專利名稱：：具有抗真菌活性的包含亞香茅的藥物組合物、獲得亞香茅的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及亞香茅提取物用于制備具有抗真菌活性的藥物組合物的應(yīng)用，用于獲得所述提取物的方法，以及所述提取物作為用于治療真菌病的所述組合物的活性組分的用途。本發(fā)明還涉及包含植物提取物的組合物，所述植物提取物得自具有抗真菌活性的禾本科家族的植物的地上部分。優(yōu)選地，所述植物提取物得自植物的葉子。更優(yōu)選地，使用的植物是亞香茅(Cymbopogo麗rdus(L)Rendle)。本發(fā)明還涉及組合物用于治療真菌病(甲癬、皮膚真菌病和女性陰道念珠菌病)的用途，所述組合物包含得自植物亞香茅的植物部分的植物提取物和/或分離的物質(zhì)。現(xiàn)有技術(shù)皮膚真菌病是可以影響所有人群的損害皮膚和附屬物例如手指甲和腳趾甲和毛發(fā)的最常見疾病。盡管這些病癥在涉及發(fā)病率和死亡率方面不是重要的，但是它們影響患者的生活質(zhì)量。由于傳染性的性質(zhì)，它們具有重要的臨床后果，尤其是反映在自尊、虛榮和社會(huì)歧視方面的審美偏見。重要的是要強(qiáng)調(diào)這些疾病的發(fā)病率的顯著增加似乎是世界性的傾向，這些真菌病的慢性病性質(zhì)和治療難度也是加重的因素。傳統(tǒng)地，皮膚真菌病的剌激物是皮膚真菌屬于毛癬菌屬(Trichophytonspp)、小孢霉屬(Microsporumspp)禾口表皮癬菌屬(Epidermophytomfloccos皿)三個(gè)屬的真菌。然而，念珠菌屬、毛孢子菌屬、和地霉屬的酵母菌以及非皮膚真菌的絲狀真菌如鐮刀菌屬、柱霉屬和帚霉屬已經(jīng)有一定頻率的確診。甲癬(0M)是損害人類手指甲和腳趾甲的最常見疾病并且可以無區(qū)別地影響每個(gè)人。由于0M的傳染性性質(zhì)，0M具有重要的臨床后果，尤其是反映在自尊、虛榮和社會(huì)歧視方面的審美偏見，是就診甚至是丟掉工作的重要原因。它們代表了指甲疾病的20%，并且是在整個(gè)世界上是最常見的甲病。大部分作者診斷皮膚真菌作為最常見的病原體(80-90%)，隨后是酵母菌(5_17%)，最后是非皮膚真菌絲狀真菌(2-12%)。由于真菌保持局限于指甲的最外層，一些作者推薦局部治療作為首選。局部治療適用于局部感染和幾乎沒有擴(kuò)展，在無效的情況中，必須開全身給藥的藥物的處方。然而，全身治療對(duì)于尤其慢性感染是更有效的。盡管在新的抗真菌藥的開發(fā)方面的不可否認(rèn)的進(jìn)步，但是甲癬的治療仍是一個(gè)問題。具有大相關(guān)性的真菌來源的另一種感染是女性陰道念珠菌病(CVV)，又稱為陰道念珠菌病，是主要損害外陰和陰道的生殖粘液的炎癥。最常見的病原體是白色念珠菌(存在二態(tài)特征的一種酵母菌)且可以在20%的健康的和無癥狀的婦女體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。作為CVV特征的主要癥狀是發(fā)癢和外陰-陰道紅斑，奶酪外觀的白色和濃稠排出物、排尿灼燒(disury)、性關(guān)系疼痛(disparunia)、外陰區(qū)域的水腫和裂口(Garcia&Svidzinski，32002)。這種感染的診斷可以通過特征性癥狀、通過陰道pH(正常范圍是4-4.5)、通過分泌物的外觀和氣味、和通過酵母菌和菌絲的微生物學(xué)檢查鑒定來確定(Daniel&Robinson,2005)。它是在全世界影響數(shù)千人的影響育齡婦女的主要婦科問題之一，在最近幾年的發(fā)病率似乎是有所增加。據(jù)估計(jì)，接近75%的成年婦女在其成年階段出現(xiàn)至少一次真菌性外陰_陰道炎的急性發(fā)作，40-50%經(jīng)歷過新的發(fā)作并且5%變?yōu)閺?fù)發(fā)性的(CVVR)。CVV的80-90%的情況是由于白色念珠菌屬，10-20%是由于被稱為非白色念珠菌(C.non-albicans)的其它物種(熱帶念珠菌(C.tropicalis)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌(C.krusei)、近平滑念珠菌(C.par即silosis))。然而，已經(jīng)觀察到在一些種群中非白色念珠菌酵母菌的分離頻率有所增加。主要的問題在于這些其它物種通常傾向于更耐受抗真菌劑這一事實(shí)。近年來，病原體對(duì)于通常的治療劑的耐藥性有所增加。目前，在甲癬的經(jīng)典治療方法中有藥物例如特比萘芬和唑類衍生物可用，但是成本過高，轉(zhuǎn)移了治療選擇且成功率有限。CVV是婦科學(xué)日常實(shí)踐中最常見的診斷并且最近幾年有所增加，然而，其治療仍是醫(yī)生和患者所擔(dān)憂的，主要在于對(duì)癥狀的作用和復(fù)發(fā)。CVV的治療取決于與藥物、宿主和顯然的環(huán)境因素有關(guān)的變量?？捎玫闹委煱ň植坑盟幬?nistatine和咪康唑)和口服藥物(主要是唑類衍生物，例如氟康唑、伊曲康唑和酮康唑(cetoconazol))。盡管近幾十年在開發(fā)用于治療CVV的新的抗真菌劑方面有所進(jìn)展，但是其仍是一個(gè)重要的問題。目前可用最佳選擇是有限的且對(duì)于患者是高成本的治療。在從天然產(chǎn)物尋找具有生物學(xué)活性的化合物方面進(jìn)行了無數(shù)的研究。已經(jīng)進(jìn)行了許多研究來評(píng)價(jià)得自藥用植物的提取物和精油的抗微生物活性的發(fā)展。許多植物對(duì)不同的病原體有抗性，并且這種抗性可能與天然產(chǎn)生的抑制真菌的化合物的存在有關(guān)。針對(duì)植物藥療法的治療替換物的找尋順便了解了要使用的植物藥物的知識(shí)、優(yōu)化了提取、得到了適用于治療且具有在治療中獲得效力的所需性質(zhì)的藥物形式。與這些要求類似，仍需要驗(yàn)證分析技術(shù)和使植物提取標(biāo)準(zhǔn)化。在全世界，植物來源的治療方法有巨大的普及和流行，一般說來，植物來源的治療方法的巨大普及和流行負(fù)擔(dān)不那么繁重并且顯示為保健服務(wù)的補(bǔ)充。在求助于其它更具侵蝕性的藥物之前，它們可以是多種疾病的首選。藥用植物產(chǎn)生具有不計(jì)其數(shù)性能的多種組分，其能抑制病原體的生長(zhǎng)或殺死它們，為此，它們被認(rèn)為是開發(fā)新的抗微生物藥的最佳選擇。亞香茅(Cymbopogonnardus(L.)Rendle)通俗地被稱為香茅，是禾本科家族的植物，在熱帶或亞熱帶氣候中常見，其最早出現(xiàn)在錫蘭和印度南部，并且其精油富含茅香油、異胡薄荷醇和香葉醇，通常用作驅(qū)蟲劑和消毒劑。亞香茅對(duì)昆蟲的拒斥活性已經(jīng)被廣泛公開，與精油中的茅香油和異胡薄荷醇的存在有關(guān)。最近，證明了與D-反式-aletrine有關(guān)的亞香茅對(duì)埃及伊蚊的作用，在使用0.1%濃度的揮發(fā)油時(shí)，昆蟲死亡率接近88.9%?，F(xiàn)有技術(shù)中單獨(dú)地或結(jié)合地涉及亞香茅的殺蟲活性的實(shí)例可以在巴西專利文獻(xiàn)PI9106328-0中找到，其涉及噴霧劑或洗劑形式的驅(qū)蟲劑，包含鵬品醇(turpeniol)、茅香油、rodenol提取物和香葉醇，各成分協(xié)同有效地對(duì)抗傳播萊姆病的扁虱以及螫剌昆蟲和錐蝽屬昆蟲(卡格氏昆蟲(Chagasinsects))。同樣地，PI9610350-7涉及包含mentanodiol和茅香油、香葉醇、鵬品醇和玫瑰醇(rodinol)的至少兩種所選組分的驅(qū)蟲混合物，用于抵制蚊子和扁虱。另外，使用禾本科家族的植物進(jìn)行的初步研究已經(jīng)證明了針對(duì)各種人類感染真菌的重要的殺菌活性。已經(jīng)由多位作者報(bào)告了亞香茅或香茅屬的其它物種的精油對(duì)醫(yī)學(xué)上感興趣的真菌的體外抗真菌活性。然而，這種研究沒有報(bào)告關(guān)于在亞香茅提取物中確定相似活性、以及植物藥療法組合物的存在、以及它們用于治療甲癬、女性外陰陰道念珠菌病和滴蟲病的用途的證明。這種提取物的用途會(huì)大大促進(jìn)獲得植物藥療法藥物的進(jìn)程，顯著降低所述產(chǎn)品的成本，且有助于將該活性成分并入到不同的藥物形式中。因此，得自天然產(chǎn)物(主要是植物來源的)的生物學(xué)活性的新化合物的找尋變?yōu)樽罡信d趣的目標(biāo)是由于對(duì)有效對(duì)抗多種疾病的新藥的需要。與茅香油的防寄生蟲活性有關(guān)，PI0106192-5要求保護(hù)基于香茅油的植物藥療法產(chǎn)品，其在概括地在治療和預(yù)防通常攻擊牛、綿羊、山羊和馬的內(nèi)和外寄生蟲方面呈現(xiàn)大的有效性。關(guān)于抗微生物活性，還已知PI9804814，其描述了口腔衛(wèi)生組合物，所述組合物包括選自以下的抗微生物劑雪松油、氯胺苯醇(cloranfenicol)、檸檬草油、香茅油、光果甘草(Glycyrrhizinglabra)的提取物、帶漿汁的baSi1iC30水果油、檸檬的basilic50油(0cim咖sp)禾口迷迭香(RosmarinusofficinaLIs)的油。PI0106903-9涉及用于治療口腔和陰道念珠菌的藥物組合物，包含1-5重量％的檸檬草(Cymbopogoncitratusst即f)(禾本科)的地上部分的水醇、醇和乙醚萃取物和/或精油，為單獨(dú)的形式或其自身的不同比例混合物或與其它天然或合成產(chǎn)品(藥物、維生素、鹽、糖等)的不同比例的混合物的形式。藥物制劑可以作為酊劑、乳劑A/0和0/A、霜?jiǎng)?、凝膠齊U、氣霧齊U、糊齊U、皂、香波和用于局部使用的類似產(chǎn)品，用于治療由真菌和細(xì)菌(特別是口腔和陰道的念珠菌)引起的感染。PI0203521-9考慮了由念珠菌屬和皮膚真菌(例如，表皮癬菌屬(Epidermophytonfloccusum)、犬小抱子菌(Microsporumcanis)禾口紅色發(fā)癱菌(trichophytonrubrum))引起的藥物組合物，其包含活性藥理學(xué)量的香茅(Cymbopogoncitratus)(檸檬草(lemongrass))的揮發(fā)油。在所述組合物中，揮發(fā)油通過汽提提取自用于蒸餾的檸檬草的葉子，含擰檬醛(60-80%v/v)、香葉烯(mircene)和香葉醇作為主要成分。專利JP7061918揭示了一種美容產(chǎn)品，包含至少一種具有強(qiáng)抗氧化作用并且能夠保持皮膚不開裂和具有輝光的提取物，所述提取物選自香根草(Vetiveriazizanoides)、印度菝葜(Hemidesmusindicus)、亞香茅(Cymbopogonnardus)、蓽撥(Piperlongum)、爪哇長(zhǎng)果胡椒(Piperchaba)、Herpestrismo皿ies、小果倒地鈴(Cardiospermumhalicacabum)、心口十青牛膽(Tinosporacordifolia)、鉤毛莢山蟲馬蟥5(Desmodiumgangeticum)、黃蘭(Micheliachampaca)禾口Melaleucaleucadendroncom。從現(xiàn)有技術(shù)還知道，提取自亞香茅的揮發(fā)油對(duì)昆蟲的拒斥活性的應(yīng)用、清潔和消毒產(chǎn)品以及關(guān)于香茅類(檸檬草)的應(yīng)用是已知的，都是關(guān)于對(duì)抗念珠菌屬(Candidaspp)和皮膚真菌(dermatofitefungi)的抗菌藥理學(xué)活性。然而，沒有一個(gè)文獻(xiàn)以前曾涉及或建議包含植物亞香茅提取物的組合物具有對(duì)抗皮膚真菌(dermatofitefungi)和對(duì)抗白色念珠菌(Candidaalbicans)的活性。因此，現(xiàn)有技術(shù)沒有描述或建議亞香茅提取物作為抗真菌劑的用途?？梢姡装_、皮膚真菌病和那些外陰陰道念珠菌病的治療仍是一個(gè)問題，盡管在新抗真菌藥的開發(fā)方面取得了不可否認(rèn)的進(jìn)步。因此，使用具有殺真菌性能的植物來源的產(chǎn)品可以帶來用于對(duì)抗甲癬、女性外陰陰道念珠菌病和皮膚真菌病的大的利益，這尚未得到研究。因此，由于亞香茅是在巴西的所有地區(qū)都容易產(chǎn)生和生長(zhǎng)的植物，對(duì)于耕種沒有特殊要求，因此，其提取物可以以相當(dāng)?shù)偷纳a(chǎn)成本得到。除此之外，其提取物的獲得顯示良好的收率并且將其并入到藥物劑型中相當(dāng)可行，為取代這種植物的葉子和莖的工業(yè)化提供了便利。本發(fā)明的生物學(xué)結(jié)果顯示，高的抗真菌活性引起試驗(yàn)微生物的死亡(殺真菌)，這是優(yōu)于市場(chǎng)上可用的大部分抗真菌劑(其大部分僅是抑制真菌的)的重要優(yōu)點(diǎn)。盡管在文獻(xiàn)中報(bào)道有通過從植物提取得到的組合物和藥物，但是沒有提及或建議具有抗真菌活性的包含亞香茅的醇和標(biāo)準(zhǔn)化提取物的植物藥療法組合物的用途、以及它們的提取方法。這種提取方法、植物藥療法組合物和它們的用途在本申請(qǐng)中予以描述且要求保護(hù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明預(yù)見了足以用于治療甲癬和女性外陰陰道念珠菌病的藥物組合物，其利用了藥理學(xué)活性量的亞香茅水醇提取物以及藥學(xué)可接受的賦形劑。本發(fā)明另外涉及得到水醇提取物、干燥提取物的方法以及禾本科家族的植物的標(biāo)準(zhǔn)化方法，特別是亞香茅的水醇提取物。本發(fā)明還涉及具有用于甲癬的抗真菌活性的組合物對(duì)抗皮膚真菌和念珠菌的用途，所述組合物包含禾本科家族的植物(更具體地為亞香茅)的地上部分的植物提取物。附圖簡(jiǎn)述為了更好地顯示本發(fā)明的范圍，提前提供在本發(fā)明中使用的植物_亞香茅以及由其得到的提取物中確定的活性和性能的各種說明性圖，其中-圖1舉例說明亞香茅提取物對(duì)皮膚真菌和酵母菌的分離物的100%抑制指數(shù)時(shí)的最低抑制濃度值(mg/ml)的分布。-圖2舉例說明能夠100%殺死皮膚真菌和酵母菌的分離物的亞香茅提取物的最小殺真菌濃度(mg/ml)。-圖3舉例說明分析亞香茅抗真菌活性的方法。發(fā)明詳述第一方面是本發(fā)明涉及包含亞香茅水醇提取物的用于治療甲癬、皮膚真菌病和念珠菌病的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以包含濃度為5-40%(p/p)的亞香茅水醇提取物。更優(yōu)選地，所述藥物組合物可以包含濃度為10-30%(p/p)的亞香茅水醇提取物。藥用賦形劑以適合于每種待治療疾病所選的藥物形式來使用。藥物組合物的液體形式使用C1-C10碳原子的水醇溶劑，諸如例如，乙醇和一縮二丙二醇。一縮二丙二醇可以以相對(duì)于亞香茅的干燥提取物為o.5:20、更優(yōu)選為i:io的比例使用，乙醇以在水中50%(v/v)的比例稀釋使用。另外，本發(fā)明還涉及禾本科植物(例如，優(yōu)選為亞香茅)的地上部分的水醇提取方法。獲得亞香茅提取物的方法從植物提取過程開始，在有機(jī)溶劑的存在下采用用于破壞植物組織的物理操作，得到禾本科家族植物的地上部分的粗植物提取物的液體提取物。為了得到提取物，優(yōu)選使用植物亞香茅的葉子，用于破壞植物部件的物理操作使用渦輪提取，使用的有機(jī)溶劑可以是包含2-6個(gè)碳原子的醇，例如乙醇、異丙醇、丁醇和戊醇。更優(yōu)選地，選擇的物理過程是渦輪提取，有機(jī)溶劑是乙醇。乙醇可以以不同的稀釋度使用，但是優(yōu)選醇以50、70和94.6%(重量/重量)使用。然后通過部分取出有機(jī)溶劑將粗的植物提取物濃縮。提取物的濃縮通過在受控的溫度和壓力下在35-55t:和減壓(真空)下進(jìn)行蒸發(fā)來進(jìn)行。優(yōu)選地，可以在充分的溫度下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器來引起所用有機(jī)溶劑的蒸發(fā)。然后將葉子的粗的植物濃縮的提取物凍干。隨后的階段包括工藝參數(shù)和殺真菌的治療活性方面的評(píng)價(jià)。通過測(cè)定最小抑制濃度(CM)和最小殺真菌濃度(CFM)測(cè)定亞香茅提取物對(duì)甲癬剌激物的體外抗真菌活性的評(píng)價(jià)。通過在漿汁的微量稀釋的方法測(cè)定最小抑制濃度(CIM)，依據(jù)由theNationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards在文件M-27A10中公布的標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)，有一些調(diào)整。在滅菌的塑料微量板(Nunclon，Delta,NuncA/S，Roskilde，Denmark)中進(jìn)行試驗(yàn)，包含以A到H標(biāo)識(shí)的八行形式組織的96個(gè)孔，每行為l-12數(shù)字編號(hào)的12個(gè)孔。每行(A-H)對(duì)應(yīng)于一個(gè)真菌的物種，其接受測(cè)定的100的接種物，每列接受在YNBG以漿汁中2倍稀釋直到1/128稀釋度的亞香茅提取物。在每個(gè)板上包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和近平滑念珠菌(ATCC22019)的參考用酵母菌。在分光光度計(jì)(Baush&Lomb)中調(diào)節(jié)接種濃度，以便對(duì)應(yīng)于在530nm波長(zhǎng)的MacFarland比例的管0.5的濁度，使得被加入到板的每個(gè)孔中的100ml這種懸浮液體積包含0.5-2.5X103UFC/ml。將如此組合的板在滅菌器中溫育，進(jìn)行日常監(jiān)控，在酵母菌的情況中在35t:溫育48小時(shí)，在皮膚真菌的情況中在環(huán)境溫度溫育七天。在對(duì)于每種真菌的充分的溫育時(shí)間之后，通過在鏡子中的反射視覺比較試驗(yàn)的讀數(shù)。CIM看作是能夠100%抑制每種真菌分離物生長(zhǎng)的亞香茅的凍干提取物的最小濃度(圖3)，參考其相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照。為了測(cè)定CFM，將在用于測(cè)定CIM的試驗(yàn)中不呈現(xiàn)生長(zhǎng)的培養(yǎng)的等分樣品轉(zhuǎn)移到Sabouraud葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SabouraudDextroseAgarmedium)，相對(duì)于不含藥物的培養(yǎng)基。預(yù)防真菌生長(zhǎng)的最小濃度看作是CFM。本發(fā)明還提供包含亞香茅水醇提取物的藥物組合物用于抑制皮膚真菌的生長(zhǎng)或使其死亡的用途，所述皮膚真菌病真菌例如毛癬菌屬(Trichophytons卯)、小孢霉屬(Microsporumspp)和表皮癬菌屬(Epidermophytomfloccosun)，以及用于抑制由酵母菌例如念珠菌屬引起的疾病的用途。藥物制劑可以作為用于局部應(yīng)用的酊劑、洗劑、凝膠劑、膏劑、霜?jiǎng)?、陰道卵形劑和片劑的形式存在，或者為用于口服使用的酊劑、顆粒劑、膠囊和片劑。為了更好地理解所要求保護(hù)的客體，隨后提供說明性實(shí)施例，不應(yīng)將其看作是對(duì)申請(qǐng)人:權(quán)利的限制。本發(fā)明的優(yōu)選用于每種真菌疾病的一種藥物組合物的實(shí)例可以包含用于甲癬酵母菌的至少1250g/ml量的亞香茅醇提取物；用于皮膚真菌的至少625yg/m1量的亞香茅醇提取物；和用于抑制陰道酵母菌(白色念珠菌)的至少625g/ml量的亞香茅醇提取物，除了賦形劑和/或稀釋劑、洗提劑和其它可接受的藥用助劑之外。亞香茅提取物的獲得實(shí)施例l.A:棺物件材料的收集在2005年5月的一個(gè)月期間在StateUniversityofMaringd(UEM)的藥用植物苗圃收集亞香茅的葉子，作為用于本發(fā)明組合物的提取物的起始原料。植物通過植物性藥材分析來確認(rèn)并且通過與質(zhì)譜偶聯(lián)的氣相色譜法證實(shí)。該物質(zhì)的干燥物在11747號(hào)UEM植物標(biāo)本室中存放。實(shí)施例1.B:植物起始原料的技術(shù)參數(shù)的表征。確定植物亞香茅(n=3)的技術(shù)參數(shù)，例如干燥失重(PS)，脫水失重(PD)，總類黃酮(flavinoids)含量(FT)，總多酚含量(PT)和揮發(fā)物油含量(0V)。結(jié)果包含在表1中。表1.由起始原料亞香茅得到的總類黃酮(FT)、總多酚(PT)、揮發(fā)物油(0V)、脫水失重(PD)和干燥失重(PS)的數(shù)值(n=3)。參數(shù)平均值scv%FT(%)0.300.00923.10PT(%)2.350.126595.38PD(%)10.570.25912.45OV(%)1.820.453124.85PS(%)30.590.12020.39實(shí)施例1.C:提取物的制備將新鮮的亞香茅葉子用壓縮空氣清理，切成小塊并使用以相對(duì)于亞香茅的干燥提取物為20%(p/p)比例的70%(p/p)醇渦輪提取15分鐘(n=3)。將提取物過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，隨后凍干。在干燥之前確定這些提取物中的技術(shù)參數(shù)，例如干燥殘留(RS)和PPH，并在干燥之后得到總類黃酮(FT)、總多酚(PT)、和抗真菌活性。結(jié)果包含在表2中。表2.得自亞香茅干葉子的提取物的pH、干燥殘留(RS)、總類黃酮(FT)和總多酚(PT)(n=3)。8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2:生物活性測(cè)定值的分析為了測(cè)定亞香茅提取物對(duì)于臨床來源的不同真菌分離物的抗真菌活性，使用前面詳述的方法。使真菌在Sabouraud葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基中在3(TC復(fù)活24/48小時(shí)，由這個(gè)生長(zhǎng)物制備在無菌鹽水中的接種物，借助Bauch&1^1^分光光度計(jì)在530咖以90+/-2%的透過率調(diào)節(jié)細(xì)胞密度。這個(gè)培養(yǎng)產(chǎn)生1.0-5.0xl06ufC/ml，由其制備在酵母菌含氮堿基葡萄糖(YeastNitrogenbaseglucose,YNBG)中的新的稀釋物，得到0.5-2.5xl03ufc/ml的所需的最終接種物。通過在漿汁的微量稀釋的方法測(cè)定最小抑菌濃度抑制濃度(CIM)，依據(jù)由theNATIONALCOMMITTEEFORCLINICALLABORATORYSTANDARDS(頂CCLS，1997)在文件M-27A中公布的標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)。在滅菌的塑料微量板(Nunclon，Delta,NuncA/S，Roskilde，Denmark)中進(jìn)行試驗(yàn)，包含以A到H標(biāo)識(shí)的八行形式組織的96個(gè)孔，每行為l-12數(shù)字編號(hào)的12個(gè)孔。每行(A-H)對(duì)應(yīng)于一個(gè)真菌的物種(測(cè)定的1001的接種物)，每列接受在YNBG以漿汁中2倍稀釋直到1/1024稀釋度(對(duì)應(yīng)于9g/ml的最終濃度)的亞香茅提取物。在每個(gè)板上包括稀釋物的陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照和近平滑念珠菌(ATCC22019)的參考用酵母菌。將由此組合的板在滅菌器中在35t:溫育72小時(shí)，進(jìn)行日常的監(jiān)控。在72小時(shí)之后，通過在鏡子中的反射進(jìn)行的視覺比較取得試驗(yàn)讀數(shù)。CIM看作是能夠100%抑制每種真菌生長(zhǎng)的亞香茅的干燥提取物的最小濃度，以其相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照作為參考。為了確定亞香茅的最小殺真菌濃度(CFM)，將沒有觀察到生長(zhǎng)的得自CIM孔的等分樣品轉(zhuǎn)移，用于與不含藥物的培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比。阻止酵母菌生長(zhǎng)的最小稀釋物看作是CFM。為了分析最小抑制濃度(CIM)和最小殺真菌濃度(CFM)的結(jié)果，對(duì)通過所選方法得到的CIM和CFM進(jìn)行分析a)數(shù)值的變化代表亞香茅提取物的CIM和CFM的上限和下限，相對(duì)于所試驗(yàn)的酵母菌的不同物種。b)CIM50和CM90分別定義為能夠抑制所試驗(yàn)樣品50%和90%生長(zhǎng)的亞香茅提取物的最小抑制濃度。c)CFM50和CFM90分別定義為能夠預(yù)防所試驗(yàn)樣品50%和90%生長(zhǎng)的亞香茅提取物的最小殺真菌濃度。實(shí)施例2.1對(duì)甲癬的酵母菌的作用使用了從能走動(dòng)的患者的手指甲和腳趾甲分離的19種酵母菌。甲癬的酵母菌原因物涵蓋了如下物種白色念珠菌(Candidaalbicans)、熱帶念珠菌，光滑念珠菌和近平滑念珠菌。結(jié)果表明，以10mg亞香茅提取物對(duì)lmg稀釋劑的比例使用的最小抑制濃度，與0.6-1.25mg/ml的總液體培養(yǎng)基不同。CFM的數(shù)值與CIM的數(shù)值相同，在所有物種中呈現(xiàn)相同的行為，如表3中所示。表3.亞香茅提取物對(duì)各種酵母菌的最小抑制濃度(CM)和最小殺真菌濃度(CFM)的以mg/ml表示的變化。酵母菌%NCIM-區(qū)間mg/mlCFM-區(qū)間mg/ml42.1080.6-1.250.6-1.255.2010.60.6近平滑念珠菌31.6060.60.6熱帶念珠菌21.1041.251.25合計(jì)跳019實(shí)施例2.2對(duì)甲癬中的皮膚真菌的作用使用了從非臥床患者的手指甲和腳趾甲分離的20種皮膚真菌。真菌原因物涵蓋了如下物禾中須毛瘤菌(Trichophytonmentagrophytes)、斷發(fā)毛瘤菌(T.tonsurans)、紅色毛癬菌(T.raubitscheki)、犬小孢子菌(Microsporumcanis)、石膏樣小孢子菌(M.gypseum)、鐵銹色小孢子菌(M.ferrugine咖)。表4中的結(jié)果顯示，亞香茅提取物對(duì)皮膚真菌有抗真菌潛力，并且CMI數(shù)值介于0.075-0.6mg/ml之間。提取物表現(xiàn)出對(duì)于所有皮膚真菌都具有殺真菌作用，CMI具有相同的變化，都是介于0.075-0.6mg/ml之間。對(duì)于亞香茅提取物最敏感的皮膚真菌是犬小孢子菌和斷發(fā)毛癬菌，為0.075mg/ml。斷發(fā)毛癬菌呈現(xiàn)最大的CIM和CFM變化系數(shù)，為0.075和0.6mg/ml。對(duì)于其它皮膚真菌的CMI幾乎沒有變化(犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和須毛癬菌)或沒有變化(鐵銹色小孢子菌和紅色毛癬菌)。表4.亞香茅提取物對(duì)各種皮膚真菌的最小抑制濃度(CM)和最小殺真菌濃度(CFM)的以mg/ml表示的變化。10皮膚真菌NMIC-區(qū)間(mg/ML)MFC-區(qū)間(mg/ML)犬小孢子菌25050.075-0.150.075—0.3鐵銹色小孢子菌5010.150.15石骨樣小孢子菌10020.15-0.30.3須毛癬菌20040.15-0.30.15-0.3紅色毛癬菌15030.30.3斷發(fā)毛褲菌合#25050.075-0.60.075-0.610020實(shí)施例2.3對(duì)于女性外陰陰道念珠菌病的酵母菌的作用使用得自能走動(dòng)患者的白色念珠菌的23種外陰陰道分離物。表5的結(jié)果表明，亞香茅提取物的最小抑制濃度為0.018-0.62mg/ml，如表6中的數(shù)據(jù)所示。CFM的數(shù)值與CIM的數(shù)值相同，對(duì)于所有的酵母菌都呈現(xiàn)相同的性能。因此，在我們?cè)囼?yàn)不同濃度對(duì)得自甲癬患者的19種酵母菌、20種皮膚真菌、和23種陰道酵母菌和l種標(biāo)準(zhǔn)樣品(ATCC)的作用以獲得提取物的CIM和CFM時(shí)，有可能記錄到0.018-1.25mg/ml范圍內(nèi)的亞香茅提取物能夠抑制所試驗(yàn)真菌的總體。表5.亞香茅提取物對(duì)白色念珠菌的陰道分離物的最小抑制濃度(CIM)和最小殺真菌濃度(CFM)的以mg/ml表示的變化。亞香茅提取物的最小抑制濃度(mg/ml)真菌^"②N5.02.51.250.620.310.150.0750.0360.0180.009M余珠麥230813173+根據(jù)生物活性的結(jié)果，證明了亞香茅提取物在體外試驗(yàn)中提供了對(duì)于在人臨床情況中分離的真菌具有優(yōu)異的性能。并且這種活性不僅是抑制真菌，而且是殺真菌，即使在低濃度仍是這樣，并且這種活性不隨所用的提取液體功能而變化。實(shí)施例3.提取的優(yōu)化使用三種乙醇稀釋物(50、70和94.6%(p/p))獲得提取物，亞香茅濃度為10、20和30%(p/p)之間。將提取物過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，隨后凍干。對(duì)它們進(jìn)行干燥殘留、抗菌評(píng)價(jià)的測(cè)定，用于優(yōu)化提取。對(duì)于隨后的提取過程，確定以下參數(shù)l^水溶液的pH值、感官特征(顏色、氣味和味道)、干燥殘留、活性物質(zhì)含量和薄層色譜分離(CCD)。干燥殘留的結(jié)果包含在表6和表7中。表6.得自亞香茅(n=12)新鮮葉子的提取物的干燥殘留(RS)的數(shù)值<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表7.供應(yīng)商與UEM苗圃(n=9)的干燥葉子的干燥殘留(RS)得到的數(shù)值<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>為了證明最好的提取，對(duì)所有提取物進(jìn)行抗真菌活性的評(píng)價(jià)。進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，不同之處在于使用新鮮和干燥的葉子和供應(yīng)商不同。結(jié)果包含在表8中。對(duì)于抗真菌活性的這種優(yōu)化方法表明，稀釋物50、70和94.6%(p/p)中的水醇提取液體足以得到亞香茅提取物并且不干涉其對(duì)于從患者分離的酵母菌和標(biāo)準(zhǔn)酵母菌(ATCC)的體外抗菌活性。對(duì)于優(yōu)選的植物濃度，在10-20%(p/p)之間得到最佳的響應(yīng)。表8.亞香茅提取物對(duì)酵母菌(白色念珠菌和熱帶念珠菌)的最小抑制濃度(CIM)和最小殺真菌濃度(CFM)的以mg/ml表示的變化。提取物酵母菌CIM-區(qū)間nig/mlCFM-區(qū)間mg/ml醇50%(p/P)10%亞#茅念珠菌屬0.039-0.1560.039-0.156醇50%(p/p)20%亞^茅念珠菌屬0.312-0.1560.312-0.156醇50%(p/p)30%亞奪,念珠菌屬0.312-1.250.312-1.25醇505Up/p)10°/植物起始原料醇70。/"p/p)10%植物起始原料念珠菌屬0.62-1.250.6-1.25念珠菌屬0.62-1.250.62-1.25醇94,6%(p/p)10%植物起始原料念珠菌屬0.62-1.250.62-1.25上述提供的實(shí)施例不用于限制用于獲得和制備本發(fā)明的水醇提取物的技術(shù)和方法，本發(fā)明的水醇提取物被用作活性抗真菌劑，用于制備藥物組合物，藥物組合物可以作為液體、凝膠、膏劑、霜?jiǎng)?、卵形劑、膠囊和片劑形式存在，用于口服和局部應(yīng)用，最好用于局部應(yīng)用，用于對(duì)抗甲癬、皮膚真菌病和念珠菌病。1權(quán)利要求具有抗真菌活性的藥物組合物，特征在于包含濃度為5-40％(p/p)的亞香茅水醇植物提取物和至少一種C1-C10碳原子的醇類有機(jī)溶劑，用于治療甲癬、皮膚真菌病和念珠菌病。2.權(quán)利要求l的藥物組合物，特征在于包含濃度優(yōu)選為10-30%(p/p)的亞香茅植物提取物。3.權(quán)利要求1和2的藥物組合物，特征在于所述醇類有機(jī)溶劑是乙醇的50%水溶液，相對(duì)于亞香茅的干燥提取物為1:IO的比例。4.權(quán)利要求1-3的藥物組合物，特征在于所述醇類有機(jī)溶劑是二醇。5.權(quán)利要求1-4的藥物組合物，特征在于所述二醇是一縮二丙二醇，相對(duì)于亞香茅的干燥提取物為0.5:20的比例。6.權(quán)利要求1-5的藥物組合物，特征在于所述醇類有機(jī)溶劑優(yōu)選是一縮二丙二醇，相對(duì)于亞香茅的干燥提取物為10:l的比例。7.權(quán)利要求1-6的藥物組合物，特征在于產(chǎn)生50%-100%的對(duì)以下皮膚真菌的真菌抑制作用犬小包子菌(Mycrosporumcanis)、鐵銹色小孢子菌(Mycrosporumferrugineum)、石膏樣小包子菌(Mycrosporumgypseum)、須毛癱菌(Trichophytummentagrophytes)、紅色毛癬菌(Trichophytumraubistscheki)禾口斷發(fā)毛癬菌(Trichosporumtonsurans)，禾口酵母菌白色念珠菌、光滑假絲酵母、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌。8.亞香茅的水醇提取物的用途，特征在于用于制備藥物組合物，用于治療甲癬、皮膚真菌病和念珠菌病。9.權(quán)利要求8的用途，特征在于產(chǎn)生50%_100%的對(duì)以下皮膚真菌的真菌抑制作用犬小抱子菌(Mycrosporumcanis)、鐵誘色小抱子菌(Mycrosporumferrugineum)、石膏樣小抱子菌(Mycrosporumgypseum)、須毛癱菌(Trichophytummentagrophytes)、紅色毛癱菌(Trichophytumraubistscheki)禾口斷發(fā)毛癬菌(Trichosporumtonsurans)，禾口酵母菌白色念珠菌、光滑假絲酵母、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌。10.從亞香茅的葉子獲得用于組合物1的水醇提取物的方法，特征在于包括以下步驟a.在包含1-6個(gè)碳原子的醇類有機(jī)溶劑的存在下破壞植物組織；b.通過在受控的溫度和壓力的條件下通過蒸發(fā)濃縮有機(jī)溶劑；禾口C.凍干。11.權(quán)利要求10的方法，特征在于使用乙醇作為包含l-6個(gè)碳原子的醇類有機(jī)溶劑。12.權(quán)利要求10和11的方法，特征在于在35-55t:的溫度范圍和在減壓(真空)下進(jìn)行有機(jī)溶劑的蒸發(fā)。全文摘要本發(fā)明涉及亞香茅提取物用于制備具有抗真菌活性的藥物組合物的應(yīng)用，用于獲得所述提取物的方法，以及所述提取物作為用于治療真菌病的所述組合物的活性組分的用途。本發(fā)明還涉及包含植物提取物的組合物，所述植物提取物得自具有抗真菌活性的禾本科家族的植物的地上部分。優(yōu)選地，所述植物提取物得自植物的葉子。更優(yōu)選地，使用的植物是亞香茅(Cymbopogonnardus(L.)Rendle)。文檔編號(hào)A61K36/88GK101730537SQ200880015450公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2008年3月14日優(yōu)先權(quán)日2007年3月16日發(fā)明者C·諾維羅,S·奧咖瓦,S·弗蘭蔻,T·斯韋德辛司基申請(qǐng)人:艾普森藥物有限公司;馬林加州立大學(xué)