濕箱中養(yǎng)護水化3d，干 燥，得到CPC微球。用激光粒度分析儀測得CPC微球的粒徑范圍為0. 27 2. 16mm ；通過壓汞法測得 微球的孔隙率為59. 7% ；通過固定漏斗法測得微球的安息角為22. 4° .按上述4個制備步驟，將其中的明膠/黃原膠/可溶性殼聚糖溶液分別替換成只 含4. 8% (w/v)的明膠溶液和只含4. 8% (w/v)的可溶性殼聚糖溶液，以相同的方法分別制 備出只含明膠的CPC微球(含明膠4.8% (w/v))和只含可溶性殼聚糖的CPC微球(含可溶 性殼聚糖4.8% (w/v)；以HA粉末替代磷酸鈣骨水泥粉末，并按照步驟上述4個步驟和添加 劑含量(調(diào)和液中明膠和可溶性殼聚糖的濃度分別為4% (w/v)和0.6% (w/v)，制備出相 同添加劑含量的非自固化的HA微球4種微球均具有一定的力學強度，用手指不能將微球捻碎，分別取6顆粒徑相差 不大的上述4種微球，并用萬能力學試驗機測微球的的平均破壞載荷，測試結(jié)果如表19所 示表19微球抗壓性能 選取粒徑范圍在1. 52 1. 81mm的4種微球，分別將其浸泡在裝有去離子水的塑 料瓶中，將瓶子置于37°C，120r/min的搖床中振蕩，并于一定時間間隔觀察記錄瓶中液體 的渾濁情況，由此考察4種微球的體外抗崩解時間；將4種微球以1. 5mg/ml的比例分別浸泡在PBS溶液(lOOmM phosphate buffer，150mMNaCl，廣州市達暉生物技術(shù)有限公司，pH值 7. 2，下同)中振蕩，條件為37°C，120r/min，每隔24h換新鮮PBS，考察4種微球的體外降解 時間。體外抗崩解與體外降解測試結(jié)果如表20所示表20微球的抗崩解性和可降解性 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種自固化磷酸鈣微球的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)將明膠和去離子水混合，于39～60℃、攪拌，直至明膠完全溶解，得到明膠溶液；(2)將多糖膠和去離子水混合，于39～80℃、攪拌，直至多糖膠完全溶解，得到多糖膠溶液；(3)將步驟(1)得到的明膠溶液和步驟(2)得到的多糖膠溶液混合，得到明膠/多糖膠溶液，其中明膠和多糖膠的濃度分別為質(zhì)量體積比2～10％和質(zhì)量體積比0.1～5％；(4)將步驟(3)得到的明膠/多糖膠溶液與磷酸鈣骨水泥按液固比1.5～3.0mL/g充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的自固化磷酸鈣漿體，再以100～500r/min的攪拌速度將自固化磷酸鈣漿體攪拌分散到-15～10℃的大豆油中，攪拌10～90min后，濾除大豆油，并用丙酮和酒精反復洗滌微球，得到濕微球；將濕微球置于25～70℃、相對濕度為95％～100％的環(huán)境中養(yǎng)護水化2～7d，干燥，得到自固化磷酸鈣微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的多糖膠為變性淀粉、魔芋膠、 黃原膠、槐豆膠、瓜爾豆膠或可溶性殼聚糖中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的變性淀粉為氧化淀粉、羧甲基 淀粉、羥丙基淀粉、磷酸酯淀粉或醋酸酯淀粉中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的磷酸鈣骨水泥為“磷酸四 鈣_磷酸氫鈣”系統(tǒng)骨水泥、“磷酸二氫鈣_ a -磷酸三鈣-碳酸鈣”系統(tǒng)骨水泥、“磷酸四 鈣-a -磷酸三鈣”系統(tǒng)骨水泥、“磷酸四鈣_ 3 _磷酸三鈣_磷酸二氫鈣”系統(tǒng)骨水泥、“無 定形磷酸鈣-磷酸氫鈣”系統(tǒng)骨水泥或“磷酸氫鈣_ a -磷酸三鈣-碳酸鈣”系統(tǒng)骨水泥中 的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的明膠和去離子水按4 20g/100mL混合；步驟(2)中所述的多糖膠和去離子水按0. 2 10g/100mL混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(4)所述洗滌的次數(shù)為至少三次。
7.一種自固化磷酸鈣微球，由權(quán)利要求1 6任一項所述的制備方法得到。
8.權(quán)利要求7所述自固化磷酸鈣微球的應用，其特征在于所述自固化磷酸鈣微球作 為骨缺損或骨組織感染區(qū)的填充修復材料；作為牙槽骨缺損填充修復材料及牙槽嵴增高材 料、增寬材料；以及作為藥物載體材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于所述自固化磷酸鈣微球作為醫(yī)用骨缺損 填充材料，應用方法為(1)對于無明顯出血的骨缺損部位，根據(jù)缺損大小，選擇適當粒徑的自固化磷酸鈣微球 直接填滿骨缺損處，然后縫合或用磷酸鈣骨水泥封閉表面后縫合；(2)對于有明顯出血的骨缺損部位，先進行適當止血，然后將自固化磷酸鈣微球與無 毒、降解性良好的高分子粘結(jié)劑調(diào)制成注射性較好的糊狀物，再填充至骨缺損部位或通過 無針頭直通管狀注射器推注至骨缺損部位，最后進行縫合處理；(3)在微球制備的調(diào)和漿體過程中根據(jù)需要直接加入藥物或生長因子成球，組成藥物 或生長因子釋放系統(tǒng)；或者成球后通過液相吸附的形式載藥，同時實現(xiàn)骨缺損填充和藥物 控制釋放治療的雙重功效。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于所述高分子粘結(jié)劑為纖維蛋白膠、黃原 膠或槐豆膠中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種自固化磷酸鈣微球及其制備方法與應用。本發(fā)明通過將明膠和去離子水混合，得到明膠溶液；將多糖膠和去離子水混合，得到多糖膠溶液；再將完全溶解后的明膠溶液和多糖膠溶液混合，得到明膠/多糖膠溶液；接著將明膠/多糖膠溶液與磷酸鈣骨水泥充分調(diào)和、攪拌，制得呈粘稠狀的自固化磷酸鈣漿體，再將自固化磷酸鈣漿體攪拌分散于大豆油中，攪拌，濾除大豆油，并用丙酮和酒精反復洗滌微球，得到濕微球；將濕微球養(yǎng)護水化，干燥，得到自固化磷酸鈣微球。本發(fā)明所述的制備方法無需經(jīng)過燒結(jié)處理，可實現(xiàn)制備過程中同步載入藥物、生長因子或其它活性功能成分，得到的自固化磷酸鈣微球粒徑為0.12～2.61mm，可保持6～32h不發(fā)生崩解。
文檔編號A61L27/54GK101850133SQ20101018851
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月1日
發(fā)明者葉建東, 李江波, 李繼彥, 王迎軍 申請人:華南理工大學