專(zhuān)利名稱(chēng)：：miR-451在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及miR-451在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：RNA是生物體內(nèi)最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，它與DNA和蛋白質(zhì)一起構(gòu)成生命的框架。但長(zhǎng)久以來(lái)，RNA一度被認(rèn)為僅僅是DNA和蛋白質(zhì)之間的“過(guò)渡”，它從DNA那兒獲得自己的順序，然后將遺傳信息轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)。然而，一系列的研究表明，這些小分子RNA事實(shí)上操縱著許多細(xì)胞功能，它可通過(guò)互補(bǔ)序列的結(jié)合反作用于DNA，從而關(guān)閉或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。最近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)非蛋白編碼的RNA家族，microRNA(miRNA,即微小RNA)，可以通過(guò)與特定mRNA結(jié)合或調(diào)節(jié)特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。目前人類(lèi)基因組中已確認(rèn)的miRNA有一千多種，可能參與調(diào)控人類(lèi)30%蛋白編碼基因的表達(dá)。MicroRNA簡(jiǎn)稱(chēng)為miRNA，通常長(zhǎng)度為1925個(gè)核苷酸，廣泛存在于各種動(dòng)植物甚至單細(xì)胞真核生物中，是一類(lèi)在進(jìn)化上高度保守的小分子單鏈RNA。miRNA位于基因內(nèi)含子區(qū)域，在細(xì)胞核內(nèi)編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄成pri-microRNA(pri-miRNA)。Pri-miRNA在一種DroshaRNase的作用下，剪切為約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)。pre-miRNA在Ran-GTP依賴(lài)的核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin5的作用下，從核內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中。在Dicer酶的作用下，pre-miRNA被剪切成2125個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈miRNA:miRNA*。隨后雙鏈miRNA:miRNA*解旋，成熟的miRNA進(jìn)入到胞漿RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)中發(fā)揮基因沉默功能。miRNA與下游特定基因的信使RNA(mRNA)的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)產(chǎn)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起該mRNA的降解或抑制其翻譯，導(dǎo)致蛋白表達(dá)失敗。我們將這些下游的基因稱(chēng)作miRNA的靶基因，他們?cè)诩?xì)胞中通常具有重要的生物學(xué)功能，miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)在細(xì)胞中行使重要的功能，與胚胎的發(fā)育，生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)。科學(xué)家已證實(shí)，miRNA的核苷酸序列在不同物種間高度保守，突變率極低，其表達(dá)有基因簇集現(xiàn)象，時(shí)空及組織特異性。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白質(zhì)基因的表達(dá)譜來(lái)決定細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等一系列重要生命活動(dòng)的進(jìn)程及多樣性。據(jù)發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅是細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要調(diào)控因子，50%以上的miRNA定位在腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域，包括L0H區(qū)、染色體擴(kuò)增區(qū)及脆性位點(diǎn)等。經(jīng)鑒定，miRNA在多種血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤中的表達(dá)譜發(fā)生改變，這為我們從RNA調(diào)控的角度揭示腫瘤發(fā)生機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，并為腫瘤診斷和治療提供新的基因靶點(diǎn)和分子標(biāo)記。在人類(lèi)基因組序列中，miR-451為一種MicroRNA，位于17qll.2，大鼠和斑馬魚(yú)基因組中，分別位于11號(hào)和5號(hào)染色體。miR-451的序列為5’-aaaccguuaccauuacugaguu-3’(GeneBank:GeneID=574411)。miR-451在進(jìn)化上高度保守，不同物種間存在同源性。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的資料顯示，肺癌的發(fā)病率和死亡率在世界各國(guó)均呈明顯上升的趨勢(shì)，尤其是工業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家。在發(fā)達(dá)國(guó)家，肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，列男性常見(jiàn)惡性腫瘤的第一位，列女性常見(jiàn)惡性腫瘤的第2、3位。20世紀(jì)末肺癌已占惡性腫瘤死亡的首位。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%，可分為鱗癌、腺癌、大細(xì)胞肺癌等。許多肺癌患者在診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，往往失去手術(shù)機(jī)會(huì)，而針對(duì)肺癌的化療方案效果亦欠佳，患者容易產(chǎn)生耐藥，五年生存率低于5%，亟需尋找新的、有效的治療肺癌的方法。隨著基因工程研究的深入，科學(xué)家對(duì)運(yùn)用基因工程研制腫瘤藥表現(xiàn)出濃厚的興趣。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR-451在治療非小細(xì)胞肺癌方面具有很好應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)目的本發(fā)明的目的是提供miR-451在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)下列步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)的1、擴(kuò)增Pre-miR-451:Pre_miR-451，即編碼miR-451前體pre-miR-451的基因序列，其RT及PCR引物由invitrogen公司合成，引物序列見(jiàn)具體實(shí)施例中RT-PCR。RT-PCR擴(kuò)增Pre-miR-451，純化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，約72bp處擴(kuò)增出一條與預(yù)期大小相一致的條帶。2、連接pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體(購(gòu)自上海吉瑪公司，載體見(jiàn)圖1，其中EmGFP為綠色熒光蛋白報(bào)告基因，用以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率)，經(jīng)BamHI和XhoI酶切后得到線性載體，將PCR產(chǎn)物連接至載體上構(gòu)成pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451重組體。10ul連接體系2ulPCR產(chǎn)物，lul線性載體，lul10*T4ligasebuffer,1u1T4DNAligase，5ulddH20。3、轉(zhuǎn)化A、制備新鮮大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(JM109)，混勻感受態(tài)細(xì)胞。B、取20ul感受態(tài)細(xì)胞于新的離心管中，加入lul連接體系，靜置30min冰浴。C、感受態(tài)細(xì)胞于42°C加熱42秒，取出后迅速4°C冰水中放置2min。D、加入400ul空白LB培養(yǎng)液，37°C振搖，恒溫培養(yǎng)30min，重懸后用消毒玻棒涂于瓊脂板上，待板干燥后，倒置平皿，37°C孵育1216h。4、擴(kuò)增根據(jù)該質(zhì)粒載體上攜帶殺稻瘟菌素抗性的特性，挑選陽(yáng)性克隆于5mlLB培養(yǎng)液中37°C恒溫振搖1216h，大量擴(kuò)增pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451重組體。重組體提取、純化參照BI0MIGA無(wú)內(nèi)毒質(zhì)粒小提試劑盒(PD1214)說(shuō)明書(shū)。5、載體pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451經(jīng)BamHI和XhoI酶切得到兩個(gè)片段，分別為72bp的Pre-miR-451片段和5.7kb的線性pcDNA6.2-GW載體，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列完全一致。6、測(cè)序正確的重組體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞使用脂質(zhì)體法，轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTiGOOO說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率用流式細(xì)胞儀分析，不同的細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率均可達(dá)到60%。7、Pre-miR-451隨質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞后，CMV啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中快速、高效、持續(xù)表達(dá)Pre-miR-451，經(jīng)過(guò)Drosha(RNaselll)作用形成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre_miR-451(約72nt)，再經(jīng)過(guò)Dicer作用形成成熟的miR-451(22nt)，發(fā)揮基因沉默功能。一、miR-451抗非小細(xì)胞肺癌的基礎(chǔ)驗(yàn)證試驗(yàn)(一):miR-451在非小細(xì)胞肺癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)譜1.樣本準(zhǔn)備收集60例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)臨床病理分析均屬于Illb和IV期，標(biāo)本由南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科提供。2.芯片制備及分析按照美國(guó)的LCSciences公司的要求準(zhǔn)備肺癌組織標(biāo)本，交由LCSciences公司進(jìn)行芯片制備，SangermiRBaseV10.0版本完成芯片分析。3.芯片結(jié)果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自LCSciences公司，結(jié)果如圖2及表格1所示。4.結(jié)果分析miR-451在正常組織(SampleA)中信號(hào)為26，894.73，在腫瘤組織(SampleB)中信號(hào)為157.30，log2(SampleB/SampleA)為_(kāi)7.41，表示miR-451在正常組織中高表達(dá)，在腫瘤組織中顯著低表達(dá)，二者差異達(dá)150倍，提示miR-451在肺癌中可能作為一個(gè)抑癌基因發(fā)揮重要的抗腫瘤作用。表1顯著性差異列表(p值<0.01的顯著性差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄子，其中hsa為檢測(cè)人標(biāo)本的探針)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(二)RT_PCR分析miR-451在非小細(xì)胞肺癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)譜1.方法Trizol試劑提取組織總RNA，RT-PCR運(yùn)用Ambion公司SuperTaq聚合酶系統(tǒng)和mirVana檢測(cè)盒，人TO作為內(nèi)參。2.RT-PCR結(jié)果如圖3所示。3.結(jié)果分析miR-451在正常組織中表達(dá)量增高，腫瘤組織中表達(dá)下降，與基因芯片結(jié)果一致。二、miR-451對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、耐藥的影響(一)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)1.MTT法測(cè)細(xì)胞增殖選擇四株NSCLC細(xì)胞系，其中肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，H3255，肺鱗癌細(xì)胞系H157，肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系H1299，四株細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Pre-miR-451為實(shí)驗(yàn)組，空載體序列(negativecontrol,NC)設(shè)為對(duì)照組。將這些細(xì)胞株種在96孔板上，2500個(gè)細(xì)胞/孔。轉(zhuǎn)染3天后MTT染色法監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況。2.結(jié)果測(cè)定如圖4所示。3.結(jié)果分析MTT法顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了Pre-miR-451的A549細(xì)胞增殖數(shù)明顯減少。H157，H1299，H3255三個(gè)細(xì)胞系中也觀察到此現(xiàn)象，提示miR-451可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)1.Caspase3/7活性法測(cè)細(xì)胞凋亡在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549,HI57，HI299，H3255中分別轉(zhuǎn)染Pre-miR-451和空載體序列，后者設(shè)為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染72h后將這些細(xì)胞株分放于OilMDDP(順鉬，化療藥)和2iiMDDP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，運(yùn)用ApoONEHomogeneousCaspase3/7Assay測(cè)定細(xì)胞中caspase3/7活性。2.caspase3/7活性測(cè)定如圖5所示。3.結(jié)果分析與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染Pre-miR-451后，四個(gè)細(xì)胞系中均出現(xiàn)caspase3/7活性上升，提示miR-451可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。盡管單用Pre-miR-451引起的caSpaSe3/7活性增加沒(méi)有單用DDP效果明顯，但聯(lián)合使用DDP和Pre-miR-451后，caspase3/7活性顯著上升，高于單用Pre-miR-451和DDP提示miR-451能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，可作為腫瘤治療的干預(yù)靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)三細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)1.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)A549細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染Pre-miR-451和空載體序列，后者設(shè)為對(duì)照，接種到Transwell上室中，選擇接種后24h，48h，72h時(shí)間點(diǎn)觀察A549細(xì)胞侵襲情況。2.細(xì)胞計(jì)數(shù)用直接計(jì)數(shù)法測(cè)定Transwell下室中腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組。計(jì)數(shù)結(jié)果如圖6所示。3.結(jié)果分析與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染Pre-miR-451后A549細(xì)胞的侵襲能力下降，miR-451可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)四活體水平觀察miR-451的抗癌作用(一)、皮下瘤實(shí)驗(yàn)1.活體模型我們選取四只5-6周齡大小的雌性裸鼠，將轉(zhuǎn)染了Pre-miR-451和空載體(NC)的A549細(xì)胞分別接種到同一只小鼠兩側(cè)肋背部的皮下組織中，每側(cè)接種細(xì)胞數(shù)為1*105或5*104個(gè)，觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。2.腫瘤生長(zhǎng)情況評(píng)估每天觀察一次，持續(xù)至少五周。測(cè)量腫瘤灶的長(zhǎng)度L和寬度W，按照公式(L*W~2)*0.5計(jì)算腫瘤灶的體積來(lái)判斷miR-451在活體水平對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。3.測(cè)量結(jié)果到觀察結(jié)束為止，4只小鼠轉(zhuǎn)染了Pre-miR-451的一側(cè)未見(jiàn)明顯腫瘤灶的形成，而4只小鼠中有3只在觀察的22-27天時(shí)，接種NC—側(cè)可觸摸到腫瘤灶的形成，觀察結(jié)束時(shí)，這些腫瘤灶體積為35-145cm2大小。腫瘤體積如圖7所示。4.結(jié)果分析從活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，miR-451在小鼠體內(nèi)可抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，與我們之前在細(xì)胞系水平得到的結(jié)果一致，證實(shí)了miR-451具有抑癌作用。(二)肺原位癌實(shí)驗(yàn)1、肺癌模型的建立的材料4只Lox-stop-loxK-RasG12D(LSLK-RasG12D)轉(zhuǎn)基因小鼠由人類(lèi)癌癥協(xié)會(huì)小鼠模型庫(kù)(MouseModelsofHumanCancerConsortium,MMHCC)饋贈(zèng)，HEK293(AmericanTypeCultureCollection,cat#CRL.1573)腺病毒的包裝細(xì)胞由第三軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室饋贈(zèng)，ADCre,AdPre-miR-451重組腺病毒由Microbix公司提供。Ad腺病毒載體上帶有0半乳糖苷酶操縱子，用以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。利用Cre重組酶在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)K-Ras基因表達(dá)，促進(jìn)肺部腫瘤發(fā)生的原理建立肺腺癌的模型°參照文獻(xiàn)⑴Thelet_7microRNAreducestumorgrowthinmousemodelsoflungcancer.CellCycle7:6，759-764.2008(2)小鼠肺腺癌動(dòng)物模型的建立。山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)。1007-6611(2009)05-0408-03。2、建模步驟及miR-451的干預(yù)以戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉3周齡小鼠，再以Ad腺病毒CaPi(Ad腺病毒CaPi:滴度為2.5X10，pfu的Ad腺病毒50ul加入到69ul的MEM中，再加入6ul的2.5mol/L的氯化鈣)的共沉淀物滴入小鼠的鼻腔，共滴入約125ul，分2次滴人，隔5天后重復(fù)，共兩次。實(shí)驗(yàn)組AdCre+AdPre-miR-451，n=2，對(duì)照組AdCre+AdNC,n=2。3、結(jié)果測(cè)定鼻腔滴注7周后處死小鼠，取小鼠肺部組織稱(chēng)重，石蠟包埋，切片，HE染色。實(shí)驗(yàn)組(Cre/Pre-miR-451)較對(duì)照組(Cre/NC)相比腫瘤體積顯著縮小，肺腫瘤全肺組織比值如圖8所示。4、結(jié)果分析該實(shí)驗(yàn)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因小鼠LSLK-RasG12D建立肺腺癌模型，再次證明，miR-451可抑制肺腺癌的發(fā)生，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。所述miR-451的表達(dá)載體，這些表達(dá)載體包括但不限于質(zhì)粒、細(xì)菌、宿主細(xì)胞。含有治療有效量的所述miR-451或其表達(dá)載體和藥學(xué)上允許的輔料組成的藥物組合物。所述的藥物組合物，其制劑采用藥學(xué)上允許的任意一種劑型，包括但不限于片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑、口服液或脂質(zhì)體。上述miR-451序列或它們的表達(dá)載體在制備腫瘤靶向藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.0軟件(Release11.0，SPSSInc.)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)表示以均值士標(biāo)準(zhǔn)差。進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，結(jié)果以P<0.05為差異有顯著性意義有益效果1、目前較為常用的制備miRNAs的方法，有體外制備miRNAs和以DNA為模板轉(zhuǎn)染到細(xì)胞并在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到miRNAs。本發(fā)明采用了后一種方法，本法簡(jiǎn)便，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道可成功制備miRNAs，不需要直接操作RNA，克服了人工合成miRNA容易降解，成本昂貴的缺點(diǎn)。而且由于含表達(dá)載體的菌株可長(zhǎng)期保存并大量擴(kuò)增，為今后的研究提供了極大的方便。2、由于miR-451在體內(nèi)一般以前體形式(pre_miR-451)存在，并且Pri_miR-451在一種DroshaRNase的作用下，剪切為約72個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)。pre-miR-451在Ran-GTP依賴(lài)的核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin5的作用下，從核內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中。在Dicer酶的作用下，pre-miR-451被剪切成22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈miRNA:miRNA*o隨后雙鏈miRNA:miRNA*解旋，成熟的miR-451進(jìn)入到胞漿RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)中發(fā)揮基因沉默功能。由于Pre-miR-451在體內(nèi)可以成功地加工成為成熟體miR-451，本發(fā)明也采用Pre-miR-451代替miR-451。試驗(yàn)中通過(guò)重組體轉(zhuǎn)染大腸桿菌JM109細(xì)胞獲得大量的Pre-miR-451，為進(jìn)行相應(yīng)的藥理試驗(yàn)做好準(zhǔn)備。同時(shí)為了避免載體對(duì)本實(shí)驗(yàn)影響，采用空載體做對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果表明空載體對(duì)本發(fā)明沒(méi)有影響。3、通過(guò)miR-451對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、耐藥的影響，說(shuō)miR-451對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、耐藥皆有抑制作用，且促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)活體水平也表明miR-451具有抗癌作用。圖1為表達(dá)miR-451的質(zhì)粒載體。圖2為基因芯片分析肺癌組織與癌旁正常組織中miRNA表達(dá)譜的情況(左邊的SampleA是癌旁正常組織，信號(hào)值為Cy3；中間的SampleB是肺癌組織，信號(hào)值為Cy5，右邊的是癌旁/癌的信號(hào)比值Cy3/Cy5；在Cy3/Cy5信號(hào)比值圖中，當(dāng)Cy3信號(hào)高于Cy5信號(hào)時(shí)，色彩顯示為綠色；當(dāng)Cy3信號(hào)與Cy5信號(hào)相當(dāng)時(shí)，色彩顯示為黃色；當(dāng)Cy5信號(hào)高于Cy3信號(hào)時(shí)，色彩顯示為紅色)。圖3RT-PCR測(cè)肺癌組織⑴與癌旁正常組織(N)中miR-451水平，GAPDH設(shè)為內(nèi)參。圖4為MTT法測(cè)miR-451對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，H1299，H3255，H157細(xì)胞增殖的作用。圖5為miR-451前體對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，H1299，H3255，H157凋亡的檢測(cè)圖6為T(mén)ranswell法測(cè)miR-451前體對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞遷移的作用圖7為活體實(shí)驗(yàn)測(cè)miR-451對(duì)A549細(xì)胞增殖的作用，縱坐標(biāo)為皮下瘤體積，橫坐標(biāo)為小鼠代號(hào)圖8為L(zhǎng)SLK-RasG12D轉(zhuǎn)基因小鼠模型上觀察miR-451對(duì)肺腺癌生長(zhǎng)的作用，其中縱坐標(biāo)為肺腫瘤(Tumor)全肺組織(TotalLungArea)的比值；橫坐標(biāo)為轉(zhuǎn)基因小鼠代號(hào)，#1，#2為實(shí)驗(yàn)組(Cre/Pre-miR-451)，#3，#4為對(duì)照組(Cre/NC)。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。一般性說(shuō)明實(shí)施例中末注明具體條件的的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照Sambrook，J等人編著的8《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黃培堂等譯，科學(xué)出版社.2002.8)中所述的條件及方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進(jìn)行，其它沒(méi)有詳細(xì)描述的技術(shù)相應(yīng)于本領(lǐng)域人員來(lái)說(shuō)是熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。本發(fā)明的材料本申請(qǐng)中提及的微生物、細(xì)胞系、質(zhì)?；蚱渌磉_(dá)載體以及培養(yǎng)基均有商品供應(yīng)或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對(duì)本發(fā)明不是唯一的，可分別用其它適合的工具和生物材料來(lái)代替。實(shí)施例11、擴(kuò)增Pre-miR-451:Pre_miR-451，其RT及PCR引物由invitrogen公司合成，引物序列見(jiàn)如下的RT-PCR。RT-PCR擴(kuò)增Pre-miR-451，純化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，約72bp處擴(kuò)增出一條與預(yù)期大小相一致的條帶。RT-PCR分別設(shè)計(jì)miR-451和TO(作為內(nèi)參)引物，由Invitrogen公司合成。1)引物序列及反應(yīng)條件MiR-451的RT引物5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAACTCAG-3，GAPDH的RT引物為Oligo(dT)15表1.PCR引物序列及反應(yīng)條件GenesymbolPrimersCDNATacyclesPre-miR-451Forv/ard:5'-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTAcr-yReverse:5'-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3'72bp60°C30GAPDHforword:5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3'lOlbp55°C35Reverse:5'-GG6TGGAATCATATTGGAACATGT-3'2)cDNA的合成5XRTBufferdNTPInhibitorPrimerRNARTaceH20(RNaseFree)4u12u11u11u1lU1(質(zhì)量小于1Ug)1u110u1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>3)RT-PCR反應(yīng)體系(50u1體系)以cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系10XExTaqBuffer(Mg2+Free)5u1MgC12(25mM)5u1dNTP(2.5mM)5u1上游引物(20pM/iil)2u1下游引物(20pM/iil)2u1Template2u1ExTaq(5U/u1)0.5u1ddH2028.5ill_總體積50ill采用以下反應(yīng)條件94°C2min預(yù)變性，后接35個(gè)循環(huán)(18SRNA25個(gè)循環(huán))，每一次循環(huán)的條件是94°C30s變性，54°C45s退火，72°C2分鐘延伸。4)PCR產(chǎn)物的鑒定50\了六￡|￡存液配制撲1860.5g，冰醋酸14.3ml，0.5mol/LEDTA25ml，加ddH20至250ml。1.0%瓊脂糖凝膠配制瓊脂糖1.0g，1XTAE溶液100ml，加熱至瓊脂糖融解，冷卻至50°C左右時(shí)加入溴乙錠至0.g/ml，鋪板凝固后使用。瓊脂糖凝膠電泳電泳槽中注入IXTAE溶液至高于凝膠面，取10illPCR產(chǎn)物，加1yl的10XDNA上樣緩沖液，混勻上樣，用DL2000DNAMarker作為參照，80V電泳，捷達(dá)凝膠成像系統(tǒng)觀察并采集圖象，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。2、連接pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體購(gòu)自上海吉瑪公司，(載體見(jiàn)圖1，其中EmGFP為綠色熒光蛋白報(bào)告基因，用以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率)，經(jīng)BamHI和Xhol酶切后得到線性載體，將PCR產(chǎn)物連接至載體上構(gòu)成pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451重組體。10ul連接體系2ulPCR產(chǎn)物，lul線性載體，lul10*T41igasebuffer,lulT4DNAligase，5ulddH20。3、轉(zhuǎn)化1.制備新鮮大腸桿菌感受態(tài)(JM109)細(xì)胞，混勻感受態(tài)細(xì)胞2.取20ul感受態(tài)細(xì)胞于新的離心管中，加入lul連接體系，靜置30min冰浴。3.于42°C加熱42秒，取出后迅速4°C冰水中放置2min。4.加入400ul空白LB培養(yǎng)液，37°C振搖，恒溫培養(yǎng)30min，重懸后用消毒玻棒涂于瓊脂板上，待板干燥后，倒置平皿，37°C孵育1216h。4、擴(kuò)增根據(jù)該質(zhì)粒載體上攜帶殺稻瘟菌素抗性的特性，挑選陽(yáng)性克隆于5mlLB培養(yǎng)液中37°C恒溫振搖1216h，大量擴(kuò)增pcDNATM6.2-Gff-Pre-miR-451重組體。重組體提取、純化參照BI0MIGA無(wú)內(nèi)毒質(zhì)粒小提試劑盒(PD1214)說(shuō)明書(shū)。5、真核表達(dá)載體pcDNATM6.2-Gff-Pre-miR-451經(jīng)BamHI和XhoI酶切得到兩個(gè)片段，分別為72bp的Pre-miR-451片段和5.7kb的線性pcDNA6.2-GW載體，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，pcDNA6.2-Gff-Pre-miR-451測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列完全一致。6、測(cè)序正確的重組體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞使用脂質(zhì)體法，轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTiGOOO說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率用流式細(xì)胞儀分析，不同的細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率均可達(dá)到60%。實(shí)施例2MTT法測(cè)細(xì)胞增殖1)接種細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMIt604培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔100-1000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul。分成四個(gè)實(shí)驗(yàn)組空載體組、Pre-miR-451組，DDP組，Pre-miR-451+DDP組。2)培養(yǎng)細(xì)胞；將培養(yǎng)板移入COz孵箱中，在37°C、5%C02及濕度條件下，培養(yǎng)3_5天。3)呈色培養(yǎng)第2-5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37°C，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。加入150illDMS0(二甲基亞砜)振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。4)比色490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值(0D)，每組3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。以空載體感染對(duì)照組作為對(duì)照，計(jì)算生存率。生存率=實(shí)驗(yàn)組0D值/對(duì)照組0D值X100%。按如上方法選擇四株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NSCLC系，其中肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，H3255，肺鱗癌細(xì)胞系H157，肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系H1299，四株細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-451前體序列(Pre-miR-451)，空載體序列(negativecontrol)設(shè)為對(duì)照組。將這些細(xì)胞株種在96孔板上，2500個(gè)細(xì)胞/孔。轉(zhuǎn)染3天后MTT染色法監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況。MTT法顯示與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了Pre-miR-451的A549細(xì)胞增殖數(shù)明顯減少。H157，H1299，H3255三個(gè)細(xì)胞系中也觀察到此現(xiàn)象，提示miR-451可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)施例3細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)(蛋白免疫印跡法測(cè)定)1.提取細(xì)胞總蛋白2.SDS-PAGE電泳1)清洗、安裝玻璃板，陶瓷片。2)配制灌注分離膠，37°C靜置25min。11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3)配制灌注濃縮膠，室溫靜置20min。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4)加蛋白樣品和分子量marker，每個(gè)時(shí)期蛋白上樣量均為40yg。5)恒壓電泳(濃縮膠80V，分離膠160V)。3.半干式轉(zhuǎn)膜1)電泳結(jié)束后，戴手套，根據(jù)目的蛋白分子量范圍參照分子量marker切膠(切角標(biāo)記)，切相同大小硝酸纖維素膜(切角標(biāo)記)一張和濾紙2張。2)轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡膠、膜和濾紙lOmin。3)在轉(zhuǎn)膜儀上從下至上平鋪濾紙，膜，凝膠，濾紙，趕除氣泡，尤其注意膜和凝膠之間禁留氣泡。擦干多余液體，0.8mAX膜面積(cm2)電流轉(zhuǎn)膜1.5小時(shí)。4.免疫印跡1)轉(zhuǎn)膜結(jié)束，檢驗(yàn)marker是否已轉(zhuǎn)至膜上(或麗春紅染色)以判定轉(zhuǎn)膜效果。TBST清洗膜后，5%脫脂奶粉(TBST配制)4°C封閉過(guò)夜。2)加一抗CaSpaSe-3/7(激活型)單克隆抗體(1500和1500)，室溫?fù)u動(dòng)2h。3)TBST漂洗3次，每次lOmin。4)加二抗(1200)，室溫?fù)u動(dòng)lh。5)TBST漂洗3次，每次lOmin。5.ECL檢測(cè)1)AB液混合，待膜不滴水后，平鋪其上。2)反應(yīng)5min后，根據(jù)熒光強(qiáng)度暗室壓片5s30min。3)顯影1530s，水洗，定影13min。4)圖片掃描和定量分析。按如上方法，在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549，H157，H1299，H3255中分別轉(zhuǎn)染Pre-miR-451和空載體序列，后者設(shè)為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染72h后將這些細(xì)胞株分放于OyMDDP(順鉬，化療藥)和2iiMDDP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，運(yùn)用ApoONEHomogeneousCaspase3/7Assay測(cè)定細(xì)胞中caspase3/7活性。caspase3/7活性測(cè)定如圖5所示。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染Pre-miR-451后，四個(gè)細(xì)胞系中均出現(xiàn)caSpaSe3/7活性上升，提示miR-451可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。盡管單用Pre-miR-451引起的caSpaSe3/7活性增加沒(méi)有單用DDP效果明顯，但聯(lián)合使用DDP和Pre-miR-451后，caspase3/7活性顯著上升，提示miR-451能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，可作為腫瘤治療的干預(yù)靶點(diǎn)。實(shí)施例4Transwell(細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn))1.Transwell小室準(zhǔn)備①包被基底膜用50mg/LMatrigel18稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4°C風(fēng)干。②水化基底膜吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無(wú)血清培養(yǎng)液，37°C，30min。2.制備細(xì)胞懸液①制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12_24h，進(jìn)一步去除血清的影響。②消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1-10X105。3.接種細(xì)胞①取細(xì)胞懸液100-200u1加入Transwell小室，②24孔板下室一般加入500ill含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，③培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)12_48h(主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定)。4.結(jié)果統(tǒng)計(jì)“貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過(guò)膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里。通過(guò)給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞①用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，有結(jié)晶紫染色。②細(xì)胞計(jì)數(shù)我們使用的是LeicaDC300F正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，把Transwell小室反過(guò)來(lái)底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細(xì)胞。“非貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)由于某些細(xì)胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時(shí)細(xì)胞在穿過(guò)膜后不能附著在膜上，而是掉進(jìn)下室。按如上方法將A549細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染Pre-miR-451或空載體序列，后者設(shè)為對(duì)照，接種到Transwell上室中，選擇接種后24h，48h，72h時(shí)間點(diǎn)觀察A549細(xì)胞侵襲情況。細(xì)胞計(jì)數(shù)用直接計(jì)數(shù)法測(cè)定Transwell下室中腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組。計(jì)數(shù)結(jié)果如圖6所示。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染Pre-miR-451后A549細(xì)胞的侵襲能力下降，miR-451可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移。實(shí)施例5活體水平觀察miR-451的抗癌作用皮下瘤實(shí)驗(yàn)1、活體模型我們選取四只5-6周齡大小的雌性裸鼠，將轉(zhuǎn)染了miR-451和空載體(NC)的A549細(xì)胞分別接種到同一只小鼠兩側(cè)肋背部的皮下組織中，每側(cè)接種細(xì)胞數(shù)為1*105或5*104個(gè)，觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。2、腫瘤生長(zhǎng)情況評(píng)估每天觀察一次，持續(xù)至少五周。測(cè)量腫瘤灶的長(zhǎng)度L和寬度W，按照公式(L*W~2)*0.5計(jì)算腫瘤灶的體積來(lái)判斷miR-451在活體水平對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。3、測(cè)量結(jié)果到觀察結(jié)束為止，轉(zhuǎn)染了miR-451前體的一側(cè)未見(jiàn)明顯腫瘤灶的形成，而4只小鼠中有3只在觀察的22-27天時(shí)，接種NC—側(cè)可觸摸到腫瘤灶的形成，觀察結(jié)束時(shí)，這些腫瘤灶體積為35-145cm2大小。腫瘤體積如圖7所示。4、結(jié)果分析從活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，miR-451在小鼠體內(nèi)可抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，與我們之前在細(xì)胞系水平得到的結(jié)果一致，證實(shí)了miR-451具有抑癌作用。肺原位癌實(shí)驗(yàn)1、肺癌模型的建立的材料4只Lox-stop-loxK-RasG12D(LSLK-RasG12D)轉(zhuǎn)基因小鼠由鼠由人類(lèi)癌癥協(xié)會(huì)小鼠模型庫(kù)(MouseModelsofHumanCancerConsortium,MMHCC)饋贈(zèng)，HEK293(AmericanTypeCultureCollection,cat#CRL.1573)腺病毒的包裝細(xì)胞由第三軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室饋贈(zèng)，ADCre,AdPre-miR-451重組腺病毒由Microbix公司提供。Ad腺病毒載體上帶有3半乳糖苷酶操縱子，用以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。利用Cre重組酶在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)K-Ras基因表達(dá)，促進(jìn)肺部腫瘤發(fā)生的原理建立肺腺癌的模型°相關(guān)文獻(xiàn)⑴Thelet_7microRNAreducestumorgrowthinmousemodelsoflungcancerCellCycle7:6，759-764.2008(2)小鼠肺腺癌動(dòng)物模型的建立。山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)。1007-6611(2009)05-0408-03。2、建模步驟及miR-451的干預(yù)以戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉3周齡小鼠，再以Ad腺病毒CaPi(Ad腺病毒CaPi:滴度為2.5X10，pfu的Ad腺病毒50ul加入到69ul的MEM中，再加入6ul的2.5mol/L的氯化鈣)的共沉淀物滴入小鼠的鼻腔，共滴入約125ul，分2次滴人，隔5天后重復(fù)，共兩次。實(shí)驗(yàn)組AdCre+AdPre-miR-451，n=2，對(duì)照組AdCre+AdNC,n=2。3、結(jié)果測(cè)定鼻腔滴注7周后處死小鼠，取小鼠肺部組織稱(chēng)重，石蠟包埋，切片，HE染色。實(shí)驗(yàn)組(Cre/Pre-miR-451)較對(duì)照組(Cre/NC)相比腫瘤體積顯著縮小，肺腫瘤全肺組織比值如圖8所示。4、結(jié)果分析該實(shí)驗(yàn)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因小鼠LSLK-RasG12D建立肺腺癌模型，再次證明，miR-451可抑制肺腺癌的發(fā)生，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。權(quán)利要求miR-451在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及miR-451在制備治療非小細(xì)胞肺癌藥物的應(yīng)用；通過(guò)對(duì)Pre-miR-451的重組體對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、耐藥的影響，說(shuō)明miR-451對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、耐藥皆有抑制作用，對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，同時(shí)活體水平也表明miR-451具有良好抗癌作用。文檔編號(hào)A61P11/00GK101804208SQ20101011455公開(kāi)日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年2月26日優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日發(fā)明者德偉,楊勁松,潘旋,王朝霞,王銳,袁櫟,邊海波,陳龍邦申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué);南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院;中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院