專利名稱：降低嗜酸性粒細(xì)胞水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及降低人對(duì)象的嗜酸性粒細(xì)胞水平的方法。
背景技術(shù)：
嗜酸性粒細(xì)胞與多種疾病有關(guān)，包括變應(yīng)性疾病，認(rèn)為這種細(xì)胞在變應(yīng)性疾病， 如慢性支氣管哮喘和特應(yīng)性皮炎的發(fā)病中起到重要作用[Adv. Immunol.，39，177 (1986)， Immunol. Today, 13，501 (1992)]。除上述疾病外，嗜酸性粒細(xì)胞也涉及通常稱為嗜酸性粒細(xì) 胞過(guò)多綜合征(HES)的疾病，如嗜酸粒細(xì)胞增多、嗜酸性粒細(xì)胞性腸胃炎、嗜酸性粒細(xì)胞性 白血病、嗜酸性粒細(xì)胞性肉芽腫和基穆拉病[Ann. Intern. Med.，97，78 (1982)]。嗜酸性粒細(xì)胞性肉芽腫是非成瘤性隱原型病變，它是溶骨性病灶，已知與顯著的 組織嗜酸粒細(xì)胞增多相關(guān)聯(lián)[U. S. Armed Forces Med. J.，2，1085 (1951)]。按照日本的骨 腫瘤患者記錄(1972-1984)，404位骨腫瘤患者中379位(93. 8% )出現(xiàn)嗜酸性細(xì)胞性肉芽 腫。嗜酸性粒細(xì)胞性肉芽腫早期主要包括嗜酸性粒細(xì)胞和組織細(xì)胞，晚期的肉芽腫包括纖 維化，或者可發(fā)展成纖維性肺。因此，除炎性疾病如變態(tài)反應(yīng)外，嗜酸性粒細(xì)胞可引起其它 各種疾病。白介素-5 (下文稱為IL-5)、白介素-3 (下文稱為IL_3)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落 刺激因子(下文稱為GM-CSF)是細(xì)胞因子家族成員，它們參與調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的分化、增 殖和活化。在這些細(xì)胞因子中，已知IL-5特異性作用于嗜酸性粒細(xì)胞，并特異性誘導(dǎo)終末 分化[Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,85, 2288 (1988)]。體外，IL-3和/或GM-CSF可激活嗜酸性粒細(xì)胞或延長(zhǎng)其存活期[J. Cl in. Invest.，81,1986(1988)]。而且，IL-3和/或GM-CSF的主要作用還有從髓細(xì)胞樣干細(xì)胞 誘導(dǎo)不成熟的嗜酸性粒細(xì)胞[Blood，76，1956 (1990)]。而且，趨化因子如嗜酸性粒細(xì)胞趨化 蛋白和RANTES (受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子)誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞向發(fā)炎部位的 趨化性[Clin. Exp. Allergy, 26,1005 (1996) ] 0在變應(yīng)性支氣管炎中，干細(xì)胞因子(下文稱 為SCF)參與嗜酸性粒細(xì)胞的累積。除IL-5外，有許多因子影響嗜酸性粒細(xì)胞功能。嗜酸性粒細(xì)胞分為以下亞組，即正常密度嗜酸性粒細(xì)胞和低密度嗜酸性粒細(xì)胞。 嗜酸性粒細(xì)胞活化后是低密度嗜酸性粒細(xì)胞[Immunology，47，531 (1982)]。低密度嗜酸性 粒細(xì)胞也稱為活化的嗜酸性粒細(xì)胞。已報(bào)道，在HES患者外周血中嗜酸性粒細(xì)胞除發(fā)生數(shù) 量改變外，也發(fā)生性質(zhì)改變[Clin. Exp. Immunol.，24，423 (1976)]?；罨氖人嵝粤＜?xì)胞與 HES癥狀的嚴(yán)重性有關(guān)[Am. J. Cardiol.，52，321 (1983)]。除HES患者外，也在支氣管哮喘 患者的外周血和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中發(fā)現(xiàn)活化的嗜酸性粒細(xì)胞[Am. Rev. Respir. Dis，132，981 (1985)]?；罨氖人嵝粤＜?xì)胞(低密度嗜酸性粒細(xì)胞)上表達(dá)各種受體 ，如 細(xì)胞因子受體[J. Immunol.，142，4416 (1989)]。與正常密度嗜酸性粒細(xì)胞相比，這些低密 度嗜酸性粒細(xì)胞對(duì) IL-5 的敏感性升高[Clin. Exp. Immunol.，85，312 (1991) ;J. Exp. Med.， 172，1347(1990)]。也知道上述活化的嗜酸性粒細(xì)胞在沒(méi)有誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞分化和增殖的細(xì)胞因子的體外條件下能夠存活[J. Exp. Med. ,170,343(1989)].因此，活化嗜酸性粒細(xì)胞的性質(zhì)類似于浸潤(rùn)組織，例如肺泡的那些嗜酸性粒細(xì)胞[Int. Arch. Allergy Immunol.，120， 91(1999)]。尚不了解活化的嗜酸性粒細(xì)胞變成細(xì)胞因子依賴性的原因的詳細(xì)解釋，然而， 其脫粒和存活期延長(zhǎng)可能是由除IL-5以外的各種重要功能分子誘導(dǎo)的。對(duì)參與嗜酸性粒細(xì)胞分化或增殖的細(xì)胞因子或趨化因子有抑制活性的物質(zhì)被認(rèn) 為是抑制嗜酸性粒細(xì)胞功能的物質(zhì)。然而，在大多數(shù)情況下，這些物質(zhì)對(duì)被激活并浸潤(rùn)到發(fā) 炎區(qū)域的細(xì)胞因子依賴性嗜酸性粒細(xì)胞不起作用。因此，嗜酸性粒細(xì)胞特異性抑制和誘導(dǎo) 活化嗜酸性粒細(xì)胞的細(xì)胞死亡是抑制任何嗜酸性粒細(xì)胞功能的必需步驟。然而，迄今為止 沒(méi)有任何消炎劑能誘導(dǎo)活化的嗜酸性粒細(xì)胞凋亡。目前，嗜酸性粒細(xì)胞疾病患者的治療包括給予類固醇。然而，給予類固醇常常伴有 副作用。具體說(shuō)，這種治療產(chǎn)生一些其它問(wèn)題，例如類固醇給藥停止后患者的病理狀況可能 回復(fù)到初始狀態(tài)，和長(zhǎng)期給予類固醇可誘導(dǎo)類固醇抗性。因此，需要針對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo) 的疾病和失調(diào)的安全有效的治療。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種減少人對(duì)象中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的方法，包括給予所述患者 IL-5R結(jié)合分子，該結(jié)合分子包含(a)特異性結(jié)合IL-5R的區(qū)域和(b)免疫球蛋白Fc區(qū)。附圖簡(jiǎn)述出于闡述本發(fā)明的目的，附圖中描述了本發(fā)明的某些實(shí)施方式。然而，本發(fā)明不僅 限于附圖中描述的實(shí)施方式的精確安排和手段。

圖1.血清嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子性蛋白質(zhì)(ECP)減少ECP是嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的 標(biāo)記物。在患者組1中，這種ECP水平降低表明嗜酸性粒細(xì)胞的減少，如圖1所示。y-軸表 示ECP水平(ng/ml)，χ-軸表示時(shí)間(天)。圖2.可逆的外周嗜堿性粒細(xì)胞消耗測(cè)定患者組1中的循環(huán)嗜堿性粒細(xì)胞。y_軸 表示嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(嗜堿性粒細(xì)胞/毫米3)，X-軸表示時(shí)間(天)。給藥后24小時(shí)觀 察到外周血中嗜堿性粒細(xì)胞快速減少。圖3.患有嗜酸粒細(xì)胞增多的對(duì)象中hsCRP (高敏感型c反應(yīng)性蛋白)基線水平升 高(可逆)。在患者組1中測(cè)定這種標(biāo)記物表明，如期發(fā)生對(duì)IL-5R表達(dá)細(xì)胞的免疫介導(dǎo)反 應(yīng)。y_軸表示hsCRP水平(mg/dl)，χ-軸表示時(shí)間(天)。圖4.血清IL-6的最小增加值。小結(jié)了在患者組1中測(cè)定的IL-6細(xì)胞因子。y_軸 表示IL-6水平(pg/ml)，χ-軸表示時(shí)間(小時(shí))。圖5.循環(huán)嗜中性粒細(xì)胞發(fā)生可變的降低。測(cè)定患者組1中的嗜中性粒細(xì)胞水平， 小結(jié)于兩幅圖中。圖6.循環(huán)淋巴細(xì)胞發(fā)生可變的降低。測(cè)定患者組1中的淋巴細(xì)胞水平，小結(jié)于兩 幅圖中。圖7.在第一天％ NK 一致地發(fā)生適度降低。在治療前、給藥后第1天和給藥后第 28天檢測(cè)患者組1中的NK細(xì)胞水平。圖8.基線較高的對(duì)象中FEm降低。在患者組1中測(cè)定呼出一氧化氮的比例。此 實(shí)驗(yàn)是非侵入性肺炎測(cè)定方法，數(shù)據(jù)表示炎癥減輕的趨勢(shì)。圖9.體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)在體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中，與不結(jié)合IL-5R的對(duì)照抗體㈧和巖藻糖基化MEDI-563的額外對(duì)照(B)相比，測(cè)定MEDI-563。KC1333效應(yīng)細(xì)胞以5 1的比例用于對(duì)抗CTLL2靶細(xì)胞。4小時(shí)時(shí)測(cè)定細(xì)胞毒性。Y軸表示細(xì)胞毒百分?jǐn)?shù)，X軸表示抗 體濃度。圖10. MEDI-563與rhuIL_5Ra的結(jié)合通過(guò)表面等離振子共振，在三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn) 中測(cè)定MEDI-563與重組人IL-5Ra的結(jié)合親和力，小結(jié)于該圖中。圖11.MEDI-563與rhuFcYRs的結(jié)合測(cè)定MEDI-563與幾個(gè)不同批次的重組人 Fc γ R的結(jié)合親和力，并與同種型匹配的巖藻糖基化對(duì)照抗體作比較，小結(jié)于該圖中。需要 注意，MEDI-56與huFcyRIIIa和muFcyRIV的結(jié)合親和力是(對(duì)照的)5_10倍。圖12.通過(guò)免疫組化分析IL_9tg小鼠肺部的IL_5Ra表達(dá)，并繪制成該圖。圖13.通過(guò)免疫組化，用MEDI-563分析鼻息肉中的IL_5Ra表達(dá)，并繪制成該圖。 MEDI-563能夠?qū)Ρ窍⑷庵械乃惺人嵝粤＜?xì)胞染色。圖14.對(duì)象中的最小瞬時(shí)嗜中性白血球減少癥對(duì)第一組的對(duì)象進(jìn)行絕對(duì)嗜中性 粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，并小結(jié)于該圖中。Y-軸代表嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(嗜中性粒細(xì)胞/毫米3)和 X-軸代表時(shí)間天數(shù)。圖15. MEDI-563與健康捐獻(xiàn)者全血中的嗜酸性粒細(xì)胞結(jié)合如本文實(shí)施例6所述， 對(duì)全血樣品進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。這三組FACS數(shù)據(jù)，特別是第三組題為“MEDI-563結(jié)合嗜 酸性粒細(xì)胞”的數(shù)據(jù)表明MEDI-563與嗜酸性粒細(xì)胞結(jié)合。圖16.來(lái)自IL-5轉(zhuǎn)基因小鼠的白細(xì)胞的FACS分析如實(shí)施例7所述，對(duì)來(lái)自IL_5 轉(zhuǎn)基因小鼠的白細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。圖16A小結(jié)了 SiglecF+CCR3+嗜酸性粒細(xì)胞的 FACS分析。圖16B用抗-IL-5Ra mAb H7證明，骨髓、脾、血液和肺中的所有嗜酸性粒細(xì)胞 (SiglecF+CCR3+)均表達(dá) IL_5Ra +。圖17.在體外ADCC實(shí)驗(yàn)中MEDI-563消耗來(lái)自骨髓的IL_5Ra陽(yáng)性單核細(xì)胞。在 CFSE染色的效應(yīng)細(xì)胞存在下使分離的非貼壁骨髓單核細(xì)胞接觸MEDI-563，或同種型對(duì)照 抗體(R347)。通過(guò)KM1257抗體/PE偶聯(lián)的山羊抗-μ IgG觀察IL_5Ra陽(yáng)性細(xì)胞。利用1A7 同種型對(duì)照抗體/PE偶聯(lián)的山羊抗-μ IgG對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)照染色。進(jìn)行MEDI-563或R347介 導(dǎo)的消耗后，樣品細(xì)胞群的染色概況顯示為KM1257/PE與CFSE或1A7/PE與CFSE散點(diǎn)圖。 比較由MEDI-563和R347處理樣品獲得的KM1257/PE與CFSE散點(diǎn)圖揭示出，MEDI-563介 導(dǎo)的ADCC基本耗盡樣品中的所有IL-5Ra陽(yáng)性細(xì)胞。圖18. MEDI-563可逆地消耗輕微哮喘患者的外周血嗜酸性粒細(xì)胞?；加休p微特應(yīng) 性哮喘的六位志愿者接受單次IV給予的(A)O. 03mg/kg或(B)O. lmg/kg MEDI-563。在篩選 時(shí)、給藥前第0天和以規(guī)則間隔到第84天以及隨訪期間通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外周血嗜酸性粒 細(xì)胞計(jì)數(shù)。y_軸表示嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(嗜酸性粒細(xì)胞/毫米3)，χ-軸表示時(shí)間(天)。 給藥后24小時(shí)觀察到外周血中嗜酸性粒細(xì)胞快速減少。MEDI-563誘導(dǎo)的嗜酸性細(xì)胞減少 是可逆的。圖19.用MEDI-563進(jìn)行免疫組化分析時(shí)發(fā)現(xiàn)正常人肺中的所有嗜酸性粒細(xì)胞上 均表達(dá)IL-5Ra，繪制該圖。圖20.用MEDI-563進(jìn)行免疫組化分析時(shí)發(fā)現(xiàn)哮喘患者的肺活檢樣品中所有嗜酸 性粒細(xì)胞上均表達(dá)IL_5Ra，繪制該圖。圖21.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析分離自健康捐獻(xiàn)者的原代嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的IL-5Ra表達(dá)。顯示利用MEDI 563抗_IL5Ra抗體和無(wú)關(guān)特異性的同種型對(duì)照抗 體獲得的染色概況，CTLLh5r細(xì)胞(IL-5Ra/i3轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞)用作陽(yáng)性對(duì)照。圖22.體外抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)實(shí)驗(yàn)在體外ADCC實(shí)驗(yàn)中比較 非巖藻糖基化和巖藻糖基化MEDI-563的活性。分離的原代NK細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞分別用 作效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，比例為5 1。在lng/ml人IL-2存在下進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。根據(jù)膜聯(lián)蛋 白V染色，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞死亡。Y和X軸分別表示最大細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)和抗體濃 度。非巖藻糖基化MEDI-563抗體的EC50為0. 965pM。圖23.體外抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)實(shí)驗(yàn)在體外ADCC實(shí)驗(yàn)中分析 非巖藻糖基化MEDI-563的活性。分離的原代NK細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞分別用作效應(yīng)細(xì)胞 和靶細(xì)胞。Y和X軸分別表示最大細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)和抗體濃度。在該實(shí)驗(yàn)中非巖藻糖基化 MEDI-563 抗體的 EC50 為 0. 561pM。圖24.在體外抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)實(shí)驗(yàn)中嗜酸性粒細(xì)胞的脫粒使用不同水平的巖藻糖基化(MEDI-563F)和非巖藻糖基化(MEDI-563)抗_IL5Ra抗體進(jìn) 行體外ADCC實(shí)驗(yàn)，以分析嗜酸性粒細(xì)胞釋放的EDN (嗜酸性粒細(xì)胞衍生的神經(jīng)毒素)。該實(shí) 驗(yàn)使用新鮮分離的嗜酸性粒細(xì)胞和NK或PBMC細(xì)胞，分別用作靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。顯示用
曲通X-100處理時(shí)檢測(cè)到的嗜酸性粒細(xì)胞脫粒最大值以便比較。圖25. MEDI-563特異性結(jié)合人IL_5Ra胞外區(qū)Dl結(jié)構(gòu)域中的表位。通過(guò)流式細(xì) 胞術(shù)確認(rèn)抗體與瞬時(shí)表達(dá)嵌合IL-5Ra蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的結(jié)合。顯示了熒光染色概況。 “多克隆”和“MEDI-563”指分別利用多克隆抗-人IL-5Rci和MEDI-563抗體觀察到的染色 概況?！半p染”指“多克隆”(χ軸)和MEDI-563 (y軸)抗體的熒光染色概況。㈧瞬時(shí)表達(dá) 一系列人-小鼠嵌合IL-5Ra轉(zhuǎn)基因?！扒贸鞭D(zhuǎn)基因是在人背景中包含單個(gè)小鼠胞外結(jié)構(gòu) 域的嵌合IL-5Ra構(gòu)建物?！扒萌搿鞭D(zhuǎn)基因是在小鼠背景中包含單個(gè)人胞外結(jié)構(gòu)域的嵌合 IL-5Ra構(gòu)建物。(B)MEDI-563特異性結(jié)合表達(dá)人IL-5Rα的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。MEDI-563不結(jié) 合表達(dá)小鼠IL-5Ra的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。(C)MEDI-563不結(jié)合表達(dá)包含小鼠Dl和人D2-D3胞外 結(jié)構(gòu)域(“敲除D1”)的嵌合IL-5Ra轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。MEDI-563特異性結(jié)合表達(dá)在 人背景中包含小鼠D2或D3胞外結(jié)構(gòu)域(“敲除D2或D3”)的嵌合IL_5Ra轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞。(D)MEDI-563特異性結(jié)合表達(dá)包含人Dl和小鼠D2-D3胞外結(jié)構(gòu)域(“敲入D1”) 的嵌合IL-5Ra轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。MEDI-563不結(jié)合表達(dá)包含人D2或D3胞外結(jié)構(gòu)域 (“敲入D2或D3”)的小鼠IL-5Rci基嵌合轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。圖26. MEDI-563特異性結(jié)合人IL_5Ra胞外區(qū)Dl的區(qū)段B中的表位。通過(guò)流式 細(xì)胞術(shù)確認(rèn)抗體與表達(dá)嵌合IL-5Ra蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的結(jié)合。顯示了熒光染色概況?！岸?克隆”和“MEDI-563”指分別利用多克隆抗-人IL-5Rci和MEDI-563抗體觀察到的染色概 況?！半p染”指多克隆(χ軸)和MEDI-563(y軸)抗體的熒光染色概況。(A)小鼠IL-5Ra 胞外區(qū)Dl的氨基酸序列與人IL_5Ra蛋白75%相同。IL_5Ra胞外區(qū)Dl分成區(qū)段A、B和 C。所示的人和小鼠IL-5Ra氨基酸序列分別是SEQ ID NO :5和6的殘基1-102。(B)瞬時(shí) 表達(dá)一系列人-小鼠嵌合IL-5Ra轉(zhuǎn)基因?！扒贸鞭D(zhuǎn)基因是在人背景中包含單個(gè)小鼠胞外 結(jié)構(gòu)域Dl的區(qū)段的嵌合IL-5Rci構(gòu)建物?！扒萌搿鞭D(zhuǎn)基因是在小鼠Dl-人D2-小鼠D3-小 鼠TM背景中包含單個(gè)人胞外結(jié)構(gòu)域Dl的區(qū)段的嵌合IL-5R α構(gòu)建物。(C)MEDI_563特異 性識(shí)別表達(dá)(i)人IL-5Ra轉(zhuǎn)基因或(ii)包含人胞外區(qū)Dl的小鼠IL-5Ra嵌合轉(zhuǎn)基因(“敲入D1”)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。MEDI-563不結(jié)合表達(dá)(i)小鼠IL_5Ra受體轉(zhuǎn)基因或(ii) 包含小鼠胞外區(qū)Dl的人嵌合IL-5Rci轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。(D)MEDI-563不結(jié)合表達(dá)在 人背景中包含小鼠胞外結(jié)構(gòu)域Dl的區(qū)段B( “敲除B”)的嵌合IL-5Ra轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞。MEDI-563特異性結(jié)合表達(dá)在人背景中包含小鼠胞外結(jié)構(gòu)域Dl的區(qū)段A或C( “敲除A 或C”)的嵌合IL-5Ra轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。(E)MEDI-563特異性結(jié)合表達(dá)在小鼠Dl-人 D2-小鼠D3-小鼠TM背景中包含人胞外結(jié)構(gòu)域D 1的區(qū)段B( “敲入B”)的嵌合IL_5Ra 轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。MEDI-563不結(jié)合表達(dá)在小鼠Dl-人D2-小鼠D3-小鼠TM背景中包 含人區(qū)段A或C(“敲入A或C”)的嵌合IL-5Ra轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。圖27. MEDI-563特異性結(jié)合包含胞外區(qū)Dl的氨基酸殘基Ile61的人IL_5Ra的 表位。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)抗體與表達(dá)變異IL-5Rα蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的結(jié)合。顯示了熒 光染色概況?！岸嗫寺　焙汀癕EDI-563”指分別利用多克隆抗-人IL-5Rci和MEDI-563抗 體觀察到的染色概況?！半p染”指多克隆(χ軸)和MEDI-563 (y軸)抗體的熒光染色概況。 (A)人IL-5Ra胞外區(qū)Dl的殘基50-61 (SEQ ID NO 5的殘基40-61)。斜體表示的殘基在 小鼠IL-5Ra蛋白的相應(yīng)區(qū)域不同。在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中表達(dá)包含至少一個(gè)突變氨基酸殘基的 一系列IL-5Ra受體變體?！扒贸盜L-5Ra變體是包含將人殘基替換成相應(yīng)小鼠殘基的至 少一個(gè)取代的突變的人蛋白。例如，“敲除DE”變體是包含D56E和E58D氨基酸取代的人 IL-5Ra蛋白。“敲入” IL-5Rci變體是包含小鼠D1、人D2、小鼠D3和小鼠TM結(jié)構(gòu)域的嵌合 蛋白，其中小鼠Dl結(jié)構(gòu)域包含突變的區(qū)段B，其具有將小鼠殘基替換成相應(yīng)人殘基的至少 一個(gè)取代。例如，“敲入DE”變體是包含突變的小鼠區(qū)段B的嵌合IL-5Ra蛋白，其中突變 的小鼠區(qū)段B包含E56D和D58E氨基酸取代。(B)MEDI-563不結(jié)合表達(dá)突變的人IL_5Ra 蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述突變的人IL-5R α蛋白包含K53Q、D56E、E58D、I61K氨基酸取代 (“敲除-KDEI”)。MEDI-563特異性結(jié)合表達(dá)突變的人IL-5Rα蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述突 變的人 IL-5Ra 蛋白包含 N40H、N42D、Q46H( “敲除-NNQ”)或 D56E、E58D( “敲除 _DE”)或 N40H、N42D、D56E、E58D( “敲除-NNDE”)氨基酸取代。(C)MEDI-563特異性結(jié)合表達(dá)包含突 變的小鼠區(qū)段B的嵌合IL-5Ra蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述突變的小鼠區(qū)段B包含Q53K、 E56D、D58E、K61I氨基酸取代(“敲入-KDEI”)。(D)MEDI_563不結(jié)合表達(dá)突變的人IL_5Ra 蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述突變的人IL-5Ra蛋白包含I61K氨基酸取代(“敲除-161”)。 MEDI-563特異性結(jié)合表達(dá)突變的人IL-5Rα蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述突變的人IL-5Rα蛋 白包含K53Q( “敲除-K53”)氨基酸取代。(E)MEDI-563特異性結(jié)合表達(dá)包含突變的小鼠區(qū) 段B的嵌合IL-5R α蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述突變的小鼠區(qū)段B包含K61I氨基酸取代 (“敲入-161”)。MEDI-563不結(jié)合表達(dá)包含突變的小鼠區(qū)段B的嵌合IL-5R α蛋白的轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞，其中所述突變的小鼠區(qū)段B包含Q53K氨基酸取代(“敲入-K53”)。圖28.嵌合抗-小鼠IL-5Rci (H7)與鼠Fc γ R結(jié)合測(cè)定嵌合抗-小鼠 IL-5Ra (H7)與重組鼠Fc γ R的結(jié)合親和力并與同種型匹配的巖藻糖基化對(duì)照抗體作比 較，小結(jié)于該圖中。顯示解離常數(shù)(ηΜ)。通過(guò)表面等離振子共振技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。圖29. (A)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定嗜酸性粒細(xì)胞，具有側(cè)散射特征的細(xì)胞為 CCR3和Siglec-F染色陽(yáng)性。(B) IL_5Tg小鼠骨髓、血液、脾和肺組織中的嗜酸性粒細(xì)胞選 擇性表達(dá)IL-5R。圖30.非巖藻糖基化 和巖藻糖基化的H7能消耗IL_5Tg小鼠脾㈧、肺組織㈧和血液(B)中的嗜酸性粒細(xì)胞。在骨髓(B)中未檢測(cè)到消耗。與巖藻糖基化H7相比，非巖藻糖 基化的H7在去除嗜酸性粒細(xì)胞方面更有效，特別是在較低的抗體劑量下。數(shù)據(jù)表示為平均 值士SEM，n = 6-8只小鼠/組，抗體治療組與對(duì)照IgG治療組相比p < 0. 05，Mann-Whitney U檢驗(yàn)。圖31.在變應(yīng)原刺激模型中非巖藻糖基化H7也消耗嗜酸性粒細(xì)胞。在氣道內(nèi)腔、 肺組織、血液和骨髓中，非巖藻糖基化H7消耗嗜酸性粒細(xì)胞。最后一次刺激后72小時(shí)(抗 體遞送后96小時(shí))，所有區(qū)室中的消耗水平最高。數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM，n = 6只小鼠 /組，*抗體治療組與對(duì)照IgG治療組相比p < 0. 05，Mann-Whitney U檢驗(yàn)。發(fā)明詳述如上所述并且不受任何特定假設(shè)或理論限制，嗜酸性粒細(xì)胞與多種疾病和失調(diào)的 發(fā)病有關(guān)。許多這類疾病或失調(diào)的特征是嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)多(嗜酸粒細(xì)胞增多)，稱為嗜酸 性粒細(xì)胞過(guò)多綜合征。嗜酸性粒細(xì)胞起作用的疾病和失調(diào)的非限制性例子是哮喘、免疫球蛋白 (IgE)_介導(dǎo)的食物變態(tài)反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞性食道炎(食道的炎癥)、炎性腸病、C0PD、變應(yīng) 性結(jié)腸炎、胃-食管反流、嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸疾病(EGID)、嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎、心內(nèi) 膜纖維化、呂弗勒心內(nèi)膜炎、戴維病(Davies disease)、與嗜酸粒細(xì)胞增多有關(guān)的發(fā)作性血 管性水腫、嗜酸粒細(xì)胞增多-肌痛綜合征/西班牙毒油綜合征、肝硬化、皰疹樣皮炎、大皰性 類天皰瘡、丘-施二氏綜合征、急性骨髓性嗜酸性細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞性嗜酸性細(xì)胞 白血病、并發(fā)嗜酸粒細(xì)胞增多的系統(tǒng)性肥大細(xì)胞病、過(guò)敏性鼻炎、濕疹、韋格納肉芽腫病、結(jié) 節(jié)性多動(dòng)脈炎、嗜酸性粒細(xì)胞性筋膜炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。因此，本發(fā)明提供一種減少人對(duì)象中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的方法，包括給予所述患 者IL-5R結(jié)合分子，該結(jié)合分子包含(a)特異性結(jié)合IL-5R的區(qū)域和(b)免疫球蛋白Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供減少人對(duì)象中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的方法，包括給 予所述患者IL-5R結(jié)合分子，該結(jié)合分子包含(a)特異性結(jié)合IL-5R的區(qū)域和(b)免疫球 蛋白Fc區(qū)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明方法減少血液、骨髓、胃腸道(如食道、胃、小腸 和結(jié)腸)或肺中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明方法減少血液嗜酸 性粒細(xì)胞的數(shù)量。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明方法減少肺嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量。在一 個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明方法減少嗜酸性粒細(xì)胞前體細(xì)胞的數(shù)量。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法使嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量減少至少約10%、至少約 20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少 約90%、至少約95%或至少約99%。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明方法使嗜酸性粒細(xì)胞 數(shù)量降低到檢測(cè)限以下。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法使嗜酸性粒細(xì)胞前體數(shù)量減少至少約10%、至少 約20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至 少約90%、至少約95%或至少約99%。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明方法使嗜酸性粒細(xì) 胞前體數(shù)量降低到檢測(cè)限以下。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法在單次給予IL-5R結(jié)合分子后消除所有可檢測(cè)的 嗜酸性粒細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，單次給予IL-5R結(jié)合分子消除所有可檢測(cè)的嗜酸 性粒細(xì)胞至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約2周、至少約3周、至少約4周、至少約5周、至少約6周、至少約7周、至少 約8周、至少約9周、至少約10周、至少約12周、至少約14周、至少約16周、至少約20周 或至少約25周。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法在單次給予IL-5R結(jié)合分子后消除所有可檢測(cè)的 嗜酸性粒細(xì)胞前體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，單次給予IL-5R結(jié)合分子消除所有可檢測(cè)的 嗜酸性粒細(xì)胞前體至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約 6天、至少約7天、至少約2周、至少約3周、至少約4周、至少約5周、至少約6周、至少約7 周、至少約8周、至少約9周、至少約10周、至少約12周、至少約14周、至少約16周、至少 約20周或至少約25周。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明方法包括給予對(duì)象一個(gè)劑量的0. 03mg/kgIL-5R 結(jié)合分子，該結(jié)合分子包含(a)特異性結(jié)合IL-5R的區(qū)域和(b)免疫球蛋白Fc區(qū)，其中給 予該IL-5R結(jié)合分子導(dǎo)致消耗該對(duì)象循環(huán)中至少約99%嗜酸性粒細(xì)胞，給藥后24小時(shí)完成 消耗，該消耗作用在給藥后持續(xù)至少約28天。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明方法包括給予對(duì)象一個(gè)劑量的0. lmg/kg IL-5R結(jié) 合分子，該結(jié)合分子包含(a)特異性結(jié)合IL-5R的區(qū)域和(b)免疫球蛋白Fc區(qū)，其中給予 該IL-5R結(jié)合分子導(dǎo)致消耗該對(duì)象循環(huán)中至少約99%嗜酸性粒細(xì)胞，給藥后24小時(shí)完成消 耗，該消耗作用在給藥后持續(xù)至少約84天。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子包括融合蛋白。在某些實(shí)施方式中， 該融合蛋白包含特異性結(jié)合IL-5R的多肽區(qū)，還包含免疫球蛋白Fc區(qū)。特異性結(jié)合IL-5R 的多肽區(qū)的非限制性例子可參見(jiàn)美國(guó)專利7，109，299和5，677，280，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 2006/0014680A1。在其它實(shí)施方式中，特異性結(jié)合IL-5R的多肽區(qū)的是人IL-5 (參見(jiàn)例如， Tanabi 等，Journal of Biological Chemistry, 1987，第 262 卷，第 34 期，第 16580-16584 頁(yè))，或者其片段、衍生物或變體(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)6，465，616)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子包括抗體。本發(fā)明抗體包括但不限于 單克隆抗體、合成抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人抗體、人源化抗體、嵌合抗 體、單鏈Fv(ScFv)(包括雙特異性scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab，)片段、二硫鍵連接的 Fv(sdFv)和它們的表位結(jié)合片段。具體說(shuō)，本發(fā)明抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白 分子的免疫活性部分，即含有能特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。本發(fā)明免疫球蛋 白分子可以是任何類型(如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、類(如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl和IgA2)或小類的免疫球蛋白分子。本發(fā)明的有用抗體可來(lái)自任何動(dòng)物，包括鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物(例如但不限于，人、 鼠、驢、綿羊、兔，山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞)。在特定實(shí)施方式中，所述抗體是人或人源化單 克隆抗體。本發(fā)明所用抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性或更多特異性的抗體。多 特異性抗體可以特異性結(jié)合于多肽的不同表位，或者可以特異性結(jié)合于多肽和異源表位， 如 異源多肽或固體支持物材料。參見(jiàn)例如，國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360 和 WO 92/05793 ；Tutt，等，1991，J. Immunol. 147 :60_69 ；美國(guó)專利號(hào) 4，474，893、 4，714，681,4, 925，648,5, 573，920 和 5，601，819 ；和 Kostelny 等，1992，J. Immunol. 148 1547-1553。
本發(fā)明所用抗體可以是單鏈抗體。單鏈抗體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建參見(jiàn)Marasco等，1993，Proc Natl Acad Sci 90 :7889-7893。本發(fā)明抗體的非限制性例子可參見(jiàn)美國(guó)專利7，179,464,6, 538, 111,6,018,032 和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2004/0136996Α1、2005/0226867Α1。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子包括抗體。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明 IL-5R結(jié)合分子是包含SEQ ID NO :1_4中任何一個(gè)氨基酸序列的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中， 本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是包含氨基酸序列SEQ ID NO :1和3的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中， 本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是包含氨基酸序列SEQ ID NO :2和4的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合表位與MEDI-563相同 的抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述抗體是MEDI-563。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明 IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合表位與MEDI-563相同的抗體，但該抗體不是MEDI-563。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合包含SEQ IDNO 5殘基 1-102的表位的抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述抗體是MEDI-563。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合包含SEQ ID NO :5殘基1-102的表位的抗體，但該抗 體不是MEDI-563。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合包含SEQ IDNO 5殘基 40-67的表位的抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述抗體是MEDI-563。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合包含SEQ ID NO 5殘基40-67的表位的抗體，但該抗 體不是MEDI-563。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合包含SEQ IDNO 5殘基 52-67的表位的抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述抗體是MEDI-563。在另一實(shí)施方式中， 本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合包含SEQ ID NO 5殘基52-67的表位的抗體，但該抗 體不是MEDI-563。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合包含SEQ IDNO 5殘基 61的表位的抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述抗體是MEDI-563。在另一實(shí)施方式中，本 發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合包含SEQ ID NO :5殘基61的表位的抗體，但該抗體不是 MEDI-563。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合第一抗原但不特異性結(jié) 合第二抗原的抗體，所述第一抗原包含SEQ ID NO :5殘基1-102，所述第二抗原包含SEQ ID NO 5殘基1-102的變體，其中所述變體包含I61K取代。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述抗體 是MEDI-563。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合第一抗原但不 特異性結(jié)合第二抗原的抗體，所述第一抗原包含SEQ ID NO :5殘基1-102，所述第二抗原包 含SEQ ID NO :5殘基1-102的變體，其中所述變體包含I61K取代，但該抗體不是MEDI-563。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合第一抗原但不特異性結(jié) 合第二抗原的抗體，所述第一抗原包含SEQ ID NO :5殘基40-67，所述第二抗原包含SEQ ID NO 5殘基40-67的變體，其中所述變體包含I61K取代。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述抗體 是MEDI-563。在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合第一抗原但不 特異性結(jié)合第二抗原的抗體，所述第一抗原包含SEQ ID NO :5殘基40-67，所述第二抗原包 含SEQ ID NO :5殘基40-67的變體，其中所述變體包含I61K取代，但該抗體不是MEDI-563。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性結(jié)合人IL-5Ra (SEQ ID NO 5)但不特異性結(jié)合包含I61K取代的人IL-5Ra突變體(SEQ IDNO 5)的抗體。在一個(gè)具 體實(shí)施方式中，所述抗體是MEDI-563。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明IL-5R結(jié)合分子是特異性 結(jié)合人IL-5Ra (SEQ ID NO :5)但不特異性結(jié)合包含I61K取代的人IL-5Rα突變體(SEQ ID NO 5)的抗體，但該抗體不是MEDI-563。本發(fā)明提供效應(yīng)功能增強(qiáng)的IL-5R結(jié)合分子。提高效應(yīng)功能的方法的非限 制性例子可參見(jiàn)美國(guó)專利5，624，821、6，602，684、7，029，872 ；美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 2006/0067930AU2005/0272128AU2005/0079605AU2005/0123546AU2004/0072290AU 2006/0257399A1,2004/0261148A1,2007/0092521,2006/0040325A1,和 2006/0039904A1 ； 和國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) WO 04/029207、W003011878、W005044859、WO 06071856、和 W006071280。本領(lǐng)域了解工程改造抗體Fc區(qū)以改變效應(yīng)功能的方法(例如，Koenig等的美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)20040185045和PCT公開(kāi)號(hào)WO 2004/016750，它們描述了改變Fc區(qū)以便與 FC y RIIA結(jié)合親和力相比，提高與Fc y RIIB的結(jié)合親和力；也參見(jiàn)Armour等的PCT公開(kāi) 號(hào)WO 99/58572、Idusogie等的W099/51642和Deo等的美國(guó)6，395，272 ；通過(guò)引用將其全 文納入本文)。本領(lǐng)域也了解修飾Fc區(qū)以降低與FcyRIIB的結(jié)合親和力的方法(例如， Ravetch等的美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)20010036459和PCT公開(kāi)號(hào)WO 01/79299，通過(guò)引用將其全文 納入本文)。也記載過(guò)具有與野生型Fc區(qū)相比，與Fc γ RIIIA和/或Fc γ RIIA結(jié)合親和力 提高的變異Fc區(qū)的修飾抗體(如，Stavenhagen等的PCT公開(kāi)號(hào)WO 2004/063351，通過(guò)引 用將其全文納入本文)。也可通過(guò)產(chǎn)生糖基化模式改變的抗體來(lái)調(diào)節(jié)抗體的效應(yīng)功能。例如，可制備糖基 化類型改變的抗體，例如巖藻糖殘基減少的非巖藻糖基化/低巖藻糖基化抗體或截開(kāi)型 GIcNAC結(jié)構(gòu)增加的抗體。已證明，這類改變的糖基化模式能提高抗體的ADCC能力。可通 過(guò)例如在糖基化機(jī)器改變的宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)這類糖修飾。本領(lǐng)域已經(jīng)描述過(guò) 糖基化機(jī)器改變的細(xì)胞，它們可用作表達(dá)本發(fā)明重組抗體，從而產(chǎn)生糖基化改變的抗體的 宿主細(xì)胞。例如，Hanai等的EP 1，176，195記載了具有功能破壞的FUT8基因(編碼巖藻 糖基轉(zhuǎn)移酶)的細(xì)胞系，以使該細(xì)胞系表達(dá)的抗體具有低巖藻糖基化水平。Presta的PCT 公開(kāi)WO 03/035835記載了將巖藻糖連接于Asn (297)連接糖的能力降低的變異CHO細(xì)胞 系、Lecl3細(xì)胞，這也導(dǎo)致該宿主細(xì)胞表達(dá)的抗體的低巖藻糖基化水平(也參見(jiàn)Shields， R. L.等(2002) J. Biol. Chem. 277 :26733_26740)。Umana 等的 PCT 公開(kāi) WO 99/54342 記 載了經(jīng)工程改造表達(dá)糖蛋白修飾性糖基轉(zhuǎn)移酶(如β (1，4)-Ν-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶 III(GnTIII))的細(xì)胞系，使該工程改造細(xì)胞系表達(dá)的抗體的截開(kāi)型GIcNAc結(jié)構(gòu)增加，導(dǎo)致 該抗體的 ADCC 活性提高(也參見(jiàn) Umana 等(1999) Nat. Biotech. 17 176-180)。本領(lǐng)域已知產(chǎn)生糖形改變的抗體的方法，包括但不限于Umana等，1999，Nat. Biotechnol 17:176-180 ；Davies ^,20017 Biotechnol Bioeng74 288-294 ；Shields ^,2002, J Biol Chem 277 26733-26740 ；Shinkawa ^,2003, J Biol Chem 278 3466-3473 ；美國(guó)專利號(hào)6，602，684 ；美國(guó)序列號(hào)10/277，370 ；美國(guó)序列號(hào)10/113,929 ； PCT WO 00/61739A1 ；PCT W001/292246A1 ；PCT WO 02/311140A1 ；PCT WO 02/30954A1 所 述的方法；Potillegent 技術(shù)(新澤西州普林斯頓的波娃公司(Biowa，Inc. Princeton,N.J.)) ；GlycoMAb 糖基化工程技術(shù)(瑞士蘇黎世的GLYCART生物技術(shù)公司(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland))。參見(jiàn)例如 W000061739 ；EA01229125 ；US 20030115614 ；Okazaki等，2004，JMB，336 :1239_49。也可通過(guò)翻譯后去除巖藻糖(例如，用
巖藻糖苷酶)制備巖藻糖基化模式改變的抗體。本發(fā)明提供體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)的特異性結(jié)合IL-5R的抗體和抗體片段。具體說(shuō)，本 發(fā)明提供的抗體和抗體片段在哺乳動(dòng)物(例如但不限于人)體內(nèi)的半衰期大于3天、大于7 天、大于10天、大于15天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于 2個(gè)月，大于3個(gè)月，大于4個(gè)月或大于5個(gè)月。為了延長(zhǎng)抗體(例如但不限于，單克隆抗體和單鏈抗體)或抗體片段(例如但不 限于Fab片段)的體內(nèi)血清循環(huán)時(shí)間，例如，可利用或不利用多功能接頭通過(guò)抗體的N或C 末端位點(diǎn)特異性與PEG結(jié)合或通過(guò)賴氨酸殘基上的ε _氨基將惰性多聚物分子如高分子量 聚乙二醇(PEG)與抗體(包括其抗體片段)連接?？衫脤?dǎo)致生物活性損失最小的線型或 分支聚合物衍生化。通過(guò)SDS-PAGE和質(zhì)譜密切監(jiān)測(cè)偶聯(lián)程度，以確保PEG分子適當(dāng)?shù)嘏悸?lián) 于所述抗體。可通過(guò)大小排阻或離子交換層析將未反應(yīng)的PEG與抗體-PEG偶聯(lián)物分離開(kāi)。 可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如本文所述的免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PEG-衍生抗體(包括其 抗體片段)的結(jié)合活性及體內(nèi)功效。也可通過(guò)在IgG恒定區(qū)或其FcRn結(jié)合片段(例如Fc或鉸鏈-Fc區(qū)片段)中引入 一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(即取代、插入或缺失)，產(chǎn)生體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)的抗體。參見(jiàn)例如，國(guó) 際公開(kāi)號(hào)WO 98/23289 ；國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 97/34631 ；和美國(guó)專利號(hào)6，277，375，通過(guò)引用將其 全文納入本文。另外，可將抗體(包括其抗體片段)偶聯(lián)于清蛋白，以制備體內(nèi)更穩(wěn)定或體內(nèi) 半衰期更長(zhǎng)的抗體(包括其抗體片段)。本領(lǐng)域熟知這些技術(shù)，參見(jiàn)例如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137 ；和歐洲專利號(hào)EP 413，622，通過(guò)引用將所有這些 文獻(xiàn)納入本文。本發(fā)明提供特異性結(jié)合IL-5R的IL-5R結(jié)合分子，其中該結(jié)合分子重組融合或化 學(xué)偶聯(lián)(包括共價(jià)和非共價(jià)偶聯(lián))于異源蛋白質(zhì)或多肽(或至少10、至少20、至少30、至 少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個(gè)氨基酸的多肽片段)，以產(chǎn) 生融合蛋白。具體說(shuō)，本發(fā)明提供含有本文所述抗體的抗原結(jié)合片段(例如但不限于Fab 片段、Fd片段、Fv片段、F(ab) 2片段、VH區(qū)、VH CDR、VL區(qū)或VL CDR)和異源蛋白質(zhì)、多 肽或肽的融合蛋白的制劑。本領(lǐng)域已知將蛋白質(zhì)、多肽、肽與抗體(包括其抗體片段)融 合或偶聯(lián)的方法。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5，336，603,5, 622，929,5, 359，046,5, 349，053、 5，447，851 和 5，112，946 ；歐洲專利號(hào) EP307, 434 和 EP 367，166 ；國(guó)際公開(kāi)號(hào) WO 96/04388 和 WO 91/06570 ；Ashkenazi 等，1991，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88 10535-10539 ；Zheng 等，1995，J. Immunol. 154 :5590_5600 ；禾口 Vil 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 11337-11341 (所述參考文獻(xiàn)通過(guò)引用全文納入本文)?？赏ㄟ^(guò)基因改組、基序改組、外顯子 改組和/或密碼子改組(總稱為“DNA改組”) 的技術(shù)產(chǎn)生其它融合蛋白?？墒褂肈NA改組改變本發(fā)明抗體或其片段(例如但不限于， 更高親合力、更低解離率的抗體或其片段)。通常參見(jiàn)美國(guó)專利5，605，793 ；5, 811，238 ； 5，830，721 ；5，834，252 ；禾口 5，837，458 ；Patten 等，1997，Curr. Opinion Biotechnol.，8 724-33 ；Harayama,1998, TrendsBiotechnol. 16(2) 76-82 ；Hansson等，1999，J.Mol. Biol.，287 265-76 ；和 Lorenzo 和 Blasco, 1998，Biotechniques 24 (2) :308_313 (這些專 利和發(fā)表物各自通過(guò)引用納入本文)?？赏ㄟ^(guò)易錯(cuò)PCR、隨機(jī)核苷酸插入或其它方法隨機(jī) 誘變，然后進(jìn)行重組，從而改變抗體(包括其抗體片段)或編碼抗體或其片段。編碼抗體 (包括其抗體片段)的多核苷酸可與一種或多種異源分子的一個(gè)或多個(gè)組件、基序、區(qū)段、 部分、結(jié)構(gòu)域、片段等重組。而且，可將抗體(包括其抗體片段)與標(biāo)記序列如肽融合，以便純化。標(biāo)記氨 基酸序列可以是六組氨酸肽，例如PQE載體(凱杰公司(QIAGEN，Inc.)，伊頓大街(Eton Avenue)9259號(hào)，查茨沃斯(Chatsworth)，CA，91311)提供的標(biāo)簽等，其中許多標(biāo)記可購(gòu)得。 如Gentz等，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 :821_824所述，六組氨酸提供了方便的融合 蛋白的純化方法。用于純化的其它肽標(biāo)簽包括但不限于血凝素(“HA”)標(biāo)簽，它對(duì)應(yīng)于 源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，1984，Cell 37:767)以及“flag”標(biāo)簽。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體或其片段偶聯(lián)于診斷或檢測(cè)試劑。此類抗體可作 為如測(cè)定特定療法的效果的臨床測(cè)試步驟的一部分，用于監(jiān)視或預(yù)測(cè)疾病或失調(diào)(例如但 不限于，自身免疫病)的發(fā)作、發(fā)展、進(jìn)展和/或嚴(yán)重性。可通過(guò)將該抗體偶聯(lián)于可檢測(cè)物質(zhì) 進(jìn)行這類診斷和檢測(cè)所述可檢測(cè)物質(zhì)包括但不限于各種酶，例如但不限于辣根過(guò)氧化 物酶、堿性磷酸酶、β —半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；輔基，例如但不限于鏈霉親和素/生 物素和親和素/生物素；熒光物質(zhì)，例如但不限于傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、羅丹 明、二氯三嗪基胺熒光素、丹酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)，例如但不限于，魯米諾；生物發(fā)光 物質(zhì)，例如但不限于熒光素酶、螢光素和發(fā)光蛋白；放射性物質(zhì)，例如但不限于碘(1311、1251、 123I 和 121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115Ιη、113Ιη、112Ιη 和 111In)和锝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵 (6W7Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y、47SC、186Re、188Re、142Pr、1(l5Rh、97RU、68Ge、57CO、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn 和117Sn ；采用各種正電子發(fā)射層析成像的正電子發(fā)射金屬以及無(wú)放射性(noradioactive) 順磁金屬離子?；蛘?，抗體可偶聯(lián)于第二抗體，形成異源抗體偶聯(lián)物，如Segal在美國(guó)專利號(hào) 4，676，980中所述，通過(guò)引用將其全文納入本文。選擇與感興趣的抗原(如IL-5R)或其片段偶聯(lián)的治療部分或藥物以達(dá)到對(duì)特定 疾病或失調(diào)所需的預(yù)防或治療效果，所述特定疾病或失調(diào)是(例如)對(duì)象中與干擾素α多 肽表達(dá)和/或活性異常相關(guān)或以其為特征的疾病或失調(diào)、與干擾素α受體或其一個(gè)或多個(gè) 亞基表達(dá)和/或活性異常相關(guān)或以其為特征的疾病或失調(diào)、自身免疫病、自身免疫病、移植 物排斥、移植物抗宿主病或其一種或多種癥狀。當(dāng)臨床醫(yī)生或其它醫(yī)學(xué)專業(yè)人員決定將何 種物質(zhì)偶聯(lián)于感興趣抗體，如特異性結(jié)合干擾素α多肽或其片段的抗體時(shí)，應(yīng)考慮如下因 素疾病的特性、疾病的嚴(yán)重程度和對(duì)象的總體狀況?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知任何合成抗體的方法，具體是化學(xué)合成或重組表達(dá)技術(shù)產(chǎn)生特 異性結(jié)合抗原的抗體(包括其抗體片段)(參見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)2007/0014724Α1)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的各種方法產(chǎn)生某抗原的特異性多克隆抗體。例如，可將人 抗原給予各種宿主動(dòng)物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以誘導(dǎo)產(chǎn)生含有該人抗原特異性 多克隆抗體的血清。可根據(jù)宿主的種類采用各種佐劑提高免疫應(yīng)答，這些佐劑包括但不限于弗氏佐劑(完全或不完全)、礦物質(zhì)凝膠，如氫氧化鋁，表面活性劑，如溶血卵磷脂、普流羅尼多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔槭血藍(lán)蛋白、二硝基酚和可能有用的人佐劑，如 BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(corynebacterium parvum)。這些佐劑也是本領(lǐng)域熟知的?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備單克隆抗體，這些技術(shù)包括使用雜交瘤、重組 技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)，或它們的組合。例如，可采用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體，該技術(shù) 是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)例如Harlow等，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies =A Laboratory Manual),(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第 2 版， 1988) ；Hammerling等，刊于《單克隆抗體和T細(xì)胞雜交瘤》(Monoclonal Antibodies and T-CelIHybridomas) 563-681 (艾思威爾出版社(Elsevier)，紐約，1981 以及 Harlow 等，《使 用抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Using Antibodies =A laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社 (1999)，其全文通過(guò)引用納入本文。本文所用術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”不限于通過(guò)雜交瘤技術(shù)產(chǎn) 生的抗體。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指衍生自單個(gè)克隆，包括真核、原核或噬菌體克隆的抗體，并 不限定其產(chǎn)生方法。用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生和篩選特定抗體的方法是常規(guī)方法，并且為本領(lǐng)域所熟知。簡(jiǎn) 要說(shuō)，可用非鼠抗原免疫小鼠，一旦檢測(cè)到免疫應(yīng)答后，例如在小鼠血清中檢測(cè)到該抗原的 特異性抗體后，就收獲小鼠脾，分離脾細(xì)胞。然后，通過(guò)熟知技術(shù)將脾細(xì)胞融合于任何合適 的雜交瘤細(xì)胞，例如購(gòu)自ATCC的細(xì)胞系SP20的細(xì)胞。選擇雜交瘤，通過(guò)有限稀釋克隆。此 夕卜，可利用RIMMS(多位點(diǎn)重復(fù)免疫)技術(shù)免疫動(dòng)物(Kilpatrack等，1997，Hybridoma 16 381-9，通過(guò)引用全文納入本文)。然后，用本領(lǐng)域已知方法測(cè)定雜交瘤克隆中分泌能夠結(jié)合 本發(fā)明多肽的抗體的細(xì)胞。可通過(guò)用陽(yáng)性雜交瘤克隆免疫小鼠產(chǎn)生通常含有大量抗體的腹 水。本發(fā)明提供產(chǎn)生單克隆抗體的方法以及該方法產(chǎn)生的抗體，所述方法包括培養(yǎng)分 泌本發(fā)明抗體的雜交瘤細(xì)胞，其中通過(guò)將非鼠抗原免疫小鼠中分離的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞 融合產(chǎn)生雜交瘤，然后篩選融合得到的雜交瘤選擇分泌能夠結(jié)合該抗原的抗體的雜交瘤克 隆?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)產(chǎn)生特異性識(shí)別特定表位的抗體片段。例 如，可利用諸如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab’)2片段)等酶對(duì)免 疫球蛋白分子進(jìn)行蛋白酶水解切割，產(chǎn)生本發(fā)明Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段含有 可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CHl結(jié)構(gòu)域。另外，也可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示法 產(chǎn)生本發(fā)明抗體。在噬菌體展示法中，功能性抗體結(jié)構(gòu)域展示在攜帶編碼它們的多核苷酸序列的噬 菌體顆粒表面上。具體說(shuō)，由動(dòng)物cDNA文庫(kù)(如人或鼠患病組織的cDNA文庫(kù))擴(kuò)增編碼 VH和VL區(qū)的DNA序列。通過(guò)PCR將編碼VH和VL區(qū)的DNA與scFv接頭重組在一起，克隆 到噬菌粒載體中。將該載體電穿孔到大腸桿菌中，用輔助噬菌體感染該大腸桿菌。用于這 些方法的噬菌體一般是絲狀噬菌體，包括fd和M13，通常將VH和VL區(qū)重組融合于噬菌體 基因III或基因VIII。可以利用抗原，如標(biāo)記抗原或者結(jié)合或捕獲在固體表面或珠上的 抗原來(lái)選擇或鑒定表達(dá)能夠結(jié)合特定抗原的抗原結(jié)合域的噬菌體?？捎糜谥苽浔景l(fā)明抗 體的噬菌體展示法的例子包括 Brinkman 等，1995，J. Immunol. Methods 182 41-50 ；Ames 等，1995，J. Immunol. Methods 184 177-186 ；Kettleborough 等，1994，Eur. J. Immunol. 24 952-958 ；Persic φ, 1997, Gene 187 9-18 ；Burton φ, 1994, Advances in Immunology57 191-280 ；國(guó)際申請(qǐng)?zhí)?PCT/GB91/01134 ；國(guó)際公開(kāi)號(hào) W090/02809、W091/10737、W092/01047、 W092/18619、W093/11236、W095/15982、W095/20401 和 W097/13844 ；以及美國(guó)專利 號(hào) 5，698，426,5, 223，409,5, 403，484,5, 580，717,5, 427，908,5, 750，753,5, 821，047、 5，571，698、5，427，908、5，516，637、5，780，225、5，658，727、5，733，743、5，969，108、 6，33，187,5, 824，520和5，702，892所述的方法，上述文獻(xiàn)全文通過(guò)引用納入本文。如上述參考文獻(xiàn)所述，噬菌體選擇后，可分離噬菌體的抗體編碼區(qū)，并用于產(chǎn)生完 整抗體，包括人抗體或任何其它所需的抗原結(jié)合片段，并在任何所需宿主，包括哺乳動(dòng)物細(xì) 胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌中表達(dá)，如下所述。也可采用通過(guò)本領(lǐng)域已知方法，例 如 PCT
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