專利名稱：Hiv-1抑制劑吡咯酮衍生物及其合成方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的二氫吡咯-2-酮衍生物在合成化學(xué)、工業(yè)與醫(yī)藥等方面有廣泛的用途。二氫吡咯-2-酮衍生物是合成不同結(jié)構(gòu)類型吡咯的中間體，譬如，其可被還原成四氫吡咯酮(Tetrahedron 2006，62，6018-6028；J.Org.Chem.1987，52，4352；US Patent6,784,167 B2，2004；Tetrahedron Lett.2005，46，1525.J.Med.Chem.1993，36，1041-1047)。由于吡咯酮具有很好的水溶性和生物相容性，還常用于生物材料、助溶劑、穩(wěn)定劑等高分子材料的合成，如具有廣泛用途的聚乙烯吡咯酮的合成。除此之外，二氫吡咯-2-酮衍生物還具有廣泛的生物活性，除了前面提到的具有抑制HIV-1PR的活性外，還可作為殺蟲劑(DE patent 102004053191，2006)；治療癌癥、細菌感染的DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)抑制劑(WO patent 054102，2006)；治療多種腫瘤的血管內(nèi)皮生長因子受體(Vascularendothelial growth factor receptors，VEGF-Rs)抑制劑(J.Med.Chem.2008，51，3814-3824)；以及Aurora激酶(Aurora kinase)抑制劑(Bioorg.Med.Chem.Lett.2008，18，1623-1627)。因此高效、環(huán)境友好、經(jīng)濟地合成該類化合物一直是人們研究的熱點。

本發(fā)明涉及的合成二氫吡咯-2-酮衍生物的方法是四組份法。雖然合成二氫吡咯-2-酮衍生物的方法很多，有多步反應(yīng)法(J.Med.Chem.2008，51，3814-3824；Tetrahedron2006，62，6018-6028；J.Med.Chem.1993.36，1041-1047)、二組份法(Tetrahedron2007，63，461-468；Eur.J.Org.Chem.2006，2843-2850；Tetrahedron 2003，59，8499-8507)、三組分法(Tetrahedron 2008，64，5221-5225；Bioorg.Med.Chem.2007，15，5487-5492；Eur.J.Org.Chem.2006，2843-2850；Tetrahedron 2006，62，6018-6028)，但卻沒有用四組份法合成該類化合物的報道。目前，在合成化學(xué)方面，多組分法越來越受到人們的青睞(J.Am.Chem.Soc.2006，128，11040-11041；Angew.Chem.Int.Ed.2007，46，2295-2298；Angew.Chem.Int.Ed.2007，46，2485-2488；Angew.Chem.Int.Ed.2007，46，3291-3295)，因為通過該方法可簡便高效地實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的多樣性。多組分法具有組合化學(xué)的某些特性，在新藥開發(fā)和研究中具有極大的優(yōu)越性和應(yīng)用價值。此外，本發(fā)明涉及的合成方法制備的化合物是一類含有α-和β-氨基酸結(jié)構(gòu)的二氫吡咯-2-酮化合物，即4-氨基-5-氧-二氫吡咯-3-羧酸酯衍生物。有關(guān)該類化合物的合成方法很少(Syn.Comm.，2005，35(18)，2453-2466；Heterocycles 2005，65(10)，2451-2459；Syn.Comm.2003，33(13)，2235-2241；J.Het.Chem.1975，12(3)，585-8；J.Org.Chem.1963，28，1332-6)，且都是由兩組分法合成，即由相應(yīng)的4-羥基或4-羰基-5-氧-二氫吡咯-3-羧酸酯衍生物與胺反應(yīng)生成4-氨基-5-氧-二氫吡咯-3-羧酸酯衍生物。由于原料不易合成，導(dǎo)致產(chǎn)物種類受到限制。更重要的是，本發(fā)明涉及的新型4-氨基-5-氧-二氫吡咯-3-羧酸酯系列化合物在體外活性實驗中，顯示出顯著的抗HIV-1的活性。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種HIV-1抑制劑吡咯酮衍生物，該類化合物可有效地與HIV-1跨膜糖蛋白亞基gp41作用，從而阻止病毒進入靶細胞，保護免疫細胞不被HIV-1感染。該類化合物的活性比單純N-取代吡咯化合物高。
本發(fā)明的另一目的是提供合成該吡咯酮衍生物的方法以及應(yīng)用，該合成方法是首次采用四組分法合成(I)的方法，實驗原料易得，實驗步驟簡單易行，可高效簡便地實現(xiàn)目標(biāo)分子的多樣性，彌補了現(xiàn)有的合成方法存在的原料難合成及產(chǎn)率低的不足。
本發(fā)明提供的新型吡咯酮衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽為
式中 R1、R2和R3為氫、直鏈或支鏈烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基或雜環(huán)基； R4為氫、直鏈或支鏈烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基或雜環(huán)基； R5為氫、烷基或芳香基。
R1、R2和R3為氫、直鏈或支鏈烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基或雜環(huán)基； R4為氫、直鏈或支鏈烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基或雜環(huán)基； R5為取代或無取代或含雜原子的芳香基、氫或C1-4烷基。
R1、R2和R3為氫、C1-4直鏈或支鏈烷基、羥基取代烷基、鹵素取代烷基、羧基取代烷基、烷氧酰基取代烷基、C5-6環(huán)烷基、芐基、苯基、取代芳基或雜環(huán)基； R4為氫、C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基、芐基、苯基、C1-3烷基取代芳基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基、烷氧酰基取代芳基、氨磺?；〈蓟螂s環(huán)基。
R1和R2為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基或芐基； R3為C1-3烷基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基、氨磺?；〈蓟?； R4為氫。
R1和R2為C1-3烷基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基或氨磺?；〈蓟?； R3為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基或芐基； R4為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基、芐基、苯基、C1-3烷基取代芳基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基、烷氧?；〈蓟?、氨磺酰基取代芳基或雜環(huán)基。
優(yōu)選的化合物是R1、R2和R3為氫、C1-4直鏈或支鏈烷基、羥基取代烷基、鹵素取代烷基、羧基取代烷基、烷氧?；〈榛?、C5-6環(huán)烷基、芐基、苯基、取代芳基或雜環(huán)基； R4為氫、C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基、芐基、苯基、C1-3烷基取代芳基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基、烷氧?；〈蓟被酋；〈蓟螂s環(huán)基。
R1和R2為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基或芐基，R3為C1-3烷基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基或氨磺?；〈蓟?；R4為氫。
R1和R2為C1-3烷基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基或氨磺酰基取代芳基，R3為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基或芐基，R4為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基、雜環(huán)基、芐基、苯基、C1-3烷基取代芳基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基、烷氧?；〈蓟虬被酋；〈蓟?br> 本發(fā)明的代表性化合物如下所述 2，5-二氫-1-芐基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-benzyl-4-(benzylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物1)、 2，5-二氫-1-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-5-oxo-1-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物2)、 2，5-二氫-1-對甲苯基-4-(對甲基苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(p-tolylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-1-p-tolyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物3)、 2，5-二氫-1-對氟苯基-4-(對氟苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(4-fluorophenylamino)-1-(4-fluorophenyl)-2，5-dihydro-5-oxo-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物4)、 2，5-二氫-1-對溴苯基-4-(對溴苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(4-bromophenylamino)-1-(4-bromophenyl)-2，5-dihydro-5-oxo-lH-pyrrole-3-carboxylate，化合物5)、 2，5-二氫-1-苯基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(benzylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-1-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物6)、 2，5-二氫-1-苯基-4-(丙氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-5-oxo-1-phenyl-4-(propylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物7)、 2，5-二氫-1-苯基-4-(環(huán)己氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(cyclohexylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-1-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物8)、 2，5-二氫-1-對硝基苯基-4-(環(huán)己氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(cyclohexylamino)-2，5-dihydro-1-(4-nitrophenyl)-5-oxo-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物9)、 2，5-二氫-1-芐基-2-苯基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-benzyl-4-(benzylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物10)、 2，5-二氫-1-丙基-2-苯基-4-(丙氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1-propyl-4-(propylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物11)、 2，5-二氫-1-甲基-2-苯基-4-(甲氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-1-methyl-4-(methylamino)-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物12)、 2，5-二氫-1-丁基-2-苯基-4-(丁氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-butyl-4-(butylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物13)、 2，5-二氫-1-對甲苯基-2-苯基-4-(對甲苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(p-tolylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1-p-tolyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物14)、 2，5-二氫-1-對氟苯基-2-苯基-4-(對氟苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(4-fluorophenylamino)-1-(4-fluorophenyl)-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物15)、 2，5-二氫-1-芐基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-benzyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物16)、 2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-cyclohexyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物17)、 2，5-二氫-1-正丁基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-butyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物18)、 2，5-二氫-1-羥乙基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-5-oxo-2-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物19)、 2，5-二氫-1-羥乙基-2-苯基-4-(對甲基苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(p-tolylamino)-2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物20)、 2，5-二氫-1-芐基-2-苯基-4-(對氟苯基氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(4-fluorophenylamino)-1-benzyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物21)、 2，5-二氫-1-羥乙基-2-對氟苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2-(4-fluorophenyl)-2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-5-oxo-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物22)、 2，5-二氫-1-苯基-2-對碘苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-2-(4-iodophenyl)-5-oxo-1-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物23)、 2，5-二氫-1-羥乙基-2-對羥基苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-5-oxo-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物24)、 2，5-二氫-1-羥乙基-2-甲基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-2-methyl-5-oxo-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物25)、 2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-甲基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-cyclohexyl-2，5-dihydro-2-methyl-5-oxo-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物26)、 2，5-二氫-1-羥乙基-2-丁基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2-butyl-2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-5-oxo-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物27)、 2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-苯基-4-(對硝基苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(4-nitrophenylamino)-1-cyclohexyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物28)、 2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-苯基-4-苯氨基-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(methyl1-cyclohexyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物29)和 2，5-二氫-1-苯基-4，4-(二丁氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(dibutylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-1-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate化合物30)。
化合物(I)的合成方法一，其反應(yīng)式是
(其中R1、R2、R3和R5如權(quán)利要求4所述，R4為氫)。
以下以摩爾份數(shù)計； (1)在4份有機溶劑中加入1份化合物(1)和1份化合物(2)，0～60℃下攪拌10分鐘～1小時； (2)在步驟(1)的反應(yīng)液中加入1～4份化合物(3)，加入0～4份的酸，反應(yīng)溫度20～100℃，攪拌1～5小時； (3)在步驟(2)的反應(yīng)液中加入1～4份化合物(4)，加入0～4份的酸，反應(yīng)溫度20～100℃，攪拌1～5小時，可以適當(dāng)選擇結(jié)晶、重結(jié)晶、硅膠色譜法、制備型HPLC等常用方法分離純化。
所述有機溶劑包括醇、苯、甲苯、己烷、鹵代烴、醚、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、乙腈中的一種或幾種； 所述酸包括硫酸、鹽酸、苯磺酸或醋酸。
合成方法二的反應(yīng)式為
(其中R1、R2、R3和R5如權(quán)利要求5所述，R4為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基或鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基、芐基、苯基、C1-3烷基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基、烷氧?；〈蓟?、氨磺酰基取代芳基或雜環(huán)基)。
化合物(I)的合成方法二是 以下以摩爾份數(shù)計； (1)在2份有機溶劑中加入1份化合物(1)和1份化合物(2)，0～60℃下攪拌10分鐘到1小時； (2)在2份有機溶劑中加入1～4份化合物(3)、1～4份化合物(4)，加入0～4份的酸或堿，反應(yīng)溫度20～100℃，攪拌10分鐘到5小時； (3)將步驟(1)和(2)的反應(yīng)液混合，20～100℃下攪拌5～20小時，可以適當(dāng)選擇結(jié)晶、重結(jié)晶、硅膠色譜法、制備型HPLC等常用方法分離純化。
所述酸包括鹽酸、苯磺酸或醋酸； 所述堿包括三乙胺、碳酸鉀或碳酸鈉； 所述有機溶劑包括醇、苯、甲苯、己烷、鹵代烴、醚、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、乙腈中的一種或幾種。
所述的吡咯酮衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用。



圖1為化合物8的分子結(jié)構(gòu)單晶衍射圖， 圖2為化合物17的分子結(jié)構(gòu)單晶衍射圖， 圖3為HL2/3細胞， 圖4為HeLa-CD4-LTR-β-gal細胞， 圖5為融合的HL2/3細胞和HeLa-CD4-LTR-β-gal細胞顯示了蘭斑的形成， 圖6為陽性藥物T-20 圖7為NB-2抑制細胞融合的活性， 圖8為部分化合物抑制細胞融合的活性， 圖9為化合物14抑制gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的活性(以NB-2作為陽性化合物對照)， 圖10為化合物14抑制gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的活性(以HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT，即Azidothymidine，作為陰性化合物對照)， 圖11為化合物22與gp41對接圖。

具體實施例方式 以下將結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步地詳細說明，但是本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于實施例表示的范圍。
實施例1 2，5-二氫-1-芐基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-benzyl-4-(benzylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物1) 方法一 步驟1 將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(107mg)的芐胺依次加入到4mL乙醇溶液中，室溫下攪拌20min，得到中間體(5)(2-芐氨基丁烯二酸二乙酯)的反應(yīng)液。
步驟2 將1.5mmol(160mg)的芐胺和1mmol(60mg)乙酸加入到上述含中間體(5)的反應(yīng)液中，20℃下，反應(yīng)5h，得到含中間體(6)(3-芐氨酰基-3-芐氨基丙烯酸乙酯)的反應(yīng)液。
步驟3 將2mmol(200mg)的30％的甲醛水溶液和60mg的乙酸加入到上述含中間體(6)的反應(yīng)液中，60℃下，反應(yīng)3h，用制備薄層析板分離產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(10:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得301mg的2，5-二氫-1-芐基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物1)。
產(chǎn)率86％，黃色粘稠物；IR(KBr)vmax＝3447，2986，1773，1691，1635，1452，1324，1290，1137，770，711cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.38-7.27(m，10H)，5.15(s，1H)，5.13(s，1H)，4.66(s，2H)，4.17(q，J＝7.2Hz，2H)，3.89(s，2H)，1.25(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.6，165.4，139.6，136.5，128.8，128.6，128.2，127.8，127.5，127.3，98.3，59.6，47.0，46.7，46.4，14.4ppm.MS(ESI)m/z 351(M+H+，42)，305(100)；Anal.Calcd for C21H22N2O3:C，71.98；H，6.33；N，7.99；FoundC，71.96；H，6.43；N，7.92. 化合物2-9、30使用方法一制備 實施例2 2，5-二氫-1-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-5-oxo-1-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物2) 方法一 步驟1 將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(93mg)的苯胺依次加入到4mL甲苯溶液中，室溫下攪拌10min，得到含中間體(5)(2-苯氨基丁烯二酸二乙酯)的反應(yīng)液。
步驟2 將1mmol(93mg)的苯胺加入到上述含中間體(5)的反應(yīng)液中，100℃下，反應(yīng)1h，得到含中間體(6)(3-苯氨?；?3-苯氨基丙烯酸乙酯)的反應(yīng)液。
步驟3 將1mmol(100mg)的30％的甲醛水溶液和1mmol(60mg)的乙酸加入到上述含中間體(6)的反應(yīng)液中，100℃下，反應(yīng)1h，用制備薄層析板分離產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(10:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得290mg的2，5-二氫-1-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物2)。
產(chǎn)率85％，白色固體，熔點138-140℃；IR(KBr)vmax＝3439，2976，1771，1681，1631，1450，1304，1291，1130，780，723cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.75-7.73(m，2H)，7.40-7.15(m，8H)，5.09(s，2H)，4.41(s，2H)，4.23(q，J＝7.2Hz，2H)，1.29(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.6，139.5，138.8，129.1，128.7，127.5，127.4，125.1，119.5，59.9，48.1，46.8，14.5ppm.MS(ESI)m/z323(M+H+，98)，277(100)；Anal.Calcd for C19H18N2O3:C，70.79；H，5.63；N，8.69；FoundC，70.96；H，5.53；N，8.51. 實施例3 2，5-二氫-1-對甲苯基-4-(對甲基苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(p-tolylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-1-p-tolyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物3) 方法一 步驟1 在0℃下將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(107mg)的對甲基苯胺依次加入到4mL二氯甲烷溶液中，攪拌60min，得到含中間體(5)(2-對甲苯氨基丁烯二酸二乙酯)的反應(yīng)液。
步驟2 將1.5mmol(160mg)的對甲基苯胺加入到上述含中間體(5)的反應(yīng)液中，20℃下，反應(yīng)5h，得到含中間體(6)(3-對甲苯氨酰基-3-對甲苯氨基丙烯酸乙酯)的反應(yīng)液。
步驟3 將3mmol(300mg)的30％的甲醛水溶液和1.5mmol(90mg)的乙酸加入到上述含中間體(6)的反應(yīng)液中，20℃下，反應(yīng)5h，用制備薄層析板分離產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(10:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得301mg的2，5-二氫-1-對甲苯基-4-(對甲苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物3)。
產(chǎn)率86％，黃色固體，熔點131-132℃；IR(KBr)vmax＝3449，2900，1770，1685，1629，1450，1300，1271，1115，830cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.96(s，1H)，7.64(d，J＝8.4Hz，2H)，7.16(d，J＝8.4Hz，2H)，7.09(d，J＝8.4Hz，2H)，7.01(d，J＝8.4Hz，2H)，4.47(s，2H)，4.18(q，J＝7.2Hz，2H)，2.32(s，3H)，2.31(S，3H)，1.20(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.6，163.7，143.2，136.3，136.2，134.7，134.3，129.8，129.6，128.9，122.9，119.3，102.4，65.8，60.2，48.3，30.8，20.9，20.8，15.2，14.2ppm.MS(ESI)m/z 351(M+H+，100)，305(76)；Anal.Calcd for C21H22N2O3:C，71.98；H，6.33；N，7.99；FoundC，71.90；H，6.45；N，8.02. 實施例4 2，5-二氫-1-對氟苯基-4-(對氟苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(4-fluorophenylamino)-1-(4-fluorophenyl)-2，5-dihydro-5-oxo-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物4) 方法一 步驟1 將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(111mg)的對氟苯胺依次加入到4mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中，60℃下攪拌10min，得到含中間體(5)(2-對氟苯氨基丁二酸二乙酯)的反應(yīng)液。
步驟2 將4mmol(444mg)的對氟苯胺加入到上述含中間體(5)的反應(yīng)液中，100℃下，反應(yīng)1h，得到含中間體(6)(3-對氟苯氨?；?3-對氟苯氨基丙烯酸乙酯)的反應(yīng)液。
步驟3 將4mmol(400mg)的30％的甲醛水溶液和4mmol(240mg)的乙酸加入到上述含中間體(6)的反應(yīng)液中，60℃下，反應(yīng)1h后，加飽和氯化鈉水溶液20mL，用二氯甲烷20mL萃取，重復(fù)三次，合并的二氯甲烷溶液，再用飽和氯化鈉水溶液20mL萃取，重復(fù)三次，所得二氯甲烷溶液用硫酸鎂干燥，減壓蒸餾除溶劑，再用制備薄層析板純化產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(10:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得312mg的2，5-二氫-1-對氟苯基-4-(對氟苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物4)。
產(chǎn)率87％，白色固體，熔點172-173℃；IR(KBr)vmax＝3445，2968，1779，1656，1621，1450，1304，1267，1132，801cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.72(s，1H)，7.71-7.68(m，2H)，7.11-6.96(m，6H)，4.48(s，2H)，4.21(q，J＝7.2Hz，2H)，1.24(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.6，163.6，161.2(d，J＝100Hz，1C)，158.8(d，J＝104Hz，1C)，143.2，134.7，134.5，124.9，124.8，121.2，121.1，116.0，115.7，115.2，115.0，102.9，60.4，48.4，14.2ppm.MS(ESI)m/z 359(M+H+，81)，313(100)；Anal.Calcd for C19H16 F2N2O3:C，63.68；H，4.50；F，10.60；N，7.82；FoundC，63.75；H，4.71；N，7.78，F(xiàn)，10.71. 實施例5 2，5-二氫-1-對溴苯基-4-(對溴苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(4-bromophenylamino)-1-(4-bromophenyl)-2，5-dihydro-5-oxo-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物5) 制備方法同實施例1 產(chǎn)率89％，白色固體；IR(KBr)vmax＝3446，2971，1764，1672，1630，1453，1314，1295，1129，815cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.0(s，1H)，7.68-6.98(m，8H)，4.48(s，2H)，4.22(q，J＝7.2Hz，2H)，1.24(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.4，163.6，142.6，137.7，137.6，132.2，131.1，124.3，120.6，118.0，117.6，104.4，60.6，48.1，14.2ppm；MS(ESI)m/z 481(M+H+，30)，435(100)；Anal.Calcd for C19H16 Br2N2O3C，47.53；H，3.36；Br，33.28；N，5.83；FoundC，47.45；H，3.42；Br，33.31；N，5.79. 實施例6 2，5-二氫-1-苯基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(benzylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-1-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物6) 制備方法同實施例1 產(chǎn)率90％，白色固體，熔點130-132℃；IR(KBr)vmax＝3413，2936，1761，1685，1637，1455，1324，1271，1120，742，715cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.75-7.73(m，2H)，7.40-7.15(m，8H)，5.09(s，2H)，4.41(s，2H)，4.22(q，J＝7.2Hz，2H)，1.29(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.6，139.5，138.8，129.1，128.7，127.5，127.4，125.1，119.5，59.9，48.1，46.8，14.5ppm；MS(ESI)m/z 337(M+H+，100)，291(49)；Anal.Calcd for C20H20 N2O3:C，71.41；H，5.99；N，8.33；FoundC，71.48；H，5.92；N，8.29. 實施例7 2，5-二氫-1-苯基-4-(丙氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-5-oxo-1-phenyl-4-(propylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物7) 制備方法同實施例1 產(chǎn)率93％，白色固體，熔點78-79℃；IR(KBr)vmax＝3449，2986，1776，1683，1531，1324，1261，1120，775，713cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.72(d，J＝8.0Hz，2H)，7.37-7.33(m，2H)，7.13(t，J＝7.2Hz，1H)，4.36(s，2H)，4.22(q，J＝7.2Hz，2H)，3.79(q，J＝6.8Hz，2H)，1.62-1.57(m，2H)，1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，0.95(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.6，138.8，129.0，124.9，119.4，59.7，48.0，44.6，24.5，14.5，11.1ppm；MS(ESI)m/z 289(M+H+，49)，243(100)；Anal.Calcd for C16H20 N2O3C，66.65；H，6.99；N，9.72；FoundC，66.59；H，6.87；N，9.78. 實施例8 2，5-二氫-1-苯基-4-(環(huán)己氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(cyclohexylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-1-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物8)，其分子結(jié)構(gòu)單晶衍射圖見圖1。
制備方法同實施例1 產(chǎn)率96％，白色固體，熔點107-108℃；IR(KBr)vmax＝3431，2986，1778，1651，1511，1304，1290，1110，770，722cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.26-8.24(m，2H)，8.01-7.98(m，2H)，4.55(brs，1H)，4.45(s，2H)，4.27(q，J＝7.2Hz，2H)，2.02-1.98(m，2H)，1.76-1.61(m，3H)，1.43-1.36(m，2H)，1.32(t，J＝7.2Hz，3H)，1.22-1.21(m，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.2，164.4，138.8，129.0，128.8，124.8，119.3，96.3，59.6，50.6，48.0，34.7，25.5，24.6，19.1，14.5ppm；MS(ESI)m/z 329(M+H+，100)，283(23)；Anal.Calcd for C19H24 N2O3:C，69.49；H，7.37；N，8.53；FoundC，69.53；H，7.41；N，8.50. 實施例9 2，5-二氫-1-對硝基苯基-4-(環(huán)己氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(cyclohexylamino)-2，5-dihydro-1-(4-nitrophenyl)-5-oxo-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物9) 制備方法同實施例1 產(chǎn)率85％，黃色固體，熔點149.5-150.5℃；IR(KBr)vmax＝3444，2932，2854，1705，1640，1632，1508，1333，1276，1109，939cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.69(d，J＝8.4Hz，2H)，7.33-7.29(m，2H)，7.11-7.07(m，1H)，4.56(brs，1H)，4.31(s，2H)，4.19(q，J＝7.2Hz，2H)，1.99-1.95(m，2H)，1.72-1.66(m，3H)，1.42-1.32(m，2H)，1.27(t，J＝7.2Hz，3H)，1.21-1.13(m，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.2，144.3，143.7，125.0，118.3，60.0，50.7，47.8，34.7，25.4，24.6，24.1，14.5ppm；MS(ESI)m/z 374(M+H+，100)，328(23)；Anal.Calcd for C19H23 N3O5:C，61.11；H，6.21；N，11.25；FoundC，61.21；H，6.28；N，11.21. 實施例10 2，5-二氫-1-芐基-2-苯基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-benzyl-4-(benzylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物10) 方法二 步驟1 將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(107mg)的芐胺依次加入到2mL乙醇溶液中，室溫下攪拌20min，得到含中間體(5)(2-芐氨基丁烯二酸二乙酯)的反應(yīng)液。
步驟2 將2mmol(214mg)的芐胺、2mmol(212mg)的苯甲醛加入到2mL乙醇溶液中，室溫下攪拌10min，得含中間體(7)(亞胺)的反應(yīng)液。
步驟3 將步驟1和2的反應(yīng)液混合，40℃下，反應(yīng)10h，用制備薄層析板分離產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(10:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得350mg的2，5-二氫-1-芐基-2-苯基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物10)。
產(chǎn)率86％，黃色油狀物；IR(KBr)vmax＝3448，2987，1775，1632，1602，1528，1353，1277，763，721cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.40-7.09(m，15H)，5.18(brs，2H)，5.13(d，J＝14.8Hz，1H)，4.89(s，1H)，3.98-3.88(m，2H)，3.52(d，J＝14.8Hz，1H)，1.27(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.4，139.5，137.1，136.7，128.8，128.4，128.2，128.0，127.7，127.6，127.4，60.9，59.4，43.9，18.5，14.0ppm；MS(ESI)m/z427(M+H+，100)，381(30)；Anal.Calcd for C27H26N2O3:C，76.03；H，6.14；N，6.57；FoundC，76.15；H，6.18；N，6.63. 化合物11-29采用方法二合成 實施例11 2，5-二氫-1-丙基-2-苯基-4-(丙氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1-propyl-4-(propylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物11) 方法二 步驟1 將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(59mg)的丙胺依次加入到2mL甲苯溶液中，室溫下攪拌10min，得到含中間體(5)2-芐氨基丁烯二酸二乙酯的反應(yīng)液。
步驟2 將4mmol(118mg)的丙胺、2mmol(212mg)的苯甲醛加入到2mL甲苯溶液中，室溫下攪拌10min，得含中間體(7)(亞胺)的反應(yīng)液。
步驟3 將步驟1和2的反應(yīng)液混合，100℃下，反應(yīng)5h，用制備薄層析板分離產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(10:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得304mg的2，5-二氫-1-丙基-2-苯基-4-(丙氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物11)。
產(chǎn)率92％，黃色油狀物；IR(KBr)vmax＝3439，2947，1725，1652，1602，1528，1453，1353，1237，733，711cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.29-7.10(m，5H)，5.01(s，1H)，3.98-3.93(m，2H)，3.84(brs，2H)，3.61-3.57(m，1H)，2.58-2.55(m，1H)，1.64-1.40(m，4H)，1.02-0.94(m，6H)，0.81(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝206.7，165.4，137.7，128.3，127.9，127.7，102.7，65.8，61.7，59.2，44.3，41.9，30.8，24.5，21.3，15.2，14.0，11.2，11.1ppm；MS(ESI)m/z 331(M+H+，100)，285(15)；Anal.Calcd for C19H26N2O3:C，69.06；H，7.93；N，8.48；FoundC，69.26；H，7.98；N，8.41. 實施例12 2，5-二氫-1-甲基-2-苯基-4-(甲氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-1-methyl-4-(methylamino)-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物12) 方法二 步驟1 將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(31mg)的甲胺依次加入到2mL二氯甲烷溶液中，0℃下攪拌1h，得到含中間體(5)2-芐氨基丁烯二酸二乙酯的反應(yīng)液。
步驟2 將4mmol(62mg)的甲胺、1mmol(156mg)的苯甲醛加入到2mL二氯甲烷溶液中，室溫下下攪拌0.5小時，得含中間體(7)(亞胺)的反應(yīng)液。
步驟3 將步驟1和2的反應(yīng)液混合，20℃下，反應(yīng)20h，用制備薄層析板分離產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(10:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得229mg的2，5-二氫-1-甲基-2-苯基-4-(甲氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物12)。
產(chǎn)率86％，白色固體，熔點129-131℃；IR(KBr)vmax＝3440，2986，1703，1698，1635，1452，1424，1290，1137，1096，1037，920，832cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.30-7.12(m，5H)，4.92(s，1H)，3.98-3.94(m，2H)，3.38(s，3H)，2.72(s，3H)，1.00(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.6，137.5，128.3，128.0，127.6，102.7，63.8，59.2，30.1，27.5，14.0ppm；MS(ESI)m/z 275(M+H+，100)，229(40)；Anal.Calcd for C15H18N2O3:C，65.68；H，6.61；N，10.21；FoundC，65.61；H，6.65；N，10.12. 實施例13 2，5-二氫-1-丁基-2-苯基-4-(丁氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-butyl-4-(butylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物13) 方法二 步驟1 將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(73mg)的正丁胺依次加入到2mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中，室溫下攪拌10min，得到含中間體(5)2-芐氨基丁烯二酸二乙酯的反應(yīng)液。
步驟2 將2mmol(146mg)的正丁胺、1.5mmol(156mg)的苯甲醛加入到2mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中，攪拌10min，得含中間體(7)(亞胺)的反應(yīng)液。
步驟3 將步驟1和2的反應(yīng)液混合，40℃下，反應(yīng)10h后，加飽和氯化鈉水溶液20mL，用二氯甲烷20mL萃取，重復(fù)三次，合并的二氯甲烷溶液，再用飽和氯化鈉水溶液20mL萃取，重復(fù)三次，所得二氯甲烷溶液用硫酸鎂干燥，減壓蒸餾除溶劑，再用制備薄層析板純化產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(10:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得313mg的2，5-二氫-1-丁基-2-苯基-4-(丁氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物13)。
產(chǎn)率87％，黃色油狀物；IR(KBr)vmax＝3449，2937，1720，1632，1612，1508，1451，1350，1207，782，723cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.32-7.13(m，5H)，5.03(s，1H)，4.01-3.95(m，2H)，3.90(brs，2H)，3.69-3.65(m，1H)，2.60-2.59(m，1H)，1.61-1.25(m，8H)，1.02(t，J＝7.2Hz，3H)，0.95(t，J＝7.2Hz，3H)，0.86(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.3，137.7，128.9，128.5，128.3，127.9，127.7，127.3，102.6，61.6，59.2，42.3，40.0，33.4，30.1，20.0，19.8，14.0，13.8，13.6ppm；MS(ESI)m/z359(M+H+，100)，313(35)；Anal.Calcd for C21H30N2O3:C，70.36；H，8.44；N，7.81；FoundC，70.29；H，8.51；N，7.78. 實施例14 2，5-二氫-1-對甲苯基-2-苯基-4-(對甲苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(p-tolylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1-p-tolyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物14) 方法二 步驟1 將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(107mg)的對甲苯胺依次加入到2mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中，室溫下攪拌10min，得到含中間體(5)2-(對甲苯氨基)丁烯二酸二乙酯的反應(yīng)液。
步驟2 將1mmol(321mg)的對甲苯胺、4mmol(424mg)的苯甲醛、1mmol(60mg)的乙酸加入到2mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中，60℃下攪拌20min，得含中間體(7)(亞胺)的反應(yīng)液。
步驟3 將步驟1和2的反應(yīng)液混合，40℃下，反應(yīng)10h后，加飽和氯化鈉水溶液20mL，用二氯甲烷20mL萃取，重復(fù)三次，合并的二氯甲烷溶液，再用飽和氯化鈉水溶液20mL萃取，重復(fù)三次，所得二氯甲烷溶液用硫酸鎂干燥，減壓蒸餾除溶劑，再用制備薄層析板純化產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(10:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得384mg的2，5-二氫-1-對甲苯基-2-苯基-4-(對甲苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物14)。
產(chǎn)率92％，白色固體，熔點150-153℃；IR(KBr)vmax＝3432，2983，1709，1632，1515，1290，1211，1110，834，823cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ[ppm]＝8.15(brs，1H)，7.33-7.16(m，7H)，7.11-7.00(m，6H)，5.75(s，1H)，3.99(q，J＝7.2Hz，2H)，2.31(s，3H)，2.21(s，3H)，1.00(t，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ[ppm]＝164.5，163.9，142.5，137.1，136.0，135.3，134.4，134.0，129.3，129.0，128.3，127.9，127.7，123.0，122.7，108.7，63.1，60.0，20.9，20.8，13.8；MS(ESI)m/z 427(M+H+，80)，381(100)；Anal.Calcd for C27H26N2O3:C，76.03；H，6.14；N，6.57；FoundC，75.81；H，6.10；N，6.35. 實施例15 2，5-二氫-1-對氟苯基-2-苯基-4-(對氟苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(4-fluorophenylamino)-1-(4-fluorophenyl)-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物15) 方法二 步驟1 將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(111mg)的對氟苯胺依次加入到4mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中，60℃下攪拌10min，得到含中間體(5)(2-對氟苯氨基丁二酸二乙酯)的反應(yīng)液。
步驟2 將2mmol(222mg)的對氟苯胺、1.5mmol(156mg)的苯甲醛、1mmol(101mg)的三乙胺加入到2mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中，100℃下攪拌20min，得含中間體(7)(亞胺)的反應(yīng)液。
步驟3 將步驟1和2的反應(yīng)液混合，40℃下，反應(yīng)10h后，加飽和氯化鈉水溶液20mL，用二氯甲烷20mL萃取，重復(fù)三次，合并的二氯甲烷溶液，再用飽和氯化鈉水溶液20mL萃取，重復(fù)三次，所得二氯甲烷溶液用硫酸鎂干燥，減壓蒸餾除溶劑，再用制備薄層析板純化產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(10:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得348mg的2，5-二氫-1-對氟苯基-2-苯基-4-(對氟苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物15) 產(chǎn)率80％，黃色油狀物；IR(KBr)vmax＝3465，2984，1709，1632，1511，1456，1289，1221，1158，885，833cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ[ppm]＝8.20(brs，1H)，7.38-7.34(m，2H)，7.23-7.13(m，7H)，7.02-6.89(m，4H)，5.70(s，1H)，4.02(q，J＝7.2Hz，2H)，1.02(t，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ[ppm]＝164.5，163.8，161.5，161.4，159.0，142.7，136.5，134.4，132.4，128.5，128.3，127.6，125.1，125.0，124.8，124.7，115.8，115.6，115.3，115.1，109.2，63.4，60.2，13.9；MS(ESI)m/z 435(M+H+，79)，389(100)；Anal.Calcd for C25H20F2N2O3:C，69.12；H，4.64；N，6.45；FoundC，69.07；H，4.61；N，6.37. 實施例16 2，5-二氫-1-芐基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-benzyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物16) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率87％，黃色油狀物；IR(KBr)vmax＝3445，2932，1705，1632，1602，1508，1443，1350，1217，810，754cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.28(s，1H)，7.36-7.13(m，15H)，5.14(d，J＝14.8Hz，1H)，4.96(s，1H)，3.98-3.86(m，2H)，3.53(d，J＝14.8Hz，1H)，0.91(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.6，143.0，138.6，136.6，136.4，128.8，128.7，128.6，128.5，128.0，127.7，124.6，122.7，109.6，61.2，60.0，58.5，44.0，18.5，13.8ppm；MS(ESI)m/z 413(M+H+，100)，367(35)；Anal.Calcd for C26H24N2O3:C，75.71；H，5.86；N，6.79；FoundC，75.83；H，5.89；N，6.81. 實施例17 2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-cyclohexyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物17)，其分子結(jié)構(gòu)單晶衍射圖見圖2。
制備方法同實施例10 產(chǎn)率95％，白色固體，熔點140-142℃；IR(KBr)vmax＝3446，2987，1731，1681，1612，1508，1433，1313，1267，798，743cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.09(s，1H)，7.33-7.09(m，10H)，5.20(s，1H)，3.94-3.89(m，2H)，3.71-3.65(m，1H)，1.76-1.06(m，10H)，0.91(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.8，164.4，142.7，138.9，138.0，128.3，128.2，128.1，128.0，124.4，122.6，109.7，61.8，59.8，54.3，30.9，30.6，26.0，25.8，25.2，13.8ppm；MS(ESI)m/z 405(M+H+，100)，359(95)；Anal.Calcd for C25H28N2O3:C，74.23；H，6.98；N，6.93；FoundC，74.28；H，6.87；N，6.97. 實施例18 2，5-二氫-1-正丁基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-butyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物18) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率89％，白色固體，熔點101-102℃；IR(KBr)vmax＝3449，2997，1715，1641，1621，1502，1423，1375，1227，803，723cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.20(s，1H)，7.36-7.10(m，10H)，5.17(s，1H)，3.98-3.93(m，2H)，3.73-3.70(m，1H)，2.66-2.65(m，1H)，1.48-1.43(m，2H)，1.28-1.23(m，2H)，0.94(t，J＝7.2Hz，3H)，0.86(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.7，164.5，143.0，138.8，136.8，128.6，128.4，128.3，127.8，124.5，122.6，109.2，62.2，59.9，40.3，30.2，20.0，13.8，13.7ppm；MS(ESI)m/z 379(M+H+，100)，333(75)；Anal.Calcd for C23H26N2O3:C，72.99；H，6.92；N，7.40；FoundC，72.79；H，6.86；N，7.35. 實施例19 2，5-二氫-1-羥乙基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-5-oxo-2-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物19) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率94％，黃色固體，熔點117-118℃；IR(KBr)vmax＝3689，3439，2943，1712，1602，1518，1452，1343，1238，798，745cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.22(s，1H)，7.34-7.08(m，10H)，5.28(s，1H)，3.93(q，J＝7.2Hz，2H)，3.69-3.56(m，3H)，3.15(brs，1H)，2.94-2.88(m，1H)，0.92(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.9，164.4，142.7，138.7，136.4，128.6，128.43，128.37，127.8，124.5，122.6，110.1，63.5，60.9，59.95，44.1，13.8ppm；MS(ESI)m/z 367(M+H+，100)，321(35)；Anal.Calcdfor C21H22N2O4:C，68.84；H，6.05；N，7.65；FoundC，68.76；H，6.13；N，7.58. 實施例20 2，5-二氫-1-羥乙基-2-苯基-4-(對甲基苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(p-tolylamino)-2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物20) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率92％，檸檬色固體，熔點127-128℃；IR(KBr)vmax＝3649，3431，2983，1772，1658，1508，1453，1346，1228，815，769cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.20(s，1H)，7.33-7.01(m，9H)，5.26(s，1H)，3.96-3.90(m，2H)，3.67-3.56(m，3H)，3.25(brs，1H)，2.91-2.88(m，1H)，2.30(s，3H)，0.92(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.9，164.4，142.7，138.7，136.4，128.6，128.43，128.37，127.8，124.5，122.6，110.1，63.5，60.9，59.95，44.1，13.8ppm；MS(ESI)m/z 381(M+H+，100)，335(53)；Anal.Calcd for C22H24N2O4:C，69.46；H，6.36；N，7.36；FoundC，69.53；H，6.41；N，7.39. 實施例21 2，5-二氫-1-芐基-2-苯基-4-(對氟苯基氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(4-fluorophenylamino)-1-benzyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物21) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率89％，黃色固體，熔點174-176℃；IR(KBr)vmax＝3439，2983，1772，1632，1558，1412，1383，1243，934，765cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.35-7.01(m，10H)，5.19(d，J＝14.8Hz，1H)，4.88-4.84(m，5H)，4.08-4.03(m，2H)，3.54(d，J＝14.8Hz，1H)，1.05(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.2，163.7，157.4，136.3，134.5，128.8，128.5，127.90，127.86，127.5，122.3，113.3，60.0，59.7，44.0，13.8ppm；MS(ESI)m/z431(M+H+，100)，385(63)；Anal.Calcd for C26H23FN2O3:C，72.54；H，5.39；F，4.41；N，6.51；FoundC，72.58；H，5.43；F，4.47；N，6.60. 實施例22 2，5-二氫-1-羥乙基-2-對氟苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2-(4-fluorophenyl)-2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-5-oxo-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物22) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率93％，黃色固體，熔點134-135℃；IR(KBr)vmax＝3689，3439，2943，1712，1602，1518，1452，1343，1238，798，745cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.21(brs，1H)，7.28-6.98(m，9H)，5.27(s，1H)，3.96-3.91(m，2H)，3.68-3.57(m，3H)，2.91-2.86(m，2H)，0.93(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.8，164.3，163.9，161.4，142.7，138.6，132.2，129.6，129.5，128.4，124.6，122.6，115.7，115.5，109.7，62.7，60.9，60.0，43.9，13.8ppm；MS(ESI)m/z 385(M+H+，100)，339(30)；Anal.Calcdfor C21H21FN2O4:C，65.62；H，5.51；F，4.94；N，7.29；FoundC，65.69；H，5.48；F，4.97；N，7.35. 實施例23 2，5-二氫-1-苯基-2-對碘苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-2-(4-iodophenyl)-5-oxo-1-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物23) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率60％，黃色固體；IR(KBr)vmax＝3449，2973，1777，1638，1550，1452，1363，1273，914，745cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.18(s，1H)，7.44-7.16(m，14H)，5.79(s，1H)，4.00(q，J＝7.2Hz，2H)，0.99(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.3，163.9，163.6，161.1，142.0，138.6，136.3，132.6，129.3，128.7，128.5，125.8，124.7，122.9，122.8，115.6，115.5，115.3，109.4，62.5，60.2，13.8ppm；MS(ESI)m/z493(M+H+，100)，447(70)；Anal.Calcd for C25H21IN2O3:C，57.26；H，4.04；I，24.20；N，5.34；FoundC，57.31；H，4.12；I，24.27；N，5.42. 實施例24 2，5-二氫-1-羥乙基-2-對羥基苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-5-oxo-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物24) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率92％，黃色固體，熔點117-119℃；IR(KBr)vmax＝3618，3430，2988，1762，1635，1568，1442，1380，1273，944，810cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.27(s，1H)，7.36-7.10(m，9H)，5.33(s，1H)，3.96(q，J＝7.2Hz，2H)，3.74-3.68(m，1H)，3.63-3.57(m，2H)，3.22(brs，1H)，2.94-2.88(m，1H)，0.94(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.9，164.4，142.7，138.8，136.5，128.6，128.4，127.9，124.4，122.5，110.1，63.4，60.8，60.0，43.9，13.8ppm；MS(ESI)m/z 383(M+H+，100)，337(40)；Anal.Calcd for C21H22N2O5:C，65.96；H，5.80；N，7.33；FoundC，65.91；H，5.76；N，7.28. 實施例25 2，5-二氫-1-羥乙基-2-甲基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-2-methyl-5-oxo-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物25) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率98％，橙色油狀物；IR(KBr)vmax＝3615，3430，2981，1752，1642，1551，1432，1373，1283，810，723cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.12(s，1H)，7.26-7.22(m，2H)，7.08-7.05(m，3H)，4.31(q，J＝6.4Hz，1H)，4.17-4.11(m，2H)，3.80-3.71(m，3H)，3.33-3.29(m，1H)，2.80(brs，1H)，1.41(d，J＝6.4Hz，3H)，1.15(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.4，164.9，142.8，138.8，128.3，124.3，122.5，110.6，61.3，60.1，55.2，43.8，17.9，14.1ppm；MS(ESI)m/z 305(M+H+，5)，359(100)；Anal.Calcd for C16H20N2O4:C，63.14；H，6.62；N，9.20；FoundC，63.21；H，6.71；N，9.32. 實施例26 2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-甲基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl1-cyclohexyl-2，5-dihydro-2-methyl-5-oxo-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物26) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率92％，黃色固體，熔點138-139℃；IR(KBr)vmax＝3413，2973，1779，1630，1550，1418，1363，1273，789，734m-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.80(s，1H)，7.29-7.25(m，2H)，7.10-7.06(m，3H)，4.30(q，J＝6.4Hz，1H)，4.13(q，J＝7.2Hz，2H)，3.70-3.65(m，1H)，1.91-1.31(m，13H)，1.14(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.8，164.1，142.8，139.1，128.2，124.2，122.4，109.5，59.9，54.2，54.0，31.1，30.4，26.1，25.9，25.4，19.9，14.1ppm；MS(ESI)m/z 343(M+H+，30)，297(100)；Anal.Calcdfor C20H26N2O3:C，70.15；H，7.65；N，8.18；FoundC，70.21；H，7.59；N，8.22. 實施例27 2，5-二氫-1-羥乙基-2-丁基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl2-butyl-2，5-dihydro-1-(2-hydroxyethyl)-5-oxo-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物27) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率60％，橙色油狀物；IR(KBr)vmax＝3685，3449，2973，1778，1636，1548，1415，1387，1263，760，734cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.12(s，1H)，7.68-7.66(m，2H)，7.50-7.48(m，3H)，4.45(t，J＝3.2Hz，1H)，4.17-4.09(m，2H)，3.84-3.77(m，1H)，3.72-3.69(m，2H)，3.21-3.15(m，1H)，2.17-2.08(m，1H)，1.86-1.77(m，1H)，1.27-1.20(m，2H)，1.30(t，J＝7.2Hz，3H)，0.98-0.88(m，2H)，0.83(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝166.0，164.8，143.2，139.0，128.3，124.2，122.3，108.5，61.0，60.1，58.6，43.7，28.2，23.6，22.5，14.1，13.9ppm；MS(ESI)m/z 347(M+H+，100)，301(32)；Anal.Calcd for C19H26N2O4:C，65.87；H，7.56；N，8.09；FoundC，65.79；H，7.61；N，8.02. 實施例28 2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-苯基-4-(對硝基苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(4-nitrophenylamino)-1-cyclohexyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物28) 方法二 步驟l 將1mmol(170mg)的丁炔二酸二乙酯、1mmol(138mg)的對硝基苯胺依次加入到2mL二氯甲烷溶液中，60℃下攪拌1h，得到含中間體(5)2-(對硝基苯氨基)丁烯二酸二乙酯的反應(yīng)液。
步驟2 將1mmol(99mg)的環(huán)己胺、1mmol(106mg)的苯甲醛加入到2mL二氯甲烷溶液中，攪拌10min，得含中間體(7)(亞胺)的反應(yīng)液。
步驟3 將步驟1和2的反應(yīng)液混合，40℃下，反應(yīng)10h，用制備薄層析板分離產(chǎn)物，展開劑為正己烷+乙酸乙酯(4:1)，洗脫劑為乙酸乙酯，用真空旋蒸法除去溶劑得405mg的2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-苯基-4-(對硝基苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(化合物28)。
產(chǎn)率88％，黃色固體，熔點160-161℃；IR(KBr)vmax＝3443，2932，2854，1705，1632，1517，1458，1340，1263，1110，851，762cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.48(s，1H)，8.18-8.15(m，2H)，7.35-7.22(m，7H)，5.25(s，1H)，4.02-3.96(m，2H)，3.68(t，J＝3.2Hz，1H)，1.78-1.52(m，7H)，1.19-1.12(m，3H)，0.98(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝165.2，144.3，143.7，125.0，118.2，60.0，50.7，47.8，34.7，25.4，24.6，24.1，14.5ppm；MS(ESI)m/z 450(M+H+，100)，404(60)；Anal.Calcd for C25H27N3O5:C，66.80；H，6.05；N，9.35；FoundC，66.83；H，6.12；N，9.23. 實施例29 2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-苯基-4-苯氨基-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(methyl1-cyclohexyl-2，5-dihydro-5-oxo-2-phenyl-4-(phenylamino)-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物29) 制備方法同實施例10 產(chǎn)率92％，白色固體，熔點175.5-176.5；IR(KBr)vmax＝3441，2978，1770，1612，1551，1452，1373，1273，769，734cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.08(s，1H)，7.33-7.09(m，10H)，5.19(s，1H)，3.69-3.63(m，1H)，3.43(s，1H)，1.79-1.48(m，6H)，1.16-0.94(m，4H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝164.8，164.6，142.8，138.8，137.9，128.3，128.2，127.9，124.5，122.8，109.2，61.8，54.3，50.9，30.9，30.6，26.0，25.8，25.2ppm；MS(ESI)m/z 391(M+H+，100)，359(40)；Anal.Calcd for C24H26N2O3:C，73.82；H，6.71；N，7.17；FoundC，73.69；H，6.83；N，7.23. 實施例30 2，5-二氫-1-苯基-4，4-(二丁氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(ethyl4-(dibutylamino)-2，5-dihydro-5-oxo-1-phenyl-1H-pyrrole-3-carboxylate，化合物30) 制備方法同實施例1 產(chǎn)率90％，黃色油狀物；IR(KBr)vmax＝3449，2953，1762，1630，1551，1432，1373，1283，825，764cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.48(s，1H)，8.18-8.15(m，2H)，7.35-7.22(m，7H)，5.25(s，1H)，4.02-3.96(m，2H)，3.68(t，J＝3.2Hz，1H)，1.78-1.52(m，7H)，1.19-1.12(m，3H)，0.98(t，J＝7.2Hz，3H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝166.1，162.8，147.2，139.0，129.0，124.8，119.6，103.7，59.9，51.2，49.0，30.4，20.0，14.6，14.0ppm；MS(ESI)m/z 359(M+H+，100)，313(15)；Anal.Calcd for C21H30N2O3:C，70.36；H，8.44；N，7.81；FoundC，70.25；H，8.51；N，7.90. 以下用細胞融合實驗方法來評估根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案的方法制備的化合物對HIV-1的融合抑制活性，用酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-linked immunoadsorbant assay，ELISA)和天然凝膠電泳分析(Native-PAGE)等方法探討活性化合物抑制gp41六螺旋束核心結(jié)構(gòu)形成的作用機制。
實施例31 細胞融合實驗方法 采用HL2/3細胞(圖3)與HeLa-CD4-LTR-β-gal細胞(圖4)共育，以β-半乳糖苷酶活性為指標(biāo)的定量檢測HIV誘導(dǎo)的細胞融合抑制活性的非感染性方法。HL2/3細胞能穩(wěn)定高效表達HIV Gag，Env，Tat，Rev和Nef蛋白，但不表達HIV逆轉(zhuǎn)錄酶，也不能檢測到成熟的病毒顆粒。HeLa-CD4-LTR-β-gal細胞能穩(wěn)定表達HIV的受體CD4和HIV LTR啟動的β-半乳糖苷酶。當(dāng)HL2/3細胞與HeLa-CD4-LTR-β-gal細胞共育時，二者的細胞膜在HIV gp120/gp41的介導(dǎo)下發(fā)生融合，HL2/3細胞表達的Tat釋放到HeLa-CD4-LTR-β-gal細胞中，能與LTR結(jié)合，啟動β-半乳糖苷酶的表達。通過檢測細胞中β-半乳糖苷酶的活性，可以判斷HIV包膜蛋白誘導(dǎo)的膜融合作用。該方法可以用來檢測化合物抑制HIV包膜蛋白誘導(dǎo)的膜融合的活性，表明該活性化合物能抑制HIV進入靶細胞，如圖5。
HL2/3細胞(2×105/孔)能高水平的表達Gag，Env，Tat，Rev，Nef等蛋白。實驗時HL2/3細胞先與樣品化合物于96孔板中37℃孵育30分鐘，然后再加Hela-CD4-LTR/β-gal細胞(2×105/孔)混合，于37℃共孵育48小時，然后做β-gal染色，倒置顯微鏡下計數(shù)蘭斑數(shù)目?；衔镆种坡?％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100，其中‘E’代表了實驗組中細胞融合的數(shù)目，‘P’代表陽性也就是不加藥物組中細胞融合的數(shù)目，‘N’代表陰性對照組中細胞融合的數(shù)目?；衔锏陌霐?shù)抑制濃度(IC50)作為化合物抗病毒活性的指標(biāo)，通過Calcusyn軟件計算得出，如圖6、圖7。
化合物2、6、10、14、19、21的活性實驗表明，各化合物均有一定的抑制HIV-1包膜蛋白誘導(dǎo)的細胞融合的作用。除化合物19、21外，其它化合物的半數(shù)抑制濃度(IC50)小于25μg/ml。
實施例32 酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunoadsorbant assay，ELISA) 在HIV的感染過程中，首先是HIV包被膜與靶細胞的細胞膜發(fā)生融合。HIV與靶細胞融合主要由包被糖蛋白gp120和跨膜亞基gp41介導(dǎo)。gp120與靶細胞上的CD4分子和輔助受體(趨化因子受體CCR5或CXCR4等)先后結(jié)合，導(dǎo)致gp41的構(gòu)型發(fā)生改變，形成六螺旋束核心結(jié)構(gòu)，將病毒包膜與靶細胞膜拉近并發(fā)生融合，完成病毒進入宿主細胞的感染過程。因此，抑制融合過程中的任何一個環(huán)節(jié)，就能抑制HIV進入靶細胞，從而預(yù)防和治療HIV的感染。
N36和C34是從HIV gp41的NHR和CHR區(qū)衍生出來的多肽，二者在體外能形成類似NHR和CHR結(jié)合的六螺旋束結(jié)構(gòu)。因此，抗gp41亞基核心結(jié)構(gòu)的活性可以用抑制N36和C34結(jié)合的作用來測定。
酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法的第一步是將特異性識別gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)的單克隆抗體NC-1包被在96孔酶標(biāo)板上；第二步是將N36與待篩選化合物混合，再加入C34，然后將它們加入到已封閉好的酶標(biāo)板中；最后，分別加入兔抗N36/C34復(fù)合物的多克隆抗體IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和顯色底物，檢測吸光度值，判斷化合物抗N36與C34結(jié)合的活性。化合物的抑制活性及半效抑制濃度(IC50)采用CalcuSyn軟件分析，如圖9。
實施例33 天然凝膠電泳(Native-PAGE) 我們建立了一個簡便的生物物理的方法，即天然聚丙烯酰氨凝膠電泳法(Peptides.2003；241303-1313)，來確認活性分子是否抑制gp41核心結(jié)構(gòu)形成。該方法不采用抗體，可以排除上面采用免疫吸附方法篩選過程中出現(xiàn)的“假陽性”化合物。
如圖10，采用18％的聚丙烯酰氨凝膠，對N36和C34的復(fù)合物進行天然凝膠電泳，然后對凝膠進行考馬斯亮藍染色，并進行照相。N36由于帶正電荷，在電泳中不顯示條帶，C34則在凝膠底部顯一條多肽條帶，N36和C34的復(fù)合物除底部有一條強度減弱的C34條帶外，在上方還出現(xiàn)一條六聚體的條帶。若化合物能抑制gp41核心結(jié)構(gòu)形成，則該六聚體條帶強度減弱或消失，而底部的C34條帶強度增加。
實施例34 如圖11(化合物22與gp41的作用圖)，應(yīng)用SYBYL8.0藥物設(shè)計軟件采用分子對接技術(shù)(docking)，計算合物與gp41的作用強度。作用強度用評分衡量，打分越高表示結(jié)合力越強，打分在3分以上表示化合物跟靶點都有較好的結(jié)合。一些化合物的評分比NB64更高(評分結(jié)果見表1)。
方法如下 第一步，準備蛋白，下載PDB1AIK，打開SYBYL8.0，F(xiàn)ile，open，選擇1AIK，點擊Prepare structure，structure preparation Tool，點擊analyze selected structure，進行蛋白修復(fù)。
第二步，分子對接。
打開SYBYL軟件，點擊Application，Docking suite，Dockligand； 在打開的DOCKING對話框中，Docking mode選擇surflex dock，在file name里面選擇要進行分子對接的PDB1AIK。接著彈出對話框，點擊generate，OK，返回Docking對話框； 在SLN右面的空框里面選擇要進行對接的小分子SLN文件； 點擊0K進行分子對接，如化合物22與gp41對接圖(圖11)； 分子對接完彈出的對話框會顯示每個小分子的打分，>3有意義。
表1 一些化合物與gp41的作用強度

權(quán)利要求
1、吡咯酮衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，通式為
式中
R1、R2和R3為氫、直鏈或支鏈烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基或雜環(huán)基；
R4為氫、直鏈或支鏈烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基或雜環(huán)基；
R5為氫、烷基或芳香基。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的吡咯酮衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，其中
R5為取代或無取代或含雜原子的芳香基、氫或C1-4烷基。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的吡咯酮衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，其中
R1、R2和R3為氫、C1-4直鏈或支鏈烷基、羥基取代烷基、鹵素取代烷基、羧基取代烷基、烷氧?；〈榛?、C5-6環(huán)烷基、芐基、苯基、取代芳基或雜環(huán)基；
R4為氫、C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基、芐基、苯基、C1-3烷基取代芳基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基、烷氧?；〈蓟被酋；〈蓟螂s環(huán)基。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的吡咯酮衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，其中
R1和R2為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基或芐基；
R3為C1-3烷基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基、氨磺?；〈蓟?；
R4為氫。
5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的吡咯酮衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，其中
R1和R2為C1-3烷基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基或氨磺?；〈蓟?br> R3為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基或芐基；
R4為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基取代烷基、鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基、芐基、苯基、C1-3烷基取代芳基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基、烷氧?；〈蓟?、氨磺酰基取代芳基或雜環(huán)基。
6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的吡咯酮衍生物，其特征在于，所述衍生物為
2，5-二氫-1-芐基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-對甲苯基-4-(對甲基苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-對氟苯基-4-(對氟苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-對溴苯基-4-(對溴苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-苯基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-苯基-4-(丙氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-苯基-4-(環(huán)己氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-對硝基苯基-4-(環(huán)己氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-芐基-2-苯基-4-(芐氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-丙基-2-苯基-4-(丙氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-甲基-2-苯基-4-(甲氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-丁基-2-苯基-4-(丁氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-對甲苯基-2-苯基-4-(對甲苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-對氟苯基-2-苯基-4-(對氟苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-芐基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-正丁基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-羥乙基-2-苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-羥乙基-2-苯基-4-(對甲基苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-芐基-2-苯基-4-(對氟苯基氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-羥乙基-2-對氟苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-苯基-2-對碘苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-羥乙基-2-對羥基苯基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-羥乙基-2-甲基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-甲基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-羥乙基-2-丁基-4-(苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-苯基-4-(對硝基苯氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯、
2，5-二氫-1-環(huán)己基-2-苯基-4-苯氨基-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸甲酯或2，5-二氫-1-苯基-4，4-(二丁氨基)-5-氧-1H-吡咯-3-羧酸乙酯。
7、一種權(quán)利要求1-6之一所述吡咯酮衍生物的合成方法，其特征在于，包括以下步驟
以下以摩爾份數(shù)計；
(1)在4份有機溶劑中加入1份化合物(1)和1份化合物(2)，0～60℃下攪拌10分鐘～1小時；
(2)在步驟(1)的反應(yīng)液中加入1～4份化合物(3)，加入0～4份的酸，反應(yīng)溫度20～100℃，攪拌1～5小時；
(3)在步驟(2)的反應(yīng)液中加入1～4份化合物(4)，加入0～4份的酸，反應(yīng)溫度20～100℃，攪拌1～5小時，用常規(guī)方法分離純化；
所述化合物(1)為
所述化合物(2)為
R1R2NH (2)
所述化合物(3)為
R3NH2 (3)
所述化合物(4)為
R4CHO (4)
其中R1、R2、R3和R5如權(quán)利要求4所述，R4為氫；
所述有機溶劑包括醇、苯、甲苯、己烷、鹵代烴、醚、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或乙腈中的一種或幾種；
所述酸包括硫酸、鹽酸、苯磺酸或醋酸。
8、一種權(quán)利要求1-6之一所述吡咯酮衍生物的合成方法，其特征在于，包括以下步驟
以下以摩爾份數(shù)計；
(1)在2份有機溶劑中加入1份化合物(1)和1份化合物(2)，0～60℃下攪拌10分鐘到1小時；
(2)在2份有機溶劑中加入1～4份化合物(3)、1～4份化合物(4)，加入0～4份的酸或堿，反應(yīng)溫度20～100℃，攪拌10分鐘到5小時；
(3)將步驟(1)和(2)的反應(yīng)液混合，20～100℃下攪拌5～20小時，用常規(guī)方法分離純化；
所述化合物(1)為
所述化合物(2)為
R1R2NH(2)
所述化合物(3)為
R3NH2 (3)
所述化合物(4)為
R4CHO (4)
其中R1、R2、R3和R5如權(quán)利要求5所述，R4為C1-4直鏈或支鏈烷基，羥基或鹵素取代烷基、C5-6環(huán)烷基、芐基、苯基、C1-3烷基、烷氧基取代芳基、鹵素取代芳基、硝基取代芳基、烷氧?；〈蓟?、氨磺酰基取代芳基或雜環(huán)基；
所述有機溶劑包括醇、苯、甲苯、己烷、鹵代烴、醚、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或乙腈中的一種或幾種。
9、一種權(quán)利要求1-6之一所述的吡咯酮衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HIV-1抑制劑吡咯酮衍生物及其合成方法和其應(yīng)用，本發(fā)明的吡咯酮衍生物的結(jié)構(gòu)式為式(I)，(I)中R1、R2、R3、R4是氫、芳香基、烷基或雜環(huán)基；R5是氫、烷基、芳香基。(I)可用四組分法簡便地由化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)及化合物(4)合成，產(chǎn)率為60-96％。本發(fā)明的吡咯酮衍生物或其藥物學(xué)上可接受的鹽可單獨或結(jié)合其他藥物應(yīng)用到制備抗艾滋病藥物。
文檔編號A61K31/4015GK101497580SQ200910036539
公開日2009年8月5日 申請日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者江煥峰, 朱秋華, 劉叔文, 珉 張 申請人:華南理工大學(xué), 南方醫(yī)科大學(xué)