專利名稱：：其它新形式的干擾rna分子的制作方法其它新形式的干擾RNA分子本申請是國際申請?zhí)朠CT/EP2003/008666，國際申請日為2003年8月5日，中國申請?zhí)枮?3818867.8，中國申請日為2005年2月5日，發(fā)明名稱為"其它新形式的干擾RNA分子"的分案申請。本發(fā)明涉及含有雙鏈結構的核糖核酸，其中所述的雙鏈結構含有第一鏈和第二鏈，所述的第一鏈含有連續(xù)核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地與目標核酸互補，所述的第二鏈含有連續(xù)核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地與目標核酸相同，還涉及該核糖核酸的應用、分別含有該核糖核酸的細胞和生物、含有該核糖核酸的組合物、含有該核糖核酸的藥物組合物和抑制目標基因表達的方法。
背景技術：
：RNA-介導的千擾(RNAi)是轉錄后的基因沉默機制，它由在序列上與沉默基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)啟動(Fire(1999),TrendsGenet15,358-63,TuscW,等(1999),GenesDev13,3191-7，Waterhouse,等(2001),Nature411，834-42，Elbashir，等(2001),Nature411,494-8,綜述參見Sharp(2001),GenesDev15,485-90,Barstead(2001),CurrOpinChemBiol5,63-6)。RNAi已經廣泛地用于檢測許多生物中的基因功能，包括植物(Baulcombe(1999)，CurrOpinPlantBiol2，109-13)、線蟲(Montgomery，等(1998)，ProcNatlAcadSciUSA95，15502-7)、果蠅屬(Kennerdell,等(1998)，Cell95,1017-26,Kennerdell,等(2000),NatBiotechnol18,896-8)。在線蟲Ce/egara中，已經有三分之一的基因組通過RNAi進行了功能分析(Kim(2001),CurrBiol11，R85-7，Maeda，等(2001)，CurrBiol11,171-6)。直到最近，哺乳動物細胞的RNAi還未普遍應用，除了早期的小鼠發(fā)育(Wianny，等(2000)，NatCellBiol2,70-5)。通常由長dsRNA得知，用21nt的雙鏈體轉染哺乳動物細胞會干擾基因表達，且不會誘導不依賴于序列的干擾素驅動的抗病毒應答，這一發(fā)現在分化的哺乳動物細胞中具有新的潛在用途(Elbashir等(2001)，Nature411，494-8)。有趣的是，這些小的干擾'RNAs(siRNA)類似于長dsRNA的加工產物，提示在分化的哺乳動物細胞中潛在的旁路機制。Dicer復合物是RNA酶III家族的成員，已經鑒別出它是啟動dsRNA加工所必需的(Bemstein,等(2001),Nature409,363-6,Billy，等(2001),ProcNatlAcadSciUSA98,14428-33)。在以前使用未修飾的核糖寡核苷酸時遇到的問題之一是在細胞或甚至在含血清培養(yǎng)基中的快速降解(Wickstrom(1986)，JBiochemBiophysMethods13,97-102，Cazenave,等(1987),NucleicAcidsRes15，10507-21)。轉染siRNA誘導的各種降低(knockdown)是否會維持足夠長的時間來實現表型的改變依賴于特定基因的功能和使用的分析系統(tǒng)。本發(fā)明解決的基本問題是提供了合成的在生物化學環(huán)境例如活細胞中穩(wěn)定切有活性的干擾RNA分子。在本發(fā)明的第一方面，通過含有雙鏈結構的核糖核酸解決了問題，其中所述的雙鏈結構含有第一鏈和第二鏈，所述的第一鏈含有連續(xù)核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地與目標核酸互補，所述的第二鏈含有連續(xù)核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地與目標核酸相同，并且其中所述的雙鏈結構是平端的。在本發(fā)明的第二方面，通過含有雙鏈結構的核糖核酸解決了問題，其中所述的雙鏈結構含有第一鏈和第二鏈，所述的第一鏈含有連續(xù)核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地與目標核酸互補，所述的第二鏈含有連續(xù)核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地與目標核酸相同，并且其中所述的第一序列和/或第二序列的長度為18或19個核苷酸。在根據本發(fā)明的第一方面的核糖核酸的一個實施方案中，第一序列和/或第二序列的長度為18或19個核苷酸。在根據本發(fā)明的第一方面的核糖核酸的另一個實施方案中，雙鏈結構的雙鏈兩端都是平端的。在根據本發(fā)明的第一方面的核糖核酸的一個備選實施方案中，雙鏈結構是平端的，雙鏈結構由第一鏈的5'-端和第二鏈的3'-端定義。在根據本發(fā)明的第一和第二方面的核糖核酸的另外一個備選實施方案中，雙鏈結構是平端的，雙鏈結構由第一鏈的3'-端和第二鏈的5'-端定義。在本發(fā)明的第三方面，通過含有雙鏈結構的核糖核酸解決了問題，其中所述的雙鏈結構含有第一鏈和第二鏈，所述的第一鏈含有連續(xù)核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地與目標核酸互補，所述的第二鏈含有連續(xù)核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地與目標核酸相同，并且其中雙鏈中的至少一個在5'-端具有至少一個核苷酸的突出端。在根據本發(fā)明的第三方面的核糖核酸的一個實施方案中，突出端由至少一個核苷酸組成，所述核苷酸選游離核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸組成的組。在根據本發(fā)明的第三方面的核糖核酸的一個更優(yōu)選的實施方案中，核苷酸具有一個修飾，所述的修飾優(yōu)選地選自包含反向無堿基的核苷酸和在2'-位具有NH2-修飾的核苷酸的組。在根據本發(fā)明的第三方面的核糖核酸的一個優(yōu)選實施方案中，至少一條鏈具有由核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸組成的3'-端的至少一個核苷酸的突出端。在根據本發(fā)明的第三方面的核糖核酸的另外一個優(yōu)選實施方案中，第一序列和/或第二序列的長度為18或19個核苷酸。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的一個實施方案中，雙鏈結構的長度為17—21個核苷酸，優(yōu)選18—19個核苷酸。在根據本發(fā)明的第三方面的核糖核酸的一個實施方案中，5'-端的突出端是在第二鏈上。在根據本發(fā)明的第三方面的核糖核酸的一個優(yōu)選實施方案中，第一鏈也包含突出端，優(yōu)選地在5'-端。在根據本發(fā)明的第三方面的核糖核酸的一個實施方案中，第一鏈的3'-端含有突出端。在根據本發(fā)明的第三方面的核糖核酸的一個備選實施方案中，5'-端的突出端是在第一鏈上。在它的一個優(yōu)選實施方案中，第二鏈也包含突出端，優(yōu)選地在5'-端。在根據本發(fā)明的第三方面的核糖核酸的一個實施方案中，第一鏈的3'-端含有突出端。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的一個實施方案中，核糖核酸中的至少一個核苷酸在2'-位有修飾，該修飾優(yōu)選地選自包含氨基、氟、甲氧基、烷氧基和垸基的組。在本發(fā)明的第四方面，通過含有雙鏈結構的核糖核酸解決了問題，其中所述的雙鏈結構含有第一鏈和第二鏈，所述的第一鏈含有連續(xù)核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地與目標核酸互補，所述的第二鏈含有連續(xù)核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地與目標核酸相同，其中，所述的第一鏈和/或所述的第二鏈含有多個在2'-位具有修飾的修飾的核苷酸基團，其中在鏈中的每個修飾的核苷酸基團在一側或兩側與核苷酸連接基團連接，形成核苷酸的連接基團的連接核苷酸是未修飾的核苷酸，或者是具有修飾的核苷酸，所述修飾不同于修飾核苷酸的修飾。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的一個實施方案中，所述的核糖核酸是根據本發(fā)明的第一、第二或第三方面的核糖核酸。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，所述的第一鏈和/或所述的第二鏈含有多個修飾的核苷酸。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，所述的第一鏈含有所述多個修飾的核苷酸基團。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，所述的第二鏈含有所述多個修飾的核苷酸基團。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的一個優(yōu)選實施方案中，修飾的核苷酸基團和/或核苷酸連接基團包含許多核苷酸，其中的數目選自包含1個核苷酸一IO個核苷酸的組。關于這里指定的任何范圍，應當理解，每一個范圍都公開了用于定義該范圍的各數值之間的任何整數，包括所述的定義該范圍的兩個數值。在本申請中，所述的組因此包含1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸和IO個核苷酸。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，所述的第一鏈的修飾的核苷酸模式與所述的第二鏈的修飾的核苷酸模式相同。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的一個優(yōu)選實施方案中，所述的第一鏈的模式與所述的第二鏈的模式匹配(align)。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的一個備選實施方案中，所述的第一鏈的模式替換為一個或多個與第二鏈的模式相關的核苷酸。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的一個實施方案中，所述的修飾選自包含氨基、氟、甲氧基、垸氧基和烷基的組。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，雙鏈結構是平端的。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的一個優(yōu)選實施方案中，雙鏈結構的兩端都是平端的。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，雙鏈結構在第一鏈的5'-端和第二鏈的3'-端定義的雙鏈結構端是平端的。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，雙鏈結構在第一鏈的3'-端和第二鏈的5'-端定義的雙鏈結構端是平端的。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，雙鏈中的至少一個在5'-端具有至少一個核苷酸的突出端。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的一個優(yōu)選實施方案中，突出端由至少一個脫氧核糖棒苷酸組成。在根據本發(fā)明的第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，所述鏈中的至少一個在3'-端具有至少一個核苷酸的突出端。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的一個實施方案中，雙鏈結構的長度為約17—21個堿基，更優(yōu)選18或19個堿基。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，所述的第一鏈的長度和/或所述的第二鏈的長度相互獨立地選自包含約15—約23個堿基、17—21個堿基和18或19個堿基的范圍的組。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的一個優(yōu)選實施方案中，所述的第一鏈和目標核酸的互補性是準確的。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的一個實施方案中，第一鏈和目標核酸形成的雙鏈體包含至少15個核苷酸，其中在形成所述的雙鏈結構的所述第一鏈和目標核酸之間有一個錯配或兩個錯配。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的一個實施方案中，第一鏈和第二鏈每個都包含至少一個修飾的核苷酸基團和至少一個核苷酸連接基團，其中每一個修飾的核苷酸基團包含至少一個核苷酸，每一個核苷酸連接基團包含至少一個核苷酸，且第一鏈中的每一個修飾的核苷酸基團與第二鏈中的核苷酸連接基團相匹配，其中第一鏈的多數5'端核苷酸是修飾的核苷酸基團的核苷酸，第二鏈的多數3'端核苷酸是核苷酸連接基團的核苷酸。在根據第四方面的核糖核酸的一個優(yōu)選實施方案中，每一個修飾的核苷酸基團由單個核苷酸組成，和/或每一個核苷酸連接基團由單個核苷酸組成。在根據第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，在第一鏈上形成核苷酸連接基團的核苷酸是未修飾的核苷酸，它相對于形成修飾核苷酸基團的核苷酸位于3'方向，和其中在第二鏈上形成修飾的核苷酸基團的核苷酸是修飾的核苷酸，它相對于形成核苷酸連接基團的核苷酸位于5'方向。在根據第四方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，第一鏈包含8_12個、優(yōu)選9一11個修飾的核苷酸基團，其中第二鏈包含7—11個、優(yōu)選8—10個修飾的核苷酸基團。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的一個優(yōu)選實施方案中，目標基因選自包含結構基因、持家基因、轉錄因子、游動因子、細胞周期因子、細胞周期抑制劑、酶、生長因子、細胞因子和腫瘤抑制劑的組。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，第一鏈和第二鏈通過環(huán)結構連接。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的一個優(yōu)選實施方案中，環(huán)結構由非核酸聚合物組成。在它的一個優(yōu)選實施方案中，非核酸聚合物是聚乙二醇。在它的一個備選實施方案中，環(huán)結構由核酸組成。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的一個實施方案中，第一鏈的5'-末端連接到第二鏈的3'-末端。在根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的另外一個實施方案中，第一鏈的3'-末端連接到第二鏈的5'-末端。在本發(fā)明的第五方面，通過使用根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸解決了問題，用于目標驗證(targetvalidation)。在本發(fā)明的第六方面，通過使用根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸解決了問題，用于生產藥物。在根據本發(fā)明的第六方面的應用的一個優(yōu)選實施方案中，藥物是用于治療選自包含惡性膠質瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌、胰腺癌和白血病、糖尿病、肥胖癥、心血管病和代謝病的疾病或病癥。在第七方面，通過含有根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的細胞、優(yōu)選敲倒細胞(knockdowncell)解決了問題。在第八方面，通過含有根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的生物、優(yōu)選敲倒生物(knockdownorganism)解決了問題。在第九方面，通過含有根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的組合物解決了問題。在第十方面，通過含有根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸和可藥用載體的藥物組合物解決了問題。在第十一方面，通過抑制細胞中目標基因或其衍生物的表達的方法解決了問題，該方法包括將根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸以足以抑制目標基因表達的量導入細胞中，其中目標基因是根據本發(fā)明的任何方面的核糖核酸的目標基因。本發(fā)明是基于一個驚人的發(fā)現，即可以設計小的干擾RNA，使其在生物系統(tǒng)例如生化實驗或細胞環(huán)境常見的反應條件下具有高度的特異性、活性和穩(wěn)定性。在現有技術例如Tuschl等(國際專利申請WO01〃5164)中描述的各種干擾RNA的長度為21—23個核苷酸，并且在雙鏈RNA的3'端有修飾。本發(fā)明的發(fā)明人已經意外地發(fā)現，干擾RNA(包括小的干擾RNA(siRNA)，在下文中通常稱作RNAi)的穩(wěn)定性問題實際上是因為核酸內切酶f不是以前認為的核酸外切酶的攻擊。在這一發(fā)現的基礎上，本發(fā)明的發(fā)明人已經提出了用于本應用的幾種策略。，這樣，本發(fā)明涉及新形式的干擾RNA。RNAi由包含雙鏈結構的核糖核酸組成。所述的雙鏈結構由第一鏈和第二鏈形成。所述的第一鏈含有連續(xù)核苷酸的序列(在這里也稱作連續(xù)核苷酸的第一序列)，所述的第一序列至少部分地與目標核酸互補。所述的第二鏈也含有連續(xù)核苷酸的序列，所述的第二序列至少部分地與目標核酸相同。該核糖核酸的最基本的結構示意性地顯示在圖1中。所述的第一鏈和所述的第二鏈優(yōu)選地相互雜交，形成雙鏈結構。典型地通過WatsonCrick堿基配對進行雜交。但是，創(chuàng)造的核糖核酸在其長度方面沒有必要限于所述的雙鏈結構。還可以向每條鏈和/或形成RNAi的任何鏈的每一末端添加其它的核苷酸。根據第一序列和第二序列的特定序列，雜交或堿基配對不是一定要完整的或準確的，這意味著第一和第二序列由于錯配而沒有100%配對。雙鏈體中還可以由一個或幾個錯配。所述的錯配對RNAi活性沒有影響，如果位于優(yōu)選地15、16或17個配對核苷酸的序列之外。如果放置錯配以產生僅15或更少的連續(xù)的配對核苷酸，與17配對核苷酸雙鏈體相比，RNAi分子通常在下調對于給定的靶目標的mRNA中顯示降低的活性。第一鏈的連續(xù)核苷酸的第一序列基本上與目標核酸互補，更優(yōu)選地與目標核酸的一部分互補。這里使用的"互補"優(yōu)選地指第一鏈的核苷酸序列與目標核酸序列或其部分的核酸序列雜交。典型地，根據干擾核糖核酸的作用模式，目標核酸序列或目標核酸是單鏈RNA，更優(yōu)選mRNA。這種雜交最可能通過WatsonCrick堿基配對來完成，但是不一定限于此。所述的第一鏈和更具體地所述第一鏈的連續(xù)核苷酸的第一序列與目標核酸序列互補的范圍可以高達100%，也可以低至80%,優(yōu)選80-100%，更優(yōu)選85-100%，最優(yōu)選90-100%。最佳互補性好像是95_100%。該意義上的互補性指前述的核苷酸范圍，例如取決于特定范圍的80%-100%的核苷酸準確地進行WatsonCrick堿基配對。本發(fā)明的一個方面表明，所述的第一核苷酸序列和目標RNA之間的互補性必須是18—19個核苷酸，即使有兩個序列特異性突出端的短至17個核苷酸的序列也沒有介導RNAi的功能。因此，假設長為19個核苷酸或堿基對的雙鏈體，17個核苷酸或核苷酸堿基對的最小互補性是可以接受的，以允許2個核苷酸的錯配。如果雙鏈體由20個核苷酸或堿基對組成，17個核苷酸或核苷酸堿基對的互補性是可以接受的，并且是功能上有活性的。這同樣適用于共有17個互補核苷酸或堿基對的21個核苷酸或堿基對的雙鏈體。基本上，雙鏈體(即雙鏈結構)長度所需要的互補性的范圍也可以基于復合物的融解溫度，所述的復合物由這里描述的雙鏈結構形成，或由第一鏈的第一序列和目標核酸的復合物形成。應當理解，本發(fā)明的所有核糖核酸都適用于產生或參與RNA介導的干擾，例如國際專利申請W099/32619、WO00/44895禾nWO01/75164中所述的。根據本發(fā)明的第一種策略可以設計出的干擾核糖核酸分子應該有序列的18或19個核苷酸的最佳長度，它與目標核酸互補。本發(fā)明的范圍還包括，所述18或19個核苷酸的最佳長度是使用的RNAi中的雙鏈結構的長度。該長度要求與現有技術(例如國際專利申請W001/75164)中的技術教導明顯不同。根據本發(fā)明和現有技術的描述，關于具有所述長度特征(即18或19個核苷酸的長度)的干擾核糖核酸可以想到的任何其它設計都在本發(fā)明的范圍內。根據本發(fā)明的第二種策略可以設計出的干擾核糖核酸分子應該在第一鏈上有游離的5'羥基，這里也稱作游離的5'OH-基。游離的5'OH-基指存在形成第一鏈的大多數末端核苷酸，這樣也是未修飾的，特別是沒有末端修飾。典型地，還分別存在未修飾的第二鏈的末端5'-羥基。在一個更優(yōu)選的實施方案中，第一鏈和第一序列的3'-末端分別是未修飾的，例如存在游離的OH-基，這里也稱作游離的3'OH-基，其中5'末端核苷酸的設計是前述的實施方案中的任何一個的內容。優(yōu)選地，第二鏈和第二序列的3'-端也存在這種游離的OH-基。在根據本發(fā)明的前述的核糖核酸分子的其它實施方案中，分別地，第一鏈和第一序列的3'-末端和/或第二鏈和第二序列的3'-末端可以在3'-末端存在末端修飾。這里使用的術語游離5'OH-基和3'OH-基還表明，聚核苷酸的5'端和3'端的相應大多數末端核苷酸分別存在OH-基。這樣的OH-基可以出自核苷酸的糖部分，更優(yōu)選的出自5'OH-基的5'位和3'OH-基的3'位，或者出自連接到各末端核苷酸的糖部分上的磷酸基。磷酸基原則上可以連接到核苷酸的糖部分上的任何OH-基。優(yōu)選地，磷酸基連接到存在游離5'OH-基時糖部分上的5'OH-基和/或存在游離3'OH-基時糖部分上的3'OH-基，它們在這里也稱作游離5'或3'OH-基。如這里公開的設計RNAi的任何策略或RNAi的任何實施方案所使用的，術語"末端修飾"指添加到第一和/或第二鏈的大多數5'或3'核苷酸上的化學實體。這類末端修飾的實例包括但不限于反向的(脫氧)無堿基(abasic)、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、甲氧基、咪唑基、羧基、硫代(thioate)、d—d。低級烷基、取代的低級烷基、垸芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-、S-、或N-烷基；O-，S-或N-烯基；SOCH3;S02CH3;ON02;N02，N3;雜環(huán)烷基(heterozycloalkyl);雜環(huán)垸芳基(heterozycloalkaryl);氨基烷基氨基;聚垸基氨基或取代的甲硅垸基，如在歐洲專利EP0586520Bl或EP0618925Bl中公開的那些。這里使用的烷基或任何包括"烷基"的術語指含有1一12個、優(yōu)選l一6個和更多、優(yōu)選1一2個碳原子的任何碳原子鏈。其它的末端修飾是生物素基團。這樣的生物素基團可以優(yōu)選地連接到第一鏈和/或第二鏈的大多數5'或大多數3'核苷酸或二者。在一個更優(yōu)選的實施方案中，生物素基團是偶連到聚肽或蛋白上。本發(fā)明的范圍也包括，聚肽或蛋白通過任何其它前述的末端修飾連接。聚肽或蛋白可以賦予發(fā)明的核酸分子其它特征。其中，聚肽或蛋白可以作為其它分子的配體。如果所述的其它分子是受體，則可以通過結合配體來激活該受體的功能和活性。受體可以顯示出內化活性，這有利于結合到發(fā)明的核酸分子上的配體的有效轉染。要結合到發(fā)明的核酸分子上的配體的實例是VEGF，且相應的受體是VEGF受體。具有不同種類的末端修飾的本發(fā)明的RNAi的各種可能的實施方案如表1所示。表l根據本發(fā)明的干擾核糖核酸的各種實施方案<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>游離OH游離OH6.)5'-端3'-端游離OH末端修飾末，修飾游離OH7,)5'-端3'-端游離OH游離OH末端修飾末端修飾8.)5'-端3'-端游離OH末端修飾末端修飾末端修飾如此處所公開的的各種末端修飾優(yōu)選地位于核糖核酸的核苷酸的核糖部分。更具體地，末端修飾可以連接到或替換核糖部分的任何OH-基，包括但不限于2'OH、3'OH和5'OH位，假設這樣修飾的核苷酸是末端核苷酸。反向無堿基是不含有核堿基部分的核糖核苷酸或核糖核苷酸。這種化合物是(特別是)Sternberger等(2002)，Antisense.Nucl.Ac.DrugDev.inpress所述的。前述的任何末端修飾都可以與表1所述的RNAi的各種實施方案一起使用。與此相關地應該指出，帶有失活(優(yōu)選地通過帶有末端修飾，更優(yōu)選地在5'端)的有義鏈的這里所述的任何RNAi形式或實施方案是特別有益的。其原因是與這里所述的核糖核酸的第二鏈相對應的有義鏈的失活，它可能反過來干擾細胞中的無關的單鏈RNA。這樣，更特異性地影響細胞的轉錄物組(transcriptome)的表達和更具體的翻譯模式。該影響也稱作偏離目標的影響。參考表l，作為實施方案7和8進行說明的那些實施方案在上述意義上是特別有益的，因為修飾導致了目標非特異性的部分RNAi(它是第二鏈)的失活，這樣減少了第二鏈與單鏈RNA在細胞系統(tǒng)或類似系統(tǒng)中的任何非特異性相互作用，這時本發(fā)明的RNAi將用于分別降低(knockdown)特異性的核糖核酸和蛋白。本發(fā)明的第三個策略是提供了包含雙鏈結構的核糖核酸，其中所述的雙鏈結構含有第一鏈和第二鏈，所述的第一鏈含有連續(xù)核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地與目標核酸互補，所述的第二鏈含有連續(xù)核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地與目標核酸相同，其中所述的雙鏈結構是平端的。如在本說明書中使用的，術語"雙鏈結構"也稱作雙鏈體。因此，這樣的RNAi設計是明顯不同的，例如與Tuschl等在公開了3'-突出端的國際專利申請WO01/75164中所述的不同。這里使用的"突出端"指這樣的雙鏈結構，其中一條鏈的至少一個末端比形成該雙鏈結構的另一條鏈的相應末端長，它在這里也稱作反鏈(counterstrand)。優(yōu)選地，第一序列即為第一鏈，第二序列即為第二鏈。分別考慮到各核糖核酸的第一鏈或第二鏈或二者的平端RNAi的有效性和末端修飾的優(yōu)點，優(yōu)選組合兩種設計原則。換句話說，帶有表l所述的任何末端修飾方案的平端RNAi都在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明的第四個策略是在核糖核酸的5'-端具有突出端。更具體地，這樣的突出端原則上可以在根據本發(fā)明的核糖核酸的第一鏈或第二鏈或二者中。所述的突出端的長度可以短至一個核苷酸，也可以長至2—8個核苷酸，優(yōu)選2、4、6或8核苷酸。5'突出端可以位于根據本發(fā)明的核糖核酸的第一鏈和/或第二鏈也在本發(fā)朋的范圍內。形成突出端的核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其延長物。突出端優(yōu)選地含有至少一個脫氧核糖核苷酸，其中所述的一個脫氧核糖核苷酸優(yōu)選地是大多數的5'-端的一個。本發(fā)明也包括，發(fā)明的核糖核酸的各反鏈的3'-端沒有突出端，更優(yōu)選地沒有脫氧核糖核苷酸突出端。再者，發(fā)明的任何核糖核酸都可以包含表1中列出的末端修飾方案和/或這里列出的末端修飾。設計本發(fā)明的干擾核糖核酸的第五種策略是，在根據本發(fā)明的至少一條鏈上，更具體地，在核糖核酸的連續(xù)核苷酸的一個序列上形成特定的修飾的核苷酸的模式。所述的核苷酸的修飾類型可以與在這里公開的設計干擾RNA的其它策略中討論的相同，更具體地，'這里所述的對于末端修飾或作為末端修飾的修飾類型例如在至少一個形成根據本發(fā)明的核糖核苷酸的核苷酸的核糖部分上的反向無堿基、甲氧基或氨基等。應當指出，所述的核苷酸的修飾可以是這里所述的任何形式的修飾，更具體地，這里所述的末端修飾的修飾類型具有一個特征，即所謂的末端修飾不一定在末端核苷酸上。更合適的修飾是在非末端核苷酸上。在該條件下，修飾優(yōu)選地在修飾的(或要修飾的)核苷酸的核糖部分上，更優(yōu)選地在核糖部分的2'位。本發(fā)明還包括，根據該策略設計的任何核糖核酸還可以具有這里所述的任何其它設計策略賦予根據本發(fā)明的核糖核酸的特征。因此，具有修飾的核苷酸模式的干擾核糖核酸可以有末端修飾，末端修飾方案可以是平端的，或可以有5'突出端，或這些元素或特征中的兩個或多個的任何組合。除了上面所述的可以作為末端修飾或修飾模式存在的修飾外，這里的核糖核酸骨架還可以通過在核苷酸之間形成不同連接來修飾。這樣的不同連接是在(特別是在)歐洲專利EP0586520Bl和歐洲專利EP0618925Bl中記載。此處特別感興趣的是核糖核酸骨架的內部修飾，已經表現它能賦予核糖寡核苷酸較高的核酸酶耐受性。在一個優(yōu)選實施方案中，修飾的核苷酸的修飾是核苷酸的核糖部分上的2'-0H-基的甲氧基化。在一個優(yōu)選實施方案中，兩條鏈(更具體地，第一序列和第二序列)都有這種分別形成所述鏈和序列的核苷酸的修飾類型。但是，本發(fā)明還包括，第一鏈和第一序列(或第二鏈和第二序列)分別有這種特殊的核苷酸修飾模式。這里使用的術語核苷酸修飾基團或核苷酸連接基團可以包含或代表少至一個核苷酸，即一個或多個核苷酸?？紤]到連續(xù)核苷酸的序列，可以將形成序列的核苷酸的修飾模式設計成單核苷酸或核苷酸基團表現出這種修飾，所述單核苷酸或核苷酸基團彼此通過標準磷酸二酯鍵或至少部分地通過硫代磷酸鍵共價地連接。當這種核苷酸或這里也稱作"修飾的核苷酸基團"的核苷酸基團沒有形成所述序列的5'-端或3'-端時，核苷酸或核苷酸基團繼續(xù)(followon)不含有前面的核苷酸或核苷酸基團的修飾的核苷酸的兩端。但是應當指出，這種核苷酸或核苷酸基團可以有不同的修飾。這種核苷酸或核苷酸基團在這里也稱作核苷酸連接基團。分別地，修飾的核苷酸和修飾的核苷酸基團的序列，和未修飾的或不同地修飾的核苷酸或未修飾的或不同地修飾的核苷酸基團的序列，可以重復一次或幾次。優(yōu)選地，該序列重復不止一次。為了清楚起見，下面更詳細地討論模式，它一般稱作修飾的核苷酸基團或未修飾的核苷酸基團，其中每一個所述的基團實際上都可以包含少至一個核苷酸。這里使用的"未修飾的核苷酸"分別指在形成各核苷酸或核苷酸基團的核苷酸上沒有任何前述的修飾，或具有與修飾的核苷酸和核苷酸基團的修飾所不同的修飾。本發(fā)明還包括未修飾的核苷酸的修飾，其中這樣的未修飾的核苷酸實際上是以與修飾的核苷酸的修飾不同的方式修飾，可以與形成所述的未修飾的核苷酸的各種核苷酸或各種核苷酸連接基團相同甚至不同。修飾的和未修飾的核苷酸的模式可以是這樣的，該鏈或序列的5'-端核苷酸以核苷酸的修飾的基團或核苷酸的未修飾的基團起始。但是，在一個備選實施方案中，5'-端核苷酸可以是由核苷酸的未修飾的基團形成。這種模式可以在干擾RNA的第一序列或第二序列或二者上實現。必須指出，siRNA雙鏈體的目標互補鏈上的5'磷酸酯是siRNA功能所必需的，這表明細胞通過游離5'OH(它可以被磷酸化)檢查siRNA的真實性，并僅允許這樣的真實的siRNA指導目標RNA的破壞(Nykanen,等(2001)，Cell107，309-21)。優(yōu)選地，第一序列顯示出核苷酸的修飾的和未修飾的基團的一種模式，即核苷酸的修飾的核苷酸基團和連接基團的模式，而第二序列未顯示出這種模式。在這樣的范圍內，即第一序列實際上在RNA干擾現象下的目標特異性降解過程中是更重要的，所以為了特異性的原因，'可以化學修飾第二序列，因為它在介導RNA干擾中不起作用，這可以是有用的。但是，本發(fā)明也包括第一序列和第二序列都有這種模式。優(yōu)選地，第一序列和第二序列的修飾模式和非修飾模式是相同的。在一個優(yōu)選實施方案中，形成第二序列且與第一序列的核苷酸的修飾基團對應的核苷酸基團也是被修飾的，而形成第二序列或第二序列的核苷酸的未修飾基團與形成第一序列或第一序列的核苷酸的未修飾的基團對應。這種可能性在圖2A中示意性地說明。另外一個備選方案是，第一序列和第一鏈各自的修飾模式相對于第二序列和第二鏈各自的修飾模式存在相轉移。優(yōu)選地，該轉移是，第一鏈核苷酸的修飾的基團與第二鏈核苷酸的未修飾的基團對應，反之亦然。這種可能性在圖2B中示意性地說明。本方面還包括，修飾模式的相轉移是不完全但重疊的，如圖2C所示。在一個優(yōu)選實施方案中，鏈和序列各自末端的第二核苷酸是未修飾的核苷酸或未修飾的核苷酸的起始基團。優(yōu)選地，該未修飾的核苷酸或未修飾的核苷酸基團分別位于第一鏈和第二鏈的5'-端，更優(yōu)選地第一鏈的5'-端。在另外一個優(yōu)選實施方案中，未修飾的核苷酸或未修飾的核苷酸基團分別位于第一鏈和第一序列的5'-端。在一個優(yōu)選實施方案中，模式由交替的單個的修飾的和未修飾的核苷酸組成。在本發(fā)明的該方面的另外一個優(yōu)選實施方案中，干擾核糖核酸主題包含兩鏈，其中2'-0-甲基修飾的核苷酸和未修飾的核苷酸，優(yōu)選地非2'-0-甲基修飾的核苷酸，以交替的方式整合在兩鏈上，這意味著每一個第二核苷酸分別是2'-0-甲基修飾的和未修飾的核苷酸。這意味著第一鏈上的一個2'-0-甲基修飾的核苷酸后面是未修飾的核苷酸，它后面又依次是2'-0-甲基修飾的核苷酸，等等。2'-0-甲基修飾和未修飾的相同序列也在第二鏈上，其中優(yōu)選地存在相轉移，這樣第一鏈堿基上的2'-0-甲基修飾的核苷酸與第二鏈上的未修飾的核苷酸配對，反之亦然。在短干擾核糖核酸(即短堿基配對的雙鏈核糖核酸)的情況下，這種特殊的排列(即兩條鏈上的2'-0-甲基修飾的和未修飾的核苷酸的堿基配對)是特別優(yōu)選的，因為假設，雖然本發(fā)明的發(fā)明人希望不受下述理論的限制，即在兩個堿基配對的2'-0-甲基修飾的核苷酸之間存在某^^斥力，這會使雙鏈體、優(yōu)選短雙鏈體不穩(wěn)定。關于特殊排列，這是優(yōu)選的，如果反義鏈起始于在5'端的2'-0-甲基修飾的核苷酸，而因此第二個核苷酸是未修飾的，第三、第五、第七個等核苷酸因此又是2'-0-甲基修飾的，而第二、第四、第六、第八個等核苷酸則是未修飾的核苷酸。另外，希望不受任何理論的限制，似乎不包含任何修飾的反義鏈的5'末端的第二個、任選的第四、第六、第八個和/或相似位是特別重要的，而大多數5'末端核苷酸，即反義鏈的第一個5'末端核苷酸可以在任何奇數位存在這樣的修飾，例如反義鏈的第一個、任選的第三、第五和相似位可以被修飾。在其它實施方案中，修飾的和非修飾的核苷酸各自的修飾和不修飾可以是這里所述的任何一個。雖然不限于此，發(fā)明的核糖核酸的雙鏈結構，也稱作雙鏈體，分別是由第一鏈和第二鏈、或連續(xù)核苷酸的第一和第二序列形成。第一和第二序列各自的長度典型地是約15—約23個堿基，優(yōu)選地17—21個堿基，更優(yōu)選地18或19個堿基。在這方面應當指出的是，低于30個核苷酸、優(yōu)選地低于21個核苷酸的長度不會使基本上能夠顯示出RNA干擾和干擾素反應的任何生物系統(tǒng)產生干擾素反應。其原因是觀察到，當長度超煤30個堿基對的雙鏈RNA結合并激活蛋白激酶PKR和2',5'-寡腺苷酸合成酶時，特定的細胞正在經歷深刻的生理學改變。激活的PKR通過elF2a磷酸化阻止翻譯，激活的2',5'-AS造成mRNA降解。在目標評價和動物模型中不希望發(fā)生這些作用，因為它們負面地影響表型的目標特異性降低。根本設計本發(fā)明的干擾核糖核酸的第六個策略，核糖核酸包含雙鏈結構，所述的雙鏈結構含有第一鏈和第二鏈，所述的第一鏈含有連續(xù)核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地與目標核酸互補，所述的第二鏈含有連續(xù)核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地與目標核酸相同，第一鏈的一個末端和第二鏈的一個末端通過環(huán)結構連接。在一個實施方案中，環(huán)結構由非核酸聚合物組成。這種非核酸聚合物可以是聚乙二醇或類似聚合物。非核酸聚合物原則上可以選自包含聚合物的組，所述聚合物不含有聚核苷酸且能使要連接的兩條鏈可以實際上相互雜交。為了允許這樣的雜交，連接兩個相互雜交的序列的分子或分子部分必須具有某種分子結構或分子柔性，以允許分子的彎曲，從而使兩個序列能緊密接觸并形成允許雜交的三維定向。這樣的分子或部分真正地作為鉸鏈。原則上，滿足該要求的任何分子都可以用于本發(fā)明。除了聚乙二醇外，還可以使用基于氨基酸的分子。這樣的基于氨基酸的分子可以是同源聚合物或異源聚合物。有用的實例是由7個甘氨酸殘基組成的同源聚合物，它允許生成要求的鉸鏈，以如需要使兩個序列近距離雜交?；诟拾彼岬你q鏈記載在，例如GuanK.L.和DixonJ.E.(1991)，AnalBiochem.192，262中。在另外一個實施方案中，鉸鏈可以通過本領域已知的冠醚形成。在一個備選實施方案中，環(huán)由核酸組成。如這里使用的，如在Elayadi和Corey(2001)CurrOpinInvestigDrugs.2(4):558-61.綜述；Orum和Wengel(2001)CurrOpinMolTher.3(3):239-43中記載的LNA和PNA被認為是核酸，也可以用作成環(huán)的聚合物?；A地，第一鏈的5'-末端可以連接到第二鏈的3'-末端。作為備選方案，第一鏈的3'-端可以連接到第二鏈的5'-末端。形成所述環(huán)結構的核苷酸序列通常被認為不是關鍵的。但是，由于空間原因，形成該環(huán)的核苷酸序列的長度好像是關鍵的。因此，最小4個核苷酸的長度好像適合形成需要的環(huán)結構。原則上，不限制形成鉸鏈或要雜交的兩個序列之間的連接的核苷酸的最大數目。但是，聚核苷寧越長，二級結構和三級結構更容易形成，從而影響，求的序列定向。優(yōu)選地，形成鉸鏈的核苷酸的最大數目是約12個核苷酸。本發(fā)明的內容包括，上述的任何設計都可以組合第六個策略，即以能通過環(huán)結構或類似結構產生后折疊(環(huán))的方式共價地連接兩條鏈。發(fā)明人已經意外地發(fā)現，如果環(huán)是位于反義鏈的3'端，即根據本發(fā)明的核糖核酸的第一鏈，這類RNAi的活性比在反義鏈的5'端的環(huán)位置更高。因此，與反義鏈和有義鏈(即第一鏈和第二鏈)分別有關的特殊環(huán)排列是至關重要的，因而這與現有技術所表述的理解(即認為與定向無關)相反。但是，根據這里所述的實驗結果，這好像是錯誤的。現有技術所表述的理解是基于一個假設，即在加工任何RNAi的過程中產生非環(huán)連接的RNAi。但是，如果這是正確的，就不能解釋清楚地觀察到的具有反義鏈的3'端環(huán)的那些結構的增加的活性。迄今為止，在這種小的干擾RNAi的5'—3'方向的優(yōu)選排列是第二鏈-環(huán)-第一鏈。相應的結構可以整合到合適的載體系統(tǒng)中。優(yōu)選地，該載體包含用于表達RNAi的啟動子。相應的啟動子優(yōu)選地是poim，啟動子更優(yōu)選地是Good等(1997)GeneTher,4,45-54中所述的U6、Hl、7SK啟動子。由于干擾RNA概念的普遍應用和編碼核苷酸(例如mRNA)的降低或敲除，通過使用根據本發(fā)明的任何核糖核酸分子，在其表達過程中可以修飾產生這樣的RNA的任何基因。由于該基礎的和普遍的應用機制，可以實現任何基于此的應用，其暗示基因的降低或敲除。優(yōu)選的應用是發(fā)明的核糖核酸在目標認證中的應用。這里使用的"目標認證"是指一種方法，它包括采取步驟證明DNA、RNA或蛋白分子是直接地參與生物學過程，優(yōu)選以參與疾病或非標準病癥為原因的過程，和因此是開發(fā)新的治療化合物的合適目標。序列的同源性研究已經成功地將基因歸類到目標家族中。需要以有效的方式完成艱巨的任務，即解密這些目標中的哪一些是疾病中的重要因素，哪一些應當用于后續(xù)的藥物開發(fā)。因此，基因表達的降低應當減少約50—100%(優(yōu)選90%)以觀察到對表型的顯著影響。在其它依賴于基因的情況下，小至20%的降低可能足以產生表型。通過對比含有功能性RNAi分子的細胞與含有非功能性RNAi分子的細胞來定義表型。這能確保顯著的讀出，即使在僅僅部分地抑制蛋白功能的條件下。mRNA減少的程度與表型改變的范圍通常沒有線性關系。必須承認，對于一些蛋白而言，減少約20%的蛋白就足以產生表型的改變，而分別對于其它基因和mRNA，少至5—10%的剩余蛋白就足以維持觀察到的表型。根據本發(fā)明的核糖核酸分子的其它的應用是，其在生產藥物中的應用或其作為藥物的應用。這樣的藥物可以用于治療和/或預防疾病或病癥，例如任意類型的癌癥，其中的基因和其產物己經與該疾病的發(fā)生、起因或進程相關聯(lián)。另外，這樣的藥物可以用于治療疾病，其中基因產物的存在或過表達造成病理表型。在一個優(yōu)選實施方案中，疾病的特征在于功能增加，并且可以通過應用或施用相應的生物活性的RNAi來補償。可以使用包含這里所述的核糖核酸的藥物治療疾病或病癥，它們可以選自包含癌癥、心臟病、代謝病、皮膚病、炎癥疾病、免疫系統(tǒng)疾病和自身免疫疾病的組。各種形式的癌癥包括但不限于實體瘤和造血系統(tǒng)瘤，例如惡性膠質瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和白血病。代謝病包括但不限于肥胖癥和糖尿病。皮膚病包括但不限于銀屑病。在另外一方面，根據本發(fā)明的核糖核酸分子可以用作診斷劑，優(yōu)選用于與上述疾病和病癥有關的指定的那些疾病。這樣的診斷可以基于這一發(fā)現，即將根據本發(fā)明的核糖核酸分子應用到樣品(它優(yōu)選地含有細胞)上，會發(fā)生樣品表達模式的改變。優(yōu)選地，該樣品含有來自受試者的細胞，所述受試者假設可能表現出待治療的所述疾病或病癥或其傾向。根據本發(fā)明的核酸的其它應用是它們在篩選藥學上有活性的化合物和/或先導化合物優(yōu)化中的應用。進行后者是為了例如監(jiān)視或檢測備選藥物(例如小分子)的效果，并將所述備選藥物產生的效果與通過施用特異性RNAi觀察到的效果作對比，所述的RNAi的設計基礎是這里公開的原理。在這樣操作的過程中，具有偏離目標效果的備選藥物可以從篩選過程中刪除，而那些產生相似的或等同的表型的備選藥物則被認為是高度地相關的先導化合物，或可能甚至是藥學上有活性的化合物自身。在該方法中，高度特異性的RNAi分子作為黃金標準，據此檢測備選藥物。另一方面，本發(fā)明涉及一種細胞，優(yōu)選降低的細胞，它含有這里公開的核糖核酸。這樣的細胞優(yōu)選地是在組織或甚至器官中分離或含有的細胞，所述的組織或器官又優(yōu)選地在生物中不含有。但是，該細胞也可yl在生物中含有。該細胞優(yōu)選地是參與要用本發(fā)明的核糖核酸治療的疾病或病癥的細胞。為了說明功能上的關系和檢測下游目標，這種降低的細胞可以用于產生基于如mRNA或蛋白的表達模式。另一方面，本發(fā)明涉及含有這里公開的核糖核酸的生物。優(yōu)選地，該生物是脊椎生物；更優(yōu)選地，該脊椎生物是哺乳動物。這里使用的"哺乳動物"特別是但不限于猿、狗、貓、山羊、綿羊、豬、豚鼠、兔子、小鼠、大鼠和人。另一方面，本發(fā)明涉及含有根據本發(fā)明的核糖核酸的組合物。優(yōu)選地，該組合物包含陰性對照和陽性對照，它們與有效的核糖核酸或其分離物相組合。該組合物還可以包含溶劑，優(yōu)選緩沖劑。另一方面，本發(fā)明涉及含有根據本發(fā)明的核糖核酸和可藥用載體的藥物組合物。可藥用載體是本領域技術人員已知的，特別包括稀釋劑、緩沖劑等。藥物組合物還可以包含藥學上有活性的化合物。要使用根據本發(fā)明的核糖核酸分子治療的疾病或病癥優(yōu)選地是現在已經在治療所述疾病或病癥方面使用的那些。由于根據本發(fā)明的核糖核酸分子的不同作用模式和根據現有技術用于治療所述疾病和病癥的藥物，可以發(fā)生協(xié)同作用?，F在參考附圖和實施例進一步解釋本發(fā)明，從中可以看出本發(fā)明的其它的特征、實施方案和優(yōu)點。圖1顯示了定義這里使用的術語的示意圖。兩條鏈中上面的一條為第一鏈和目標核酸(例如mRNA)的反義鏈。第二鏈是其序列基本上與目標核酸對應，并從而形成有義鏈。第一鏈和第二鏈形成雙鏈結構，典型地通過WatsonCrick堿基配對。圖2說明了本發(fā)明的帶有修飾的或未修飾的核苷酸基團模式(它們在這里也被稱作修飾模式)的核糖核酸分子的一些實施方案。核苷酸的修飾的基團在這里也被稱作修飾的核苷酸的基團。如此處使用，在這里稱作核苷酸的連接基團的未修飾的核苷酸或核苷酸的未修飾的基團還可以具有一個或多個這里所述的修飾，但是它們不同于形成修飾的核苷酸基團的核苷酸的修飾。在圖2A中，修飾的和未修飾的核苷酸基團(即第一序列和第二序列上的修飾的核苷酸基團和核苷酸的連接基團)位于序列的相應部分，并這樣相互匹配(第一鏈上的修飾的核苷酸基團與第二鏈上的修飾的核苷酸基團匹配，第一鏈上的核苷酸連接基團與第二鏈上的核苷酸連接基團匹配)；而在圖2B中，第一鏈上實現的模式也在第二鏈上實現，但是存在的相轉移使第一序列的修飾的核苷酸基團與第二序列的未修飾的核苷酸基團進行堿基配對，反之亦然，結果。第一鏈上的修飾的核苷酸基團與第二鏈上的核苷酸連接基團相匹配。在圖2C中實現了排列修飾的和未修飾的核苷酸基團的另外一種可能性。本發(fā)明也包括，第一序列的模式獨立于第二序列的模式，通過堿基配對定義的雙鏈結構中的兩個模式根據相對位置部分地相互重疊。在另外一個實施方案中，該重疊的范圍可以分別根據序列和鏈的長度而變化。圖3顯示了使用具有不同末端保護基團的RNAi分子的降低實驗的結果。更具體地，圖3A表明，各種形式的末端保護的RNAi分子對PTENmRNA的降低是有作用的。圖3B顯示了在實驗中使用的不同RNAi分子的序列，實驗結果如圖3A所示。圖3C顯示了用修飾的RNAi分子處理后PTEN蛋白與PTEN特異性的反義構建體相比的免疫印跡分析。圖4表明RNAi分子的3'突出端對RNA干擾是不重要的。更具體地，圖4A顯示了不同RNAi分子的劑量反應曲線，圖4B顯示了在實驗中使用的RNAi分子的序列，實驗結果如圖4A所示。圖5表明RNAi分子的雙鏈體長度必須是至少18—19個核苷酸。更具體地，圖5B顯示了在實驗中使用的PTEN特異性的RNAi分子的序列，實驗結果如圖5A所示的劑量反應曲線。圖6表明在長度為19個核苷酸的RNAi分子中的四個末端錯配的核苷酸對介導Aktl降低仍然有作用。更具體地，圖6B顯示了在實驗中使用的RNAi分子的序列，實驗結果如圖6A所示。圖7顯示了對雙鏈體長度要求和對siRNA中的突變的耐受的進一步結果。更具體地，圖7A顯示了使用的各種構建體(左區(qū))和相對于在介導量的siRNA分子中使用的pllOa的表達對HeLa細胞中的AktlmRNA表達的抑制的各自影響(右區(qū))。在錯配的siRNA分子中的核苷酸改變以箭頭標明3'脫氧核苷酸，如果有則以大寫字母標明。圖7B顯示了各種PTEN特異性的siRNA(左區(qū))，不同量的siRNA對HeLA細胞中的PTENmRNA表達的抑制表示為PTEN/pllOa比(中區(qū))，圖7C的Western印跡分析說明了分別48和96小時后使用PTEN特異性的siRNA(30nM)和各錯配siRNA對PTEN蛋白表達的抑制，使用plOOa作裝載對照。圖8顯示了經2'-0-甲基化賦予RNAi分子的在血清中穩(wěn)定性的研究結果，并表明末端修飾對RNAi的穩(wěn)定性沒有有益作用。更具體地，圖8A顯示了與胎牛血清孵育的圖8B所示的各種RNAi分子的凝膠電泳結果。圖9表明氨基末端修飾會導致活性的減少。圖9B顯示了在實驗中使用的特殊RNAi分子，實驗結果如圖9A所示，表達為PTEN/pllOa表達水平比。圖9C顯示了可以從圖9A所示的結果推導出的設計原則。如在圖9C中使用的，術語"有作用的"指在實施例所述的特殊分析系統(tǒng)中是功能上有活性的，"無作用的"指在所述的系統(tǒng)中是功能上無活性的。圖10表明2'-0-烷基(甲基)修飾能穩(wěn)定RNAi分子，但是也會降低它們的活性。更具體地，圖10C顯示了在實驗中使用的RNAi分子的序列，實驗結果如圖10A所示的劑量反應曲線。圖10B顯示了與胎牛血清孵育2小時的圖10C所示的各種RNAi分子的凝膠電泳結果。圖11顯示了用2'-0-甲基修飾阻斷的RNAi分子的功效實驗結果。圖IIA用劑量反應曲線圖示地說明了所述實驗的結果，圖IIC顯示了在所述實驗中使用的特殊RNAi分子的序列。圖11B顯示了與胎牛血清孵育2小時的圖llC所示的各種RNAi分子的凝膠電泳結果。圖12表明交替的2'-0-甲基修飾使修飾的RNAi分子比未修飾的形式有活性。更具體地，圖12B顯示了在該實驗中使用的RNAi分子的序列，實驗結果如圖12A所示。圖12C顯示了所述的RNAi分子在血清中孵育2小時后的穩(wěn)定性。圖12D顯示了將不同RNAi分子應用到HeLa細胞時PTEN蛋白的免疫印跡。從中可以看出，交替修飾的RNAi分子被穩(wěn)定化后能耐受核酸內切酶的降解，在介導PTEN蛋白的降低中也有活性。圖13顯示了Western印跡分析以檢測PTEN蛋白降低的時間進程的結果。使用陽離子類脂，以2'-0-甲基修飾的相對未修飾的RNAi分子連續(xù)轉染細胞72小時。48和120小時后制備蛋白裂解物并通過免疫印跡和分析。在96小時和120小時的時間點，在沒有RNAi分子的條件下將細胞分離、重新涂平板并孵育另外的24和48小時。一圖14顯示了說明持續(xù)使用交替修飾的RNAi分子相對未修飾的RNAi分子PTEN蛋白降低的Western印跡。轉染只進行了5小時，加入無轉染試劑的新培養(yǎng)基。在用所述的RNAi分子轉染后的72小時和96小時，通過免疫印跡分析裂解物。圖15表明帶有不同的2'-0-甲基核糖核苷酸修飾的siRNA分子顯示出增高的在血清中的穩(wěn)定性，并且介導HeLa細胞中的蛋白降低。更具體地，圖15A表明了使用的各種siRNA分子構建體(左區(qū))，其中2'-0-甲基核糖核苷酸修飾標有下劃線，并在序列中以粗體標示。對在用標示量的修飾的siRNA分子轉染的HeLa細胞中的PTENmRNA表達的抑制表示為PTEN/pllOa比，并標示在右區(qū)。圖15B的左區(qū)顯示了使用的各種siRNA構建體，右區(qū)顯示了在血清中孵育后的修飾的和未修飾的siRNA分子的PAA凝膠電泳；含有2'-0-甲基核糖核苷酸的各種構建體以下劃線標示并以粗體打印。圖15C顯示了說明使用分別圖15A和15B所示的各種siRNA構建體(30nM)對PTEN蛋白表達的抑制的基于SDS-PAGE的免疫印跡。另外，pll0a用作裝載對照。最后，圖15D是說明48和128小時后施用不同的2'-0-甲基核糖核苷酸修飾的siRNA分子(30nM)的延長的蛋白降低(即PTEN蛋白表達的抑制)的免疫印跡。如圖15C所示，pll0a用作裝載對照。圖16表明，帶有對Aktl和pllO卩mRNA特異性的不同2'-0-甲基核糖核苷酸修飾的siRNA分子顯示出增高的在血清中的穩(wěn)定性，并且介導HeLa細胞中的蛋白降低。更具體地，圖16A的左區(qū)標示使用的各種構建體，其中2'-0-甲基核糖核苷酸標有下劃線并以粗體打印。標示的siRNA分子在血清中孵育后的完整性顯示在右區(qū)。圖16B顯示了用標示的siRNA(30mM)轉染細胞后的Aktl、Akt2和Akt磷酸化和p110用作裝載對照的免疫印跡。圖16C顯示了標有下劃線并以粗體打印具有2'-0-甲基修飾的各種pll0f3特異siRNA構建體(左區(qū))，和所述的siRNA構建體抑制下游激酶Aktl的磷酸化的免疫分析結果(右區(qū))。pll0a已經用作裝載對昭。/"、o圖17的劑量反應曲線顯示了具有發(fā)夾結構的各種RNAi分子的功效，而圖17B顯示了所述RNAi分子的結構，其結果如圖17A所示。含有不同環(huán)的合成siRNA在減少p110(3、Aktl和Akt2表達中起作用。(14A)在siRNA轉染的HeLa細胞中pllOpmRNA表達的抑制。在標示的siRNA轉染后24小時，平行地分析樣品中的pllOPmRNA表達水平。示意性地顯示了轉染的雙分子siRNA(具有3'TT突出端的21mer，分子IAB)或具有環(huán)結構的單分子siRNA。注意到在3A、4A相對于3B、4B中相對于反義序列的環(huán)(HIV衍生的pA-環(huán)；(A)u-環(huán))的位置是相反的。2ABsiRNA分子在21mer雙鏈體中含有6個錯配，并和未處理的樣品一起作為陰性對照。制備RNA后對其進行實時RT-PCR(Taqman)分析。顯示了相對于作為內部參考的pllOamRNA水平的p110(3mRNA水平。每一個條代表三次轉染(土標準偏差)。在生長培養(yǎng)基中以標示濃度的siRNA在50%匯合(2500細胞/96孔)時轉染HeLa細胞。圖18的劑量反應曲線顯示了具有分子間環(huán)結構和分子內環(huán)結構的各種RNAi分子的功效。(18A)在siRNA轉染的HeLa細胞中的AktlmRNA表達的抑制。在標示的siRNA轉染后24小時，平行地分析樣品中的Aktl和Akt2mRNA表達水平。示意性地顯示了不同環(huán)(A-環(huán)；GAGA-環(huán)和聚乙二醇(PEG)-連接物)和它們的推定二級結構。siRNA分子9A對Akt2是特異性的，并作為陰性對照。注意到IOA和10B不含有自身互補序列，并組合轉染。顯示了相對于作為內部對照的pll0|3mRNA水平的AktlmRNA水平。(18B)在標示的siRNA分子轉染的HeLa細胞中的Akt2mRNA表達的抑制。顯示了相對于pll0卩mRNA水平的Akt2mRNA水平。Aktl特異分子7A在這里作為陰性對照。圖18C顯示了Akt蛋白的Western印跡分析，它說明了含有不同環(huán)的合成siRNA在特異性地降低Aktl和Akt2表達中的作用。通過免疫印跡分析了Aktl和Akt2蛋白表達的抑制。標示的發(fā)夾siRNA(20nM)轉染后48小時收集細胞。通過SDS-PAGE分離細胞提取物，并通過使用抗-p110抗體、抗Aktl/2的免疫印跡進行分析。用特異于磷酸化形式Aktl的抗體得到了類似結果。左邊標明了pllOa(PI3-激酶的另外一個催化亞基，它用作裝載對照)、Aktl、Akt2和磷酸化的Akt(P、Akt)的位置。圖19顯示了NH2修飾(這里也稱作氨基修飾)，它可以存在于3'-OH末端核苷酸或5'末端核苷酸。氨基通過垸基連接到磷酸基上，后者又連接到糖部分的OH基團，所述的烷基包含l一8個(優(yōu)選6個)碳原子的烷基鏈，其中連續(xù)磷酸基的第2個碳原子具有與其相連的CH20H基團。作為備選，連接物可以由醚形成，其中該醚有兩種醇組成，其中的一種醇是氨基醇，另外一種是二醇，該二醇的一個醇基參與形成醚基，另外一個是位于任一個碳原子上的OH基，優(yōu)選地在相對于磷酸基的第2個碳原子上。實施例l:合成的雙鏈體RNAi分子的劑量反應在該實施例中研究了NH2末端保護基團對雙鏈體RNAi分子活性的影響。合成的siRNA購自Biospring(Frankfort,Germany)。將核糖-寡核苷酸重新懸浮于無核糖核酸酶的TE中至終濃度為50pM。關于雙分子siRNA分子的情況，組合等份試樣(100nM)至終濃度為50pM。為了形成分子內雙鏈體，將siRNA在退火緩沖液(25mMNaCl;5mMMgCl2)中、在5(TC孵育2分鐘，冷至室溫。根據生產商的說明，通過使用各種陽離子脂質侈!j如01igofectamine、Lipofectamine(LifeTechnologies)、NC388(RibozymePharmaceuticals,Inc.,Boulder,CO)或FuGene6(Roche)，在96孑L或10cm平板中進行轉染(30%—50°/。匯合)。通過將預制的5倍濃縮的退火RNAi和無血清培養(yǎng)基中的脂質的復合物加給完全培養(yǎng)基中的細胞來轉染RNAi分子。在轉染前，在轉染96孔形式前15—18小時，將2500HeLa細胞分布到每個孔中。分布在96孔中的細胞的總轉染體積是100^，在10cm平板中的細胞的總轉染體積是10ml。根據細胞密度，最終的脂質濃度為0.8—1.2嗎/ml;在每個實驗中都說明了RNAi濃度。允許在37t:形成復合物30分鐘。將復合物加給細胞，產生最終lx濃度的脂質和RNAi。根據在轉染后進行的分析，使用標準細胞裂解緩沖液裂解細胞以提取蛋白(Klippd，A.，Escobedo，J.A.，Hirano，M.和Williams,L.T.(1994).MolCellBio114，2675-2685)，或根據RNA分離試劑盒(Invitek，Berlin,德國)用變性緩沖液分離RNA，轉染后24—48小時進行RNA分析，轉染后48—72小時通過Western印跡迸行蛋白分析。通過Taqman分析檢測相對量的RNA水平轉染后24小時，使用InvisorbRNAHTS96試劑盒(InVitekGmbH，Berlin)分離并純化96孔中的轉染的細胞的RNA。使用300nMPTEN5'弓|物CACCGCCAAATTTAACTGCAGA、300nMPTEN3'弓|物AAGGGTTTGATAAGTTCTAGCTGT和100nMPTENTaqman探針Fam-TGCACAGTATCCTTTTGAAGACCATAACCCA-Tamra,并結合40nM(3-肌動蛋白5'引物GTTTGAGACCTTCAACACCCCA、40nMp-肌動蛋白3'引物GACCAGAGGCATACAGGGACA和100nM卩-肌動蛋白Taqman探針Vic-CCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTG-Tamra，通過實時RT-PCR(Taqman)分析檢測PTENmRNA表達的抑制。Akt引物和探針按照Sternberger等(Stemberger，a.a,O.)的方法檢測，并根據生產商的說明書(AppUedBiosystem;useofAmpliconSet)使用。還可以使用軟件程序PrimerExpress(AppliedBiosystem)設計所述的引物和探針。在50pl中進行反應，根據生產商的說明書在ABIPRISM7700序列檢測器(AppliedBiosystems)上進行分析，條件如下在48。C進行30分鐘，在95。C進行10分鐘，隨后進行40個下述條件的循環(huán)在95。C進行i5秒和在6(TC進行1分鐘。通過HeLa細胞的實時RT-PCR分析顯示RNA降低，所述的HeLa細胞由21nt長的未修飾的和在1.0pg/ml的脂質載體濃度用NH2或反轉的無堿基基團在5'-端修飾的siRNA雙鏈體分子轉染。細胞密度為2000細胞/孔。3'-端的修飾是RNA突出端、帶有氨基基團的RNA突出端或DNA突出端。細胞提取物的制備和免疫印跡。用冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細胞2次，在含有20mMTris(pH7.5)、137mMNaCl、15%(體積/體積)甘油、1%(體積/體積)NonidetP-40(NP-40)、2mM苯基甲基磺酰氟、10mg抑酶肽/ml、20mM亮抑蛋白酶肽、2mM芐脒、1mM釩酸鈉、25mMP-甘油磷酸酯、50mMNaF和10mMNaPPi的裂解緩沖液中于4'C裂解。通過以14,000xg離心5分鐘清除裂解產物，通過Western印跡分析含有等量蛋白的等分試樣細胞提取物的蛋白表達通過SDS-PAGE分離樣品，轉移到硝酸纖維素濾膜上(Schleicher&SchueU)。濾膜在含5%(重量/體積)奶粉的TBST緩沖液(10mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，0.05%(體積/體積)Tween20，0.5%(重量/體積)疊氮化鈉)中封閉。將各抗體以合適的稀釋度加入TBST。在TBST中用抗-小鼠-或抗-兔-綴合的辣根過氧化物酶(TransductionLaboratories)檢測結合的抗體，洗滌，使用SuperSignalWestDura(Pierce)或ECL(Amersham)化學發(fā)光基質(c.f.Stemberger等(2002),Antisense.Nucl.Ac.DrugDev.inpress)顯影?？贵w。鼠單克隆抗-pllO抗體U3A和鼠單克隆抗-p85抗體N7B已經有記載(Klippd等，1994，aaO)。通過細胞信號技術得到兔多克隆抗-Akt和抗-磷酸基Akt(S473)抗體。鼠單克隆抗-PTEN抗體來自SantaCruzBiotechnology。PTEN53特異性的反義分子(即geneBloc)記載于Sternberg等[Sternberger，上文]，它具有下述序列(ucuccuuTTGTTTCTGcuaacga)，其中小寫的核苷酸是核糖核苷酸，而大寫的核苷酸則是脫氧核糖核苷酸。該反義分子也與無TT的RNAiIA相同。結果顯示在圖3A中，各RNAi分子在圖3B中，它們指向PTEN的mRNA。小寫的核苷酸代表核糖核苷酸，而大寫的核苷酸則代表脫氧核糖核苷酸。術語"NH2"表示核糖核苷酸的3'-位被氨基基團修飾。在這里公開的本實施例和其它實施例中使用的RNAi分子也稱作小的干擾RNA分子siRNA。應當指出，在這里包含的任何圖中，上鏈是反義鏈或第一鏈，而下鏈則是干擾RNA分子的有義鏈或第二鏈。從圖3A中可以看出，當修飾位于反義鏈的3'端時，核酸末端OH基團的氨基末端修飾(例如氨基修飾)和反轉的無堿基修飾與未修飾的末端一樣有效(參見圖8A;8B)。因此，當位于3'OH時，特別是當3'OH位于突出的核苷酸時，能夠在無活性損失的情況下耐受使穩(wěn)定或具有其它有益性能(輸送)的化學修飾。關于圖3C所示的實驗，使用的條件與上面描述的類似。RNAi的第一鏈和第二鏈由NH2基團在核糖部分的3'-位修飾或由反轉的無堿基在該位修飾。第一個構建體設計成siRNA-NH2(3A3B)，第二個設計成siRNA-iB(4A4B)。兩個分子的序列如圖3B所示。術語"3A3B"表示干擾核糖核酸由作為反義鏈的鏈3A和作為有義鏈的鏈3B組成。為了對比的原因，生成了指定為GB53(Steinberger等，上文)的反義寡核苷酸，它也指向PTENmRNA。該后一實驗的特殊性如下。從圖3C可以看出，圖3B所示的末端保護的RNAi分子在產生PTEN蛋白的降低方面是有作用的。從該實施例可以看出，兩個末端保護的基團使RNAi分子在降低PTEN蛋白中具有活性。該抑制與反義構建體的抑制一樣有效，但是使用濃度更低，該優(yōu)點明顯超過已有的非常有效的反義技術。實施例2:體內RNAi雙鏈體活性對突出端的要求實驗方法與關于實施例1的描述相同，只是不同地設計了靶向PTENmRNA的干擾RNAi分子。結果如圖4A的劑量反應曲線所示，圖4B顯示了用于產生圖4A所示的數據的干擾RNAi分子的特殊序列和修飾。命名是這樣的，如RNAi18是由作為反義鏈的鏈18A和作為有義鏈的鏈18B組成。對比了平端分子在降低HeLa細胞中的PTENmRNA方面的活性與具有3'-突出端(RNAi18)和5'-突出端(RNAi30和RNAi31)的分子的活性。平端分子(RNAi28)和具有5'-突出端的分子的活性可以比得上具有3'-突出端的分子的活性。這表明3'-突出端對于RNAi不是基本的。實施例3:對于體內RNAi活性干擾RNA分子雙鏈體長度的要求實驗方法與關于實施例1的描述相同，只是干擾RNA分子指向Aktl的mRNA。顯示RNAi分子特異性的陰性對照還是pllOmRNA。實驗結果如圖5A所示，使用的干擾RNAi分子的細節(jié)如圖5B所示。用圖7A的左區(qū)所示的其它的siRNA構建體進行了類似實驗，其中的箭頭標出了錯配，脫氧核糖核苷酸用大寫字母表示。用標示量的siRNA分子轉染的HeLa細胞中的AktlmRNA的表達抑制如圖7A的右區(qū)所示。來自用不同的RNAi分子轉染的HeLa細胞的AktRNA的Taqman分析表明，siRNA分子的雙鏈雙鏈體的長度必須超過17個堿基對才能顯示出活性，而有17個堿基對長或更短的雙鏈體的分子則沒有作用，即使添加了序列特異性的突出端。成功地實驗了的最短的RNAi分子的長度是18一19個核苷酸或堿基對。應當指出，稱作RNAi51的干擾RNA分子51A/51B的設計對應于國際專利申請WO01/75164中所述的。RNAi分子55A/55B包含17個核苷酸的序列，且在降解AktlmRNA方面具有明顯降低的活性。從圖7A中可以看出，19nt長的雙鏈體在降低不依賴于3'突出端的性質(脫氧-或核糖核苷酸)的AktlmRNA水平中高度有效(對比分子1AB、2AB、3AB、4AB)。17個核苷酸長的siRNA(分子5AB)顯著地減少了沉默活性，這確證了上述的理解，即有活性的siRNA雙鏈體應該是至少18nt或更長。不受任何理論的約束，該結果可以從機制上由兩種不同的要求來解釋。首先，siRNA的反義鏈和目標mRNA之間的最小18nt的堿基配對可以是必須的，或者其次，整合進RNA誘導的沉默復合物(RISC)需要最小長度的siRNA雙鏈體。為了說明該問題，合成了相對于野生型序列有1和2個末端突變(CG和UA反轉)的19nt長的siRNA雙鏈體分子(分子6AB和7AB)。兩個分子，即使具有與目標mRNA配對的僅15nt堿基的序列的分子，在誘導AktlmRNA水平中是有作用的。因此可以i得出結論，好像是雙鏈體長度本身(但不是反義'siRNA與目標mRNA之間的堿基配對)決定了有作用的siRNA的最小長度b這表明，雙鏈螺旋的長度是整合進RISC復合物的重要決定齒素。在siRNA雙鏈體的末端導入的錯配對RNA干擾的影響較小。在得到的實驗結果下，因此，實現最佳的RNAi介導的干擾的最小要求是18或,19個核苷酸的雙鏈體長度，這獨立于其它的通?？捎糜赗NAi分子的RNAi分子設計，例如平端或5'-突出端或這里所述的任何其它形式。但是必須承認，RNAi分子的特殊設計可以賦予所述的分子其它優(yōu)點，例如分別是增加的效率和增加的穩(wěn)定性。實施例4:對于體內RNAi的目標-反義同源性的要求實驗設置與實施例1描述的相似，其中RNAi是對AkU特異性的。另外，設計了PTEN特異性的干擾RNA分子，并用作陰性對照。結果如圖6A和圖6B所示。使用圖7B所示的其它siRNA分子進行了基本上相同的實驗，結果分別如圖7B(右區(qū))和圖7C所示。己經建立了有作用的siRNA分子的最小雙鏈體長度為18個或超過18個核苷酸后，我們已經提出了一個問題在目標mRNA和siRNA之間有多少配對的核苷酸是沉默活性所必須的。在Akt1的例子中，如AktlRNA的Taqman分析所示，與目標RNA準確配對的19一15個核苷酸序列足以介導RNAi活性。PTEN特異性的RNAi分子不能減少Aktl的RNA量，這證實了該方案的特異性。在鏈任一端或兩端的一個或兩個核苷酸錯配是有作用的，這表明目標mRNA和RNAi之間的15nt的同源序列足以形成基因沉默。從這些數據可以得出結論，通過非特異性的結合到無關目標上，能隨機發(fā)生非特異性的基因沉默。這基于一個理解，考慮到脊椎動物的基因組或轉錄物組的復雜性和大小，即有1517個配對堿基對的序列對單個基因無特異性且隨機發(fā)生。除了上述的實驗之外，隨后還分析了錯配的位置。為此目的，使用了指向PTENmRNA的19nt長的平端siRNA。在一個siRNA鏈中的序列改變由另外一鏈中的互補性改變予以補償，以防止破壞雙鏈體的形成。從圖7B和C分別可以看出，在分子中心僅有一個點突變的siRNA嚴重損害其利用mRNA和蛋白表達水平的能力。該結果表明，RNA機器對雙鏈體中心的目標mRNA和siRNA之間的準確的和不準確的堿基配對是高度辨別的。這種對目標和siRNA之間的準確互補性的極端依賴已經用來解釋果蠅系統(tǒng)中的RNAi干擾。但是，還沒有與哺乳動物系統(tǒng)(例如HeLa)關聯(lián)起來?；谶@一觀察，本發(fā)明通過兩個方案減少了siRNA的這種偏離目標的問題。首先，通過將siRNA分子的分子長度減少至最小要求(18-19nt)，由此減少偏離目標的同源性機會。其次，通過使有義鏈失活來防止不想要的由有義鏈和無關目標RNA的意外互補性造成的RNA沉默(還參見實施例6)。實施例5:修飾的RNAi分子在血清中的穩(wěn)定性將寡核苷酸在人血清中孵育15分鐘和2小時，與未處理的對照裝載到10%聚丙烯酰胺凝膠上。結果如圖8A所示。使用的各種RNAi分子更詳細的顯示和記錄在圖8B中。'從該實施例可以看出，所有的核苷酸都用2'-0-甲基基團修飾的RNA分子的RNAi雙鏈體(RNAi分子79A79B和28A28B)在血清中具有更高的穩(wěn)定性。它也表明，平端雙鏈體比帶有突出端的雙鏈體分子更穩(wěn)定。從該結論可以得出，末端保護(例如iB或氨基)不能增加在血清中的穩(wěn)定性。另外，還可以得出結論，與提交本申請之前的現有技術中的理解相反，核酸內切酶(而不是核酸外切酶)在RNAi分子的保護中更重要。鑒于此，除了在本申請中公開的發(fā)明的RNAi分子的各種修飾或設計外，其它的或另外的核苷酸修飾可以是使用RNAi分子的完全的或部分的硫代磷酸酯骨架，以抑制核酸內切酶的功能。完全的硫代磷酸酯骨架是指任何核苷酸帶有硫代磷酸酯基團，而部分的硫代磷酸酯骨架是指并非形成RNAi分子的所有核苷酸都帶有硫代磷酸酯修飾。該修飾適用于增加RNAi分子的壽命，這與RNAi分子的其它設計無關。在這方面，部分地或完全地用硫代磷酸酯骨架修飾的RNAi用于本發(fā)明，它們可以通過結合這里公開的干擾RNA分子不同設計策略或現有技術中的任何已知設計來實現。實施例6:在5'和3'端的NH2末端保護基團對有義鏈的滅活實驗設置與關于實施例1的描述相似，目標核酸序列是PTENmRNA。HeLa細胞的濃度為2,000細胞/L。用不同修飾的RNAi分子轉染后，通過Taqman實驗分析PTEN的RNA。使用的不同干擾RNA分子如圖9B所示，而實驗結果如圖9A所示。從圖8A中的各種RNAi分子的劑量反應曲線可以看出，當有義鏈(即第二鏈)的兩端被氨基基團修飾時，RNAi分子是有作用的。特別有效的是RNAi分子20A26B、18A26B和28A26B。RNAi分子26A26B表現出最低活性，它對應于在雙鏈體的所有4個末端上的末端修飾(Tuschl是18AB)。但是，當反義鏈(即第一鏈)僅在3'端上修飾、在5'端保留游離OH基團時(RNAi構建體22A26B;20A26B)，也可以實現RNAi活性。當反義鏈在5'和3'端兩端都有氨基基團修飾時(26A26B)，則無活性。這就得出結論，反義鏈的任何一端(更具體地，反義鏈的5'端)應當無修飾。另外，值得一提的是，NH2末端修飾可,以用于在5'和3'端使有義鏈失活，從而減少其它有作用的有義鏈介導的偏離目標作用，它會明顯增加RNAi分子的特異性，這對于目標驗證和RNAi分子的任何其它醫(yī)學應用都是有益的。從該實驗中得出的其它概括性結果如圖9C所示。因此，功能上有活性的RNAi是在反義鏈上無氨基修飾或只在反義鏈的3'端有氨基修飾的那些，而在反義鏈的兩端都有氨基修飾的則是無作用的，即不能導致目標mRNA的降低。實施例7:RNAi分子的2'-0-甲基修飾對核酸內切酶保護的影響在用指向PTENmRNA的RNAi雙鏈體分子轉染的HeLa細胞上，使用實時RT-PCR分析，再次顯示了如圖10A所示的RNA降低。實驗方法基本上與關于實施例1的描述相同。研究的RNAi分子的結構如圖IOC所示，它們的劑量反應如圖IOA所示。以粗體打印的核苷酸具有2'-0-甲基修飾。圖10A中顯示的各種RNAi分子的劑量反應曲線說明，內部2'-0-烷基基團降低RNAi活性。優(yōu)選地，這樣的2'-0-烷基基團是2'-0-甲基或2'-0-乙基基團。但是，含有未修飾的核苷酸的分子與2'-0-烷基修飾相組合則顯示出顯著活性。如圖10A所示，當反義鏈都被2'-0-甲基基團修飾且有義鏈無修飾時(例如RNAi分子79A28B)則無活性。從圖10B所示的穩(wěn)定性實驗(例如將各種RNAi分子在血清中孵育)的結果可以看出，2'-0-垸基修飾使RNAi分子穩(wěn)定化、抗降解。但是，該明顯的有益效果被通常會導致減少的降低活性的2'-0-烷基修飾的作用抵消到至少某種程度。因此，RNAi分子的設計必須平衡活性的穩(wěn)定性，這使意識到本申請公開的各種設計原則變得重要。實施例8:阻止內部2'-0-甲基修飾對RNAi分子在血清中的穩(wěn)定性的影響該研究的實驗方案實際上與實施例l所述的相同。另外，在用不同劑量的RNAi分子轉染的密度為2000細胞/孔的HeLa細胞上，通過實時RT-PCR分析PTENRNA。將RNAi分子在血清中孵育2小時，在10%聚丙烯酰胺凝膠上分析。該研究的結果如圖IIA至IIC所示，其中圖11A顯示了圖llC所示的各種RNAi分子的劑量反應，圖11B顯示了使用一些圖11C所示的RNAi分子的穩(wěn)定性實驗的結果。應當承認，在圖nc中以粗體書.寫的核苷酸帶有修飾，在本申請中它是在核苷酸的核糖部分的2'-0-甲基修飾。未修飾的RNAi分子有劑量依賴性抑制。這也表明，核心9個核苷酸的2'-0-甲基修飾使RNAi在血清中穩(wěn)定，并且使雙鏈體在介導導致PTENmRNA降解的干擾現象中有活性。有義鏈的總修飾使RNAi分子在血清中穩(wěn)定并且具有一定的活性。交替地阻止帶有2'-0-甲基修飾的5個核苷酸使RNAi分子在血清中穩(wěn)定，并且具有對PTENRNA的活性，這可以通過將RNAi雙鏈體在血清中孵育2小時并將樣品上樣到10%聚丙烯酰胺凝膠證實。從圖11B可以看出，包含鏈80A和80B的雙鏈體在血清中孵育2小時后被明顯降解。由鏈82A和82B組成的雙鏈體證實了該結果，即包含反義鏈的第一鏈的5'-端不應該在5'-端核苷酸被修飾(將82A82B與反向的81A81B對比)。這也被得到的另一結果所證實，它具有由鏈86A和86B組成、在血清中有活性且穩(wěn)定的雙鏈體。值得注意的是，在反義鏈的5'末端有未修飾的阻斷的分子更有活性，而5'端OH基團優(yōu)選地不是衍生的。使用核苷酸的2'0-甲基修飾的不同修飾模式進行了其它實驗。其結果如圖12A至12C所示，并在這里的實施例9中進一步討論。實施例9:交替的內部2'-0-垸基修飾對RNAi分子的血清穩(wěn)定性的影響進行這類研究的實驗設置分別與實施例1和實施例8所述的研究中使用的相同，目標核酸還是PTENmRNA。用圖12B所示的不同RNAi分子轉染HeLa細胞，在PTENRNA上以劑量依賴性方式使用實時RT-PCR證實RNA降低(圖12A)。各種RNAi分子在血清中于37。C孵育15分鐘和2小時后的穩(wěn)定性如圖12C所示，對p110和PTEN作為各種RNAi分子的目標蛋白的Western印跡如圖12D所示，實驗的RNAi分子與圖12C和圖12D所述的兩個實驗中的相同。圖12A和圖12C說明，用2'-0-甲基基團修飾的核苷酸與未修飾的核苷酸相交替使RNAi分子在血清中穩(wěn)定，并且仍然能使它們具有干擾目標mRNA的活性。這表明，將RNAi雙鏈體分子在血清中孵育15分鐘和2小時會降解未修飾的雙鏈體和其中10個大多數5'-位核苷酸是未修^的雙鏈體。在圖12B所示的RNAi分子中，實現了修飾的和未修飾的核苷酸的各種模式。RNAi分子94Al/94Bl包含一種結構，其中修飾的核苷酸是由未修飾的核苷酸連接到位于第一鏈5'端的未修飾的核苷酸。由鏈94A2和94B2組成的RNAi分子是另外一個實施例，其中第一鏈和第二鏈的修飾的核苷酸和未修飾的核苷酸位于相對位點。與此相反，由鏈94A1和94B2組成的RNAi分子具有相同的修飾的和未修飾的核苷酸模式。但是存在相轉移，這樣修飾的核苷酸與未修飾的核苷酸形成堿基配對。由鏈94A1和94Bl、鏈94A2和94B2組成的兩個RNAi分子相互不同，這樣，第一種情況是第一鏈從未修飾的核苷酸開始，而對應的第二鏈上的第一個核苷酸(即在第二鏈的3'端的核苷酸)從未修飾的核苷酸開始，其排列與由94A2和94B2組成的RNAi分子的排列相對。另夕卜，圖12B所示的交替地修飾的RNAi分子在介導PTEN蛋白降低中是有作用的，如圖12D所示，但是只有在當第二個5'和第二個3'端核苷酸是未修飾的時(見94A294B1和94A294B2)。綜合這些數據可以看出，最穩(wěn)定的和最有活性的RNAi分子確實具有交替的2'烷基修飾的和未修飾的核苷酸殘基。應當指出，當與未修飾的siRNA分子(它們在血清中穩(wěn)定，這有利于增加的或更容易的處理)對比時，這些分子確實顯示出非常相似的mRNA減少。實施例10:內部修飾的RNAi分子介導的功能性蛋白降低實驗方案與實施例1所述的相似。用圖12B所示的交替地修飾的RNAi分子轉染后，在不同的時間點(48、72、96和120小時)收集HeLa細胞，進行Western印跡，為了實驗原因，值得注意的是，已經將在第96小時時間點的細胞分開，用總數的一半重新涂平板。將共計40nM的各種RNAi分子應用到細胞上。用實施例1所述的陽離子脂質連續(xù)轉染細胞72小時；然后在沒有轉染劑的存在的條件下重新涂平板。通過使用各種陽離子脂質例如Oligofectamine、Lipofectamine(LifeTechnologies)、NC388、L8(Atugen，Berlin),在96孔或10cm平板中進行轉染(30%—50%匯合)，通過將預制的5倍濃縮的RNAi和無血清培養(yǎng)基中的脂質的復合物加給完全培養(yǎng)基中的細胞來轉染RNAi。分布在96孔中的細胞的總轉染體積是100^，在10cm平板中的細胞的總轉染體積是10ml。根據細胞密度，最終的脂質濃度為0.8—1.2pg/ml;在每個實驗中都說明了RNAi濃度。Western印跡分析的結果如圖13所示。從該圖可以看出，94A2B1和94A2B2版本的修飾的RNAi分子比未修飾的分子產生更持久的PTEN蛋白降低。該實驗證實了從圖12中可以看出的用94A1B1和94A1B2版本的分子無蛋白降低。當細胞不是被連續(xù)地轉染時，未修飾的分子(80AB)在支持持久的蛋白降低中沒有作用。實施例ll:含有交替的2'-0-甲基修飾的RNAi分子的持續(xù)的PTEN蛋白降低實驗方案與實施例10所述的相似，只是通過將轉染培養(yǎng)基替換為新培養(yǎng)基在5小時后終止轉染。該方案進行了少許改變，這樣對于每一個RNAi分子而言，使用實施例1所述的1嗎RNAi/ml陽離子脂質儲液實現了40nM濃度。轉染后5小時，撤掉培養(yǎng)基，加入新鮮的EMEM。72小時后，將細胞分成2半，一半細胞進行裂解，另外一半新涂平板，24小時后(轉染后96小時)裂解。使用3種不同的RNAi分子(80AB，94Al/B2，94A2/B1)進行的Western印跡分析結果如圖14所示。使用未處理的細胞作為陽性對照。圖14顯示了分別72小時和96小時后PTEN的表達?？紤]到各種RNAi分子的結構特殊性，從圖14可以看出，與未修飾的RNAi分子(例如80AB)和RNAi分子94A1B2相比，94A2B1類的交替分子的蛋白降低的是持續(xù)的，即使在分開細胞和將細胞重新涂平板后96小時。使用圖15A(左區(qū))所述的siRNA構建體進行了其它實驗。從表示為在實驗系統(tǒng)中使用的各種濃度siRNA構建體下PTEN/pllOamRNA降解比可以看出，具有一條或兩條由2'-0-甲基殘基組成的鏈的siRNA分子不能誘導哺乳動物系統(tǒng)中的RNA干擾(圖15A，分子V2、V5、V6)。但是，當僅有部分鏈被修飾時，活性降低是較不明顯的。有趣地，具有未修^5的反義鏈(除非另有說明，它在本說明書中是指上鏈)和完全修飾的有義鏈的分子具有比反轉版(圖5A，分子V5和V6)明顯更高的活性。該結果表明，siRNA的反義鏈似乎更關鍵，且對修飾敏感。誘導PTENmRNA的最有效的分子只具有修飾的序列，其5'端未修飾，或在兩條鏈的交替位置被修飾(圖15A，分子VIO、V12)。為了實驗對核酸酶的抗性，將不同的siRNA版在血清中孵育，隨后進行PAA凝膠電泳。結果如圖15B所示(右區(qū)，各序列如圖15B的左區(qū)所.示)。前面已經表明，具有未修飾的核糖核苷酸的平端siRNA分子會被迅速降解，而用2'-0-甲基核苷酸完全取代則會介導對血清來源的核酸酶的抗性(圖15B，將分子AB與V1對比)。與未修飾的siRNA相比，具有部分的2'-0-甲基修飾的siRNA分子也顯示出提高的穩(wěn)定性。特別地，在兩條鏈上有交替修飾的分子的不穩(wěn)定性明顯改善(圖15B，分子V13、V14、V15和V12)。更重要地，這些分子中的三個轉染進HeLa細胞會導致明顯的PTEN蛋白表達的下調，如圖15C(長度6、9和10)所示。在該RNA干擾活性實驗中，觀察到意外優(yōu)選的分子，它在所有的從反義鏈的大多數5'端核苷酸起始的第二個核苷酸被修飾(分子V15、V12)。含有從反義鏈的5'端第二個核苷酸起始的修飾的分子更加穩(wěn)定，但是在基因沉默中具有明顯降低的活性(分子V13、V14)。該結果預示著參與的酶和siRNA雙鏈體中的精確核苷酸之間的高度特異性的相互作用。綜合，\里所述的數據表明，在siRNA雙鏈體的特別地選定的位(置的'2'-0-甲ife、布能增加核酸酶抗性，且不會必然地徹底消除RNAi。'.盡管合成的siRNA的提高的穩(wěn)考性基本上暗示了體內用途，'還是分析了特殊修飾是否也會導致細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的大范圍的蛋白降低。據此，使用不同類型的PTEN特異性的siRNA瞬時轉染HeLa細胞6小時。然后洗去脂質siRNA復合物，48和120小時后分析PTEN蛋白降低。由于未轉染的細胞在該時間段的快速生長導致了非常短暫的降低，雖然沒有連續(xù)轉染siRNA的降低實驗是復雜的，本發(fā)明的發(fā)明人能夠證明，通過所述的2'-0-甲基修飾穩(wěn)定過的siRNA分子能延長PTEN蛋白降低。在轉染后48小時，未修飾的siRNA(AB)表現出PTEN蛋白水平的最大降低，但是，在轉染后120小時，利用交替的2'-0-甲基修飾穩(wěn)定過的siRNA減少的PTEN蛋白表達是優(yōu)越的(圖15D，將帶2與4、6和7作對比)。從該結果可以看出，優(yōu)選地，交替修飾的起始核苷酸位置好像是重要的。為了更詳細地檢測該優(yōu)選，合成了兩個其它的siRNA系列，一個對激酶Aktl是特異性的，另外一個對pllOp是特異性的，pllOp是PI(3-)激酶的兩個催化亞基之一。該特殊構建體如圖16A所示。從中可以看出，只使用了有19個核苷酸長的siRNA雙鏈體，在每隔一個核苷酸上沒有任何修飾或者有2'-0-甲基修飾。以Aktl為目標，使用平端的，未修飾的siRNA觀察到有效的蛋白降低和磷酸基-Akt水平的明顯降低(圖16A，右區(qū))。在不同種類的每個一個核苷酸上有修飾的分子中，只有一個能有效地介導RNAi(圖16A，分子V5)。該siRNA分子含有反義鏈，它在大多數5'和3'端核苷酸有修飾。有義鏈在大多數末端位以未修飾的核苷酸起始，在產生的結構中，兩條鏈的修飾的和未修飾的核糖核苷酸彼此面對。如預期的，該分子也受到對抗血清來源的核酸酶的保護，如圖16B所示(分子V5)。有趣地，在使用的特殊實驗中，非常相似的從反義鏈的第二個核苷酸開始有修飾的19個核苷酸長的siRNA分子(V4)顯示不出RNA干擾活性。在該實驗中，V6類也無活性，V6中反義鏈的修飾的核苷酸對著有義鏈的修飾的核苷酸。相同系列的19個核苷酸長的對pll0p特異性的siRNA分子證實了該結果，如圖16C所示。另外，類似地修飾的siRNA分子(V5)最有活性，如通過減少Akt磷酸化所表明的，它指示著由于pll0(3水平的降低導致的P(1)-3激酶活性的降低。分子V6活性的降低可以通過雙鏈體穩(wěn)定性的降低來解釋，因此相同的結構在使用21mersiRNA的PTEN降低實驗中都是有活性的。雖然已知在彼此相對的兩鏈上的2'-0-甲基修飾會降低核酸雙鏈體的穩(wěn)定性，siRNA分子V4和V5的活性間的差異(圖16B和C)不可能是由于雙鏈體穩(wěn)定性的差異所致，因為修飾的和未修飾核苷酸的堿基對數目是相同的。這種活性差異可能是由于參與降解目標mRNA的相互作用的蛋白的特異性要求。從這些實驗還可以看出，反義鏈的大多數末端核苷酸在2'-OH-基有修飾會明顯減少沉默活性。實施例12:不同的環(huán)結構在介導RNA千擾中是有作用的為了驗證RNAi分子(優(yōu)選地，有自身互補結構的合成的RNAi分子)是否會象標準雙鏈siRNA分子一樣有效地抑制基因表達，用p110(3特異性的合成的siRNA轉染HeLa細胞。通過使用各種陽離子脂質例如Oligofectamine、Lipofectamine(LifeTechnologies),在96孑L或10cm平豐及中進行轉染(30%—50%匯合)。通過將預制的5倍濃縮的GB和無血清培養(yǎng)基中的脂質的復合物加給完全培養(yǎng)基中的細胞來轉染GeneBlocs。分布在96孔中的細胞的總轉染體積是100^，在10cm平板中的細胞的總轉染體積是10ml。根據細胞密度，最終的脂質濃度為0.8-1.2嗎/ml;在每個實驗中都說明了RNAi濃度。劑量依賴性的滴定表明，標準雙分子雙鏈21mer和對應的單分子分子達到的mRNA降低效率沒有明顯差異，如通過實時PCR(Taqman)所分析的(圖17A)。平行地實驗了兩個不同的環(huán)結構(A)u環(huán)和fflV衍生的pA-環(huán)，得到了類似結果。對比反義序列和環(huán)結構的相關位置后發(fā)現，用位于3'至環(huán)的反義序列改進了降低效率(圖17B;對比構建體3A、3B和4A、4B)。實施例13:對分子內發(fā)夾環(huán)和分子間"泡"的功效的研究實驗了不同環(huán)結構對mRNA的抑制和蛋白表達的影響。在這些實驗中，選擇Aktl和Akt2作為目標。實驗方法與實施例12所述的類似。顯然地，圖18A和圖18B所示的AktlmRNA的減少、圖18C所示的Aktl蛋白水平的減少完全獨立于實驗的環(huán)結構(對比分子5A、6A、7A、8A)(實驗的RNAi分子的結構都列在條形圖下面)。即使含有相當非生理性結構(例如聚乙二醇連接物(PEG))作為環(huán)的分子也有效地降低了Aktl表達，這表明環(huán)的大小和核苷酸序列都不是關鍵的(圖18A;分子8A)。對Akt2(9A)特異性的合成的siRNA分子用作特異性對照，且對Aktl水平無作用，如圖15A所示。但是，該分子有效地沉默了Akt2表達(圖18B;圖18C)。在生理的雜交條件下，帶有環(huán)結構的自身互補的RNA分子有可能退火為單分子結構或雙分子結構中的雙鏈(圖18B，環(huán)或泡結構)。為了解釋這一問題siRNA分子是否通過適應分子內環(huán)或分子間"泡"(示意性地顯示在圖18B中)來發(fā)揮它們的作用，轉染了兩種不能向它們自身折回的分子。這些構建體在相同的分子中含有Aktl-和Akt2-特異性的序列(圖18B，構建體10A、10B)，并且設計成不能形成雙分子雙鏈體("泡")。意外地，當兩條鏈退火后轉染時，該分子有效地介導了Aktl和Akt2mRNA降低以及蛋白降低。尚不清楚環(huán)和泡結構是否確實地是RNA加工酶(例如D^r)的底物。Paddison和coworkers的最近的研究表明，含有siRNA的發(fā)夾比雙鏈siRNA更依賴于活性。但是，這些使用PEG連接物分子的證實RNA干擾活性的數據表明連接物序列可能是無關的。在說明書、權利要求書和/或附圖中公開的本發(fā)明的特征可以單獨地或以其任何組合方式成為用于實現各種形式本發(fā)明的材料。序列乾<120><130><17D><210><212><213><223><220><221><223>阿圖根股份公司其它新形式的干擾RNA分子A19014PCT174Patentlnversion3.]23人工序列misc—feature1A(—圖3B〉<221><222><223><220><221><222><223>misc(22)'feature二(23)<400>1cuccuumiguuucugcuaacgtt23<210><211><212><213>223人工序列<220><223>EHAl<220>■<221><223>miscIBfeature-圖3B)<:22D><221><222><223>miscU〉,Rid(21)<220><221><222><223>raise—featuire(22):，(23〉Dm<400>2cguuagcagasacaaaaggagtt23<210><211><212><213>23人工序列<220><223>ENAi<220><221><223>ndsc_feature3A廠圖3B)<220><221><222><223>misc(1).-feature_(21)<220:<221><222=><223:>misc(22,DNAfeature二(23)<220><221><222><223>ni工sc(23).feature-.(23)HH2-修飾的<400>3cuccuuuuguuucugcuaacgtt23<210><211><212><213>423人工#歹.11<220><223>RNAi<220><221><223>nusc3B(■feature-圖3B)<220><221><222><223>masc(1)..feature「(21)<220><22l>misc一feature<222>(22):-(23)<223>DNA<220><221><222><223>misc—fsature(23》.(23)NH2-修飾的<400>4cguuagcagaaacaaaaggagtt23<210><211><212><213>523DNA人工序列<220:<223:<220><221><223>miscfeature4A(3B)<220><221;><222><223>misc(1),R]9Afeature「(21)<220><221><222><223>misc(22):feature.(23)<220><22工><222><223>masc(23〉-feature-.(23)附著于反向的無堿基<400>5cuccuuuuguuucugcusscgtt23<210><211><212><213>23DNA人工序列<220><223>BNAi<220><221><223>misc_feature4B(_圖3B)<220><221><222><223>misc一feature(1).:(21)<221><222><223>.misc_feature(22):(23)<220><221><222><223>ndsc—feature(23):(23〉附著于反向的無堿基<40.0>Scguuagcsgaa3c333agg3gtt23<210><211><212><213><220><223>723DNA人工序列<220><221><223>misc_feature5AMM一(圖3B)<220><221><222><223>miscU〉.■feature陽{21)<220><221><222><223>misc(22).feature「.(23)<400>7eucauuuucuuugugcucacgtt23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>RKM<220><221><223>misc一fe3ture5BMM一(圖3B)<220><221><222><223>raisc_feature(1).:(21)<221><222=><223>raisc—festure(22):.(23)DNA<400>8cgugagcacaaagaaaaugagtt23<210><211><212><213>323DHA人工序列<220><223>RHAi<220><221><223>misc一festure18A"[圖4B,8B)<220><221><222><223>(1).-feature「(21)<220><221><222><223>(22)'feature「.(23)<400>9cuccuuuuguuucugcuaacgtt23<210><211><212><213>1023DNA人工序列<220><223>ENAi<220><221><223>misc_feature18B1"圖4B,8B)<220><221><222><223>misc一feature(1).:(21)<220><221><222><223>misc一feature(22):(23)<400>10cgruuagcagaaacaaaaggagtt.23<2工0><211><212><213><220><223>1123DHA人工序列KNAi<220><221><223>misc_feature19A(Sm)(圖4B)<220><221><222><223>misc一feature(1).:(21)<220><221><222=<223>misc一feature(22)"7.(23)<400>11cucauumicuuugugcucacgtt23<210><211><213><220><223>1223人工序列<220><221>misc—feature<223>19B(i^5〉{圖4B〉<220><formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula><4O0:15cucaxiuuucuuugugcucacg<210><211;<212><213>1S21人工序列<220><223>RNAi<220><221><223>misc一featuxe2SB(^M〉(圖4B)<400>1Scgugagcacaaagassaugag21<210><211><212><213>1723DNA人工序列<220><223>RNAi<220><221><223>misc一feature30A"T圖4B,8B)<220><221><222><223>misc一fsstu:rsu).:(2)<220><221><222><223:raisc一feature{3).:(23)<400:>17ttcuccuutmgizuucugcuaacg23<210><211><212:<213>1823人工序列<220><223><220><221:>miscfeature30B(圖4B〉<220><221><222><223>raisefeature<1).(2)220:<221:<222-<223:misc(3)feature《23)<403>18ttc'jmiagcag站3cs站3ggag23<2工)><21.J>1923DNA人工序列<22'>><22:>>RNAi<220>misc一fS3turs31A(S)(圖4B)<22":<22:-:<22:!:misc一fsaturs(1).:(2)DNA<22:.=misc(3)二RNA(23)<40('>19ttciLcauuuucuuugugeucacg23<21('<21:、<21:2023DNA人工序列<22('<22:<22("<223,'<222misc一fs3turs31B(i^i)(圖4B)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage50</formula><220;><222><223>tnisc一feature(1)-:(")<220><221><222><223>.misc(20).feature「.(21)《400>23ucuugsugu3cuccccucguu21<210><211><212;><213>2421人工序列<220><223>EKAi<220><221><:223>misc一feature53B7圖5B)<220><221><222><223>misc一featm:e(i〉.(is)<220><221><222><223>misc_feature(20):.(21)<400>24cgaggggaguacaucaagacc21<210><211><212><213>2513人工序列<220><223>RHAi<220><22工><223=>mis'c一feature55AT:圖5A)<220><221>misc_feature<222>(1):(17)<223>ENA<220><221><222><223>mxsc(18「DNAfeature-.(13)<400>25cuugauguacuccccucgu13<210><211><212><213>2S13人工序列<22.0><22'3>RHAi<220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<211><212><213><220;><223>11521人工序列RNAi<:220:<221>misc—feature<223>94A2一(圖12B)<220><221;>misc一feature<223:>在位fi,3,5,7,S,11,13,1S,17,1S禾Q21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>115ctic:cuuuuguuucugcuaacg21<210;>116<211>21<212>RNA<213>人工序列<220><223>RNAi<220><221>misc一feature<223:94B:f"(圖-12B〉<220><221>misc一feature<223>在寸立f2,4,S,8,10,12,14,IS,1B禾卩20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>116cguuagcagaaacaaaaggag21<210>117<211>21<212>HNA<213>人工序列<220><223>RNAi<220><221>misc一feature<223>S4A2一(圖.1'2B)<220><221>tnisc一feature<223>在1立置1,3,5,7,3,11,13,15,17,1S禾口21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>117cuccuuuuguuucugcuaacg21<210>118<211><212><213><220><223>21人工序列<220><221><223>misc_featureS4B2_(圖.12B)<220><221><223>misc_featuxe在位i"1,3,5,7,9,11,13,15,17,IS禾[)21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<40.0>118cgupagcagaa'acaaaaggag21<210><212><213>11321RHTA人工序列<220><223>EKai<220><221><223>misc一featurePTEB^(圖.15A,B)<400>119cuccuuuuguuiicugcusscg21<210><211><212><213>12021R]m人工序列<220><223>'孤Ai<220><221><223>misc_featurePTENi(圖-15A,B》<400>120cguuagcagsascaaasggsg21<210>121<211>21<212>RNA<213>人工序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage91</formula><221>misc一feature<223>PTENiVI(圖15A,B)<220><221><222><223>misc_feature(1).:(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400>124cguusgcsgssacssasggsg21<210><211><212><213><220>:<223:><220:><221;<223>12521RNA人工序列misq一featurePTEnSY2(圖15A)<220:<221:<222:<223:misc一feature(3).:(IS)2'-0甲基核糖核苷酸<400>125cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><211><212:><213><220><223>12621人工序列RNAi<220:><221;><223>raise—featurePTENiV2(圖15A)<220><221:><222:><223>misc一feature(3).:(IS)2'-0甲基核糖核苷酸<400>126cguuagcagaaacsai祖ggag21<210>127<212;><213>21ENA人工序歹IJ<220:><223;>KNAi<220><221:misc一featureFTEhZV3(圖15A)<220:><221;><222><223>misc—feature(5).:(17)2'-0甲基核糖核苷酸<400>127cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><211><212><213><220><223:>12821人工序列RNAi<221><223>misc一featurePTENiV3(圖15A)<220><221><222><223>misc一feature(5).:(17)2'-0甲基核糖核苷酸<400>12821<210;><213><220><221><223>12S21RNA人工序列<220:><223:RNAimisc一featuxePTEN^V4(圖15A)<220><221><222>inisc一feature(7).:(15)<2232'-0甲基核糖核苷酸<400>123cuccimuugruuucugcuascg21<210><211><212><213>13021RNA人工序列<220:<223:<220><221><223>misc_￡eaturePTKMiV4(圖15A》.<220:><221><222><223>misc一featuxe(7).:(15)2'-0甲基核糖核苷酸<400>130cguuagcagsascaaaaggag■21<210><211><212><213>13121孤A人工序列<220><223>RWAi<220><221><223>misc_featurePTEK^V5(圖15A)<400>131cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><211><212><213>13221人工序列<220><223>RNAi<220><221><223>misc一featurePTBNiV5(圖15A)<220><221><222><223:>raisc一feature(1).:(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400>132<210>133<211>21<212>RNA<213>人工序列<220><223>RNAi<2.20><221>misc一feature<223>PTEn5v6(圖15a)<220><221>misc一feature<222:(1)-:(21)<223>2'-O甲基核糖核苷酸<400>133cuccuuuuguuucugcuaacg21<210>134<211>21<212>RNA<213>人工序列<220><223><220><221>misc一feature<223>PTEnSV6(圖15A)<400>134cguuagcagasacaasaggag21<210>135<211>21《212>RNA《213>人工序列<2'20><223>RNAi<220><221>misc一feature<223>PTEB^V7(圖15A,B)<220><221>misc_feature<222>(1)<223>2'-0甲基核糖核苷酸<400>135cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><211><213>13621RNA人工序列<220><223>RNAi<220>s221><223>misc一featurePTEuiV7(圖15A,B)<220><221><222><223>misc_feature(1)2'-0甲基核糖核苷酸<400>135cguusgcagaaacasaaggsg21<210><211><212><213>13721RNA人工序列<220><223>RNM<220><221><223》misc一featurePTEN^V8(圖15A,B)<220><221><222><223>misc一feature(ll):.(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400>137cuccuuuuguuucrugcuaacg21<210>138<211>21<212>RMA<213>人工序列<220><223>ENAi<220:<221:<223:misc一feature15A,B)<220:><221><222〉<223>misc—fe3ture(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400>138cguusgcagasscassaggag21<210><211><212><213>13921人工序列<220><223>KNAi<220><221><223>m丄sc一featurePTEn5V3(圖15a)<220><221><222><223>misc一feature(8).:(13)2'-0甲基核糖核苷酸<400:>133cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><211><212><213><220><223>14021人工序列RHAi<220><221><223>ndsc一featurePTEHiVS(圖15A)<220:<221><222><223>misc_feature(1).:(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400:>140cguuagcagaaacaaasggag21<210><211><212><213>14121RNA人工序列<220:<223:RJ3Ai<220;><221><;223>tnisc一featurePTEn5V10(圖15A,B)<220:><221;><222:miscfeature(S).:UO)2'-O甲基核糖核苷酸<220><221><222><223>misc一feature(16):.(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400>141cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><213>14221人工序列<220><223>ENAi<220><221><223>misc一featurePTENiV10(圖15A,B}<220><221><222><223>misc_feature'(7).:(12)2'-0甲基核糖核苷酸<220><221><222:><223>misc一feature(17):.(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400;142cgruuagcagaaacaaaaggag21<210><211><212:><213><220><223>14321RNA人工序列RNAi<221><223>misc—featurePTENiiVI1(圖ISA)<220><221><222><223>misc一feature(7).:(15)2'-O甲基核糖核苷酸<400>143cuceuimuguuucugcuaacg21<210><211><212><213>14421RNA人工序列<220><223:>RHAi<220><221><223>misc一featurePTEn5VI1(圖15A)<220><221><222><223>misc一featurePTENBVll(圖15)<400>144cguuagcagaaacaaaaggag21<210;<211><212:><213>1452JLRNA人工序列<220><223>RKAi<220><221><223>misc一featureFTEN^V12(圖15A,B)<220><221:>misc一feature<223>在位fl,3,5,7,S,11,13,15,17,1S和21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400;>145cuccummguuucugcuaacg21<210><211><213>14521RMA人工序列<220><223>RKAi<220><221:><223>roisc_featurePTENiV12(圖15A,B)<220:><221;><223>raise—feature在位i"l,3,5,7,3,11,13,15,17,13禾B21的核苷酸是2'-0甲基哮糖核苷酸<40O:>14621<210><211><212><213>14721ENA人工序列<220><223>RNAi<220><221><223>misc—featurePTEmSV13(圖15b)<220><221><:223>raise—feature在位i"2,'4,S,8,10,12,14,1S,18禾口20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>147cuccuuuuguuucugcuaacg21<210:<211><212><213>14B21RI9A人工序列<220><223:<220><221><223>misc一featuire3PTEKi"V13(圖15B)<220><221><223>misc一feature在位置2,4,6,8,10,12',14,1S,18禾口20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>14821<210>-213>14921人工序列<220><223>EMAi<220><221;><223>misc一fs3turcPTEN"ZV14(圖15B)<220><221><223>misc一feature在位f2,4,6,8,10-12,14,1G,1S禾卩20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷—酸<400>149cuccuuuuguuucugcuaacg21<211><212><213>ISO21人工序列<220<223>RNAi<220><221><223>misc—featurePTENiV14(圖15B)<220><221>misc一feature在位il,3,5,7,3,11,13,15,17,1S禾口21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>150cgvmagcagasacaaaaggsig21<210><212><213>15121RKA人工序列:220>:223>RNAi<220><221><223:>misc_featurePTEN5V15(Fig.15B)<220><221><223>misc一feature在位M"l,3,5,7,3,11,13,15,17,13禾口21的核苷酸是2'-O甲基核糖核苷酸<400>151cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><211><212><213>15221RNA人工序列<220><223>RNAi<220:<221><223>misc_featurePTENiV15(圖15B)<220:<221><223=misc—feature在位M"2,4,6,8,10,12,14,1S,13禾卩20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>15221<210><211><212><213》15321人工序列<220><223>RNAi<220:><221><223>misc一featureAfctlSVI(圖ISA)<220><221><222><223>misc一festure(1).:(19)RNA<220><221;<222>misc(20).feature二(21)<400>153ucuugauguacuccccucgtt21<211><213>15421DNA人工序列<220><223>RKAi<220><221><223>misc一festureAktlSVI(圖ISA)<220><221><222><223>misc_feature(1).:US)<220><221><222:><223>misc一featurs(20):,(21)<400>154cgaggggaguacaucaagatt21<211><212><213>15513人工序列<223><220:<221><223>tnisc一featureAktli;V2(圖ISA)<4O0>155ucuugauguacuccccucg13<210><211><212><213>15S19人工序列<220:<223:西Ai<220><221><223;>misc一featureAktl5V2(圖ISA)<400>156cgaggggaguacaucaaga—13<210><211>，212><213>15719人工序列<220><223>RNA1<220><221><223;misc_featureAktlKV3(圖ISA)<220:><221><223>misc_feature在1立置2,4,6,8,10,12,14,16,18禾Q20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400:>157ucuugaugu3cuccccucgIS<210;><211><212><213>15813RNA人工序列<220:><223>RNAi<220><221><223>misc一fsatursAktliV3(圖16A)<220><221><223>misc一fssiturs在位f2,4,6,8,10,12,14,16,18禾卩20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400:158cgaggggsguacauc站gaIS<210><211;><212><213><220><223>159RMA人工序列RNAi《221>misc一featureAKtlSV4(圖16A)<220:><221><=223>misc一fssturs在位置2,4,6,8,10,12,14,16,18禾卩20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>15Sucuugaugru3cuccccucg1S<210><211:><212><213>ISO孤A人工序列<220><223>KNAi<220><221><223>ndsc—featureAkt:iiiV4(圖16A)<220><221><223>misc—feature'在位置l,3,5,7,S,11,13,15,17,13禾口21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>ISOcgaggggaguacaucaaga19<210><211><212><213>1S119ENA人工序列<220><223>RNAi<:220><221><223>misc_featureAktlJV5(圖16A)<220><221>misc一feature<223>在位i"l,3,5,7,S,11,13的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>161ucuugauguacuccccucg<210>162<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><223>RNAi<220>.<221>misc一feature《223>Aktl5V5(圖16A)<220><221>raise—feature<223:>在位i"2,4,6,8,10,12,14的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<:400;>162cgaggggaguacaucaaga<210>163<211>19<212>ENA<213>人工序列<220><223>RNAi<220><221>mi5C一feature<223>Aktl^VS(圖ISA)<220><221>miscfeature<223>在位置l,3,5,7,3,11,13,15的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>163ucuugsuguscuccccucg<210>164<211:13<212>RNA<213>人工序列<220:<223:RNAi<220:<221-<223-misc_featureAJctaSV6(圖ISA)<220><221><223>misc一feature在位置l,3,5,7,S,13,15,17,19禾口21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>1S4cgaggggsguscaucssgs13<210》<211><212:><213><220><223>1S5ENA人工序列<220><221:><223>mlsc一featurePlloSV2(圖16C)<400:>165站uuccagugguucauucc13<210><211><212><213>16S13SKA人工序列<220><223>RNAi<220><221:><=223>raisc_featurePlloSV2(互補序列，圖1SC)<400;>16SggaaugaaccacoiggaauuIS<210:>167<211>1S<212>RHA<213:人工序列<220:<223:<220=><221>misc_feature<223:>PlloSV3(圖16C)<220:<221>misc一feature<223>在位i2,4,S,8,10,12,14,1S禾口18的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>167aauuccagugguucauucc19<2工0:>158<:211>13<212>RNA<213>人工序列-<220><223>RNAi<220><221>misc一feature<223>Pllo￡V3(互補序歹lj,圖16C)<220><221>raisc_feature<223>在4立i2,4,S,B,10,12,14,1S禾口18的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400:>168ggaaugaaccacuggaauu19<210>16S<211;13<212>RMA<213>人工序列<220><223>RNAi<220><221>misc一feature-<223>PlloSV4.(圖16C)<220><221>misc一feature<223>在位i"2,4,S,8,10,12,14,16禾口18的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>169aauuccagugguucauucc19<210><211:><212><213><220><223>170人工序列<220><221><223>misc一featurePllo￡V4(互補序列，圖1SC)<220><221><223>misc_feature在位i"l,3,5,7,3,11,13,15,18禾口的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸2.1<400>170ggaaugaaccacuggaauu19<210><211><212><213>17113孤A人工序列<220:><223>RMAi<220><221>《223>misc一featureP110SV5(圖工SC)《220:><221:>《223>misc_feature在位fl,3,5,7,S,11,13,15,17禾卩13的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸400>171aauuccagugguucauucc<210:><211:>《212>'<:213:17213人工序列<220s><223>RKAi《221><223>misc_featureP110SV5(互補序列，圖is。<220><221;>miscfeature<223>在位置2,4,S,8,10,12,14,1S禾卩18的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>172ggaaugaaccacuggaauu13<210>173<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><223>RNAi<220><221>misc—feature<223:>PlloSVS(圖1SC)<220><221>misc_feature'<223>在l立置l,3,S,7,3,11,13,15,17禾Q19的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>173aauuccagugguucauucc13<210>174<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><223>RKAi<220><221>misc一feature<223>VS(互補序歹lj,圖16C〉<220;><221><223>在位置l,3,5,7,9,11,13,15,17禾口13的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400:>174ggaaugaaccscuggssuu權利要求1.一種包含長度為18-30個堿基對的雙鏈結構的核糖核酸在制備藥物中的應用，其中所述雙鏈結構包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈由連續(xù)核苷酸的第一序列組成，所述第一序列與目標核酸80-100％互補，所述第二鏈由連續(xù)核苷酸的第二序列組成，所述第二序列與目標核酸相同，其特征在于，所述第一序列和所述第二序列包含由多個在2′-位具有修飾的修飾的核苷酸組所組成的模式，其中在序列中，每個修飾的核苷酸組在一側或兩側與核苷酸連接組連接，其中在第一序列和第二序列兩者中，修飾的核苷酸組與核苷酸的連接組交替，其中形成核苷酸的連接組的核苷酸是未修飾的核苷酸，或者是具有與修飾的核苷酸的修飾不同的修飾的核苷酸，其中所述第一序列在5’端和3’端均不具有氨基修飾，并且所述第一序列在其5’端起始為修飾的核苷酸組，其中所述修飾選自氨基，氟，甲氧基，烷氧基和烷基中的一種。2.根據權利要求1的應用，其中的藥物用于治療疾病或病癥，所述疾病或病癥選自包含惡性膠質瘤，前列腺癌，乳腺癌，肺癌，肝癌，結腸癌，胰腺癌和白血病，糖尿病，肥胖癥，心血管病和代謝病的組。3.—種藥物組合物，其含有根據權利要求1所定義的核糖核酸和可藥用載體。全文摘要本發(fā)明涉及含有雙鏈結構的核糖核酸，其中所述的雙鏈結構含有第一鏈和第二鏈，所述的第一鏈含有連續(xù)核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地與目標核酸互補，所述的第二鏈含有連續(xù)核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地與目標核酸相同，并且其中所述的雙鏈結構是平端的。文檔編號A61K38/00GK101301309SQ200810097059公開日2008年11月12日申請日期2003年8月5日優(yōu)先權日2002年8月5日發(fā)明者克勞斯·吉澤,安克·克利佩爾-吉澤,約爾格·考夫曼申請人:阿圖根股份公司