專利名稱：用于預(yù)防性治療特應(yīng)性皮炎的軟化劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特應(yīng)性領(lǐng)域，以及與之相關(guān)的病變治療領(lǐng)域。
技術(shù)背景
特應(yīng)性被定義為對各種變應(yīng)原，例如室塵、螨、花粉、獸毛等以癥狀方式(疾 病)反應(yīng)的遺傳性素因(hereditary predisposition)。被稱為特應(yīng)性的病變包括特應(yīng)性皮炎 (AD)、變應(yīng)性支氣管哮喘和變應(yīng)性鼻炎或者“花粉癥”。
特應(yīng)性皮炎(或者特應(yīng)性濕疹)為常見的皮膚病，影響法國10-15%的嬰兒，且 在過去的幾十年里有所增加。
特應(yīng)性皮炎為慢性病，其發(fā)展時發(fā)疹，間斷地出現(xiàn)緩解期，在這期間損害總是 存在但是處于最小程度，基本上表現(xiàn)為干燥病(皮膚干燥)和瘙癢癥。
皮膚發(fā)炎是發(fā)疹的特征，其表現(xiàn)為發(fā)炎跡象和癥狀，包括紅色斑塊(紅斑)、水 皰、痂、滲出物和瘙癢(itch)。
疾病通常在3個月至2年的年齡間開始出現(xiàn)，但是甚至可以更早地從1個月開始 出現(xiàn)。其發(fā)展通常是良好的，在大多數(shù)情況下，在5至8歲時出現(xiàn)完全緩解。有可能在 青春期或者青少年時再現(xiàn)。在15-20%的情況下，該疾病可持續(xù)至成年。
也有可能朝著另一特應(yīng)性病變發(fā)展。在兒童期存在AD增加了患哮喘的風(fēng)險， 且在AD的出現(xiàn)率與哮喘的出現(xiàn)率間存在明顯的相關(guān)性。受AD影響的兒童出現(xiàn)哮喘的 風(fēng)險估計(jì)為30-40%。
出現(xiàn)食物過敏的風(fēng)險(最常出現(xiàn)在3歲前)，或者出現(xiàn)變應(yīng)性鼻炎(過些時候出 現(xiàn))的風(fēng)險根據(jù)研究的不同而有所變化。
有關(guān)特應(yīng)性皮炎，存在顯著的遺傳素因(genetic predisposition)，如果父母之一受到感染，則出現(xiàn)疾病的風(fēng)險為30-50%，如果父母均受到感染，則風(fēng)險接近80%。遺 傳素因包括很多基因，其編碼表皮屏障作用的決定子，或者編碼先天或適應(yīng)性的免疫作 用物(immunity actor)?？紤]到很多近期的調(diào)查研究，可以假設(shè)AD (或者甚至其它特應(yīng) 性疾病)與表皮的屏障作用的原始異常有關(guān)，其導(dǎo)致對環(huán)境劑(變應(yīng)原和微生物)增加的 滲透性，導(dǎo)致免疫激活和過敏癥狀。
表皮滲透性的異常表現(xiàn)為皮膚干燥病，增加的難以覺察的失水量，以及編碼表 皮蛋白如絲聚蛋白(FLG)(參與表皮的屏障作用)的基因表現(xiàn)出多態(tài)性(Palmer，2006)。 法國的最新研究證實(shí)FLG基因的多態(tài)性與AD相關(guān)，相對危險性在3以上(Hubiche， 2007)。
特應(yīng)性可被認(rèn)為是與環(huán)境的變應(yīng)原接觸而引起的延遲的過分敏感反應(yīng)。其通常 出現(xiàn)兩個階段。臨床上不活躍的第一致敏階段產(chǎn)生對皮膚特異的T淋巴細(xì)胞。來自環(huán)境 的變應(yīng)原穿透受干燥病影響的皮膚而導(dǎo)致該致敏的發(fā)生。第二階段特異的T淋巴細(xì)胞的 活化導(dǎo)致產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子。
總體上，特應(yīng)性皮炎的外部體征起因于環(huán)境因素、藥理學(xué)異常、皮膚的屏障作用的機(jī)能障礙或變更、免疫現(xiàn)象和遺傳易感性之間的復(fù)雜相互作用。
在眾多因素中，皮膚高反應(yīng)性、對各種微生物不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)以及二次感染 似乎對于慢性病理學(xué)起作用。
皮膚菌群在有利于濕疹損傷發(fā)展的免疫激活的發(fā)生和/或維持中的作用逐漸為 人所知。與受特應(yīng)性皮炎感染的患者的某些免疫缺陷相關(guān)的皮膚的屏障作用的改變，導(dǎo) 致金黃色釀膿葡萄球菌Staphylococcus aureus)的移生，金黃色釀膿葡萄球菌移生在90% 的具有AD的患者的皮膚上，甚至在疾病的進(jìn)行性出疹之外。(CurrentOpinionteAllergy and Clinical Immunol.2007, 7, 413)。
疾病的嚴(yán)重性一方面與葡萄球菌移生密度之間存在關(guān)聯(lián)，另一方面與針對葡 萄球菌毒素的特應(yīng)性IgE的陽性檢出率(positivity frequency)之間存在關(guān)聯(lián)(J.Allergy Clin.Immunol.2006，117，1141 ； Am.J.Clin.Dermatol., 2006，7，273 ； Clin.Rev.Allergy Immunol.，2007，33，167 ； Current Opinion Allergy and Clinical Immunol.2004, 4，373)。
這些事實(shí)引起如下猜想金色葡萄球菌對于引起特應(yīng)性皮炎和可能的變應(yīng)性致 敏的外部皮膚體征的局部免疫活化發(fā)展起作用。
除搔抓外，很多因素通過改變初級皮膚防御系統(tǒng)并首先改變角質(zhì)層的類脂組合 物，而促進(jìn)金黃色釀膿葡萄球菌的移生。該皮膚屏障作用的改變因而導(dǎo)致葡萄球菌的移 生，并導(dǎo)致皮膚失水量的增加，引發(fā)干燥病、刺激、搔癢，并因此產(chǎn)生一種病理生理學(xué) 上的惡性循環(huán)。
特應(yīng)性皮炎的治療管理可被認(rèn)為處于各種水平，主要為癥狀水平但也有預(yù)防水 平。如今對該疾病沒有根治療法。
除了逐出盡可能所需的確定的變應(yīng)原外，皮膚的保濕作為恢復(fù)或維持其屏障作 用的方法可加入通過局部皮質(zhì)療法(其為該疾病標(biāo)準(zhǔn)療法)而對出疹進(jìn)行的癥狀治療中。 其它局部非類固醇類抗炎劑(鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin)的顯著抑制劑)也可用于治療 出疹。最后，光線療法、口服免疫抑制劑或者其它廣泛的系統(tǒng)療法被保留用于重癥。
但是，使用腎上腺皮質(zhì)激素、抗炎劑和/或免疫抑制劑，即使經(jīng)由局部途徑， 特別是對于嬰兒或小孩而言并不是件小事，其具有不良副作用，且僅為癥狀治療。
另一方面，使用腎上腺皮質(zhì)激素導(dǎo)致存在恐懼癥，這不利于管理該疾病也不符 合患者的要求(他們通常是貧困的)。
最后，金黃色釀膿葡萄球菌可誘導(dǎo)對腎上腺皮質(zhì)激素的抵抗(Clin.RevAllergy Immunol.2007 33 167)。
因此需要且強(qiáng)烈需求治療替代方案，更具體地需要且強(qiáng)烈需求預(yù)防性治療。這 些治療的目的在于降低在感染特應(yīng)性皮炎的患者中觀察到的濕疹出疹的出現(xiàn)率和/或強(qiáng) 度。該方法為根據(jù)WHO定義的三級預(yù)防方案，因?yàn)槠鋬A向于避免已經(jīng)存在的疾病(特 應(yīng)性皮炎)的并發(fā)癥(炎性出疹)。
申請W02008048076公開了使用葡萄糖胺或者其衍生物的一種用于治療特應(yīng)性 皮炎。
申請W020070232^公開了使用益生菌并結(jié)合益生元用于治療兒童的特應(yīng)性皮 炎。
目前，已經(jīng)注意到令人非常驚奇和意想不到的是，水包油或油包水乳液形式的 丙三醇、凡士林 和液體石蠟的組合能夠預(yù)防特應(yīng)性皮炎。
發(fā)明人已經(jīng)顯示該組合對于金黃色釀膿葡萄球菌粘附于培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的 抑制效果。丙三醇、凡士林和液體石蠟的組合因此能夠預(yù)防金黃色釀膿葡萄球菌在特應(yīng) 性患者中的傳染作用，以及其通過生成抑制金黃色釀膿葡萄球菌在皮膚上移生的特應(yīng)性 IgE而維持炎性反應(yīng)的作用。
此外，發(fā)明人已經(jīng)顯示這種組合恢復(fù)了皮膚的保護(hù)和功能屏障作用。對此，發(fā) 明人使用了誘導(dǎo)性皮膚脫水的活體外皮膚模型。此外，它們遵從表皮標(biāo)記的表達(dá)和絲氨 酸蛋白酶活性。發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的為一種用于局部用途的組合物，其包含水包油或油包水乳液 形式的丙三醇、凡士林和液體石蠟的組合作為活性成分，所述組合物用于預(yù)防特應(yīng)性皮 炎。
優(yōu)選地，預(yù)防為初始型。
在本發(fā)明中，術(shù)語“預(yù)防”或“預(yù)防性治療”是指避免疾病、病癥、或一個或 多個體征和/或癥狀的出現(xiàn)。
在本發(fā)明中，術(shù)語“初級預(yù)防”或“初級預(yù)防性治療”是指通過在特應(yīng)性的第 一臨床體征之前(即從發(fā)病起)采取行動，預(yù)防特應(yīng)性疾病(特應(yīng)性皮炎和/或變應(yīng)性支 氣管哮喘和/或變應(yīng)性鼻炎，通稱“花粉癥”)和/或變應(yīng)性致敏的發(fā)生。
在本發(fā)明中，水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林和液體石蠟的組合被 稱為“活性組合”。
有利地，丙三醇、凡士林和液體石蠟具有根據(jù)“歐洲藥典”(第6版)所記載和 管理的標(biāo)準(zhǔn)。
有利地，活性組合的凡士林具有35至70°C，優(yōu)選51至57°C，更優(yōu)選大約M°C 的滴點(diǎn)。根據(jù)在“歐洲藥典”(第6版)中所述的2.2.17方法測量滴點(diǎn)。
有利地，活性組合的凡士林具有175至1951/10毫米，優(yōu)選大約1851/10毫米的 稠度(在25 °C下錐體針入度(cone penetration))。
有利地，活性組合的凡士林具有在100°C下4至^^1優(yōu)選在100°C下大約4. 的粘度。
在根據(jù)本發(fā)明的組合物中，活性組合的存在比例以組合物的總重量計(jì)為10-50 重量％，優(yōu)選20-30重量丙三醇濃度以組合物的總重量計(jì)為5-30重量％，優(yōu)選10-20 重量％，更優(yōu)選大約15重量％，凡士林濃度以組合物的總重量計(jì)為3-20重量％，優(yōu)選 5-10重量％，更優(yōu)選大約8重量％，以及液體石蠟濃度以組合物的總重量計(jì)為0.5-5重 量％，優(yōu)選1-3重量％，更優(yōu)選大約2重量％。
在水相中，基于組合物的總重量包含30-80重量％的水。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含以組合物的總重量計(jì)，大約15重量％的丙三 醇、大約8重量％的凡士林和大約2重量％的液體石蠟。
根據(jù)本發(fā)明的皮膚病學(xué)組合物進(jìn)一步包含常規(guī)皮膚病學(xué)可相容賦形劑。
根據(jù)本發(fā)明的皮膚病學(xué)組合物可以制備成油包水(W/0)或水包油(0/W)乳 液，制備成多重乳液如水包油包水乳液(W/0/W)或油包水包油乳液(0/W/0)，或者進(jìn) 一步制備成水分散體或脂分散體、凝膠或氣溶膠。
皮膚病學(xué)上相容的賦形劑可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何賦形劑，從而獲得 以乳膏、洗劑、凝膠、軟膏、乳液、微乳劑、噴霧劑等形式局部施用的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可特別地包含添加劑和制劑助劑，如乳化劑、增稠劑、膠 凝劑、固水劑(water fixing iigent)、鋪展劑、穩(wěn)定劑、染料、香料和防腐劑。
合適的乳化劑包括硬脂酸、三乙醇胺(trolamine)、PEG_40_硬脂酸酯。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)大約5重量％的乳化 劑。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)1-5重量％，優(yōu)選大約3 重量％的硬脂酸。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)0-2重量％，優(yōu)選大約0.5重量％的三乙醇胺。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)0-2重量％，優(yōu)選大約 0.5重量％的PEG-40-硬脂酸酯。
合適的增稠劑包括甘油單硬脂酸酯、PEG。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)大約5重量％的增稠 劑。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)2-10重量％，優(yōu)選大約 5重量％的甘油單硬脂酸酯。
合適的防腐劑包括對羥基苯甲酸丙酯、氯甲酚。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)大約0.1重量％的防腐 劑。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)0.05-1重量％，優(yōu)選大約0.1重量％的對羥基苯甲酸丙酯。
合適的鋪展劑包括聚二甲基硅氧烷(dimethicone)、聚二甲基環(huán)硅氧烷。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)大約2重量％的鋪展 劑。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)0.2-2重量％，優(yōu)選大約0.5重量％的聚二甲基硅氧烷。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)1-3重量％，優(yōu)選大約 2.5重量％的聚二甲基環(huán)硅氧烷。
合適的固水劑包括聚乙二醇，優(yōu)選聚乙二醇600。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)大約8重量％的固水 劑。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物具有以組合物的總重量計(jì)2-10重量％，優(yōu)選大約5重量％的聚乙二醇。
用于乳液的水相的水可以為蒸餾水或者具有美膚性能的溫泉水。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含
-大約15%的丙三醇，
-大約8%的凡士林，
-大約2%的液體石蠟，以及作為賦形劑的如下組分
-大約1-5%的硬脂酸，
-大約2-10%的甘油單硬脂酸酯，
-大約1-3%的聚二甲基環(huán)硅氧烷，
-大約0.2-2%的聚二甲基硅氧烷，
-大約2-10%的聚乙二醇600，
-大約0-2%的三乙醇胺，
-大約0.05-1%的對羥基苯甲酸丙酯，
-直至100%的水。
本發(fā)明的目的還在于根據(jù)本發(fā)明的組合物用于制備旨在預(yù)防特應(yīng)性皮炎的藥物 的用途。
具體實(shí)施方式
通過以下實(shí)施例闡明本發(fā)明。
實(shí)施例
實(shí)施例1 制劑
組合物A
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液體石蠟，
-0.5克的三乙醇胺，
-以及作為賦形劑的硬脂酸、甘油單硬脂酸酯、聚二甲基環(huán)硅氧烷、聚二甲基硅 氧烷、聚乙二醇(PEG)600、對羥基苯甲酸丙酯，
-直至IOOg的水。
組合物A'
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液體石蠟，
-1.5克的硬脂酸，
-5克的甘油單硬脂酸酯，
-1.5克的聚二甲基環(huán)硅氧烷，
-0.5克的聚二甲基硅氧烷，
-5克的聚乙二醇600，
-0.15克的三乙醇胺，
-0.1克的對羥基苯甲酸丙酯，
-直至IOOg的水。
組合物B
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液體石蠟，
-0.5克的PEG-40-硬脂酸酯，
-以及作為賦形劑的硬脂酸、甘油單硬脂酸酯、聚二甲基環(huán)硅氧烷、聚二甲基硅 氧烷、聚乙二醇(PEG) 600、氯甲酚，
-直至IOOg的水。
組合物B'
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液體石蠟，
-3克的硬脂酸，
-5克的甘油單硬脂酸酯，
-2克的聚二甲基環(huán)硅氧烷，
-0.5克的聚二甲基硅氧烷，
-0.1克的三乙醇胺，
-3克的聚乙二醇600，
-0.5克的PEG-40-硬脂酸酯，
-0.075克的氯甲酚，
-直至IOOg的水。
實(shí)施例2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)
M
試驗(yàn)的原理基于四唑鐺鹽“3，3_[1[(苯基氨基)羰基]-3_4四唑鐺鈉雙甲 氧基-6-硝基)]苯磺酸水合物”(即XTT)酶轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)品，甲臜(formazan)。
在電子耦合劑、輔酶Q的存在下，XTT通過活細(xì)胞的線粒體脫氫酶而被還原為 黃色/橙色水溶性化合物甲臜(其可通過分光光度法在450納米下進(jìn)行測定)。
用產(chǎn)品進(jìn)行治療
用IO5細(xì)胞/毫升播種96-孔微板，在孵育M小時后，除去培養(yǎng)基，并用PBS 沖洗微板。向微板的每個孔中加入100微升測試產(chǎn)品的不同稀釋物。在相同條件下制備 無任何產(chǎn)品的對照樣。
將微板置于5% CO2下，在37°C孵育2小時。
揭露細(xì)胞毒性
在孵育后，用PBS洗滌微板兩次。接著，在96-孔板的每個孔中加入100微升 XTT (1毫克/毫升)/輔酶Q (0.2毫克/毫升)混合物。
在孵育3小時后，向每個孔中加入100微升10%的SDS溶液。
采用分光光度計(jì)POLARstar (BMG，法國)，在450納米處進(jìn)行光密度的瞬間讀數(shù)。
結(jié)果表示
測量的光密度與存活細(xì)胞總數(shù)(viablecellpopulation)成正比。
當(dāng)光密度小于對照批次的光密度時，因此我們有可能通過該試驗(yàn)，從對應(yīng)于對 照批次的光密度分析細(xì)胞毒性
存活率％ (% viability)=(治療的 OD-對比 OD) / 對比 OD X 10
如果存活率百分?jǐn)?shù)<30%，則產(chǎn)品被認(rèn)為是細(xì)胞毒性的。
進(jìn)行8次內(nèi)操作試驗(yàn)。
MM
取決于產(chǎn)品的非細(xì)胞毒性的程度，所選用于粘附試驗(yàn)的濃度如下
-組合物A: 6%, 3%, 1.5%, 0.8%禾口 0.4%
-Atopiclair0.8%、0.4%, 0.2%, 0.1%禾口 0.05%
-Physiogel 6%、3%, 1.5%, 0.8%禾口 0.4%
-組合物B: 3%, 1.5%, 0.8%, 0.4% 禾口 0.2%
實(shí)施例3 粘附試騎
M
用含氚腺嘌呤(σ)標(biāo)記細(xì)菌，并通過評價放射性水平確定粘附于角質(zhì)形成細(xì)胞 表面的細(xì)菌比例。
用含氚腺嘌呤標(biāo)記細(xì)菌
在充足培養(yǎng)基中，在30 μ Ci含氚腺嘌呤的存在下進(jìn)行細(xì)菌的標(biāo)記。在37°C下孵 育18小時后，在PBS中洗滌微生物3遍以除去非摻入的放射性。
在維持介質(zhì)中調(diào)節(jié)懸浮液至2X IO8微生物/毫升。
粘附抑制效果
在產(chǎn)品的每個試驗(yàn)稀釋液的存在下，在細(xì)胞層的表面沉積500微升標(biāo)記的細(xì) 菌。
在孵育(37°C，5%C02)2小時后，用PBS洗滌3遍。
細(xì)胞的溶解
在37°C下用500微升0.5N的氫氧化鈉溶液(含0.1 %的十二烷基硫酸鈉)對粘附 于角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)菌溶解18小時。
對每個孔的溶解產(chǎn)物取樣并置于計(jì)數(shù)管中。在每個管中加入2毫升液體閃爍 體。
結(jié)果表示
用β計(jì)數(shù)(其表示放射性水平，以cpm(計(jì)數(shù)/分鐘)計(jì))進(jìn)行讀數(shù)。
-根據(jù)下式計(jì)算粘附抑制百分?jǐn)?shù)
抑制％ =((試驗(yàn) cpm-對比 cpm) / 對比 cpm) X 100
如果粘附抑制百分?jǐn)?shù)的值<-30%，則其是顯著的。
一式四份地進(jìn)行測試。
Mit
-在6%和3 %下孵育2小時后，組合物A顯著地抑制了金黃色釀膿葡萄球菌粘 附于角質(zhì)形成細(xì)胞。
-在6%但并非3%下孵育2小時后，Physiogel產(chǎn)品顯著地抑制了金黃色釀膿葡萄球菌粘附于角質(zhì)形成細(xì)胞。
-Atopiclair產(chǎn)品對金黃色釀膿葡萄球菌粘附于角質(zhì)形成細(xì)胞沒有任何影響。
-在組合物B的存在下，金黃色釀膿葡萄球菌對角質(zhì)形成細(xì)胞的粘附異常地增 加。
實(shí)施例4 對誘導(dǎo)件皮膚脫水的調(diào)整件的分析
我們在此通過使用誘導(dǎo)性皮膚脫水的活體外皮膚模型，評價了組合物A的增濕 活性以及后續(xù)對皮膚屏障作用的改進(jìn)。
我們通過定量PCR和免疫組織化學(xué)，觀察了微分分子表皮標(biāo)記的表達(dá)。
我們還通過原位酶譜法追蹤了絲氨酸蛋白酶的活性，并通過Western免疫印跡法 (Western blotting)追蹤了角層橋粒蛋白(corneodesmosomal protein)的降解。
利用熒光探針分析皮膚屏障的作用。
裝置和方法
1、組織模型
1、皮膚移植物的制備
實(shí)驗(yàn)室從整形外科(乳房縮小)的操作廢料中回收皮膚樣品。使用這些樣品進(jìn) 入法國高等教育和研究部規(guī)定的“Pierre Fabre組的研究方案所需的人體元件的保存和制 備活動的聲明 ” ("the declaration of an activity for preserving and preparing elements of the human body for the needs of a research program of the Pierre Fabre group ”)的范圍。
在10PBS浴中洗滌這些樣品，然后沖切成直徑為2厘米的盤狀。將皮膚移植物 展開在Petri盤中的網(wǎng)格上，并將1厘米直徑的環(huán)密封在皮膚上以限定治療區(qū)域。
2、模型動力學(xué)
對于誘導(dǎo)性脫水模型，在無任何蓋子的盤中，在細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺下干燥皮膚2 小時，然后將皮膚置于保溫箱(oven)中，在存在或不存在任何活性組合的情況下局部治 療2小時。脫水應(yīng)激的陰性對比樣在封閉的Petri盤中經(jīng)歷相同的動力學(xué)。
3、用于分析的樣品
在治療后，取樣2個直徑為6毫米的活組織用以分析RNA表達(dá)，以及取樣一個 包括在Tissue Tek(Sakura Finetek)樹脂團(tuán)中的直徑為4毫米的活組織用于組織學(xué)。為 分析蛋白，將皮膚在60°C水浴的熱沖擊中暴露5分鐘，然后在4°C中暴露2分鐘以分離表 皮和真皮。
在液氮中冷卻活組織和表皮，并存儲在-80°C下以待分析。
II.通過定量PCR分析轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)
在之前用液氮冷卻的研缽中研磨皮膚活組織，根據(jù)提供者的推薦利用RNeasy 試劑盒(QIAGEN)提取 RNA。然后用 Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)在 RNA 6000 Nano LabChip 切片上測定 RNA。采用 Access RT-PCR Core Reagents 試劑盒 (Promega)，使用寡dT引物，通過進(jìn)行酶逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，自1微克RNA獲得cDNA。根 據(jù)40個循環(huán)步驟(包括在95°C下變性(15秒)和在60°C下伸長(1毫米))，通過在配 備 PCRiQ SYBR Green Super Mix 試劑盒(Biorad)的熒光溫度循環(huán)器 IClycler iQ (Biorad)上定量的PCR分析基因表達(dá)水平。利用iCycler軟件觀察在一個接一個循環(huán)中 PCR產(chǎn)品的積聚(正比于熒光發(fā)射6YBR Green intercalant))。
iClycler版本3.1分析軟件傳送Ct (循環(huán)閾值)的原始值開始cDNA放大的循環(huán)。利用程序Genorm版本3.4 (其能夠從各樣品中選擇最穩(wěn)定的參考基因)平行分析數(shù) 個參考基因的表達(dá)。然后使用該基因作為對比，通過計(jì)算Δ Ct=感興趣的基因Ct-對比 基因Ct來歸一化結(jié)果。
然后計(jì)算每個治療相對于對應(yīng)的對比條件的誘導(dǎo)因子(IF)。IF = 2_mct，其中 Δ Δ CT =處理的Δ CT-對比Δ CTo對于獲自5個不同個體的五個試驗(yàn)評價mRNA的表 達(dá)2次。當(dāng)相對于對比樣的誘導(dǎo)因子在2以上時，認(rèn)為基因表達(dá)受到誘導(dǎo)，但其在0.5以 下時，認(rèn)為表達(dá)被抑制。通過用下式計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)來評價在模型中引起的活性成分對 應(yīng)激反應(yīng)的影響
應(yīng)激反應(yīng)抑制％ = 100*[(應(yīng)激的IF-無應(yīng)激的對比IF)-(治療的IF-無應(yīng)激的對 比IF) ]/[(應(yīng)激的IF-無應(yīng)激的IF)]
與研究模型相比，“無應(yīng)激的對比”條件對應(yīng)于無干燥的對比；“應(yīng)激的”條 件對應(yīng)于已經(jīng)干燥2小時且在對比條件下(即無任何局部治療)處理另外2小時的皮膚活 組織；最后“治療的”條件為已經(jīng)干燥2小時且接著用軟化劑局部治療2小時的皮膚。
III.通過Western免疫印跡法分析蛋白表達(dá)
在用液氮冷卻的研缽中研磨治療的表皮，在溶解緩沖液ROPA(Tris HCl pH8 50mM ； NaCl 150mM ； Triton X 100 IX ；脫氧膽酸鈉(Na+desoxycholate) 1 % ； SDS 0.1% ； EDTA 5mM ； DTT IOOmM ；蛋白酶抑制劑的混合物(參考P8340，SIGMA)中提取蛋白。
然后利用DC-DC蛋白測定法(Biorad)測定蛋白，并利用Western免疫印跡 法分析蛋白。對于每個條件，將25至40微克的總蛋白沉積在含7.5%聚丙烯酰胺的 Tris-Glycine凝膠上。利用Mini Protean II系統(tǒng)(Biorad)，通過電泳法分離蛋白混合物， 在PVDF膜(Hybond-Ρ，Amersham)上轉(zhuǎn)移蛋白。通過特定的抗體和ECL+試劑盒 (Amersham)揭露感興趣的蛋白。在相對于β-肌動蛋白(參比蛋白)歸一化后，通過軟 件Image Master TotalLab版本1.11 (Amersham)計(jì)算蛋白的量和降解形式的比例。
IV.組織學(xué)技術(shù)
采用Cryotome (Leica CM 3050s)將皮膚活組織切成厚度為5微米的切塊，并沉積 在觀察載玻片Mtarfrost )上。
1、免疫組織化學(xué)
在20°C下采用丙酮固定冷凍切塊(CTyocut)IO分鐘，然后在用免疫化學(xué)標(biāo)記分析 之前用PBS進(jìn)行再水合。在固定和再水合之后，采用3% BSA溶液使皮膚切塊飽和， 并用針對感興趣的蛋白的初級抗體將其孵育1小時。在第二階段，用與Alexa-488或 Alexa-555熒光染料結(jié)合的第二抗體將它們孵育1小時，最后將其固定在包含DAPI的 Mowiol中用于標(biāo)記細(xì)胞核。
2、原位酶譜法
在_20°C下在丙酮中固定10分鐘后，在洗滌液(在水中的Tween20)中沖洗 切塊，并用包含感興趣的酶的特定作用物結(jié)合熒光團(tuán)(輔助的)的溶液在37°C下孵育2小 時。當(dāng)活化酶時，熒光團(tuán)被分開，釋放熒光信號，這可在顯微鏡下觀察到。然后在落射 熒光顯微鏡(NikonEclipse 50i)下或者在反相的同焦顯微鏡Zeiss Axiovert 100下觀察標(biāo)記的載玻片。
3、熒光探針
在脫水治療后，采用在HBSS緩沖液中ImM的熒光探針螢光黃羧基-酰胼二 鋰鹽(Invitrogen)，在37°C下在保溫箱中進(jìn)一步孵育皮膚移植物1小時。然后在HBSS 浴中沖洗皮膚1分鐘，接著取樣直徑為4毫米的活組織，使其包括在Tissue TekR 樹脂 MakuraFinetek) (Matsuki等人，1998)中。其后切開皮膚，用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，在如上 所述的熒光顯微鏡下采用450納米波長觀察載玻片。
結(jié)果
1、由于誘導(dǎo)干燥的屏障作用失效模型
1、采用熒光探針測量皮膚滲透性
第一分析的組成為研究皮膚屏障作用中的基本功能參數(shù)表皮上層的滲透性。 在干燥實(shí)驗(yàn)后利用熒光探針(螢光黃)的皮膚孵育能夠表征皮膚滲透性的調(diào)節(jié)。在對比條 件下，標(biāo)記非常低和淺，探針通過角質(zhì)層穿透得并不很多，且在沖洗過程中被除去。在 干燥2小時后，在角質(zhì)層的較深層可觀察到標(biāo)記。干燥使得皮膚更具有滲透性，其屏障 作用被破壞。在干燥兩小時后用組合物A進(jìn)行局部治療恢復(fù)了 SC相對于探針的不滲透 性，標(biāo)記再次變得低和淺，與在對比條件下的類似。由此可以得出結(jié)論增濕治療對于 干燥皮膚以及對于皮膚屏障作用具有修復(fù)效果，這可在組織模型上觀察到。
2、對轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的調(diào)整性的影響
在干燥模型的不同應(yīng)激或治療條件下，通過定量PCR測量潛在地涉及表皮屏障 作用的內(nèi)環(huán)境平衡(homeostasia)的不同基因的表達(dá)。通過免疫組織化學(xué)分析給出顯示就 定位而言重新組織某些蛋白表達(dá)(例如關(guān)閉連接)的可能性。通過Western免疫印跡法分 析角層橋粒蛋白的降解。
將通過這些不同方法研究的目標(biāo)根據(jù)其生理學(xué)作用組合在一起(參見表1)。研 究的目的是觀察可觀察的應(yīng)激反應(yīng)和由于組合物A的局部施用帶來的對應(yīng)激效果的修 正。
根據(jù)已完成的工作，還有可能顯示出某些目標(biāo)的不同調(diào)整水平。因此，我們能 夠注意到脫屑的酶沒有在轉(zhuǎn)錄水平，而是更特別地在其活性水平被調(diào)整(參照結(jié)果3)。
表1 :在干燥模型中研究的目標(biāo)和藥理反應(yīng)的匯總
Y =在模型中目標(biāo)反應(yīng)；Y =是
X=在模型中目標(biāo)不反應(yīng)N =否
權(quán)利要求
1.一種用于局部用途的組合物，其包含水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林 和液體石蠟的組合作為活性成分，所述組合物用于預(yù)防特應(yīng)性皮炎。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其用于初級預(yù)防特應(yīng)性皮炎。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述凡士林具有35至70°C的滴點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述凡士林具有51至57°C，特別是54°C的滴點(diǎn)ο
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任意項(xiàng)所述的組合物，其中所述凡士林具有175至1951/10毫米 的稠度(在25 °C下的錐體針入度)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述凡士林具有大約1851/10毫米的稠度(在 25°C下的錐體針入度)。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任意項(xiàng)所述的組合物，其中所述凡士林在100°C下具有4至5cSt 的粘度。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述凡士林在100°C下具有大約4.8cSt的粘度。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任意項(xiàng)所述的組合物，其包含大約15%的丙三醇、大約8%的凡 士林和大約2%的液體石蠟。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任意項(xiàng)所述的組合物，其包含選自硬脂酸、甘油單硬脂酸酯、 聚二甲基環(huán)硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇600、三乙醇胺、對羥基苯甲酸丙酯、蒸 餾水的一種或多種賦形劑。
11.一種包含水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林和液體石蠟的組合作為活性 成分的組合物用于制備旨在預(yù)防特應(yīng)性皮炎的藥物的用途。
12.如權(quán)利要求3至10中所述的組合物在制備旨在預(yù)防特應(yīng)性皮炎的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于局部用途的組合物，其包含水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林和液體石蠟的組合作為活性成分，所述組合物用于預(yù)防特應(yīng)性皮炎。
文檔編號A61K31/01GK102026631SQ200980117468
公開日2011年4月20日 申請日期2009年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者D·庫斯圖, H·杜普蘭 申請人:皮埃爾·法布爾皮膚化妝品公司