專利名稱：一種預(yù)防或治療視網(wǎng)膜損傷的長效緩釋制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種用于預(yù)防或治療視網(wǎng)膜損傷的長效緩釋制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
文獻(xiàn)報(bào)道，視網(wǎng)膜視神經(jīng)疾病種類多樣，是重要的致盲因素之一，目前，在眼科臨床中尚未有效的治療方法。研究表明，在視神經(jīng)受到損傷后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸索損傷，導(dǎo)致軸突鞏膜篩板處軸漿運(yùn)輸受阻，使供應(yīng)營養(yǎng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子不足，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，氧化應(yīng)激和自由基大量產(chǎn)生，影響了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal Ganglion Cells, RGCs)的正常功能，造成其變性死亡；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)死亡所產(chǎn)生的毒性介質(zhì)造成細(xì)胞外環(huán)境變化，促發(fā)相鄰的健康RGCs繼發(fā)變性、凋亡，數(shù)量進(jìn)行性減少。研究已經(jīng)證明多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived NeurotrophicFactor, BDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary Neurotrophic Factor, CNTF)、 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor, ⑶NF)、促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EP0)等對受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有明確的保護(hù)作用。但是，現(xiàn)有技術(shù)中，以EPO的應(yīng)用為例，全身給藥需要劑量大，會導(dǎo)致血管生成增加和紅細(xì)胞生成而產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，且很難達(dá)到視網(wǎng)膜發(fā)揮其有效的藥效作用；玻璃體腔直接注射，短期內(nèi)顯現(xiàn)出明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，但由于半衰期短，隨著代謝其保護(hù)效果會很快減弱直至消失。臨床治療實(shí)踐中，為達(dá)到長期有效的保護(hù)作用，需要定期反復(fù)眼內(nèi)注射，這就大大增加了操作引起的并發(fā)癥，如出血、感染、并發(fā)白內(nèi)障等。國內(nèi)文獻(xiàn)針對這一問題報(bào)道了局部在玻璃體腔內(nèi)注射EPO的治療方案，其中提出了在玻璃體腔內(nèi)注射EPO的溶液達(dá)到治療和預(yù)防治療視網(wǎng)膜損傷的方法，但是經(jīng)測試，EPO在玻璃體腔內(nèi)注射后的半衰期仍然在M-36小時(shí)之間，表明其半衰期并沒得到延長，故仍然不能替代全身用藥。同樣，具有視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的其他神經(jīng)營養(yǎng)因子，在視網(wǎng)膜視神經(jīng)疾病應(yīng)用方面具有相同的缺點(diǎn)有待研究及攻克。為了克服上述的缺點(diǎn)，以達(dá)到長效的神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)又能避免因多次注射引起的一系列并發(fā)癥，提供可以長期、持久發(fā)揮療效的這類治療藥物的長效緩釋制劑引起有關(guān)研究人員的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種用于預(yù)防或治療視網(wǎng)膜損傷的長效緩釋制劑及其制備方法。具體而言，本發(fā)明用于預(yù)防或治療視網(wǎng)膜損傷的長效緩釋制劑采用促紅細(xì)胞生成素緩釋微球方法長期緩釋給藥，能解決現(xiàn)有技術(shù)長期無法克服視網(wǎng)膜損傷這類疾病需要長期頻繁的注射給藥的難題，使視網(wǎng)膜損傷患者更容易接受治療和防治的方案，減輕病人的痛苦。
本發(fā)明長效緩釋制劑采用促紅細(xì)胞生成素(EPO)為活性成分，葡聚糖為活性成分保護(hù)劑，聚乳酸-羥基乙酸聚(PLGA)、聚乳酸(PLA)或聚己內(nèi)酯(PCL)為包裹成分制成緩釋微球；所述的緩釋微球其粒徑為0. 10-500μπι，各組分其重量百分比為聚乳酸-羥基乙酸、 聚乳酸、或聚己內(nèi)酯的重量百分比為50%-99%，促紅細(xì)胞生成素為0. 5%-20%，葡聚糖為 0. 5% -30%。上述的緩釋微球各組分通過低溫誘導(dǎo)相分離方法制備促紅細(xì)胞生成素多糖顆粒， 再用水包油/油包固(s/0/w)或油包油/油包固(S/0/0)的方法制備促紅細(xì)胞生成素緩釋微球(EP0-PLGA)，所述的聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸、或聚己內(nèi)酯包裹促紅細(xì)胞生成素；所制得的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球?yàn)殚L效緩釋制劑，能用于預(yù)防或治療視網(wǎng)膜損傷。本發(fā)明中，所述的視網(wǎng)膜損傷包括視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷或視網(wǎng)膜組織損傷。其中視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷包括視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、或周細(xì)胞損傷。本發(fā)明中，所述的視網(wǎng)膜組織損傷包括黃斑變性。本發(fā)明中，所述的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞包括下組視錐細(xì)胞、視桿細(xì)胞、雙極細(xì)胞、 Muller細(xì)胞、水平細(xì)胞、無長突細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。本發(fā)明中，所述的細(xì)胞損傷主要是細(xì)胞凋亡。本發(fā)明長效緩釋制劑促紅細(xì)胞生成素緩釋微球通過下述水包油/油包固法(S/0/ W)或油包油/油包固法(S/0/0)制備①促紅細(xì)胞生成素葡聚糖微粒的制備a)預(yù)先將占促紅細(xì)胞生成素微球的重量百分比為0. 5 % -20 %的促紅細(xì)胞生成素配制成重量百分濃度為0.01%-10%溶液，葡聚糖占促紅細(xì)胞生成素微球的重量百分比 0. 5-30%配制成重量百分濃度的-30%的溶液；配制重量百分濃度為-30%的聚乙二醇溶液；b)將上述促紅細(xì)胞生成素溶液、葡聚糖溶液、PEG溶液按照一定的體積比混和并混勻；c)然后再將上述步驟b)所制備的混合均勻的混合物在冷凍室預(yù)凍8-32小時(shí)，然后凍干，d)將上述步驟C)凍干后的粉末利用有機(jī)溶劑溶解聚乙二醇(PEG)，離心除去上清液即PEG的有機(jī)溶液，重復(fù)三次，然后揮發(fā)干收集，再用有機(jī)溶劑除去聚乙醇(PEG)即得促紅細(xì)胞生成素的葡聚糖微粒；②促紅細(xì)胞生成素緩釋微球的制備a)將步驟①促紅細(xì)胞生成素的微粒加入到重量百分濃度為5-25%的聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、或聚己內(nèi)酯(PCL)有機(jī)溶液后，形成混懸液，即油相(0)中攪拌或漩渦等使之均勻分散形成均勻的混懸液；b)將完成步驟a)形成促紅細(xì)胞生成素微球的混懸液加到重量百分比濃度為 0% -10%的氯化鈉溶液和重量百分比濃度為-10%表面活性劑乳化l-5min，然后將其轉(zhuǎn)移到重量百分比濃度為-10%的氯化鈉溶液固化1-4小時(shí)；再將收集的微球用水洗滌三到五次除去表面活性劑和氯化鈉；c)將完成步驟b)的樣品凍干除去水分即得到干燥的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球其粒徑為0. 10-500 μ m。或，1)制備促紅細(xì)胞生成素葡聚糖微粒同上述步驟①；2)制備促紅細(xì)胞生成素緩釋微球d)將步驟①促紅細(xì)胞生成素的微粒加入到重量百分濃度為5-25%的聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、或聚己內(nèi)酯(PCL)有機(jī)溶液后，形成混懸液，即油相(0)中攪拌或漩渦等使之均勻分散形成均勻的混懸液；e)將完成步驟a)形成促紅細(xì)胞生成素微球的混懸液加到棉籽油、礦物油乳化 l-5min，然后把它轉(zhuǎn)移到石油醚或乙醚中固化1-4小時(shí)；然后將收集的微球用乙醚洗滌三到五次除去殘留的有機(jī)溶劑；f)將完成步驟b)的樣品揮干除去有機(jī)溶劑得到干燥的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球，其粒徑為0. 10-500 μ m。本發(fā)明所述方法中，所述的促紅細(xì)胞生成素的重量百分比濃度為0.01% -20%,所述的葡聚糖的重量百分比濃度為1 % -30 %，葡聚糖的分子量為 10000-5000000 道爾頓；所述的PEG的分子量為2，000-300, 000道爾頓，在水溶液中的重量百分比濃度為 1% -40% ；所述的促紅細(xì)胞生成素的葡聚糖微粒，其顆粒的粒徑大小在0. 01 μ m-5 μ m,所述的油相(0)為聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)或它們的任意混合物的有機(jī)溶液；所述的有機(jī)溶液中的有機(jī)溶劑為二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、庚烷、氯仿、或丙酮有機(jī)溶液，本發(fā)明中，以二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈或它們的任意組合的有機(jī)溶液為佳；所述的聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)或它們的任意混合物的有機(jī)溶液濃度為聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)或它們的任意混合物的重量百分比濃度為5% -30% ；所述的聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)它們的分子量為 5000-500000 道爾頓；所述的表面活性劑為聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 或泊洛沙姆(po loxmer)；所述的聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、或泊洛沙姆(poloxmer)它們的分子量分別為10000-1000000道爾頓、4000-300000道爾頓、 20000-400000 道爾頓或 10000-400000 道爾頓；所述的表面活性劑聚乙烯醇(PVA)的重量百分比濃度為0.5% -10%或含 0.5% -10%氯化鈉的溶液、聚乙二醇(PEG)的重量百分比濃度為0.5% -20%或含 0. 5% -10%氯化鈉的鹽溶液、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)重量百分比濃度為0. 5% -20%或含重量百分比濃度為0.5%-10%氯化鈉等鹽溶液、泊洛沙姆(poloxmer)重量百分比濃度為 0. 5% -20%或含0. 5% -10%氯化鈉等鹽溶液。所述的促紅細(xì)胞緩釋微球與0. OlM PBS按一定重量百分比混和，其比例為1 0.5-1 20。本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球長效緩釋制劑可采用局部給藥于眼部玻璃體、 皮下注射或腹腔注射途徑，均能夠?qū)κ軗p視網(wǎng)膜產(chǎn)生很好的保護(hù)作用，緩釋微球能減少給藥次數(shù)，避免多次操作引起的并發(fā)癥。本發(fā)明通過對促紅細(xì)胞生成素緩釋微球玻璃體腔注射對視神經(jīng)挫傷成年SD大鼠受損視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的長效保護(hù)作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，與僅視神經(jīng)挫傷不治療相比，本促紅細(xì)胞生成素緩釋微球能明顯提高受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率，且該緩釋微球單次玻璃體腔注射能達(dá)到促紅細(xì)胞生成素蛋白重復(fù)多次玻璃體腔注射同效的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用，并顯著減輕因多次注射引起的并發(fā)癥，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本促紅細(xì)胞生成素緩釋微球?qū)κ軗p視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有顯著的長效的保護(hù)作用。


圖1促紅細(xì)胞生成素葡聚糖微粒的掃描電鏡圖。圖2促紅細(xì)胞生成素緩釋微球的掃描電鏡圖。圖3視神經(jīng)挫傷后5天，TUNEL檢測各組RGCs凋亡情況，可見正常視網(wǎng)膜切片(A、 B、C)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層未檢測到凋亡的RGCs，各實(shí)驗(yàn)組(未治療組D-F ；EPO-PLGA組 G-I ；EPO 組J-L ；PLGA 組M_0 ；PBS 組P_R)均可見 TUNEL 陽性 RGCs，以 PLGA 組、PBS 組 TUNEL陽性細(xì)胞最多，凋亡最明顯。EPO組和EPO-PLGA組僅見少量TUNEL陽性細(xì)胞。(圖 A、D、G、J、M、P 為 TUNEL 檢測圖片；圖 B、E、H、K、N、Q 為 DAPI 標(biāo)染細(xì)胞核；圖 C、F、I、L、0、 R為TUNEL與DAPI合并。)圖4視神經(jīng)挫傷后5天各組RGCs凋亡率的比較，^"表示與未治療組相比，P < 0. 001。圖5視神經(jīng)挫傷后4W、8周各組RGCs密度比較廣表示各實(shí)驗(yàn)組與未治療組相比， P < 0. 001。
具體實(shí)施例方式以下對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明以下實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1①制備促紅細(xì)胞生成素的葡聚糖微粒a)預(yù)先將占促紅細(xì)胞生成素微球的重量百分比分別為0. 5%、10%、或20%的促紅細(xì)胞生成素配制成重量百分濃度分別為0. 01 %、10%、或20%的溶液，分別將葡聚糖(分子量為10000、2500000、或5000000道爾頓的)占促紅細(xì)胞生成素微球的重量百分比分別為 0.5%、15%或30%配制成重量百分濃度為1%、15%或30%的溶液；分別將聚乙二醇(分子量為2000、150000或300000)配制成重量百分濃度分別為1 %、20%或40%的溶液。b)把上述促紅細(xì)胞生成素溶液按促紅細(xì)胞生成素溶液葡聚糖溶液PEG溶液按照體積比=50 1 200、1 1 8或2 3 12體積比混和并混勻；c)然后將上述步驟b)混和均勻，在冷凍室預(yù)凍8-32小時(shí)，然后凍干，d)將上述步驟c)凍干后的粉末利用有機(jī)溶劑溶解聚乙二醇(PEG)，離心除去上清液即PEG的有機(jī)溶液，重復(fù)三次，然后揮發(fā)干收集，再用有機(jī)溶劑除去聚乙醇(PEG)即得到促紅細(xì)胞生成素的葡聚糖微粒，且微粒中的促紅細(xì)胞生成素與葡聚糖的重量比例分別為 1 UlO 15 或 20 30 ；②制備促紅細(xì)胞生成素緩釋微球a)將步驟①相對應(yīng)的比例制備的促紅細(xì)胞生成素的微粒分別取lmg、2. 5mg或!Bmg 加入到重量百分濃度為30%的330mg聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、或聚己內(nèi)酯 (PCL)的二氯甲烷溶液(將制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球含0.5%的促紅細(xì)胞生成素和 0.5%的葡聚糖)、重量百分濃度為15%的50mg聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、 或聚己內(nèi)酯(PCL)的二氯甲烷溶液(將制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球含10%的促紅細(xì)胞生成素和15%的葡聚糖)、或5%的140mg的聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、或聚己內(nèi)酯(PCL) 的二氯甲烷溶液(將制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球含20 %的促紅細(xì)胞生成素和30 %的葡聚糖)，形成混懸液。即油相(0)中攪拌或漩渦等使之均勻分散形成均勻的混懸液；b)將完成步驟a)形成的促紅細(xì)胞生成素微球的混懸液分別加到重量百分比濃度為0. 5%的氯化鈉溶液和重量百分比濃度為PVA、PVP或PEG的表面活性劑4mL中乳化 l-5min，然后把它轉(zhuǎn)移到重量百分比濃度為10%的氯化鈉溶液IOOOmL中固化1_4小時(shí)；然后將收集的微球用水洗滌3-5次除去表面活性劑和氯化鈉；c)將完成步驟b)的樣品凍干除去水分得到干燥的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球。制備的促紅細(xì)胞生成素葡糖微粒的掃描電鏡圖顯示粒徑大小約1-2 μ m，(如附圖 1所示)；制備的促紅細(xì)胞緩釋微球的掃描電鏡圖顯示粒徑大小約40-100 μ m(如附圖2所示)°將上述制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球和0.01M PBS按照1 0.5、1 1、 1 0.5、或1 2混勻，用于成年SD大鼠眼睛的玻璃體腔內(nèi)給藥。實(shí)施例2①制備促紅細(xì)胞生成素的葡聚糖微粒同實(shí)施例1的步驟①。a)將步驟①相對應(yīng)的比例制備的促紅細(xì)胞生成素的微粒分別取lmg、2. 5mg或!Bmg 加入到重量百分濃度為30%的330mg聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、或聚己內(nèi)酯 (PCL)的二氯甲烷溶液(將制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球含0.5%的促紅細(xì)胞生成素和 0.5%的葡聚糖)、重量百分濃度為15%的50mg聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、 或聚己內(nèi)酯(PCL)的二氯甲烷溶液(將制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球含10%的促紅細(xì)胞生成素和15%的葡聚糖)、或5%的140mg的聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、或聚己內(nèi)酯(PCL) 的二氯甲烷溶液(將制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球含20 %的促紅細(xì)胞生成素和30 %的葡聚糖)，形成混懸液。即油相(0)中攪拌或漩渦等使之均勻分散形成均勻的混懸液；b)將完成步驟a)形成促紅細(xì)胞生成素微球的混懸液分別加到重量百分比濃度重量百分比濃度為1%PVP、泊洛沙姆或PEG的棉籽油、硅油或礦物油4mL中乳化l-5min，然后把它轉(zhuǎn)移到200mL的石油醚或乙醚中固化1-4小時(shí)；然后將收集的微球用乙醚洗滌三到五次除去殘留的有機(jī)溶劑；c)將完成步驟b)的樣品揮干除去有機(jī)溶劑得到干燥的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球。
制備的促紅細(xì)胞生成素葡糖微粒的掃描電鏡圖顯示粒徑大小約1-2 μ m(如圖1所示)，制備的促紅細(xì)胞緩釋微球的掃描電鏡圖顯示粒徑大小約40-100 μ m(如圖2所示)。將上述制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球和0.01M PBS按照1 0.5、1 1、 1 0.5、或1 2混勻用于成年SD大鼠眼睛的玻璃體腔內(nèi)給藥。實(shí)施例3凋亡原位細(xì)胞凋亡檢測法(TUNEL檢測)觀察本發(fā)明長效緩釋制劑EPO緩釋微球?qū)κ軗p視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)的保護(hù)效果①實(shí)驗(yàn)動物和分組成年雄性SD大鼠(200g左右)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后檢查雙眼， 查屈光間質(zhì)清，瞳孔等大等圓，對光反射靈敏，眼底無異常。以左眼為視神經(jīng)挫傷眼，右眼為正常對照眼。根據(jù)視神經(jīng)挫傷后玻璃體腔注射給藥的不同分為以下五組未治療組(玻璃體腔不注射)，EPO組(玻璃體腔注射ΕΡ0)，EPO-PLGA組(玻璃體腔注射EPO-PLGA微球)， PBS組(玻璃體腔注射0. OlM PBS)，PLGA組(玻璃體腔注射PLGA微球)。②動物模型建立及給藥氯氨酮(80mg/kg)及甲苯噻嗪(12mg/kg)腹腔注射全身麻醉后，SD大鼠左眼周局部清潔消毒，環(huán)行剪開外眥部球結(jié)膜，打開Tenon’ s囊，鈍性分離懸韌帶，向前牽拉眼球，暴露視神經(jīng)，用微型血管鉗，持力為70g，自球后約Imm處夾持視神經(jīng)60秒造成視神經(jīng)損傷，縫合球結(jié)膜，迪可羅眼膏涂眼。術(shù)后第2天出現(xiàn)Marcus-gun瞳孔，眼球無明顯突出，眼底無出血者為模型成功。右眼不手術(shù)作為正常對照。將所制備微球懸于0. OlM PBS，視神經(jīng)損傷后，未治療組不予玻璃體腔注射，EPO組即刻玻璃體腔內(nèi)注射 EP010IU (5 μ L)，EPO-PLGA組即刻給予玻璃體腔內(nèi)注射EPO-PLGA緩釋微球0. 2mg (5 μ L，含 EPO 20IU)，PBS組即刻給予玻璃體腔內(nèi)注射0. OlM PBS (5 μ L)，PLGA組即刻給予玻璃體腔內(nèi)注射空白PLGA微球0.2mg(5yL)。術(shù)后當(dāng)時(shí)及術(shù)后每隔1天手術(shù)顯微鏡下觀察，未出現(xiàn)眼內(nèi)出血、并發(fā)白內(nèi)障、眼內(nèi)感染等，納入實(shí)驗(yàn)。③視網(wǎng)膜切片原位細(xì)胞凋亡檢測術(shù)后5天用生理鹽水200 250mL，4%多聚甲醛200mL經(jīng)心臟灌注固定后取出眼球，將眼球在4%多聚甲醛中后固定2小時(shí)，依次于20% 蔗糖、30%蔗糖浸泡過夜，沿角膜緣剪去角膜，去除晶體和玻璃體。用OCT包埋劑填滿眼球， 沿眼球矢狀面作連續(xù)冷凍切片，厚度10 μ m。原位細(xì)胞凋亡檢測采用原位細(xì)胞凋亡檢測法 (TUNEL染色法)。冰凍切片室溫晾干，用4%多聚甲醛15-20°C固定20min后，0.01M PBS沖洗30min，再用新鮮配制的含0. 1% Triton X_100、0. 枸櫞酸鈉緩液沖液4°C浸泡2min， 0. OlM PBS沖洗2min，沖洗2次。干燥標(biāo)本周邊載玻片后，滴加TUNEL混合反應(yīng)液，于37°C 下 60min，0. OlM PBS 沖洗 anin，沖洗 3 次。加 DAPI 反應(yīng)液(1 μ g/mL)，于 37°C下 lOmin，最后0.01M PBS沖洗aiiin，沖洗3次。干燥玻片，甘油封片。熒光顯微鏡觀察。④結(jié)果正常SD大鼠視網(wǎng)膜切片TUNEL檢測可見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層為陰性(如圖3A-C所示)，未見凋亡細(xì)胞。視神經(jīng)挫傷后5天，各實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰，各組均可見TUNEL陽性細(xì)胞，其中以未治療組、PBS組、PLGA組TUNEL陽性細(xì)胞最多，凋亡最明顯(如圖3D-F，M-O，P-R所示)；EPO組和EPO-PLGA組(如圖3G-I，J-L所示)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層也有TUNEL陽性細(xì)胞，但明顯少于未治療組、PBS組、PLGA組，具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P < 0. 001)(如圖4所示)，并且EPO組和EPO-PLGA組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ρ > 0. 05)。結(jié)果表明本發(fā)明EPO-PLGA緩釋微球?qū)κ軗pRGCs具有顯著保護(hù)作用，保護(hù)效果與 EPO蛋白同效。
實(shí)施例4DiI逆標(biāo)檢測本發(fā)明長效緩釋制劑EPO緩釋微球?qū)κ軗p視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs) 的長效保護(hù)作用步驟①與實(shí)施例3中①相同；②動物模型建立及給藥氯氨酮(80mg/kg)及甲苯噻嗪(12mg/kg)腹腔注射全身麻醉后，SD大鼠左眼周局部清潔消毒，環(huán)行剪開外眥部球結(jié)膜，打開Tenon’ s囊，鈍性分離懸韌帶，向前牽拉眼球，暴露視神經(jīng)，用微型血管鉗，持力為70g，自球后約Imm處夾持視神經(jīng)60秒造成視神經(jīng)損傷，縫合球結(jié)膜，迪可羅眼膏涂眼。術(shù)后第2天出現(xiàn)Marcus-gun瞳孔，眼球無明顯突出，眼底無出血者為模型成功。右眼不手術(shù)作為正常對照。將所制備微球懸于0. OlM PBS，視神經(jīng)損傷后，未治療組不予玻璃體腔注射，EPO組分別于即刻和造模后4 周玻璃體腔內(nèi)注射EP010IU (5 μ L), EPO-PLGA組即刻給予玻璃體腔內(nèi)注射EPO-PLGA緩釋微球0. 2mg(5 μ L，含EPO 20IU)，PBS組分別于即刻和造模后4周給予玻璃體腔內(nèi)注射0. OlM PBS (5 μ L)，PLGA組即刻給予玻璃體腔內(nèi)注射空白PLGA微球0. 2mg(5 μ L)。術(shù)后當(dāng)時(shí)及術(shù)后每隔1天手術(shù)顯微鏡下觀察，未出現(xiàn)眼內(nèi)出血、并發(fā)白內(nèi)障、眼內(nèi)感染等，納入實(shí)驗(yàn)。③上丘逆行標(biāo)記存活視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞SD大鼠常規(guī)處理前。用電鉆(鉆頭直徑約1. Imm)在雙側(cè)上丘相應(yīng)的位置處鉆孔，于后囟旁開1.2mm，向前2. 0mm，進(jìn)針至深度3. 2mm 處，用10 μ L的微量進(jìn)樣器注射DiI 5 μ L，縫合頭皮，縫合處涂抗生素。④視網(wǎng)膜鋪片節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)后4周、8周分別用生理鹽水200 250mL，4%多聚甲醛200mL經(jīng)心臟灌注固定后取出左眼眼球，將眼球在4%多聚甲醛中后固定2小時(shí)，于 0.01M PBS中去除眼前節(jié)和玻璃體，分離視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜平鋪于明膠化的載玻片上，在視網(wǎng)膜周邊做4處垂直于視盤的切口以便于視網(wǎng)膜平鋪，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。 每張視網(wǎng)膜四個(gè)象限距視盤1/6、3/6、5/6半徑處共拍攝12張200倍的熒光照片，對每個(gè)視野中標(biāo)記的RGCs進(jìn)行計(jì)數(shù)，求RGCs密度的平均值(個(gè)/mm2)。⑤結(jié)果視網(wǎng)膜鋪片RGCs計(jì)數(shù)顯示，正常SD大鼠RGCs密度為 2387. 69 士 164. 87 (個(gè) /mm2)；術(shù)后 4 周，未治療組、EPO 組、EPO-PLGA 組、PBS 組和 PLGA 組 RGCs 密度(個(gè)/mm2)分另Ij 為 748. 30 士 58. 81、1418. 52 士 154. 91、1四6· 68 士 157. 55、 804. 43士86. 44 和 821. 72士52. 13 ；術(shù)后 8 周，未治療組、EPO 組、EPO-PLGA 組、PBS 組和 PLGA 組 RGCs 密度(個(gè) /mm2)分別為 532. 74士35. 14、1083. 66士57. 82,913. 98士37. 72、 548. 01 士47. 00和561. 96士；34. 23 ；EPO組和EPO-PLGA組較未治療組具有明顯的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)保護(hù)作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P < 0. 001)，而EPO組和EPO-PLGA組間無明顯差異(P >0.05)。(如圖5所示)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單次玻璃體腔注射EPO-PLGA緩釋微球?qū)κ軗pRGCs的保護(hù)效果與重復(fù)定期玻璃體腔注射EPO蛋白同效，結(jié)果還顯示單次注射能顯著減少因重復(fù)注射對引起的并發(fā)癥，可降低用藥量和治療成本，不會對體內(nèi)其它器官或組織產(chǎn)生不良影響。結(jié)果證實(shí)， 本發(fā)明的EPO-PLGA緩釋微球具有長效的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療視網(wǎng)膜損傷的長效緩釋制劑，其特征在于，以促紅細(xì)胞生成素為活性成分，葡聚糖為活性成分保護(hù)劑，聚乳酸-羥基乙酸聚、聚乳酸或聚己內(nèi)酯為包裹成分制成緩釋微球；所述的聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸或聚己內(nèi)酯包裹促紅細(xì)胞生成素；各組分占所述緩釋微球的重量百分比為聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸或聚己內(nèi)酯為 50% -99%，促紅細(xì)胞生成素為0. 5% -20%，葡聚糖為0. 5% -30%。
2.按權(quán)利要求1所述的預(yù)防或治療視網(wǎng)膜損傷的長效緩釋制劑，其特征在于，所述的緩釋微球其粒徑為0. 10-500 μ m。
3.按權(quán)利要求1所述的預(yù)防或治療視網(wǎng)膜損傷的長效緩釋制劑的制備方法，其特征在于，采用水包油/油包固法(s/0/w)或油包油/油包固法(S/0/0)，包括步驟如下①制備促紅細(xì)胞生成素葡聚糖微粒a)將0.5%-20%的促紅細(xì)胞生成素配制成重量百分濃度為0.01% -10%溶液， 0. 5-30%的葡聚糖配制成重量百分濃度-30%的溶液；配制重量百分濃度為"30% 的聚乙二醇溶液；b)將上述促紅細(xì)胞生成素溶液、葡聚糖溶液或聚乙二醇溶液按照體積比混和并混勻；c)將上述步驟b)制備的混合均勻的混合物在冷凍室預(yù)凍8-32小時(shí)，然后凍干，d)將上述步驟c)凍干后的粉末用有機(jī)溶劑溶解聚乙二醇，離心除去上清液，重復(fù)三次，揮發(fā)干收集，再用有機(jī)溶劑除去聚乙二醇，得促紅細(xì)胞生成素的葡聚糖微粒；②制備促紅細(xì)胞生成素緩釋微球a)將步驟①制得的促紅細(xì)胞生成素的葡聚糖微粒加入重量百分濃度為5-25%的聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸或聚己內(nèi)酯有機(jī)溶液，形成混懸液；b)將步驟a)的混懸液加入重量百分比濃度為0%-10%的氯化鈉溶液和重量百分比濃度為-10%表面活性劑乳化l-5min，然后將其轉(zhuǎn)移到重量百分比濃度為-10%的氯化鈉溶液固化1-4小時(shí)；將收集的微球用水洗滌三到五次除去表面活性劑和氯化鈉；c)將步驟b)的樣品凍干除去水分制得促紅細(xì)胞生成素緩釋微球；或，1)制備促紅細(xì)胞生成素葡聚糖微粒同上述步驟①；2)制備促紅細(xì)胞生成素緩釋微球d)將步驟①制得的促紅細(xì)胞生成素的葡聚糖微粒加入重量百分濃度為5-25%的聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸或聚己內(nèi)酯(PCL)有機(jī)溶液后，形成混懸液；e)將步驟d)形成的混懸液加到棉籽油、礦物油乳化l-5min，然后將其轉(zhuǎn)移到石油醚或乙醚中固化1-4小時(shí)；然后將收集的微球用乙醚洗滌三到五次除去殘留的有機(jī)溶劑；f)將步驟e)的樣品揮干除去有機(jī)溶劑，得干燥的緩釋微球。
4.按權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的葡聚糖的分子量為 10000-5000000 道爾頓。
5.按權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的聚乙二醇的分子量為 2，000-300, 000 道爾頓。
6.按權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的促紅細(xì)胞生成素的葡聚糖微粒 0. 01ym_5ym。
7.按權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸或聚己內(nèi)酯的分子量為5000-500000道爾頓。
8.按權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的表面活性劑為聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮或泊洛沙姆，分子量分別為10000-1000000道爾頓、4000-300000道爾頓、20000-400000道爾頓或10000-400000道爾頓。
9.按權(quán)利要求1所述的預(yù)防或治療視網(wǎng)膜損傷的長效緩釋制劑，其特征在于，所述的視網(wǎng)膜損傷選自視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷或視網(wǎng)膜組織損傷。
10.權(quán)利要求1的長效緩釋制劑在制備治療視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷或視網(wǎng)膜組織損傷藥物中的用途，其中，所述的藥物中促紅細(xì)胞生成素緩釋微球與0. OlM PBS按1 0.5-1 20重量百分比混和。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種用于預(yù)防或治療視網(wǎng)膜損傷的長效緩釋制劑及其制備方法。本發(fā)明以促紅細(xì)胞生成素為活性成分，葡聚糖為活性成分保護(hù)劑，聚乳酸-羥基乙酸聚、聚乳酸或聚己內(nèi)酯為包裹成分制成緩釋微球；所述的聚乳酸-羥基乙酸、聚乳酸或聚己內(nèi)酯包裹促紅細(xì)胞生成素。經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明長效緩釋制劑緩釋微球單次玻璃體腔注射與重復(fù)EPO蛋白玻璃體腔注射對受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有同效的保護(hù)作用，并且緩釋微球能避免因多次注射引起的一系列并發(fā)癥，能克服重復(fù)眼內(nèi)注射給藥及基因治療存在的缺點(diǎn)。本發(fā)明采用眼內(nèi)局部給藥，可降低用藥量和治療成本，不會對體內(nèi)其它器官或組織產(chǎn)生不良影響。
文檔編號A61K47/36GK102233129SQ201010165098
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日
發(fā)明者吳飛, 榮先芳, 莫曉芬, 袁偉恩, 金拓 申請人:上海交通大學(xué), 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院