專利名稱：一種含附屬器的組織工程皮膚的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料的組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用羊膜來源細胞構(gòu)建
具有附屬器組織工程皮膚的方法。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，具有保護機體、調(diào)節(jié)體溫、排泄廢物的功能，是覆蓋與保 護體表和內(nèi)臟器官的重要組織。炎癥、潰瘍、外傷、燒傷、腫瘤術(shù)后以及先天畸形等原因常造 成皮膚和粘膜的缺損及異常。正常的皮膚含有分化良好的表皮層和真皮層，理想的愈合創(chuàng) 面應(yīng)具有完整的表皮層、真皮層以及毛囊、汗腺等附屬器結(jié)構(gòu)；表皮層能夠起到屏障和保護 作用，防止有害物質(zhì)通過體表進入機體；真皮層為皮膚提供機械保護和外觀特征，在創(chuàng)面愈 合、生長、抵抗細菌及防御外傷方面發(fā)揮著重要作用；毛囊、汗腺等附屬器結(jié)構(gòu)主要參與皮 膚新陳代謝及溫度調(diào)節(jié)。 大量的實驗和臨床證明，組織工程方法制備的皮膚替代物能夠用于創(chuàng)面修復重 建，國內(nèi)外已有成熟的組織工程全層皮膚產(chǎn)品上市銷售。但目前的皮膚產(chǎn)品不具有毛囊和 汗腺等附屬器，毛囊可幫助皮膚排熱及參與皮膚新陳代謝，汗腺具有分泌汗液、調(diào)節(jié)體溫的 作用。各種原因造成的皮膚損傷，在傷及真皮深層，使汗腺不能再生，導致汗液排泄障礙，嚴 重影響患者生活質(zhì)量。 另外，現(xiàn)有商品化的組織工程皮膚是使用成體細胞進行創(chuàng)面治療，這不但影響治 療效果，還存在因受體免疫排斥導致治療失敗的風險；而且，來自成體組織的成纖維細胞、 間充質(zhì)干細胞、表皮細胞的增殖速度和代謝緩慢，細胞分泌蛋白的能力弱。由于表皮層與真 皮層能否建立緊密的連接，取決于表皮細胞能否合成充足的半橋粒，以及表皮細胞與間充 質(zhì)干細胞能否合成分泌大量的細胞外基質(zhì)；這是因為表皮層與表皮層下基膜的緊密連接需 要表皮細胞能夠合成大量的半橋粒參與，而基膜則是由真皮層中成纖維細胞或間充質(zhì)干細 胞與表皮層的表皮細胞共同分泌的細胞外基質(zhì)形成?，F(xiàn)有組織工程皮膚的表皮層脫落正是 由于表皮層與真皮層缺乏有效連接所造成。 因表皮細胞在體外培養(yǎng)過程中，有失去角質(zhì)化特征的趨勢，致使所制備的組織工 程皮膚的表皮層脆性增大，不能正常發(fā)揮表皮層的功能，這也是多年困擾組織工程皮膚領(lǐng) 域的技術(shù)難題。 由于間充質(zhì)干細胞具有較強的增殖及多向分化能力，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于組織工程皮 膚的構(gòu)建。間充質(zhì)干細胞作為種子細胞，接種于組織工程皮膚用于人體治療，所以間充質(zhì)干 細胞的生命活力直接決定著組織工程皮膚的治療效果。本申請人研究證實，間充質(zhì)干細胞 的生命活力與來源組織的年齡有著密切關(guān)系，來源于胚胎組織的間充質(zhì)干細胞比來自于成 年組織的同類細胞有更強的生命活力，同時，胚胎組織來源的間充質(zhì)干細胞的免疫原性遠 遠低于成年組織的；最近的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞能夠調(diào)節(jié)受體的免疫排斥，降低應(yīng)用于 受體后免疫排斥的風險。所以，胚胎來源的間充質(zhì)干細胞比成體組織來源的間充質(zhì)干細胞 具有更加廣闊的應(yīng)用前景。
由于這些顯著的優(yōu)勢，來源于人體胚胎時期，且無倫理爭議的羊膜間充質(zhì)干細胞 和羊膜上皮細胞被人們寄予了厚望，成為當前研究的熱點。通過研究發(fā)現(xiàn)，羊膜間充質(zhì)干細 胞的細胞狀態(tài)介于成體干細胞與胚胎干細胞之間，屬于"年輕的"成體干細胞，一般傳至30 代仍能保持旺盛的代謝功能，羊膜來源的這兩種細胞都被證明具有多向誘導分化能力。并 且羊膜間充質(zhì)干細胞移植入體內(nèi)后能夠調(diào)節(jié)受體的免疫排斥，提高皮膚移植的成功率。同 時，研究還證實羊膜上皮細胞具有促進表皮類細胞角質(zhì)化分化狀態(tài)的作用。這些特點使得 羊膜來源細胞作為組織工程的種子細胞應(yīng)用成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含附屬器的組織工程皮膚的制備方法，所制備的組織工
程皮膚含有毛囊、汗腺的附屬器結(jié)構(gòu)，在用于修復皮膚或軟組織損傷形成的創(chuàng)面，能夠減少
瘢痕形成、在創(chuàng)面生成毛囊及汗腺結(jié)構(gòu)、恢復創(chuàng)面的外觀及散熱功能、調(diào)節(jié)受體免疫排斥，
且使表皮層與真皮層連接緊密，表皮層不易脫落，完成受損皮膚的全層修復。 本發(fā)明含附屬器的組織工程皮膚的制備方法，包括有細胞的獲得、擴大培養(yǎng)、定向
誘導分化，以及組織工程雙層皮膚的制備，其特征在于是在凝膠溶液中接種羊膜間充質(zhì)干
細胞、向毛乳頭方向誘導的羊膜間充質(zhì)干細胞、羊膜上皮細胞、向汗腺上皮方向誘導的羊膜
上皮細胞，經(jīng)真皮層培養(yǎng)后，再經(jīng)形成毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)的誘導培養(yǎng)，于其表面再接種羊膜上
皮細胞和經(jīng)向角質(zhì)形成細胞誘導的羊膜上皮細胞，經(jīng)組織工程雙層皮膚的培養(yǎng)得到含有毛
囊、汗腺結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚；其中的毛囊結(jié)構(gòu)由向毛乳頭方向誘導后的羊膜間充質(zhì)干細
胞和羊膜上皮細胞共同構(gòu)建，汗腺結(jié)構(gòu)由向汗腺上皮方向誘導后的羊膜上皮細胞構(gòu)建；以
羊膜上皮細胞和向角質(zhì)形成細胞方向誘導后的羊膜上皮細胞構(gòu)建表皮層，以具有誘導形成
毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)作用的凝膠溶液與羊膜間充質(zhì)干細胞構(gòu)建真皮層；所述的凝膠溶液含有細
胞外基質(zhì)和有誘導形成毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)作用的蛋白。 本發(fā)明含附屬器的組織工程皮膚制備方法的具體步驟包括 步驟一.材料、培養(yǎng)液及細胞的準備 制備細胞外基質(zhì)取新鮮動物胚胎皮膚剪碎絞成肉泥，加入4倍體積的3% (V/V) 乙酸溶液在4t:條件下攪拌12小時，該乙酸溶液含有l(wèi)g/L濃度的胃蛋白酶；離心取上清， 加入NaCl至終濃度為0. 9M鹽析沉淀，離心取沉淀，將沉淀物溶解于0. 1M的Tris-HCl溶液 (pH7. 2)，向其中加入NaCl至終濃度為1. 7M鹽析沉淀，離心取上清，再加入NaCl至終濃度 為2. 6M鹽析沉淀，離心棄上清，沉淀物用V/V為1%的乙酸溶液溶解后，用超純水透析純化； 經(jīng)真空凍干后消毒，獲得細胞外基質(zhì)； 制備具有誘導形成毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)作用的凝膠溶液無菌條件下，將制備的細胞外 基質(zhì)溶于V/V為0. 1%的乙酸溶液中，濃度為5 12mg/ml (4"C儲存可防止細胞外基質(zhì)降 解)；將該溶液在冰浴下紫外線照射，操作過程確保處于冷卻狀態(tài)；按該溶液的體積比分別 加入10%的胎牛血清和10%的DMEM培養(yǎng)基，再加入wnt3a蛋白300 500ng/ml和硫酸肝 素糖蛋白100 300ng/ml，調(diào)pH至7. 2，得到凝膠溶液; 配制培養(yǎng)液A(羊膜上皮細胞向角質(zhì)形成細胞方向誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml 體積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 360ml、商用培養(yǎng)基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤180 260mM、胰島素2 10ii g/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5 10ii g/ml、表皮生長因子(EGF) 5 15ng/ml、氫化可的松0. 2 0. 5 ii g/ml ; 配制培養(yǎng)液B(間充質(zhì)干細胞向毛乳頭方向誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計 包括商用培養(yǎng)基DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基F12 125ml、胎牛血清75ml、 wnt3a蛋白50 150ng/ml、成纖維生長因子2(FGF-2)3 8ng/ml ; 配制培養(yǎng)液C(羊膜上皮細胞向汗腺上皮樣細胞誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體 積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神經(jīng)生長因子(NGF) 10 15ng/ml、表 皮生長因子5 15ng/ml、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-P ) 10 20ng/ml、硫酸肝素糖蛋白50 100ng/ml ; 配制培養(yǎng)液D (組織工程真皮培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng)基 DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基F12 150ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子6 18ng/ml、表皮 生長因子5 15ng/ml、成纖維細胞生長因子5 15ng/ml ; 配制培養(yǎng)液E(組織工程雙層皮膚培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培 養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子6 18ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ ml ; 配制培養(yǎng)液F(毛囊樣結(jié)構(gòu)誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng) 基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、成纖維生長因子2 (FGF-2) 5 15ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ml、wnt3a蛋白100 200ng/ml、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP) 50 200ng/ml ;
配制培養(yǎng)液G (汗腺樣結(jié)構(gòu)誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng) 基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神經(jīng)生長因子(NGF) 20 80ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ ml、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-P )5 15ng/ml、硫酸肝素糖蛋白50 250ng/ml ;
羊膜間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法可參考Isolation of amnioticstem cell lines with potential for therapy. Nature biotechnology. 2007 JAN ;25(1)或是其 他已有技術(shù)，將獲得的干細胞采用培養(yǎng)液B擴大培養(yǎng)，完成羊膜間充質(zhì)干細胞向毛乳頭方 向的誘導，備用；羊膜上皮細胞的分離培養(yǎng)方法可參考Stem Cell Characteristics of Amniotic Epithelial Cells. Stem cell. 2005 ;23 :1549 1559或是其他已有技術(shù)，將獲 得的羊膜上皮細胞采用培養(yǎng)液A擴大培養(yǎng)，誘導分化為角質(zhì)形成細胞，備用；將獲得的羊膜 上皮細胞采用培養(yǎng)液C擴大培養(yǎng)，誘導生成汗腺上皮樣細胞，備用； 步驟二 .組織工程皮膚真皮層的培養(yǎng)在所制備的凝膠溶液中按105 107個/ml 的細胞濃度加入羊膜間充質(zhì)干細胞；再加入向毛乳頭方向誘導后的羊膜間充質(zhì)干細胞與羊 膜上皮細胞混合形成的細胞團，加入的細胞團數(shù)量為10 30個/ml，細胞團的細胞數(shù)為 103 104個/團，二種細胞的比例為1 : 1 ;再按105 1(f個/ml細胞濃度加入向汗腺上 皮方向誘導后的羊膜上皮細胞，置于5% (A環(huán)境中37t:條件下培養(yǎng)1小時，待凝膠固化后，
按培養(yǎng)液D :培養(yǎng)液F為i : i比例混合培養(yǎng)液，用該培養(yǎng)液培養(yǎng)4天，每天換液，完成組
織工程皮膚真皮層的制備(其可單獨使用)； 步驟三.組織工程毛囊和汗腺的誘導培養(yǎng)將制備的組織工程真皮用培養(yǎng)液F與 培養(yǎng)液G按2 : 1比例混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，每天換液；再使用培養(yǎng)液G培養(yǎng)2天，每天 換液，使其中的毛囊和汗腺結(jié)構(gòu)誘導成熟； 步驟四.組織工程雙層皮膚的培養(yǎng)在誘導培養(yǎng)后的真皮層表面按104 2X 104 個/cm2的密度接種羊膜上皮細胞，按3X 104 6X 104個/cm2的密度接種向角質(zhì)形成細胞
6方向誘導后的羊膜上皮細胞，再用培養(yǎng)液E與培養(yǎng)液G按1 : 2比例混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)2 天，每天換液，完成制備。 本發(fā)明制備方法中所制備的真皮層可作為組織工程真皮單獨使用，也可繼續(xù)按本 發(fā)明復合表皮層后作為雙層皮膚使用。本發(fā)明制備的含有毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚， 不僅具備現(xiàn)有組織工程皮膚的優(yōu)點(如具有彈性、韌性)，還因為采用胚胎期羊膜細胞，細 胞新陳代謝旺盛、增殖能力強，細胞外基質(zhì)分泌充分，表皮層與下部基膜及真皮層細胞的連 接緊密，不易脫落，極大地提高了組織工程皮膚移植的成功率，更快的促進創(chuàng)面愈合；且羊 膜上皮細胞分化形成的角質(zhì)形成細胞具有維持表皮層角質(zhì)化的特點，有利于保持表皮層的 結(jié)構(gòu)功能，提高組織工程皮膚的修復和替代效果；所含的毛囊和汗腺結(jié)構(gòu)能夠調(diào)節(jié)創(chuàng)面新 陳代謝、溫度，加快創(chuàng)面的功能恢復。 本發(fā)明采用羊膜細胞參與構(gòu)建組織工程皮膚，能保證所制備的組織工程皮膚免疫 排斥反應(yīng)低，且羊膜間充質(zhì)干細胞具有調(diào)節(jié)移植受體免疫排斥的作用，有利于組織工程皮 膚與創(chuàng)面的整合，到達更好的醫(yī)療、美容修復目的；所采用的羊膜組織為分娩后廢棄組織， 原料來源廣泛，且羊膜來源的細胞增殖能力強，傳代次數(shù)多，有利于種子細胞的大規(guī)模生 產(chǎn)，降低了產(chǎn)業(yè)化成本。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實例對本發(fā)明技術(shù)方案作進一步的詳細說明。實例中所采用細胞 的獲得和擴大培養(yǎng)以及細胞外基質(zhì)的制備，是按上述方案操作得到，這里不再贅述；其中 wnt3a蛋白、硫酸肝素糖蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白為Sigma公司生產(chǎn)。
實例1、 步驟l.培養(yǎng)液配制及細胞定向誘導 配制培養(yǎng)液A(羊膜上皮細胞向角質(zhì)形成細胞方向誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml 體積計包括商用培養(yǎng)基DMEM360ml、商用培養(yǎng)基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤200mM、 胰島素2ii g/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6ii g/ml、表皮生長因子15ng/ml、氫化可的松0. 2 y g/ml ;
配制培養(yǎng)液B(間充質(zhì)干細胞向毛乳頭方向誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計 包括商用培養(yǎng)基DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基F12 125ml、胎牛血清75ml、 wnt3a蛋白150ng/ ml、成纖維生長因子2(FGF-2)4ng/ml ; 配制培養(yǎng)液C(羊膜上皮細胞向汗腺上皮樣細胞誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體 積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神經(jīng)生長因子(NGF) 12ng/ml、表皮生長 因子15ng/ml、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-l3)10ng/ml、硫酸肝素糖蛋白100ng/ml ;
配制培養(yǎng)液D (組織工程真皮培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng)基 DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基F12 150ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子7ng/ml、表皮生長 因子5ng/ml、成纖維細胞生長因子6ng/ml ; 配制培養(yǎng)液E (組織工程雙層皮膚培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培 養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子10ng/ml、表皮生長因子15ng/ml ;
配制培養(yǎng)液F(毛囊樣結(jié)構(gòu)誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng) 基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、成纖維生長因子2 (FGF-2) 15ng/ml、表皮生長因子5ng/ml、 wnt3a蛋白150ng/ml、骨形態(tài)發(fā)生蛋白100ng/ml ;
配制培養(yǎng)液G (汗腺樣結(jié)構(gòu)誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng) 基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神經(jīng)生長因子60ng/ml、表皮生長因子10ng/ml、轉(zhuǎn)化生長因 子8ng/ml、硫酸肝素糖蛋白200ng/ml ; 使用培養(yǎng)液A誘導羊膜上皮細胞向角質(zhì)形成細胞方向分化，使用培養(yǎng)液B誘導間 充質(zhì)干細胞向毛乳頭樣細胞分化，使用培養(yǎng)液C誘導羊膜上皮細胞向汗腺上皮樣細胞分 化，備用； 步驟2.無菌條件下，將細胞外基質(zhì)溶于V/V為0. 1%的乙酸溶液中，制成6mg/ml 的細胞外基質(zhì)溶液，冰浴下紫外燈照射30分鐘，再按該溶液體積比分別加入10%的DMEM 培養(yǎng)基和10X的胎牛血清，加入wnt3a蛋白500ng/ml，硫酸肝素糖蛋白150ng/ml，調(diào)pH至 7.2，得到凝膠溶液； 步驟3.將羊膜間充質(zhì)干細胞按1(f個/ml的濃度混合于凝膠溶液中，然后加入25 個/ml(l(f個細胞/團)向毛乳頭方向誘導后的羊膜間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮細胞按l : 1 混合后離心形成的細胞團，再將羊膜上皮細胞向汗腺上皮方向誘導后，按10s個/ml的濃度 混合于該凝膠溶液中，置于5% (A環(huán)境中37t:條件下培養(yǎng)1小時，待其固化后，加入培養(yǎng)液 D與培養(yǎng)液F按1 : l混合的培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天，每天換液，得到的組織工程真皮即可使用；
步驟4.將制備的組織工程真皮采用培養(yǎng)液F與培養(yǎng)液G按2 : l混合的培養(yǎng)液 培養(yǎng)3天，每天換液；再使用培養(yǎng)液G培養(yǎng)2天，每天換液； 步驟5.在誘導培養(yǎng)后的組織工程真皮表面接種104個/cm2密度的羊膜上皮細胞 和3X 104個/cm2密度的經(jīng)向角質(zhì)形成細胞方向誘導后的羊膜上皮細胞，再用培養(yǎng)液E與培 養(yǎng)液G按1 : 2比例混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，每天換液，得到含有毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)的組織工 程皮膚。 所制備的組織工程雙層皮膚中毛囊結(jié)構(gòu)相對汗腺結(jié)構(gòu)較多，可用于頭部皮膚創(chuàng)面
的修復，有利于創(chuàng)面毛囊結(jié)構(gòu)的盡快重建，達到創(chuàng)面修復的功能及外觀要求。
實施例2、 步驟l.培養(yǎng)液配制及細胞定向誘導 配制培養(yǎng)液A(羊膜上皮細胞向角質(zhì)形成細胞方向誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml 體積計包括商用培養(yǎng)基DMEM360ml、商用培養(yǎng)基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤260mM、 胰島素5iig/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5iig/ml、表皮生長因子13ng/ml、氫化可的松0. 4 y g/ml ;
配制培養(yǎng)液B(間充質(zhì)干細胞向毛乳頭方向誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計 包括商用培養(yǎng)基DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基F12 125ml、胎牛血清75ml、 wnt3a蛋白130ng/ ml、成纖維生長因子2(FGF-2)8ng/ml ; 配制培養(yǎng)液C(羊膜上皮細胞向汗腺上皮樣細胞誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體 積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神經(jīng)生長因子(NGF) 15ng/ml、表皮生長 因子10ng/ml、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-l3)20ng/ml、硫酸肝素糖蛋白80ng/ml ;
配制培養(yǎng)液D (組織工程真皮培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng)基 DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基F12 150ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子10ng/ml、表皮生長 因子10ng/ml、成纖維細胞生長因子10ng/ml ; 配制培養(yǎng)液E(組織工程雙層皮膚培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培 養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子8ng/ml、表皮生長因子13ng/ml ;
8
配制培養(yǎng)液F(毛囊樣結(jié)構(gòu)誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng) 基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、成纖維生長因子2 10ng/ml、表皮生長因子6ng/ml、wnt3a蛋 白100ng/ml、骨形態(tài)發(fā)生蛋白80ng/ml ; 配制培養(yǎng)液G(汗腺樣結(jié)構(gòu)誘導培養(yǎng)基)，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng) 基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神經(jīng)生長因子80ng/ml、表皮生長因子15ng/ml、轉(zhuǎn)化生長因 子10ng/ml、硫酸肝素糖蛋白250ng/ml ; 使用培養(yǎng)液A誘導羊膜上皮細胞向角質(zhì)形成細胞方向分化，使用培養(yǎng)液B誘導間 充質(zhì)干細胞向毛乳頭樣細胞分化，使用培養(yǎng)液C誘導羊膜上皮細胞向汗腺上皮樣細胞分 化，備用； 步驟2.無菌條件下，將細胞外基質(zhì)溶于V/V為0. 1%的乙酸溶液中，制成9mg/ml 的細胞外基質(zhì)溶液，冰浴下紫外燈照射30分鐘，再按該溶液體積比分別加入10 %的DMEM 培養(yǎng)液和10X的胎牛血清，加入wnt3a蛋白300ng/ml，硫酸肝素糖蛋白300ng/ml，調(diào)pH至 7.2，得到凝膠溶液； 步驟3.將羊膜間充質(zhì)干細胞按1()S個/ml的濃度混合于凝膠溶液中，然后加入10 個/ml(l(^個細胞/團)向毛乳頭方向誘導后的羊膜間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮細胞按l : 1 混合后離心形成的細胞團，再將羊膜上皮細胞向汗腺上皮方向誘導后，按1(^個/ml的濃度 混合于該凝膠溶液中，置于5% (A環(huán)境中37t:條件下培養(yǎng)1小時，待其固化后，加入培養(yǎng)液 D與培養(yǎng)液F按1 : l混合的培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天，每天換液，得到的組織工程真皮即可使用；
步驟4.將制備的組織工程真皮采用培養(yǎng)液F與培養(yǎng)液G按2 : 1混合的培養(yǎng)液 培養(yǎng)3天，每天換液；再使用培養(yǎng)液G培養(yǎng)2天，每天換液； 步驟5.在誘導培養(yǎng)后的組織工程真皮表面接種1. 5Xl(^個/cn^密度的羊膜上皮 細胞和4.5Xl(^個/cn^密度的經(jīng)向角質(zhì)形成細胞方向誘導后的羊膜上皮細胞，再用培養(yǎng)液 E與培養(yǎng)液G按1 : 2比例混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，每天換液，得到含有毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)的組 織工程皮膚。 所制備的組織工程雙層皮膚含有少量毛囊結(jié)構(gòu)，由于使用了高濃度的汗腺樣上皮 細胞及汗腺誘導蛋白，制備的組織工程皮膚具有較多的汗腺結(jié)構(gòu)，可用于II度燒傷創(chuàng)面修 復，有利于燒傷病人創(chuàng)面溫度調(diào)節(jié)。
權(quán)利要求
一種含附屬器的組織工程皮膚的制備方法，包括有細胞的獲得、擴大培養(yǎng)、定向誘導分化，以及組織工程雙層皮膚的制備，其特征在于是在凝膠溶液中接種羊膜間充質(zhì)干細胞、向毛乳頭方向誘導的羊膜間充質(zhì)干細胞、羊膜上皮細胞、向汗腺上皮方向誘導的羊膜上皮細胞，經(jīng)真皮層的培養(yǎng)后，再經(jīng)形成毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)的誘導培養(yǎng)，于其表面再接種羊膜上皮細胞和經(jīng)向角質(zhì)形成細胞誘導的羊膜上皮細胞，經(jīng)組織工程雙層皮膚的培養(yǎng)得到含有毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚；其中，毛囊結(jié)構(gòu)由向毛乳頭方向誘導后的羊膜間充質(zhì)干細胞和羊膜上皮細胞共同構(gòu)建，汗腺結(jié)構(gòu)由向汗腺上皮方向誘導后的羊膜上皮細胞構(gòu)建，以羊膜上皮細胞和向角質(zhì)形成細胞方向誘導后的羊膜上皮細胞構(gòu)建表皮層，以具有誘導形成毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)作用的凝膠溶液與羊膜間充質(zhì)干細胞構(gòu)建真皮層；所述的凝膠溶液含有細胞外基質(zhì)和有誘導形成毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)作用的蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，具體步驟包括 步驟一.材料、培養(yǎng)液及細胞的準備制備細胞外基質(zhì)取新鮮動物胚胎皮膚剪碎絞成肉泥，加入4倍體積的V/V為3%的乙 酸溶液，在4t:條件下攪拌12小時，該乙酸溶液含有l(wèi)g/L濃度的胃蛋白酶；離心取上清，加 入NaCl至終濃度為0. 9M鹽析沉淀，離心取沉淀，將沉淀物溶解于0. 1M的Tris-HCl溶液， 向其中加入NaCl至終濃度為1. 7M鹽析沉淀，離心取上清，再加入NaCl至終濃度為2. 6M鹽 析沉淀，離心棄上清，沉淀物用V/V為1%的乙酸溶液溶解后，用超純水透析純化；經(jīng)真空凍 干后消毒，獲得細胞外基質(zhì)；制備誘導形成毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)的凝膠溶液無菌條件下，將制備的細胞外基質(zhì)溶于V/V 為O. 1X的乙酸溶液中，濃度為5 12mg/ml ;將該溶液在冰浴下紫外線照射后，按該溶液的 體積比分別加入10%的胎牛血清和10X的DMEM培養(yǎng)基，再加入wnt3a蛋白300 500ng/ ml和硫酸肝素糖蛋白100 300ng/ml，調(diào)pH至7. 2，得到凝膠溶液；配制培養(yǎng)液A，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 360ml、商用培養(yǎng)基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤180 260mM、胰島素2 10 ii g/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5 10ii g/ml、 表皮生長因子5 15ng/ml、氫化可的松0. 2 0. 5 y g/ml ;配制培養(yǎng)液B，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基F12 125ml、胎牛血清75ml、wnt 3a蛋白50 150ng/ml、成纖維生長因子2 3 8ng/ml ;配制培養(yǎng)液C，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、 神經(jīng)生長因子10 15ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ml、轉(zhuǎn)化生長因子10 20ng/ml、硫 酸肝素糖蛋白50 100ng/ml ;配制培養(yǎng)液D，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 300ml、商用培養(yǎng)基 F12150ml、胎牛血清50ml、胰島素樣生長因子6 18ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ml、成 纖維細胞生長因子5 15ng/ml ;配制培養(yǎng)液E，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、 胰島素樣生長因子6 18ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ml ;配制培養(yǎng)液F，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、 成纖維生長因子25 15ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ml、 wnt3a蛋白100 200ng/ml、 骨形態(tài)發(fā)生蛋白50 200ng/ml ;配制培養(yǎng)液G，其組分按500ml體積計包括商用培養(yǎng)基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神經(jīng)生長因子20 80ng/ml、表皮生長因子5 15ng/ml、轉(zhuǎn)化生長因子5 15ng/ml、硫酸 肝素糖蛋白50 250ng/ml ;獲得羊膜間充質(zhì)干細胞，采用培養(yǎng)液B擴大培養(yǎng)，完成羊膜間充質(zhì)干細胞向毛乳頭方 向的誘導；獲得羊膜上皮細胞，采用培養(yǎng)液A擴大培養(yǎng)，誘導分化為角質(zhì)形成細胞；采用培 養(yǎng)液C擴大培養(yǎng)羊膜上皮細胞，誘導形成汗腺上皮樣細胞；步驟二.組織工程皮膚真皮層的培養(yǎng)在所制備的凝膠溶液中按105 107個/ml的細 胞濃度加入羊膜間充質(zhì)干細胞；再加入向毛乳頭方向誘導后的羊膜間充質(zhì)干細胞與羊膜上 皮細胞混合形成的細胞團，細胞團的數(shù)量為10 30個/ml，每個細胞團的細胞數(shù)為103 104個/團，二種細胞的比例為1 : 1 ;再按105 1(f個/ml細胞濃度加入向汗腺上皮方向 誘導后的羊膜上皮細胞，在5% C02環(huán)境中37t:條件下培養(yǎng)1小時，待凝膠固化后，按培養(yǎng)液d :培養(yǎng)液F為i : i比例混合培養(yǎng)液，用該培養(yǎng)液培養(yǎng)4天，每天換液，完成組織工程皮膚真皮層的制備；步驟三.組織工程毛囊和汗腺的誘導培養(yǎng)將制備的組織工程真皮用培養(yǎng)液F與培養(yǎng) 液G按2 : 1比例混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，每天換液；再使用培養(yǎng)液G培養(yǎng)2天，每天換液；步驟四.組織工程全層皮膚的培養(yǎng)在誘導培養(yǎng)后的真皮層表面按104 2X 104個/ cm2的密度接種羊膜上皮細胞，按3X 104 6X 104個/cm2的密度接種經(jīng)向角質(zhì)形成細胞方 向誘導后的羊膜上皮細胞，再用培養(yǎng)液E與培養(yǎng)液G按1 : 2比例混合的培養(yǎng)液培養(yǎng)2天， 每天換液，完成制備。
全文摘要
一種含附屬器的組織工程皮膚的制備方法，本發(fā)明是在凝膠溶液中接種羊膜間充質(zhì)干細胞、向毛乳頭方向誘導的羊膜間充質(zhì)干細胞、羊膜上皮細胞、向汗腺上皮方向誘導的羊膜上皮細胞，經(jīng)真皮層培養(yǎng)后，再經(jīng)形成毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)的誘導培養(yǎng)，于其表面再接種羊膜上皮細胞和經(jīng)向角質(zhì)形成細胞誘導的羊膜上皮細胞，培養(yǎng)后得到具有毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚，該皮膚不僅具有彈性、韌性，細胞新陳代謝旺盛、增殖能力強，細胞外基質(zhì)分泌充分，表皮層與基膜和真皮層細胞連接緊密、不易脫落，提高了移植的成功率，能促進創(chuàng)面的愈合、提高修復和替代的效果，具有調(diào)節(jié)受體免疫排斥的作用；所含的毛囊、汗腺結(jié)構(gòu)，使皮膚功能更完全；采用的羊膜組織為分娩后廢棄物、來源廣泛，細胞增殖能力強、傳代次數(shù)多，有利于種子細胞的規(guī)模生產(chǎn)，降低產(chǎn)業(yè)化成本。
文檔編號A61L27/40GK101773688SQ201010107208
公開日2010年7月14日 申請日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者張勇杰, 楊鷺, 王愛軍, 金巖 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學;陜西瑞盛生物科技有限公司