專利名稱：擬脂聯素多肽片段用于治療缺血缺氧性腦病藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞因子應用領域，更具體地說，涉及一種擬脂聯素多肽片段用于治 療缺血缺氧性腦病藥物的應用，特別適用于罹患高原腦水腫患者。
背景技術：
急性高原病(Acute Mountain Sickness，AMS)是指由平原進入高原或由高原進 入更高海拔地區(qū)，在短期內(數小時至數日)發(fā)生的各種臨床癥候群，分為急性輕型高原病 (急性高原反應)、高原肺水腫和高原腦水腫。其中，高原腦水腫(High Altitude Cerebral Edema, HACE)多在海拔3700米以上高度發(fā)病，起病急驟，病情危重，常合并高原肺水腫、嚴 重感染、心衰、多系統(tǒng)器官功能衰竭以及并發(fā)腦出血等，病死率高，成為目前高原病預防及 治療的重點。研究證明，血管源性水腫是HACE發(fā)生的主要病理基礎，缺氧時毛細血管靜壓 升高，可能通過機械作用使腦靜脈破裂，血管通透性增加，牽張內皮細胞可能使血腦屏障開 放增加而導致水腫形成。在特殊條件下，如戰(zhàn)爭或毀滅性自然災害如地震時，大量人員快速 集結進入高原，高強度運動時，由于沒有充分的時間進行預防性教育及培訓，以及無針對病 因的治療手段，HACE對此類人員的的影響將更為顯著。脂聯素是一種由脂肪細胞分泌并釋放入血液循環(huán)而發(fā)揮作用的細胞因子，它由22 個膠原重復序列的柄和高度保守的gAd組成，正常人血漿中脂聯素含量豐富，是一種與機 體代謝密切相關的激素，具有降血糖、降血脂、胰島素增敏等作用。近年的研究發(fā)現，它與動 脈粥樣硬化以及由此引發(fā)的缺血性心臟病之間也有一定關聯。臨床觀察表明，血漿中脂聯 素水平與心肌梗死的發(fā)病危險性明顯呈負相關，而糖尿病患者血漿中脂聯素的水平會顯著 降低，另外，還發(fā)現脂聯素具有直接的抗細胞凋亡的作用。而直接利用脂聯素預防性注射入 小鼠腦內后，可以顯著減輕缺血后腦組織的水腫程度。這些結果提示脂聯素可能具有直接 的神經保護作用。而給這類患者補充外源性脂聯素可能成為一種神經保護的治療手段。雖然目前人源性脂聯素已經成功制備，但因其分子量較大，無法透過血腦屏障發(fā) 揮其神經保護作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，提供一種擬脂聯素多肽片段用于治療缺血缺氧性腦病藥物的 應用，特別是高原腦水腫發(fā)生時，通過外源性給藥，以減輕患者腦水腫損傷。申請人:根據脂聯素氨基酸序列，利用蛋白質分析技術和多肽合成技術得到了擬脂 聯素多肽片段，其氨基酸序列如下NH2-LQVYGDGDHNGLYADNVN-C00H ，并發(fā)現該該蛋白在 體內能迅速通過血腦屏障，作用于腦血管內皮細胞，促進eNOS的磷酸化并增加NO的生成， 在預防性給藥后，可在急性缺氧條件下，保護腦血管內皮細胞并顯著減輕急性缺氧后腦水 腫的程度及范圍。并采用SYBYL程序計算多肽片段分子模型并構建3D分子結構。合成的 多肽片段腹腔注射小鼠后，可以有效地通過血腦屏障并和腦內脂聯素受體結合而發(fā)揮類脂 聯素作用。
申請人研究表明，與全長的脂聯素相比，擬脂聯素多肽片段有著類似的生物學活 性，而且給藥后反應迅速，生物利用度好，有著更好的臨床應用前景。申請人:在研究中發(fā)現
1、人工合成的擬脂聯素多肽片段腹腔注射或尾靜脈注射小鼠后，可以有效地通過血腦 屏障并和腦內脂聯素受體結合而發(fā)揮類脂聯素作用，并明顯減小其缺血后的腦水腫范圍。2、擬脂聯素多肽片段能夠促進腦血管內皮細胞NO生成。3、擬脂聯素多肽片段能夠促進腦血管內皮細胞eNOS磷酸化。


圖1是擬脂聯素多肽3D空間結構A 對照多肽片段；B:擬脂聯素多肽圓圈勾出 部分為與脂聯素受體結合位點。圖2是給予小鼠擬脂聯素多肽腹腔注射后，可以明顯減小其缺血后腦水腫范圍圖 片。圖中表示對不同處理組的腦組織TCC染色，(A):未治療組，(B):擬脂聯素多肽治療組。圖3是給予小鼠擬脂聯素腹腔注射，可促進腦血管內皮細胞NO生成。圖中，Sham 對照組；Vehicle 缺血缺氧未治療組，gAD:缺血缺氧前，擬脂聯素多肽預防性治療組。**與 Vehicle 相比，Ρ<0· 01。圖4是擬脂聯素多肽促進腦血管內皮細胞eNOS磷酸化。圖中，Sham:對照組； Vehicle 缺血缺氧未治療組，gAD:缺血缺氧前，擬脂聯素多肽預防性治療組。**與Vehicle 相比，P<0. 01。以下結合附圖和發(fā)明人給出的實驗及其結果對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式1、擬脂聯素多肽人工固相合成
多肽的合成工藝分成了四個步驟，即粗肽合成、粗肽純化、色譜肽粉、精烘包。(1)粗肽合成
采用固相Fmoc-法擬脂聯素多肽合成工藝。用Fmoc-法固相多肽合成工藝合成。以 wang樹脂作為固相載體，以DMAP，DIC為縮合劑與第一個氨基酸連接；以活潑酯法連接以 后十八個氨基酸，縮合劑組成為TBTU/H0BT/DIEA ；以甲醇為清洗劑，以25%哌啶的DMF溶液 為脫保護劑；以TFA/T0SLE/EDT/PNL/H20=82. 5/5/2. 5/5/5為切割劑；以自行研制的多肽 合成器為設備建立適于擬脂聯素多肽的大規(guī)模合成工藝及設備體系。(2)粗肽純化
HPLC反相色譜法純化擬脂聯素多肽，純度大于98%。其主要工藝內容為二元梯度洗脫， 流動相A:0. 1%三氟乙酸水溶液，流動相B:0. 1%三氟乙酸乙腈溶液，洗脫時間30分鐘，B: 10 40%，流速60ml/min，檢測波長215nm，每次粗肽上樣量為lg，將主峰分為四段收集，經 HPLC分析，純度符合要求者合并濃縮，純度不符合要求的重新純化。統(tǒng)計對粗肽中目標產 物的生產收率。(3)色譜肽粉
色譜純擬脂聯素多肽濃縮及冷凍干燥。旋轉蒸發(fā)濃縮，原流動相中的乙腈隨濃縮過程 的進行被揮發(fā)除去，至肽溶液體積減少至原體積的5% 10%時停止?jié)饪s。濃縮液置-20°C預凍成冰，再置冷凍干燥機內冷凍干燥，使其脫水成為粉末，HPLC分析純度、醋酸含量及三 氟乙酸殘留。(4)精烘包
擬脂聯素多肽原料藥的精制、干燥、分裝。在10000級凈化環(huán)境下將肽粉用注射用水溶 解，用截流量10000的微孔濾膜過濾，濾液置-20°C預凍成冰，置冷凍干燥機內凍干，再將肽 粉裝在含有干燥劑五氧化二磷的真空干燥器內室溫下減壓脫水24小時，收集，稱量，分裝。 得到擬脂聯素多肽的原料。2、擬脂聯素多肽制劑的制備
總體積為IOOOml制劑緩沖液，用氫氧化鈉調整PH=7. 0，內含(30g)甘露醇其含量為3%， 計算加入擬脂聯素多肽原料使其含量為20(^g/ml，每個2ml西林瓶中灌裝0. 6ml,置冷凍干 燥機中冰凍干燥，制成擬脂聯素多肽的凍干粉針劑。稱取一定量的擬脂聯素多肽肽粉原料， 分級混合的方法與賦性劑(淀粉)混勻，裝膠囊，制作擬脂聯素多肽的膠囊制劑。3、擬脂聯素多肽原料和制劑的質量標準研究
原料檢定包括純度(HPLC)、分子量(質譜)、氨基酸組成、氨基酸序列、紫外吸收、紅外吸 收等；制劑檢定包括鑒別(化學鑒別、高效液相色譜鑒別)，檢查(包括有酸堿度、顏色與澄 清度、水分、含量均勻度、裝量差異、無菌和細菌內毒素)，含量測定等方法。所得到的擬脂聯 素多肽空間結構可見圖1，與脂聯素受體完全結合，滿足設計要求。4、藥效學研究
采用小鼠急性腦缺血模型，研究擬脂聯素多肽灌胃給藥和肌注給藥對實驗性急性腦缺 氧的防治作用。1)建立動物急性腦缺血模型
小鼠腹腔注射擬脂聯素多肽片段后，以2%異氟烷面罩吸入麻醉，術中麻醉機控制持續(xù) 吸入異氟烷。參照zea—Longa線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞缺血再灌注模型，用線栓阻 斷右側MCA的血液供應，阻斷大腦中動脈2h后退出線栓，而sham組只分離頸總動脈不置入 線拴。術中直腸溫度控制在36. 5^37. 5°C，監(jiān)測小鼠鼠顳溫和局部腦血流。2)腦水腫面積檢測
于缺血24h處死動物(每組4飛只)，迅速斷頭取腦，腦組織放入腦槽切成Imm厚的切片。 切片放入1% TTC生理鹽水中孵育3-5min (37°C pH 7.4)。采集并分析圖像。3)動物處死后，剪取基底動脈并檢測血管內皮細胞NO含量。4)檢測血管內皮細胞eNOS含量。5)、結果
(1)人工合成的擬脂聯素多肽片段腹腔注射小鼠后，可以有效地通過血腦屏障并和腦 內脂聯素受體結合而發(fā)揮類脂聯素作用，并明顯減小其缺血后的腦水腫范圍(圖2)。(2 )擬脂聯素多肽片段能夠促進腦血管內皮細胞NO生成(圖3 )。(3)擬脂聯素多肽片段能夠促進腦血管內皮細胞eNOS磷酸化(圖4)。綜上所述，申請人利用DNA重組技術和蛋白修飾技術制作出了擬脂聯素多肽片 段，并發(fā)現該該蛋白在體內能迅速通過血腦屏障，作用于腦血管內皮細胞，促進eNOS的磷 酸化并增加NO的生成，在預防性給藥后，可在急性缺氧條件下，保護腦血管內皮細胞并顯 著減輕急性缺氧后腦水腫的程度及范圍，有潛在的臨床應用價值。
采用本發(fā)明的擬脂聯素多肽片段制成的藥物為靜脈注射給藥制劑。使用對象是缺 血缺氧性腦病患者，特別是罹患高原腦水腫患者。對患者發(fā)生高原腦水腫治療時，通過外源 性給藥，以減輕發(fā)病后腦水腫程度。本發(fā)明簡單易行，且無特殊禁忌癥，可在大醫(yī)院、小診所 等廣泛使用。
權利要求
一種擬脂聯素多肽片段用于制備治療缺血缺氧性腦病藥物的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的擬脂聯素多肽片段的氨基酸序列如 下NH2-LQVY⑶⑶HNGLYADNVN-COOH。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的藥物為靜脈注射給藥制劑。
4.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的藥物是對患者發(fā)生高原腦水腫治療 時，通過外源性給藥，以減輕發(fā)病后腦水腫程度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種擬脂聯素多肽片段用于治療缺血缺氧性腦病藥物的應用，該擬脂聯素多肽片段有著脂聯素類似的生物學活性，而且給藥后反應迅速，生物利用度好，有著較好的臨床應用前景。
文檔編號A61P25/00GK101879306SQ201010185120
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權日2010年5月28日
發(fā)明者屈延, 廉坤, 張磊, 費舟, 陶凌 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學