專利名稱：：西沙海綿中一種環(huán)九肽類化合物及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，是產自西沙群島附近海域的海洋動物棕色扁海綿中的一種具有抗腫瘤活性的新的環(huán)九肽類化合物。
背景技術：
：海綿是一種低等的多細胞動物，其分布廣泛但常含有很多結構罕見的具有抗癌活性的次生代謝產物，因此一直是海洋天然產物化學家首選海洋生物研究對象。本發(fā)明的藥源材料P/z"fe肌"海綿屬尋常綱(Demospongiae)軟海綿目(Halichondrida)小軸海綿科(Axindlidae)海綿。2002年，曾從我國南海西沙永興島上采集的戶/"""海綿中發(fā)現(xiàn)了1個新的環(huán)肽phakemastatin12并已申請專利(申請?zhí)?1113389.9)。之前的所有Phakellistatins類環(huán)肽化合物均是由美國亞利桑那州立大學Pettit小組從尸/wfe/""屬海綿中發(fā)現(xiàn)的，但至今未見有關具有抗腫瘤活性的新的環(huán)九肽類化合物的報道。
發(fā)明內容本發(fā)明提供一種從中國西沙群島附近海域的棕色扁海綿中分離到新的環(huán)九肽類化合物，其化學結構式如下本發(fā)明化合物的制備方法如下:1.提取，制備總提物將千燥的棕色扁海綿(P./W")粉碎后，按常規(guī)用95%乙醇冷浸提取，得提取液，將提取液濃縮得浸膏，加入50%的乙酸乙酯水溶液進行提取，得乙酸乙酯總提物。2.分離純化1)制備粗提物將乙酸乙酯總提物用90%甲醇混懸，按常規(guī)經石油醚脫脂后，將甲醇水層用正丁醇萃取，得粗提物；2)分離純化環(huán)肽類化合物將粗提物上SephadexLH-20凝膠柱色譜，以純甲醇為洗脫劑，根據薄層層析檢識結果，收集含有環(huán)肽類化合物的洗脫液部分，再進行反相硅膠柱色譜，以體積比為l:1-1:0的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，再以反相高效液相(55%甲醇/水，流速1.5ml/min，檢測波長為280nm)制備，得本發(fā)明化合物G48H68Ni20|4°體外活性試驗證明，本發(fā)明化合物對P388、BEL-7402、SPC-A-1、HAC和Colo-26等多種不同的腫瘤細胞均有一定的抑制活性。因此可用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明化合物制備方法簡單，抗腫瘤活性顯著。本發(fā)明為研究和開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了新的先導化合物，為開發(fā)利用我國海洋藥用資源提供了科學依據。具體實施例方式現(xiàn)結合實施例對本發(fā)明作詳細描述。實施例l.制備本發(fā)明化合物取干燥粉碎后的棕色扁海綿15kg，分別用95%乙醇50L冷浸提取8次，每次一周，合并提取液，提取液經減壓濃縮得浸膏，浸膏用50%的乙酸乙酯水溶液進行提取，得乙酸乙酯總提物，乙酸乙酯總提物用卯％甲醇混懸，用石油醚脫脂；將醇水層用正丁醇萃取，得粗提物50g;將上述粗提物50g進行SephadexLH-20凝膠柱色譜，以純甲醇為洗脫劑，根據薄層層析檢識結果，收集含有環(huán)肽類化合物的洗脫液部分，再進行反相硅膠柱色譜，以體積比為l:1-1:0的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，再以反相高效液相(55%甲醇/水，流速1.5ml/min,檢測波長為280nm)制備，得化合物C48H68N12014，其理化性質和核磁共振譜數(shù)據如下化合物<:48^168:^12014:白色玻璃狀粉末。ESI-MS中顯示有[M+Hr峰1037.54、[M+Na]+峰1059.55,確定其分子量為1036。核磁共振譜數(shù)據見表l。表1化合物C48H68N12014的核磁共振譜數(shù)據(DMSO-d6,600MHz/150MHz)Positions13cS'H(mult.J)PositionS'3CS'H(mult.J)Pro4-CH223.441.58(m)卜CO174.21.55Cm)2-CH60.644.00Cm)5-CH240.573.14(m)3-CH228.74a:1.77(m)2.94(m)b:1.26(m)NH9.36(br.s)4-CH224.21a:1.66On)34-C157.42b:1.53(m)=NH5-CH247.13a:3.63(m)-NH2b:3.19(m)C陽NH8.76(d,7.2)PheAla1-CO169.241-CO172.252-CH54.444.22(m)2-CH47.584.44(qui,7,0)3-CH234.87a:3.33(m)3-CH318.871.28(d，7.0)b:2.90(m)NH7.58(d,7.0)4-C138.56Val5/5'-CH128.887.08(d，7.S)1-CO171.316/6'-CH128.17.23(t,7.5)2-CH59.963.98(t，7.0)7-CH126.197.16(t，7.5)3-CH29.382.07(m)NH7.23(br.s)4-CH318.380.87(d,6.8)Asp5-CH319.430.89(d,6.8)1-CO172.72NH8.08(d,6.3)2-CH50.284.71(br.t10.2)Thr3-CH241.96a:2.82(m)1-CO169.67b:2.17(m)2-CH58.833.98(m)4-CO175.783-CH65.584.15(m)OHOH5.03(br.s)NH7.00(d，8.8)4-CH320.630.98(d，6.4)SerNH7.63(d，7.5)1-CO169.89Tyr2-CH57.364.01(m)1-CO170.413-CH260.63a:3.78(m)2-CH51.154.81(q，7.4)b:3.68(br.d，7.8)3-CH236.57a:2.83(m)OH4.88(d,6.0)b:2.94(m)NH8.53(d,4.4)4-C126.92Arg5/5'-CH130.067.06(d,8.3)1-CO171.496/6'-CH1〗5.116.64(d，8.3)2-CH53.334.04(m)5-C155.93-CH227.81.79(m)OH61.72(m)NH7.01(d，8.2)體外抗腫瘤活性實驗實驗使用的腫瘤細胞株為上海天甲公司提供的P388(小鼠白血病)、BEL-7402(人肝癌)、SPC-A-1(人肺癌)、HAC(小鼠肝癌腹水瘤)、Colo-26(小鼠結腸癌)。實驗方法采用常規(guī)的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，臺盼蘭染色法。實驗分3組空白對照組、陽性對照組和本發(fā)明化合物組。陽性對照藥為長春新堿。將本發(fā)明化合物和陽性對照藥分別用DMSO溶解，配成IOO，50，25，12.5，6.25，3.125(微克/毫升)6種濃度，細胞先按常規(guī)以10%的小牛血清培養(yǎng)，傳代時貼壁細胞以0.2%的胰酶消化液消化，使細胞處于對數(shù)生長期，實驗時細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種180微升，濃度為5><104個/毫升的細胞懸液。置37匸的C02培養(yǎng)箱預培養(yǎng)過夜后，每孔加20微升藥物溶液，空白對照組加20微升DMSO，每種濃度重復5孔。藥物作用于細胞3天后進行MTT法測定，于96孔培養(yǎng)板每孔加入濃度為5毫克/毫升的MTT工作液10微升，37。C孵育4小時，棄上清液，加100微升DMSO，在570納米波長下用酶標儀測定OD值。臺盼蘭排染法，加入臺盼蘭工作液，計數(shù)活細胞。按下列公式計算被測物對癌細胞生長的抑制率空白對照組細胞數(shù)一用藥組細胞數(shù)~~空白對照組細胞數(shù)~~x100%半數(shù)有效抑制濃度IQJ直采用L0git法計算，結果見表2:表2化合物<:48^168^2014對腫瘤細胞的半數(shù)有效抑制濃度(ng/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表2可見，化合物(:48&8^2014對多種不同的腫瘤細胞株均表明有一定的抑制作用，其中對小鼠P388的IC5。值僅為5.6pg/ml，且明顯優(yōu)于對照藥長春新堿，故可以用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥提供了新的先導化合物。權利要求1.一種環(huán)九肽類化合物，其特征在于化學結構式如下2權利要求1所述九肽類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，是產自西沙群島附近海域的海洋動物棕色扁海綿Phakelliafusca中的一種具有抗腫瘤活性的新的環(huán)九肽類化合物。其化學結構式如右所示。體外活性試驗證明，本發(fā)明化合物對多種不同的腫瘤細胞均有顯著的抑制活性，其中對小鼠P388的IC₅₀值僅為5.6μg/ml，且明顯優(yōu)于對照藥長春新堿。因此可用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥提供了新的先導化合物。文檔編號A61P35/00GK101519435SQ20091004898公開日2009年9月2日申請日期2009年4月9日優(yōu)先權日2009年4月9日發(fā)明者張紅軍,曹桂東,帆楊,林厚文,濤董,陳萬生申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學