專利名稱：：干漆提取物及其作為有效成份的抗癌藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種以干漆為主要有效成份制備的藥物制劑，及其在抗癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥是威脅人類生命的惡性疾病之一，據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2007年全球超過(guò)750萬(wàn)人死于癌癥，有超過(guò)1200多萬(wàn)個(gè)癌癥病例被確診。隨著全球人口增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)2050年，癌癥致死病例和新確診病例將分別增至1750萬(wàn)和2700萬(wàn)。我國(guó)每年癌癥的發(fā)病人數(shù)約為200萬(wàn)，死亡人數(shù)超過(guò)140萬(wàn)。癌癥已成為我國(guó)各類疾病的死因之首，且發(fā)病率有猛增和年輕化趨勢(shì)。目前化學(xué)藥物仍然是癌癥治療的主要手段之一，在過(guò)去幾年中，世界抗腫瘤藥物市場(chǎng)一直都在增長(zhǎng)，美國(guó)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2004年全球抗腫瘤藥物市場(chǎng)總銷售額為240億美元，2007年猛增至396億美元。雖然抗癌藥物不斷地被發(fā)現(xiàn)，但至今仍然沒(méi)有一種有效藥物可以征服癌癥，而且隨著新型癌癥和抗癌藥物耐藥性的增加，迫使人們努力尋找新型抗癌藥物和新的治療策略?？v觀1981年到2002年期間世界上開(kāi)發(fā)的新化學(xué)藥物來(lái)看，約有60%的抗癌藥物直接或間接來(lái)自天然產(chǎn)物(JNatProd，2003，66:1022-1237)，表明自然界已經(jīng)成為全球?qū)ふ铱拱┧幬锏闹匾慈＝陙?lái)，喜樹(shù)堿，長(zhǎng)春新堿，三尖杉酯堿，紫杉醇，Epothilone等分別被發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著抗癌藥物的研究取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，其中，值得一提的是紫杉醇的問(wèn)世被譽(yù)為是世界抗腫瘤藥物研發(fā)史上的一個(gè)"里程碑"(中草藥，1997，28(增刊)1-5)。癌癥被稱為惡性腫瘤，屬于毒邪，其發(fā)病特點(diǎn)之一是病勢(shì)兇猛，變化迅速，死亡率高。在各種對(duì)付癌癥的策略中，"以毒攻毒"被認(rèn)為是治療癌癥的有效辦法之一。砒霜是眾所周知的毒劇中藥，但因?yàn)槠渲械娜趸槟苷T導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，并能協(xié)同全反式維甲酸治療新發(fā)急性早幼粒細(xì)胞白血病而震驚世界，成為國(guó)際上治療這種類型白血病時(shí)的首選藥物(Blood，1996,88:1052-1061;ProcNatlAcadSciUSA，2009，doi:10.1073/pnas.0813280106)。雄黃也是有毒中藥，其主要成分是硫化砷，復(fù)方黃黛片中硫化砷能直接作用于癌蛋白，通過(guò)誘導(dǎo)其降解，從根本上逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的瘋長(zhǎng)，促使其分化成熟(ProcNatlAcadSciUSA，2008，105，4826-4831);最近的研究還顯示硫化砷能激活蛋白泛素化等通路，并導(dǎo)致癌蛋白降解，協(xié)同伊馬替尼阻斷細(xì)胞周期，激活細(xì)胞程序化死亡通路，這一研究發(fā)現(xiàn)得到了科學(xué)界的承認(rèn)，并使得硫化砷正在受到世界的關(guān)注(ProcNatlAcadSciUSA，2009，106:3378-3383)。鬼臼毒素為有毒中藥八角蓮的主要成分之一，因?yàn)槠淇拱┳饔蔑@著，其衍生物的制備和化學(xué)合成工作吸引了世界眾多科學(xué)家的參與(國(guó)外醫(yī)藥植物藥分冊(cè)，2006，1:6-9)。斑蝥素是我國(guó)傳統(tǒng)毒性中藥斑蝥的活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明，斑蝥素是絲氨酸和蘇氨酸的抑制劑，這兩種氨基酸在細(xì)胞增殖和分化等活動(dòng)中起著重要的調(diào)控作用，因此我國(guó)已經(jīng)將斑蝥素作為抗肝癌和食管癌的重要藥物應(yīng)用到了臨床實(shí)踐(BioorgMedChem，2007，15:6126-6134;第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29:1470-1474)。蟾酥為有毒動(dòng)物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥分泌物，主要含有甾類化合物，其中的華蟾毒精和羥基華蟾毒精臨床用于強(qiáng)心和治療癌癥，效果明顯(動(dòng)物活性成分化學(xué).天津天津科學(xué)技術(shù)出版社，1995，1518-1542)。有臨床報(bào)道瑞香狼毒對(duì)于肺癌、肝癌等治療有效，中國(guó)和日本學(xué)者曾從其甲醇提取物中分離得到一系列抗腫瘤活性二萜成分(中華腫瘤雜志，1995，17:324-26)。縱觀目前西醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用的腫瘤化療藥物，可以看出其中大部分都是含有劇烈毒性的藥物，然而也正是這些劇毒藥物挽救了世界上數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的癌癥病人。大量臨床實(shí)踐證明，化療藥物的毒性與其療效成正比，其毒性越大療效也越好，所以，化療藥物治療腫瘤的最重要機(jī)理之一是其細(xì)胞毒作用。我國(guó)古代早就有運(yùn)用毒劇中藥治療疑難病(包括腫瘤)的豐富經(jīng)驗(yàn)，如《醫(yī)學(xué)問(wèn)答》指出，"藥之治病，無(wú)非以毒拔毒，以毒攻毒"，且有"大毒大效，小毒小效，無(wú)毒無(wú)效"的論述，中國(guó)醫(yī)圣張仲景更是開(kāi)創(chuàng)了毒劇中藥治療頑癥的先河。因此"以毒攻毒"在我國(guó)歷代均有其理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，"以毒攻毒"也成為腫瘤治療中重要和公認(rèn)策略之一。"以毒攻毒"可以有效治療疑難雜癥，甚至立起沉疴，而不會(huì)輕易對(duì)患者造成傷害，這一點(diǎn)在經(jīng)典古籍《內(nèi)經(jīng)》中早就有闡述，如"黃帝問(wèn)曰婦人重身，毒之何如？歧伯曰有故無(wú)殞，亦無(wú)殞也"，是說(shuō)對(duì)于懷孕的婦女用藥，有病則病受之，只要正氣足，對(duì)胎兒不會(huì)有什么妨礙的"。這種現(xiàn)象在中藥中比較常見(jiàn)，即在人體生病時(shí)，即使有毒的藥物而病受之，而對(duì)于人體無(wú)危害，但若人無(wú)病，此時(shí)就容易產(chǎn)生毒副作用，因此用毒性或峻藥治療重癥在歷代都受到重視。另一方面，在科技不斷進(jìn)步的今天，癌癥理論研究不斷取得新的進(jìn)展，上世紀(jì)70年代，哈佛醫(yī)學(xué)院學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察提出腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移依賴于血管新生。發(fā)現(xiàn)腫瘤在沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)下，只能長(zhǎng)到并保持筆尖大小，而一旦有新生血管與其相連，腫瘤便獲得營(yíng)養(yǎng)，就會(huì)迅速以幾何級(jí)數(shù)瘋長(zhǎng)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)新生血管轉(zhuǎn)移到其他器官，從而引起腫瘤轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致人體死亡的重要原因。因此，血管新生對(duì)腫瘤研究具有重要意義。在此基礎(chǔ)上，科學(xué)家們?cè)噲D利用血管新生抑制劑來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，2004-2006年，美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局相繼批準(zhǔn)了兩種血管新生相關(guān)新藥上市，用來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。血管新生(即熟知的"餓死腫瘤療法")已成為腫瘤研究的前沿和熱點(diǎn)領(lǐng)域，通過(guò)抑制血管新生來(lái)抑制腫瘤被科學(xué)界稱為繼手術(shù)、化療、放療之后的第四種腫瘤療法，具有革命式意義。更為重要的是，由于此方法是通過(guò)切斷腫瘤的養(yǎng)分供應(yīng)而達(dá)到治療腫瘤的目的，因此，腫瘤血管生成抑制劑被業(yè)界認(rèn)為對(duì)于絕大多數(shù)腫瘤都有作用，成為發(fā)展低毒、廣譜抗腫瘤藥物的重要方向，具有廣闊的研究前景。目前，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家專門成立了血管新生研究中心，正在對(duì)眾多血管生成抑制劑進(jìn)行廣泛研究，許多血管生成抑制劑在進(jìn)行I-III期臨床試驗(yàn)研究，例如血管抑素、內(nèi)皮抑素、煙曲霉素類似物及金屬蛋白酶抑制因子和尿激酶、Bufotanine等20多種。Bufotanine被證明是一種有效的腫瘤血管生成抑制劑，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分患者在服用藥物7天內(nèi)即可產(chǎn)生療效，并且無(wú)副作用。鑒于血管新生的重要性，國(guó)際著名科學(xué)雜志《Nature》甚至有文稱"未來(lái)幾十年里，血管新生研究將改變目前藥物的面貌，全球至少有50億人將從血管新生研究中受益。"總之，腫瘤血管生成與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等特性密切相關(guān)，因此以腫瘤血管生成為靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)腫瘤血管生成抑制劑已成為腫瘤藥物研究中的熱點(diǎn)(中醫(yī)雜志，2008，49，1133-1135)。中藥在抗腫瘤血管生成方面應(yīng)該具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如，2008年國(guó)際著名雜志CancerResearch發(fā)表的中藥藤黃樹(shù)脂中發(fā)現(xiàn)的藤黃酸就具有顯著的抗腫瘤血管生成作用。迄今，未發(fā)現(xiàn)關(guān)于干漆乙醇提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞株的抑制作用和抗腫瘤血管生成藥理作用的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抗癌藥物、其制備方法和應(yīng)用，它是一種以干漆乙醇提取物或乙酸乙酯提取物為主要有效成份制成的藥物組合物，以及藥物片劑、膠囊劑等口服劑型或注射劑；另一目的在于提供其提取物在制備抗惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案干漆乙醇提取物，由下述方法制成將干燥的干漆粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用乙醇冷浸、溫浸或加熱回流，取濾液，回收乙醇并濃縮得提取物浸膏；其中乙醇的濃度為5095%，乙醇體積每次為藥材的210倍，提取次數(shù)為13次，冷浸每次110天，回流時(shí)間為每次14小時(shí)，溫浸溫度為60°C。具體地，取干燥干漆，粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用95%乙醇冷浸3次，每次用3倍于藥材的體積的乙醇，每次72小時(shí)，不斷攪拌，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇并濃縮干燥得干漆乙醇提取物浸膏。干漆乙酸乙酯提取物，用下述方法制成權(quán)利要求1所述的乙醇提取物浸膏用水適當(dāng)稀釋，用等體積的乙酸乙酯萃取16次，分取上層，回收乙酸乙酯并濃縮得乙酸乙酯提取物浸膏。干漆乙酸乙酯提取物，用下述方法制成將干漆粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用乙酸乙酯冷浸、溫浸或加熱回流，取濾液，回收乙酸乙酯并濃縮得浸膏；其中乙酸乙酯的體積每次為藥材的210倍，提取次數(shù)為13次，冷浸每次110天，回流時(shí)間每次為14小時(shí)，溫浸溫度為60°C。具體地，取干燥干漆，粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用95%乙醇冷浸3次，每次用3倍于藥材的體積的乙醇，每次72小時(shí)，不斷攪拌，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，加水適當(dāng)稀釋，水液用等體積乙酸乙酯萃取4次，分取乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯后干燥得干漆乙酸乙酯提取物。藥物組合物，其中含有治療有效量的本發(fā)明的上述干漆提取物和藥學(xué)上可接受的載體?？拱┧幬?，其中含有治療有效量的本發(fā)明的上述干漆提取物和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的上述干漆提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述干漆提取物在制備抗癌藥物口服劑型中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述干漆提取物在制備抗癌藥物注射劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述干漆提取物在制備抗白血病、肝癌、肺癌、食道癌、骨髓瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是基于正向藥理學(xué)的研究方法，即從在臨床人種藥理學(xué)中長(zhǎng)期應(yīng)用有效的中草藥中去高效地尋找藥效物質(zhì)，從而使得這些一旦被發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)將具有現(xiàn)代臨床價(jià)值；本發(fā)明旨在解決目前抗癌藥物靶點(diǎn)單一、治療效果不佳、耐藥性產(chǎn)生等問(wèn)題，從具有千百年人群應(yīng)用歷史的中草藥中目的性地尋找具有多靶點(diǎn)、或新穎作用途徑的抗癌藥物；其有益效果是從自然界中捷徑發(fā)現(xiàn)新型抗癌藥物，提高癌癥的治療效果，同時(shí)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。本發(fā)明從中醫(yī)"以毒攻毒"、活血化瘀和止血收斂劑將可能和腫瘤血管生成5(angiogenesis)相關(guān)的假設(shè)出發(fā)，對(duì)18種中草藥提取物進(jìn)行了抗腫瘤定向活性篩選(顏色干擾的提取物進(jìn)行了排除)，發(fā)現(xiàn)其中4種提取物有效，且干漆的乙醇提取物和乙酸乙酯提取物作用最為明顯，表現(xiàn)在其對(duì)HL-60，Jurkat，K562，U937，H印G2，MCF和SGC7901等七種腫瘤細(xì)胞株均顯示出顯著的生長(zhǎng)抑制活性。同時(shí)，本發(fā)明還首次發(fā)現(xiàn)提取物能明顯抑制與腫瘤血管生成相關(guān)的HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)的增殖，劃痕法試驗(yàn)顯示其能在6小時(shí)內(nèi)顯著抑制HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，并且還明顯阻滯HUVEC成管。因此，干漆的乙醇提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移和成管的顯著抑制活性的發(fā)現(xiàn)，提示干漆的抗癌作用不僅僅是"以毒攻毒"的細(xì)胞毒途徑，而且還和腫瘤血管生成密切相關(guān)，是一種"多管齊下"的抗癌作用機(jī)制。本發(fā)明采用的干漆(Toxicodendronvernicifl皿m)屬于傳統(tǒng)中藥，為漆樹(shù)科植物漆樹(shù)(RhusvernicifluaStokes)的干燥樹(shù)脂，漆樹(shù)原產(chǎn)我國(guó)，且生長(zhǎng)迅速，因此資源豐富。本發(fā)明提取物所采用的制備方法特征在于有效成份中所含有的化學(xué)成分屬于中、低極性，而高極性部位的化學(xué)成分，如乙酸乙酯萃取后剩余的水液中的高極性成分無(wú)效。因此制備乙酸乙酯部位所含有的有效成分類型也可以采用對(duì)準(zhǔn)樣品參照法，采用相應(yīng)的大孔吸附樹(shù)脂法同樣可以獲得。本發(fā)明提取物可以單獨(dú)直接應(yīng)用，可以相互組合應(yīng)用，也可以與其它藥物包括植物提取物組成復(fù)方的形式使用，可以使用不同的藥用輔料，制成多種固體制劑或液體制劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)口服和注射兩種形式給藥。使用量可根據(jù)給藥途徑、患者的年齡、體重、所治療疾病的類型和嚴(yán)重程度等變化進(jìn)行一次或多次使用。對(duì)成人來(lái)說(shuō)，給藥量每天可以30-200mg比較合適。圖1A-G為本發(fā)明乙酸乙酯提取物、乙醇提取物對(duì)HL-60JurkatK562U937H印G2MCF7SGC7901的IC5。值(yg/ml);圖2A為舉例說(shuō)明CHYX470A(即圖中CHYX470)抑制HUVEC增殖的量效關(guān)系HUVEC:IC50=1.25iig/ml;圖2B-1和B-2分別為說(shuō)明CHYX470A和CHYX470B抑制劃痕法HUVEC細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中B-l上排為劃傷后0小時(shí)；下排為劃傷后7小時(shí)。左列為control,右列為CHYX470A(1.0yg/ml)。其中B-2上排為劃傷后0小時(shí)；下排為劃傷后7小時(shí)。左列為control,右列為CHYX479B(1.0iig/ml);圖2C-1和C-2分別為說(shuō)明CHYX470A和CHYX470B抑制HUVEC成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果。C-1其中上排左列為對(duì)照組(不加藥物)；上排右列為藥物組CHYX470A(10yg/ml)。C-2其中上排左列為對(duì)照組(不加藥物)；上排右列為藥物CHYX470B(10yg/ml)。具體實(shí)施例方式下面用本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來(lái)限定本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:干漆乙醇提取物的制備取干燥干漆17公斤，粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用95%乙醇冷浸3次，每次60升，每次72小時(shí)，不斷攪拌，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇并濃縮干燥得浸膏，提取率約為溫浸或加熱回流，取濾液，回收乙醇并濃縮得浸膏850克，提取率約為5%。實(shí)施例2:干漆乙酸乙酯提取物的制備取干燥干漆17公斤，粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用95%乙醇冷浸3次，每次60升，每次72小時(shí)，不斷攪拌，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，加水適當(dāng)稀釋，水液用等體積乙酸乙酯萃取4次，分取乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯后干燥得萃取物250克。實(shí)施例3:干漆乙醇提取物的制備取干燥干漆20公斤，粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用80%%乙醇冷浸2次，每次80升，每次96小時(shí)，不斷攪拌，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇并濃縮干燥得浸膏，提取率約為溫浸或加熱回流，取濾液，回收乙醇并濃縮得浸膏950克。實(shí)施例4:干漆乙酸乙酯提取物的制備取干燥干漆20公斤，粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用85%乙醇冷浸3次，每次70升，每次96小時(shí)，不斷攪拌，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，加水適當(dāng)稀釋，水液用等體積乙酸乙酯萃取3次，分取乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯后干燥得萃取物300克。實(shí)施例5:按實(shí)施例1或2或3或4的方法制得提取物，按藥物制備常規(guī)方法加注射用油，過(guò)濾，灌封、滅菌后可制成注射用乳劑。實(shí)施例6:按實(shí)施例1或2或3或4的方法制得提取物，按藥物制備常規(guī)方法配以各種藥用輔料可制成各種其它固體和液體制劑。實(shí)施例7:本發(fā)明提取物及其與藥用輔料組成的藥物組合物的抗惡性腫瘤作用細(xì)胞毒活性。(1)實(shí)驗(yàn)原理對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和抑制將有可能發(fā)展成為抗腫瘤藥物，多年來(lái)細(xì)胞毒類藥物在人類征服癌癥的過(guò)程中起到了重要的作用，到目前為止，該類藥物仍占據(jù)抗癌藥物的主要市場(chǎng)。細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物篩選一般采取MTT法，MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開(kāi)裂，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比(死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原)。還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉的MTT溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目，即可了解藥物對(duì)細(xì)胞的毒性。本實(shí)驗(yàn)采取這一原理進(jìn)行。(2)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)是按照文獻(xiàn)(J.Immunol.Methods1983，65，55-63;CancerRes.1988，48，589-601;Chin.J.Pharm.1993，24，455-457)通用方法進(jìn)行的。簡(jiǎn)單而言，100貼壁細(xì)胞種到96孔微板中，在加藥物前，貼壁12小時(shí)；懸浮細(xì)胞在將加受試藥物前以IX105cellS/ml密度種到96孔微板。每個(gè)受試藥物濃度分別為0.0625，0.32，1.6，8和40iiM，藥物與細(xì)胞接觸時(shí)間為48小時(shí)。然后，細(xì)胞生存能力按照文獻(xiàn)(Am.J.Hygiene1938,27,493-497)方法測(cè)試，以105。值表示。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果ICs。值(yg/ml)如表1及圖1所示，其中CHYX470A為乙酸乙酯提取物；CHYX470B為乙醇提取物。表1本發(fā)明干漆提取物CHYX470A和CHYX470B的IC5。值(yg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例8:本發(fā)明提取物及其與藥用輔料組成的藥物組合物的抗惡性腫瘤作用抗腫瘤血管生成作用。(1)實(shí)驗(yàn)原理許多研究已經(jīng)證實(shí)當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到一定體積，比如約1立方毫米時(shí)(約106個(gè)細(xì)胞)，就具有形成血管的能力以獲得養(yǎng)分和促進(jìn)排泄，腫瘤血管生成也是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因。內(nèi)皮細(xì)胞是血管的重要組成部分，因此對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有增殖、遷移以及成管抑制的物質(zhì)被認(rèn)為將會(huì)抑制腫瘤血管生成，從而抗癌。HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)作為內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)類型被廣泛用于腫瘤血管生成的模型研究，因此對(duì)HUVEC具有增殖、遷移和成管抑制的物質(zhì)將可能發(fā)展成為新的抗腫瘤血管生成藥物，用于癌癥治療和防治癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)采取這一原理進(jìn)行。(2)實(shí)驗(yàn)方法HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)增殖抑制實(shí)驗(yàn)藥物抑制HUVEC增殖試驗(yàn)是按照文獻(xiàn)(BioorgMedChemLett2009;19:1851-1854)方法采用MTT進(jìn)行測(cè)定的。簡(jiǎn)單而言，以1000HUVECs/孔將細(xì)胞種到96孔微板中，在加不同濃度的藥物(藥物溶解在DMSO或其它細(xì)胞可耐受的溶劑中，并控制其溶劑的終濃度)前，細(xì)胞貼壁20小時(shí)。在37t:孵育96小時(shí)后，細(xì)胞用MTT試劑處理，測(cè)定細(xì)胞活力，以IC5。值表示活性大小。HUVEC遷移能力實(shí)驗(yàn)HUVEC細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)是按照文獻(xiàn)(JCellBiol107:1199-1205)受傷愈合方法進(jìn)行的。HUVEC以3X105/孔種到24孔板中，并用完全培養(yǎng)基于37。C含5%C02培養(yǎng)，24小時(shí)后，細(xì)胞換用低濃度血清(0.5%FBS)培養(yǎng)24小時(shí)。然后每孔HUVEC以水平方式用P100吸液管尖端進(jìn)行劃痕，隨機(jī)選擇三個(gè)含劃痕的視野采用配備有相機(jī)的熒光倒置顯微鏡，在剛換新鮮培養(yǎng)基時(shí)對(duì)每孔劃痕進(jìn)行圖像獲得。繼續(xù)孵育7小時(shí)，采取上面相同的方法對(duì)劃痕進(jìn)行圖像獲得。細(xì)胞遷移能力的分析可以通過(guò)比較對(duì)照和受試藥物7小時(shí)前后劃痕變化而確定。HUVEC成管實(shí)驗(yàn)HUVEC成管實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)(JNatlCancerInst95:388-399)方法進(jìn)行。收獲匯合的HUVEC，并用低濃度的血清培養(yǎng)基250毫升稀釋(4.5X10力UVECs)，含藥物10i!g/ml，將其種到24孔板中，并設(shè)對(duì)照組，37t:孵育7小時(shí)，然后用裝備有照相機(jī)的倒置熒光顯微鏡，隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行圖像獲取，比較藥物和對(duì)照組圖像中管狀結(jié)構(gòu)以評(píng)價(jià)藥物對(duì)成管的效能。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，其中A為舉例說(shuō)明CHYX470A(即圖中CHYX470)抑制HUVEC增殖的量效關(guān)系HUVEC:IC5。=1.25yg/ml;B-1和B-2分別為說(shuō)明CHYX470A和CHYX470B抑制劃痕法HUVEC細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中B-l上排為劃傷后0小時(shí)；下排為劃傷后7小時(shí)。左列為control，右列為CHYX470A(1.0yg/ml)。其中B-2上排為劃傷后0小時(shí)；下排為劃傷后7小時(shí)。左列為control,右列為CHYX479B(1.0yg/ml)。C-1和C-2分別為說(shuō)明CHYX470A和CHYX470B抑制HUVEC成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果。C_l其中上排左列為對(duì)照組(不加藥物)；上排右列為藥物組CHYX470A(10yg/ml)。C-2其中上排左列為對(duì)照組(不加藥物);上排右列為藥物CHYX470B(10iig/ml)。本發(fā)明制成的提取物及其制劑具有顯著的腫瘤細(xì)胞毒活性和腫瘤血管生成抑制作用，對(duì)惡性腫瘤及其引起的多種不適癥狀均具有較好的療效，適用于任何年齡的患者。由于其新穎和獨(dú)特的抗腫瘤血管生成作用，對(duì)于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要治療價(jià)值。對(duì)肝癌前期肝硬化也有一定的療效。制成的劑型符合臨床需要，且使用和攜帶方便。權(quán)利要求干漆乙醇提取物，由下述方法制成將干燥的干漆粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用乙醇冷浸、溫浸或加熱回流，取濾液，回收乙醇并濃縮得提取物浸膏；其中乙醇的濃度為50～95％，乙醇體積每次為藥材的2～10倍，提取次數(shù)為1～3次，冷浸每次1～10天，回流時(shí)間為每次1～4小時(shí)，溫浸溫度為60℃。2.如權(quán)利要求1所述的干漆乙醇提取物，其特征在于取干燥干漆，粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用95%乙醇冷浸3次，每次用3倍于藥材的體積的乙醇，每次72小時(shí)，不斷攪拌，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇并濃縮干燥得干漆乙醇提取物浸膏。3.干漆乙酸乙酯提取物，用下述方法制成權(quán)利要求1所得的乙醇提取物浸膏用水適當(dāng)稀釋，用等體積的乙酸乙酯萃取16次，分取上層，回收乙酸乙酯并濃縮得乙酸乙酯提取物浸膏。4.干漆乙酸乙酯提取物，用下述方法制成將干漆粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用乙酸乙酯冷浸、溫浸或加熱回流，取濾液，回收乙酸乙酯并濃縮得浸膏；其中乙酸乙酯的體積每次為藥材的210倍，提取次數(shù)為13次，冷浸每次110天，回流時(shí)間每次為14小時(shí)，溫浸溫度為60°C。5.如權(quán)利要求4所述的干漆乙酸乙酯提取物，其特征在于取干燥干漆，粉碎成粗粉，置于容器內(nèi)，用95%乙醇冷浸3次，每次用3倍于藥材的體積的乙醇，每次72小時(shí)，不斷攪拌，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，加水適當(dāng)稀釋，水液用等體積乙酸乙酯萃取4次，分取乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯后干燥得干漆乙酸乙酯提取物。6.抗癌藥物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1或3或4的干漆提取物和藥學(xué)上可接受的載體。7.權(quán)利要求1或3或4的干漆提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。8.權(quán)利要求1或3或4的干漆提取物在制備抗癌藥物口服劑型中的應(yīng)用。9.權(quán)利要求1或3或4的干漆提取物在制備抗癌藥物注射劑中的應(yīng)用。10.權(quán)利要求1或3或4的干漆提取物在制備抗白血病、肝癌、肺癌、食道癌、骨髓瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種以傳統(tǒng)中藥為主要有效成份制備的藥物制劑，它是以中藥材干漆為主要有效成份制成片劑、膠囊劑等口服給藥劑型或注射劑，以干漆為有效成份的口服劑型或注射劑可加入其它成份和輔料組成復(fù)方制劑，具有顯著的腫瘤細(xì)胞毒活性和腫瘤血管生成抑制效果，可用于預(yù)防和治療白血病、肝癌、肺癌、食道癌、骨髓瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等癌癥，具有顯著的治療效果。文檔編號(hào)A61P35/02GK101732373SQ20101003917公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2010年1月18日優(yōu)先權(quán)日2010年1月18日發(fā)明者呂青,程永現(xiàn)申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所