專利名稱：植物乳桿菌用于增加細(xì)菌多樣性的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物乳桿菌的一種菌林用于制造增加胃腸道多樣性的 一種組合物的用途，并涉及植物乳桿菌的一種菌林用于制造預(yù)防性治療 的一種組合物的用途。
背景技術(shù)：
生物學(xué)中的一種共識(shí)是高度多樣性(不同類型的生物的變異)對(duì)總 的生態(tài)系統(tǒng)是有益的、同樣對(duì)于局部更有限的生態(tài)系統(tǒng)以及還對(duì)人類的 個(gè)體是有益的。高度的多樣性表明生態(tài)系統(tǒng)是處于健康的平衡之中。相 比之下，一個(gè)失衡的或紊亂的、或患病的生態(tài)系統(tǒng)對(duì)于少數(shù)的生物的"過 度生長"開放門戶，使這些生物控制了該系統(tǒng)并引起進(jìn)一步的紊亂以及 新的患病情況。這也適用于人類腸道的生態(tài)系統(tǒng)。
人類胃腸(GI)道的細(xì)菌菌群是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。由于細(xì)菌菌 群對(duì)營養(yǎng)、免疫系統(tǒng)的發(fā)育和不斷的調(diào)諧、以及對(duì)集群現(xiàn)象的抵抗力的 貢獻(xiàn)，其組成與活性在人類健康中發(fā)揮了重要作用。胃腸道可以被認(rèn)為 是一個(gè)從口腔延伸至肛門的一個(gè)專門化的管道。它被分成幾個(gè)明確定義 的解剖學(xué)區(qū)域，包括口腔、食道、胃、小腸(十二指腸、空腸、以及回 腸)、以及大腸(盲腸、結(jié)腸、以及直腸)。由于胃內(nèi)的酸度、內(nèi)容物短 的通過時(shí)間、膽汁和胰液的分泌，在胃以及上面的三分之二的小腸(十 二指腸以及空腸)內(nèi)的細(xì)菌濃度是相對(duì)較低的。每亳升的胃或腸的內(nèi)容 物的細(xì)菌的濃度正常是在102至104菌落形成單位(cfu)的范圍內(nèi)，在 這些區(qū)域中的典型常駐細(xì)菌的實(shí)例是鏈球菌屬以及乳桿菌屬。小腸(回 腸)的遠(yuǎn)端部分正常具有每亳升107至108 cfu的濃度，并且通常是由在 結(jié)腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)的相同類型的細(xì)菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)，即不同類別的厚壁菌門 (Firmicutes )、擬桿綱門(Bacteriodetes )、梭桿菌門(Fusobacteria )、 疾微菌門(Verrucomicrobia )、變形細(xì)菌門(Proteobacteria )、以及雙 岐桿菌屬(WANG, M" AHRNf， S" JEPPSSON， B. & MOLIN， G. (2005)。 Comparison of bacterial diversity along the human intestinal tract by direct ■ cloning ■ and sequencing of 16S rRNA genes. i^EMS*Af/cra^W五co/o狄54: 219-231)。由于更長通過時(shí)間(高達(dá)60h),在大 腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌濃度最高。已經(jīng)估計(jì)細(xì)菌的生物質(zhì)構(gòu)成了糞便固體物的 40%至55%,并且活細(xì)菌的濃度正常是每克腸的內(nèi)容物101()至10"cfu 左右。在一個(gè)未擾亂的、平衡的、以及健康的結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌多樣性也是處 在它的峰值。然而，由于極高的細(xì)菌濃度，結(jié)腸也是胃腸(GI)道最容 易受到易位損害的部分，這里活的細(xì)菌或細(xì)菌的毒性部分穿過粘膜屏障 并且進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)以及其他腸外的部位，諸如脾、肝、腎、腹膜腔、 以及血流。低細(xì)菌多樣性(LBD)增加了大腸細(xì)菌過度生長(LIBO) 以及小腸細(xì)菌過度生長(SIBO)的風(fēng)險(xiǎn)，它可以導(dǎo)致易位。
在本技術(shù)領(lǐng)域中已經(jīng)證明在克羅恩病患者胃腸道內(nèi)的多樣性很低， [Manichanh C.， Rigottier-Gois L.， Bonnaud E.， Gloux K.， Pelletier E.， Frangeul L.， Nalin R.， Jarrin C.， Chardon P" Marteau P" Roca J., and Dor6 J. (2006) Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach. Gut 55:205-211[Ott S.J. Musfeldt M.， Wenderoth D.F" Hampe J.， Brant O.， F別sch U.R., Timmis K.N.， and Schreiber S. (2004) Reduction in diversity of the colonic mucosa associated bacterial microflora in patients with active inflammatory disease. Gut 53:685-693。
已經(jīng)進(jìn)一步證明具有胃腸道內(nèi)低多樣性的新生兒具有變成過敏性 的風(fēng)險(xiǎn)更高，[Wang, M" Karlsson， C.， Olsson， C" Adlerberth， I" Wold， A.， Strachan， D.P" Martricardi, P.M., Aberg， N.， Perkin， M.R.， Tripodi, S.， Hesselmar， B.， Saalman， R.， Molin， G. & Ahrn6， S. (2008). Reduced diversity in the early fecal microbiota of infants developing atopic eczema: Low diversity in early microbiota of infants developing atopy. Journal of Allergy and Clinical Immunology 121:129-134。
已經(jīng)進(jìn)一步證明遭受在胃腸道內(nèi)"過度生長"(低多樣性)的雌性
大鼠所產(chǎn)的幼鼠具有增高的結(jié)合珠蛋白水平以及不成熟的腸，[fAk，f.，
Ahrn6， S., Molin, G" Jeppsson, B. & Westr6m, B (2008). Microbial manipulation of the rat dam changes bacterial colonization and alters properties of the gut in her offspring. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 294: 148-154]。
因此，在人類及其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)胃腸道內(nèi)的低多樣性與若干生理性擾亂的狀況之間似乎存在一種聯(lián)系。
已知使用抗生素降低了胃腸道內(nèi)的細(xì)菌多樣性。由于抗生素的使用 在世界范圍是巨大的，在技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)確實(shí)存在一種需要來提供新穎的方 法以便克服在胃腸道內(nèi)的低多樣性的這個(gè)問題，所述低多樣性影響人類 的總體健康。
另外普遍已知在發(fā)達(dá)國家中人類的生活方式引起許多不健康的障 礙以及狀況，諸如由于例如壓力與超重而引起的心血管疾病。已知患有 這些障礙以及狀況的人通常在胃腸道內(nèi)具有低細(xì)菌多樣性。
因此，在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)存在一種需求來克服生理性擾亂的狀況的問 題，這些狀況關(guān)系到個(gè)體的胃腸道內(nèi)的低多樣性或由其引起。
WO 01/11077 A2披露了診斷或治療過敏性腸綜合征以及其他由小 腸細(xì)菌過度生長(SIBO)所引起的失調(diào)的方法，它們是通過給予抗微 生物的藥劑或益生菌藥劑，例如雙岐桿菌屬、或乳桿菌屬的一個(gè)種，或 通過采用促運(yùn)動(dòng)的藥劑使腸的運(yùn)動(dòng)正常化。
發(fā)明概迷
以上提及的問題是通過本發(fā)明得以解決的。
在一方面中，本發(fā)明涉及植物乳桿菌的一種菌抹用于制造增加胃腸 道菌群多樣性的一種組合物的用途，這是通過將所述菌林給予一位個(gè) 體，其目的在于產(chǎn)生一個(gè)與安慰劑相比的增加的多樣性指數(shù)差異。
在另 一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及植物乳桿菌的一種菌林用于制造一種 組合物的用途，該組合物用于健康個(gè)體的預(yù)防性治療以防止其發(fā)展成低 細(xì)菌多樣性(LBD);用于一個(gè)患有LBD的個(gè)體的預(yù)防性治療以防止其 發(fā)展成生理性擾亂的狀況、大腸細(xì)菌的過度生長(LIBO)、或小腸細(xì)菌 的過度生長(SIBO );以及用于一個(gè)患有LIBO或SIBO的個(gè)體的預(yù)防 性治療以防止其發(fā)展成一種或多種生理性擾亂的狀況。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種用于增加胃腸道菌群多樣性的方法，這是通 過將植物乳桿菌的一種菌株給予一位個(gè)體來產(chǎn)生與安慰劑相比的一個(gè) 增加的多樣性指數(shù)差異。
本發(fā)明還涉及通過改善和/或增加細(xì)菌多樣性并在腸道內(nèi)根除小腸 細(xì)菌過度生長(SIBO)和/或大腸細(xì)菌過度生長(LIBO)而對(duì)一種或一 組生理性擾亂的狀況進(jìn)行的治療，該生理性擾亂的狀況是基于一位個(gè)體
7的胃腸(GI)道內(nèi)的低細(xì)菌多樣性(LBD)，可任選地是通過小腸細(xì)菌 過度生長(SIBO)和/或大腸細(xì)菌過度生長(LIBO)所引發(fā)。
此外，本發(fā)明還涉及一種植物乳桿菌菌林，該菌株在產(chǎn)生如權(quán)利要 求1至13中的任何一項(xiàng)所限定的增加的多樣性指數(shù)差異中使用和/或在 如權(quán)利要求14至25中的任何一項(xiàng)所限定的預(yù)防性治療中使用。
附圖筒要說明


圖1描繪了從人類粘膜擴(kuò)增的消化的16S rRNA基因的 T國RFLP特征。
發(fā)明詳細(xì)說明
完全出人意外的是根據(jù)本發(fā)明給予植物乳桿菌的單一菌林增加了 胃腸道的多樣性，即通過僅給予一種單一的菌林就增加了胃腸道內(nèi)的不 同類型的細(xì)菌的總數(shù)目。這樣不只是增加了觀查到的所給予的菌林的 量，而且還增加了其他的細(xì)菌類型。此外，所述單一的植物乳桿菌菌林 的給予和集群現(xiàn)象為新的細(xì)菌群的生長打開通道，這些新的細(xì)菌群以前 未能在該個(gè)體的胃腸道中生長。這與本領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)提出的理論形成對(duì) 照，在本領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)提出只有不同菌抹的一個(gè)混合物能夠在胃腸道內(nèi)提 供多種菌林的一種混合，即增加的多樣性。這樣，鑒于這種生物多樣性 被由此降低的假定，在本技術(shù)領(lǐng)域中經(jīng)常反對(duì)僅給予一種單一的菌抹。 換句話說，給予不同類型細(xì)菌的混合物的主要的理由在于這些混合物滿 足了多樣性的要求。
因此，完全出乎意外的是才艮據(jù)本發(fā)明僅給予植物乳桿菌的一種單一 的菌林就提供了增加的多樣性。
如上所述，患有如以下限定的一種或多種不同的生理性擾亂的狀況 的個(gè)體經(jīng)常同時(shí)顯示LBD (低細(xì)菌多樣性)，這或者是在該擾亂的狀況 背后的一個(gè)原因或者是由這些擾亂的狀況所引起。這樣的LDB不應(yīng)當(dāng) 被認(rèn)為是一種普通的疾病情況，但是隨著時(shí)間可能導(dǎo)致生理性擾亂的狀 況，包括不同的疾病或LIBO (大腸細(xì)菌過度生長)或SIBO (小腸細(xì) 菌過度生長)。雖然LIBO和SIBO并非一定是LBD的結(jié)果，但通常是 這種情況。 一個(gè)患有LIBO或SIBO的個(gè)體也自動(dòng)地患有在胃腸道內(nèi)的 LBD。 LIBO與SIBO是本身也不被認(rèn)為是普通的疾病情況，但是各自涉及了發(fā)展成若干生理性擾亂的狀況的一種相當(dāng)大的風(fēng)險(xiǎn)，這些狀況包
括如以下限定的不同的疾病，例如易位。LIBO和SIBO也許可替代地 是不同的生理性擾亂的狀況的 一種后果?？梢詫⒏鶕?jù)本發(fā)明的組合物給 予一個(gè)健康的個(gè)體，用于防止其發(fā)展成LBD的預(yù)防性治療。此外，也 可以將所述組合物給予一個(gè)患有LBD(不管LBD的起因如何)的個(gè)體， 用于防止發(fā)展成一種或多種生理性擾亂的狀況(SIBO或LIBO)的預(yù) 防性治療。另外，所述組合物可還可以被給予一個(gè)患有LIBO或SIBO (不管其起因如何)的個(gè)體，用于防止發(fā)展成一種或多種生理性擾亂的 狀況(例如易位)的預(yù)防性治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患有LDB和/ 或SIBO和/或LIBO并且同時(shí)還遭受一種或多種以上提及的生理性擾亂 的狀況的個(gè)體可以經(jīng)歷用所述組合物給藥，目的在于增加在胃腸道內(nèi)的 細(xì)菌多樣性并且由此改善該個(gè)體的整體健康狀況，可任選地還減輕所述 一種或多種生理性擾亂的狀況的作用。
所觀查到的與本發(fā)明相關(guān)的增加的多樣性可以用一種多樣性指數(shù) 的形式來衡量，該多樣性指數(shù)是通過眾所周知的T-RFLP方法使用 RfleIII酶來剪切并且計(jì)算以下所說明的Shannon-Weaner以及Simpson 指數(shù)進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)使用Shannon-Weaner指數(shù)時(shí)，所述增加的多樣性指 數(shù)差異至少是0.15，優(yōu)選是0.30，更優(yōu)選是0.45，并且甚至更優(yōu)選是 0.60。
當(dāng)使用Simpson多樣性指數(shù)時(shí)，所述增加的多樣性指數(shù)差異至少是 0.02，優(yōu)選是0.04，更優(yōu)選是0.06，并且甚至更優(yōu)選是0.08。
多樣性指數(shù)差異(Didiff—total)的計(jì)算是通過以下步驟完成在第 一步中，計(jì)算服用包含植物乳桿菌的一種菌林的產(chǎn)品的個(gè)體的多樣性差 異(Didiff)，即攝取菌林之后的多樣性指數(shù)的值(Diafter一product)減 去攝取菌林之前的多樣性指數(shù)的值(Dibefore—product )，除以服用該產(chǎn) 品的個(gè)體的數(shù)目(nproduct)。此后，在上述第一步所獲得的值減去安 慰劑所獲得的多樣性差異 (Diplacebo_total = Diafter—placebo -Dibefore_placebo)除以nplacebo，這是服用該安慰劑的個(gè)體的數(shù)目。 用于多樣性指數(shù)差異的等式如下
Didiff_total= 2(Diafter product - Dibefore一product) / (nproduct)— S(Diafter一placebo — Dibefore_placebo) / (nplacebo)
9當(dāng)然多樣性指數(shù)可以通過其他巳知的方法來測(cè)量，并且本領(lǐng)域的技
術(shù)人員知道這些其他巳知的方法會(huì)是什么。此外，用來剪切的酶HaeIII 可以被任何其他的巳知的酶替代。
鑒于根據(jù)本發(fā)明在胃腸道內(nèi)提供的增加的多樣性指數(shù)，人類的總體 健康也許會(huì)變得更好。上述已經(jīng)討論到許多生理性障礙與低多樣性指數(shù) 有關(guān)。通過能容易地服用以一種固體或液體配制品的形式(例如以下所 討論的一種食物產(chǎn)品)的植物乳桿菌的一種菌林，有助于個(gè)體保持健康。
此外，在此所提供的增加的多樣性指數(shù)抵消了現(xiàn)代社會(huì)以及福利國 家的負(fù)面效應(yīng)。例如，如以上所討論，世界范圍服用巨大數(shù)量的抗生素 打破了胃腸(GI)道內(nèi)的平衡。通過給予根據(jù)本發(fā)明的植物乳桿菌的一 種菌林，這一被打破的平衡也許會(huì)再次變得正常和健康。
此外，人們相信現(xiàn)代社會(huì)的許多生理性擾亂的狀況可以通過持續(xù)攝 取根據(jù)本發(fā)明的植物乳桿菌的 一種菌抹而得以防止。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物是一種液體配制品或一種 固體配制品，其中所述固體配制品是選自下組，其構(gòu)成為片劑、含片、 糖果、咀嚼片劑、口香糖、膠嚢、小藥嚢、粉末、粒劑、包衣顆粒和包 衣片劑、腸溶的包衣片劑和膠嚢、以及可溶性條(melting strip)以及 薄膜，并且所述液體配制品選自下組，其構(gòu)成為口J3i液、懸浮液、乳 劑、以及糖漿劑。本發(fā)明的組合物可以根據(jù)任何常規(guī)方法給予。然而， 本菌林優(yōu)選是口服施用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中所述組合物包括一種運(yùn)載物質(zhì)，其中所 述運(yùn)載物質(zhì)是獨(dú)立地選自下組，其構(gòu)成為燕麥片粥、乳酸發(fā)酵食品、 抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白、以及糖基化蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物是一種醫(yī)藥食品、 一種功 能性食品、 一種膳食增補(bǔ)劑、 一種營養(yǎng)產(chǎn)品或一種食物制品。這樣，該 植物乳桿菌菌株能以許多不同的形式被給予這些個(gè)體。所述食物制品可 選自下組，其構(gòu)成為飲料、酸奶、果汁(juices)、水淇淋、面包、餅 干、谷類、健康食品棒(health bars )、以及涂抹醬(spreads )。這樣， 在此認(rèn)識(shí)到該組合物也許可以在日常的生活里以食物產(chǎn)品的形式容易 地服用。這樣，通過使用根據(jù)本發(fā)明所述的組合物，人類的總體健康會(huì) 變得更好。該植物乳桿菌的菌抹是以下述量存在于該組合物中大約1 x 106 至大約lxlO"CFU(菌落形成單位)、優(yōu)選是從大約lxl()S至大約lx 1012、并且更優(yōu)選是從大約1 x 109至大約1 x IO11。
本申請(qǐng)正文通篇所使用的表述"與安慰劑相比的增加的多樣性差 異"是指被給予該植物乳桿菌菌林的個(gè)體的細(xì)菌多樣性變化與其他的個(gè) 體進(jìn)行比較(在本研究的期間給予一種類似的產(chǎn)品，但是沒有該植物乳 桿菌菌抹)。這些類型的研究是采用盲法，即在研究期間不論是志愿者 還是撐握本研究并分析結(jié)果的人員都不知道哪些個(gè)體得到安慰劑、以及 哪個(gè)得到治療產(chǎn)品。這消除了許多誤差來源以及錯(cuò)誤的結(jié)果。
在本申請(qǐng)正文通篇所使用的表述"大腸細(xì)菌過度生長(LIBO)"是 指一種或一些細(xì)菌類型在大腸的細(xì)菌菌群里高度占據(jù)優(yōu)勢(shì)，即它們以比 大多數(shù)其他類型的細(xì)菌高很多的數(shù)目存在。
在本申請(qǐng)正文通篇所使用的表述"小腸細(xì)菌過度生長(SIBO)"是 指一種或一些細(xì)菌類型在小腸的細(xì)菌菌群里高度占據(jù)優(yōu)勢(shì)，即它們以比 大多數(shù)其他類型的細(xì)菌高很多的數(shù)目存在。
本申請(qǐng)通篇所使用的表述"低細(xì)菌多樣性(LDB)"是指在一位個(gè) 體的胃腸道內(nèi)一種失衡的細(xì)菌組合物，根據(jù)Shannon-Weaner多樣性指 數(shù)它可能被定義為至少0.15的多樣性指數(shù)差異或根據(jù)Simpson多樣性 指數(shù)被定義為至少0.02的多樣性指數(shù)差異。應(yīng)當(dāng)注意到有時(shí)在本申請(qǐng) 正文中所使用的術(shù)語"多樣性"是旨在表示"細(xì)菌多樣性"。
本申請(qǐng)正文通篇所使用的表述"生理性擾亂的狀況，，是指任何不希 望有的健康狀況或由于LDB的存在和/或LIBO或SIBO的存在或與之 相關(guān)的狀況，諸如胃腸機(jī)能紊亂，例如易位、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、 過敏性腸綜合征、以及由于抗生素?cái)z取的不希望的狀況。此外，LDB、 SIBO、以及LIBO可以是形成冠狀動(dòng)脈失調(diào)、非酒精性脂肪肝、2型糖 尿病、過敏、異位性濕瘆、以及自身免疫疾病的負(fù)面因素。
本申請(qǐng)正文通篇所使用的表述"增加胃腸道的多樣性"是指在胃腸 道內(nèi)微生物的增加的菌群是以存在不同類型細(xì)菌的形式來獲得的。這意 味著減少了某些負(fù)面性的細(xì)菌的"過度生長"的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致個(gè)體的 更好的總體健康。這樣，根據(jù)本發(fā)明減少了在胃腸(GI)道內(nèi)的某些細(xì) 菌的過度生長。由此提供了一種令人希望的平衡。
多樣性指數(shù)是通過T-RFLP方法使用HaeIII酶切割并且計(jì)算
iiShannon-Weaner多樣性指數(shù)以及Simpson多樣性指數(shù)而進(jìn)行測(cè)量。
如上所述，本發(fā)明還涉及通過改善和/或增加細(xì)菌多樣性以及在腸 道內(nèi)根除小腸細(xì)菌過度生長(SIBO)和/或大腸細(xì)菌過度生長(LIBO) 而對(duì)一種或一組所述生理性擾亂的狀況進(jìn)行的治療，這些生理性擾亂的 狀況是基于一位個(gè)體的胃腸(GI)道內(nèi)的低細(xì)菌多樣性(LBD),可任 選地是通過小腸細(xì)菌過度生長(SIBO )和/或大腸細(xì)菌過度生長(LIBO ) 所引發(fā)。LBD是通過攝入選自下組的植物乳桿菌的一種菌林來治療的， 該組的構(gòu)成為植物乳桿菌299， DSM 6595、植物乳桿菌299v， DSM 9843、植物乳桿菌HEAL-9， DSM 15312、植物乳桿菌HEAL-19, DSM 15313,以及植物乳桿菌HEAL-99, DSM 15316。
植物乳桿菌是在龐大的并且相對(duì)多樣的乳桿菌屬中的一個(gè)細(xì)菌的 種，該屬包括大約90個(gè)有效命名的種或亞種。按照傳統(tǒng)，乳桿菌 (丄fl"Mfl"7/ws spp.)根據(jù)其發(fā)酵能力已被分成三個(gè)功能群專性同型 發(fā)酵的(I群)、兼性異型發(fā)酵的(II群)、以及專性異型發(fā)酵的(III 群)。I群專門將己糖類發(fā)酵成乳酸，并且不能發(fā)酵葡萄糖酸鹽或戊糖類； 而II群也使己糖發(fā)酵成乳酸但是另外能夠發(fā)酵戊糖類和/或葡萄糖酸 鹽。III群將己糖發(fā)酵成乳酸、乙酸、和/或乙醇、以及二氧化碳。植物 乳桿菌是兼性異型發(fā)酵的。植物乳桿菌的典型菌抹是ATCC 14917。 植物乳桿菌在下面幾點(diǎn)不同于許多其他的乳桿菌屬
1) 植物乳桿菌具有一個(gè)相對(duì)大的基因組，這表明了適應(yīng)于許多不 同情況的能力。
2) 植物乳桿菌具有一種發(fā)酵許多不同的碳水化合物的驚人能力。
3) 植物乳桿菌對(duì)于錳具有一種高生長需求，并且可以在細(xì)胞間積 聚高水平的錳。錳通過將氧基團(tuán)還原為11202而為植物乳桿菌提供了一 種抗氧毒性的防護(hù)。所產(chǎn)生的11202于是能夠通過錳輔助的假過氧化氫 酶(manganese cofactored pseudocatalase)被轉(zhuǎn)變成O2以及水。
4) 植物乳桿菌具有一種對(duì)于低pH的高耐受性。植物乳桿菌經(jīng)常 在自然產(chǎn)生的乳酸發(fā)酵食品(其中pH通常低于4.0)中占優(yōu)勢(shì)地位并 且還穿過人類胃的酸性條件而生存的事實(shí)表明它對(duì)于酸性條件的高抵
抗力o
5) 植物乳桿菌可以具有鞣酸酶活性并且也能代謝酚酸類。 植物乳桿菌經(jīng)常在大多數(shù)乳酸發(fā)酵的食品中以高數(shù)目自然地存在，尤其當(dāng)該食品是基于植物材料時(shí)，例如在腌制的橄欖、續(xù)隨子(續(xù)隨子 漿果)、德國泡菜、咸小黃瓜、酵母面團(tuán)、尼日利亞Ogi (由玉米或高粱
制成)、埃塞俄比亞的kocho (由來源于阿比尼西亞象腿蕉(ensete ventricosum)的淀粉制成)、由畫眉草(Ze/)制成的埃塞俄 比亞的酵母面團(tuán)、以及木薯中。這樣，顯而易見的是吃下植物來源的乳 酸發(fā)酵產(chǎn)品的個(gè)體也吃下了大量植物乳桿菌。此外，植物乳桿菌存在于 葡萄汁以及葡萄酒中。植物乳桿菌經(jīng)常出現(xiàn)在從口腔到直腸的人類胃腸 粘膜上[Molin， G" Jeppsson， B.， Ahrn" S.， Johansson, M.國L.， Nobaek， S., StShl， M.， and Bengmark， S. (1993).Numerical taxonomy of 丄a"o6ac///！151 spp. associated with healthy and diseased mucosa of the human intestines, / J5flc/cV /. 74: 314-323; Ahrn6， S.， Nobaek， S.， J印psson， B.， Adlerberth, I.， Wold， A.， and Molin， G. (1998).The normal iflc^>6flcz7/ws flora of healthy human rectal and oral mucosa, / ^4/7/ A Af/cwWo/. 85: 88-94)。所以，顯而易見的是物種植物乳桿菌具有與人類 食物以^A類腸道方面有關(guān)的一種獨(dú)特的地位，并且考慮到人類自起源 時(shí)就已經(jīng)在吃乳酸發(fā)酵食品(因?yàn)槿绻参锊牧媳粔喝胍粋€(gè)封閉的區(qū) 域，例如在土地中的一個(gè)坑中，這是一種自發(fā)過程)，可以理解的是在 這些環(huán)境中自然地占優(yōu)勢(shì)的一種生物也要在人類腸道內(nèi)起一種關(guān)鍵性 的作用。
實(shí)例
多樣性的測(cè)量
末端限制性片斷長度多態(tài)性(T-RFLP)分析是基于熒光末端標(biāo)記 的PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切核酸酶消化的一種群落指紋法，并且它揭示 已知和未知的細(xì)菌群兩者的信息。T-RFLP模式是在一系列步驟中產(chǎn)生 的簡言之，直接從樣品中提取出群落DNA。相關(guān)基因是使用引物(其 中之一是熒光標(biāo)記的)經(jīng)PCR擴(kuò)增的。在純化后，用一種限制性內(nèi)切 核酸酶(通常是一種4-堿基切割酶)消化該P(yáng)CR產(chǎn)物。將消化產(chǎn)物與 一種用熒光標(biāo)記的DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品相混合，然后通過電泳(使用凝膠
或者基于毛細(xì)管的系統(tǒng)(配備有一種激光探測(cè)器這樣只有熒光標(biāo)記的末 端片段是可見的))分離這些片段。來源于這種分析的結(jié)果處于兩種形 式1)將一個(gè)細(xì)菌菌群的特征顯示為一系列具有不同高度的峰值的一
13種電泳圖鐠，2)從一個(gè)自動(dòng)化片段分析程序中產(chǎn)生的表格，該表格最 重要地包括每個(gè)峰值在堿基對(duì)中的大小以及高度(或面積)。在樣品之 間的T-RFLP特征能夠通過使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法從數(shù)字上進(jìn)行比較。 一些 統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法已經(jīng)被用于比較微生物的群落。
近年來在生態(tài)學(xué)研究中微生物群落的T-RFLP分析已經(jīng)變得使用 得越來越多。它是可重復(fù)的并且給出高分辨率。
結(jié)果
受試者以及樣品采集
這些受試者全部是男性，除了患有一種已確定的控制良好的心血管 疾病之外身體狀況良好。他們?cè)谑橙朐囼?yàn)溶液四周之前以及之后經(jīng)受了 柔性乙狀結(jié)腸鏡檢查。按照一種標(biāo)準(zhǔn)化方式從較低的乙狀結(jié)腸的粘膜進(jìn) 行活組織檢查供進(jìn)一步分析。
在多樣性評(píng)估中包括16位志愿者，這些自愿者來源于一個(gè)隨機(jī)化、 雙盲、安慰劑對(duì)照的研究中所包括的受試者的一個(gè)更大的同齡組。九個(gè) 受試者每天消耗IOO ml治療產(chǎn)品達(dá)四周，相當(dāng)于每天攝取10H菌落形 成單位的植物乳桿菌。七個(gè)受試者每天消耗IOO ml類似的產(chǎn)品(但不 含細(xì)菌)達(dá)四周。
"，提取
將該粘膜的活組織在超聲波浴中處理5分鐘，然后渦旋2分鐘。將 樣品轉(zhuǎn)入紫外線(UV)處理過的1.5 ml管并且以9,000 rpm離心7分 鐘。將380 jil緩沖液G2以及30 nl的Proteiims K ( Qiagen, Hilden, 德國)加至該沉淀部分。將該樣品在56°C水浴中處理直到全部溶解。 在一個(gè)Eppendorf Mixer (型號(hào)5432， Eppendorf， Hamburg,德國) 中在4°C條件下通過將該懸浮液與12至15個(gè)玻璃珠(直徑為2 mm ) 一起震動(dòng)45分鐘將其進(jìn)一步分解。在以5,000 rpm離心一分鐘之后， 將上清液轉(zhuǎn)入兩個(gè)不同的2 ml樣品管(在每個(gè)管中200 pi )。在具有EZ1 DNATissue Card以及EZ1 DNATissue Kit的BioRobot EZl( Qiagen， Hilden,德國)中根據(jù)制造商的說明書完成進(jìn)一步的純化。將DNA以 200 nl洗脫。
PO 擴(kuò)增、純化、以及濃度的測(cè)量
將16S rRNA基因用在5'端以Cy5做熒光標(biāo)記的通用的正向引物Cy5-ENV1 ( 5'-AGA GTT TGA TII TGG CTC AG-3 ),以及反向引物ENV2 (5'隱CGGITACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行擴(kuò)增，這兩種引物分別以8至27 bp和1511至1492 bp退火。該P(yáng)CR反應(yīng)混合物在50Hi的最終體積中包含0.2 nM的每種引物、0.2 mM的每種脫氧核糖核苷三磷酸(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN )、 5 jil的10 x PCR反應(yīng)緩沖液(lOOmMTris-HCl, 500mMKCl， pH 8.3 )、 2.5 U/pl Taq聚合酶(Roche Diagnostics, Mannheim,德國)以及0.2至10 pi的模板。用以下程序在一個(gè)Eppendorf Mastercycler ( Hamburg,德國)中完成擴(kuò)增在94。C下3分鐘， 一個(gè)循環(huán)；隨后在94°C下1分鐘，32個(gè)循環(huán)；50。C達(dá)45秒以及72。C達(dá)2分鐘，另外在72°C延伸7分鐘。
將PCR產(chǎn)物(5 )用溴化乙錠染色后，在1 x TBE緩沖液(89 mMTris， 89 mM硼酸，2.5 mM EDTA)中的1.5 % (w/v)的瓊脂糖凝膠上驗(yàn)證。
收集來自三個(gè)反應(yīng)的PCR產(chǎn)物以降低PCR的偏倚并且獲得足夠的DNA用于T-RFLP分析。通過MinElute PCR Purification Kit( Qiagen,Hilden,德國)根據(jù)制造商的說明書將這些擴(kuò)增子純化。用30 jil的無菌蒸餾水進(jìn)行洗脫。
通過配有用于WindowsTM的DataMax的FlouroMax隱2 (ISA JobinYvon國Spex Instruments S.A., Inc., New Jersey)以熒光光譜法觀'J量純化的DNA的濃度，使用嵌入有雙股DNA的Quant-iTTMPicoGreen (Invitrogen， Eugen, Oregon,美國)。根據(jù)制造商的說明書使用Quant-iTTMPicoGreen 。激發(fā)是在480 nm完成的。
r-RFLP分析
在總體積10 jil中將若干等份的200 ng純化的PCR產(chǎn)物分別用15U的限制性內(nèi)切核酸酶iyfldll( Sigma-Aldrich， St Louis,美國)在37°C消化16小時(shí)。在消化之后，通過在65。C加熱15分鐘將酶滅活。將消化物與1 jil的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品以及裝載染料的4 nl曱酰胺(3.3 nl去離子曱酰胺，帶有5% w/v葡聚糖藍(lán)的0.7 ^ 25 mM EDTA)混合，并且在94°C將該混合物變性3分鐘，然后立即置于水上，然后裝栽到聚丙烯酰胺凝膠。
該內(nèi)部大小標(biāo)準(zhǔn)品包舍Cy5-ENVl引物(如以上所述20bp)以及通過使用引物685r ( 5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT AC隱3';大腸桿菌編號(hào)705-685 )和Cy5-ENV1從大腸桿菌ATCC 11775擴(kuò)增的697 bp的PCR產(chǎn)物。包括ALFexpress Sizer 50-500 ( GE Healthcare, Uppsala,瑞典)以及Cy5標(biāo)記的697 bp PCR產(chǎn)物的外部大小標(biāo)準(zhǔn)品,皮裝載在包含樣品的聚丙烯酰胺凝膠上以估計(jì)T-RF的長度。將該熒光標(biāo)記的片段分離并且用 一個(gè)配有7 % ReproGel Long Read凝膠(GE Healthcare,Uppsala，瑞典)的ALFexpress II DNA測(cè)序儀在下列情況進(jìn)行檢測(cè)達(dá)700分鐘1500 V、 60 mA、以及55。C。統(tǒng)計(jì)分析
通過寸吏用ALFwinTMFragment Analyser 1.03程序(AmershamBiosciences, Uppsala,瑞典)估計(jì)焚光標(biāo)記的T-RF的峰面積。在一個(gè)給出的T-RFLP模式內(nèi)計(jì)算了每個(gè)T-RF的相對(duì)豐度，是用對(duì)應(yīng)的T-RF的峰面積除以在一個(gè)片段長度(在20 bp至697 bp之間)內(nèi)所檢測(cè)的所有T-RF的總的峰面積。4吏用以下等式計(jì)算Simpson (D)與Shannon-Weaner ( H')指數(shù)D = I^/2并且H =-2:/ /ln/w'，其中pi是在該群落中ith峰的相對(duì)豐度(Magurran A, 1996， Ecologicaldiversity and its measurement, Chapman and Hall, London.)。 使用Simpson的多樣性指數(shù)(1-D)而不是Simpson指數(shù)的初始公式確保了該指數(shù)的值隨多樣性的增加而增加。對(duì)于每一位個(gè)體，對(duì)處理之前以及之后的樣品計(jì)算指數(shù)。通過從處理之后的指數(shù)中減去處理之前的指數(shù)獲得了多樣性的差異。使用Mann-Whitney Rank Sum Test ( SigmaStat，Systat Software, Point Richmond,美國)檢測(cè)了在益生素與安慰劑組中的個(gè)體之間的細(xì)菌多樣性的差異。p值O.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
當(dāng)分析來自T-RFLP特征的數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)與接受安慰劑的個(gè)體相比，用植物乳桿菌299v處理四星期的個(gè)體的腸內(nèi)的小生物群的多樣性有統(tǒng)計(jì)上顯著的差異。限制性內(nèi)切核酸酶好fleIII被用作切割酶，并且通過Shannon指數(shù)所測(cè)量的多樣性的平均差異對(duì)于益生素組是0.2305803,而對(duì)于安慰劑組是-0.3929243 ( p = 0.026 )。
計(jì)算Simpson多樣性指數(shù)證實(shí)了通過給予植物乳桿菌299v有更大的多樣性。丑fleIII被用作切割酶，并且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)上顯著的差異，通過Simpson多樣性指數(shù)得到的平均差異對(duì)于益生素組是0.0367907，而對(duì)于安慰劑組是-0.04792 ( p = 0.026)。多樣性指數(shù)的平均差
0.23058030.0367907
Dibefore placebo-Diafter placebo-0.3929243-0.04792
Ditotal0.62350460.0847107
Dit。^的顯著性P-0.026P-0.026
以上結(jié)果顯示在被給予該植物乳桿菌菌林的個(gè)體與被給予安慰劑的個(gè)體之間，當(dāng)給予植物乳桿菌的一種單一菌林時(shí)，人類胃腸道的細(xì)菌多樣性增加了。
1權(quán)利要求
1.植物乳桿菌的一種菌株于制造增加胃腸道的多樣性的一種組合物的用途，這是通過將所述菌株給予一位個(gè)體，其目的在于產(chǎn)生與安慰劑相比的一個(gè)增加的多樣性指數(shù)差異。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述增加的多樣性指數(shù)差異是按T-RFLP方法使用HaeIII作為酶并用Shannon-Weaner多樣性指數(shù)以及Simpson多樣性指數(shù)來測(cè)量的。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述植物乳桿菌是選自下組，其構(gòu)成為植物乳桿菌299， DSM 6595、植物乳桿菌299v， DSM 9843、植物乳桿菌HEAL-9， DSM 15312、植物乳桿菌HEAL-19, DSM 15313，以及植物乳桿菌HEAL-99， DSM 15316。
4. 如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的用途，當(dāng)使用Shannon-Weaner指數(shù)時(shí)，其中所述增加的多樣性指數(shù)差異至少是0.15，優(yōu)選是0. 30，更優(yōu)選是0.45,并且甚至更優(yōu)選是Q. 60。
5. 如權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的用途，當(dāng)使用Simpson多樣性指數(shù)時(shí)，其中所述增加的多樣性指數(shù)差異至少是0.02,優(yōu)選是O. 04,更優(yōu)選是O. 06，并且甚至更優(yōu)選是Q. 08。
6. 如權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的用途，其中所述組合物是一種液體配制品或一種固體配制品。
7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述固體配制品是選自下組，其構(gòu)成為片劑、含片、糖果、咀嚼片、口香糖、膠嚢、小藥嚢、粉末、粒劑、包衣顆粒以及包衣片劑、腸溶的包衣片劑和膠囊、以及可溶性條(melting strips)以及薄膜。
8. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述液體配制品是選自下組，其構(gòu)成為口服液、懸浮液、乳劑、以及糖漿劑。
9. 如權(quán)利要求1至8中任何一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物包括一種運(yùn)載物質(zhì)。
10. 如權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物是一種醫(yī)藥食品、 一種功能性食品、 一種膳食增補(bǔ)劑、 一種營養(yǎng)產(chǎn)品、或一種食物制品。
11. 如權(quán)利要求9或10所述的用途，其中所述運(yùn)載物質(zhì)是獨(dú)立地選自下組，其構(gòu)成為燕麥片粥、乳酸發(fā)酵食品、抗性淀粉、膳食纖維、碳7K化合物、蛋白、以及糖基化蛋白。
12. 如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述食物制品是選自下組，其構(gòu)成為飲料、酸奶、果汁、冰淇淋、面包、餅干、谷物、健康食品棒(healthbars )、以及涂抹醬(spread X
13. 如權(quán)利要求1至12中任何一項(xiàng)所述的用途，其中存在于本組合物的所述菌林的量大約是l x 106至大約1 x IO"菌落形成單位(CFU)，優(yōu)選是從大約1 x 108至大約1 x 10"，以及更優(yōu)選是從大約1 x 109至大約1 x 1011。
14. 植物乳桿菌的一種菌林用于制造一種組合物的用途，該組合物用于健康個(gè)體的預(yù)防性治療以防止其發(fā)展成低細(xì)菌多樣性(LBD );用于一個(gè)患有LBD的個(gè)體的預(yù)防性治療以防止其發(fā)展成一種或多種生理性擾亂的狀況、大腸細(xì)菌的過度生長(LIB0)、或小腸細(xì)菌的過度生長(SIB0 );以及用于一個(gè)患有LIB0或SIB0的個(gè)體的預(yù)防治療以防止其iu艮成一種或多種生理性擾亂的狀況。
15. 如權(quán)利要求14所述的用途，其中易位是所述生理性擾亂的狀況之一。
16. 如權(quán)利要求14所述的用于制造一種組合物的用途，該組合物通過改善和/或增加細(xì)菌多樣性并且在腸道內(nèi)才艮除小腸細(xì)菌過度生長(SIB0 )和/或大腸細(xì)菌過度生長(LIB0)來治療一種或一組所述生理性擾亂的狀況，該生理性擾亂的狀況是基于或與一種個(gè)體的胃腸(GI)道內(nèi)的低細(xì)菌多樣性(LBD)相關(guān)聯(lián)，可任選地是通過小腸細(xì)菌過度生長(SIB0)和/或大腸細(xì)菌過度生長(LIB0)所引發(fā)。
17. 如權(quán)利要求14所述的用途，其中所述植物乳桿菌是選自下組，其構(gòu)成為植物乳桿菌299, DSM 6595、植物乳桿菌299v, DSM9843、植物乳桿菌HEAL-9， DSM 15312、植物乳桿菌HEAL-19, DSM 15313、以及植物乳桿菌HEAL-99， DSM 15316。
18. 如權(quán)利要求15至17中任何一項(xiàng)所述的權(quán)利要求的用途，其中所述組合物是一種液體配制品或一種固體配制品。
19. 如權(quán)利要求18所述的用途，其中所述固體配制品是選自下組，其構(gòu)成為片劑、含片、糖果、咀嚼片、口香糖、膠嚢、小藥嚢、粉末、粒劑、包衣顆粒以及包衣片劑、腸溶的包衣片劑和膠嚢、以及可溶性條以及薄膜。
20. 如權(quán)利要求18所述的用途，其中所述液體配制品是選自下組，其構(gòu)成為口服液、懸浮液、乳劑、以及糖漿劑。
21. 如權(quán)利要求14至20中任何一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物包括一種運(yùn)載物質(zhì)o
22. 如權(quán)利要求14至21中任何一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥用組合物是一種醫(yī)藥食品、 一種功能性食品、 一種膳食增補(bǔ)劑、 一種營養(yǎng)產(chǎn)品、或一種食物制品。
23. 如權(quán)利要求21或22所述的用途，其中所述運(yùn)載物質(zhì)是獨(dú)立地選自下組，其構(gòu)成為燕麥片粥、乳酸發(fā)酵食品、抗性淀粉、膳食纖維、碳7jc化合物、蛋白、以及糖基化蛋白。
24. 如權(quán)利要求22所述的用途，其中所述食物制品是選自下組，其構(gòu)成為飲料、酸奶、果汁、水淇淋、面包、餅干、谷物、健康食品棒、以及涂抹醬。
25. 如權(quán)利要求14至24中任何一項(xiàng)所述的用途，其中存在于本組合物中的所述菌林的量大約是l x 106至大約1 x IO"菌落形成單位，優(yōu)選是從大約1 x 108至大約1 x 1012，以及更優(yōu)選是從大約1 x 109至大約1 x 1011。
26. —種增加胃腸道多樣性的方法，該方法通過將植物乳桿菌的一種菌抹給予一位個(gè)體，目的在于產(chǎn)生與安慰劑相比的一個(gè)增加的多樣性指數(shù)差異。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述增加的多樣性指數(shù)是按T-RFLP方法使用HaeIII作為酶并用Shannon-Weaner多樣性指數(shù)以及Simpson多樣性指數(shù)來測(cè)量的。
28. 植物乳桿菌菌抹供產(chǎn)生如權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所限定的增加的多樣性指數(shù)差異之用和/或供如權(quán)利要求14至25中任何一項(xiàng)所限定的預(yù)防性治療之用。
全文摘要
在此披露了將植物乳桿菌的一種菌株用于制造增加胃腸道多樣性的一種組合物的用途，這是通過將所述菌株給予一位個(gè)體，其目的是產(chǎn)生與安慰劑相比的一個(gè)增加的多樣性指數(shù)，連同將植物乳桿菌的一種菌株用于制造一種組合物的用途，該組合物用于健康個(gè)體防止其發(fā)展成低細(xì)菌多樣性(LBD)的預(yù)防性治療；用于一個(gè)患有LBD的個(gè)體的預(yù)防性治療以防止其發(fā)展成一種或多種生理性擾亂的狀況、大腸細(xì)菌的過度生長(LIBO)、或小腸細(xì)菌的過度生長(SIBO)；以及用于一個(gè)患有LIBO或SIBO的個(gè)體的預(yù)防性治療以防止其發(fā)展成一種或多種生理性擾亂的狀況；以及用于增加所述多樣性的一種方法。
文檔編號(hào)A61K35/74GK101674840SQ200880012037
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2008年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月1日
發(fā)明者B·杰普松, C·卡爾森, G·莫蘭, S·阿漢尼 申請(qǐng)人:普羅比公司