專利名稱：：重組fn肝素結(jié)合域多肽在制備抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，尤其屬于重組纖維連接蛋白N端及C端肝素結(jié)合域多肽在制備抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應用。
背景技術：
：纖維連接蛋白，fibronectim以下簡稱FN;侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學特征。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中，腫瘤細胞與腫瘤細胞、腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞及細胞外基質(zhì)之間的粘附和解離在轉(zhuǎn)移擴散屮起重要作用。近年來腫瘤中細胞外基質(zhì)成分如何影響腫瘤細胞粘附、遷移，從而影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，已成為研究熱點。FN是細胞外基質(zhì)(ECM)的重要成份，為—種具有多種功能的糖蛋白大分子，能與肝素、膠原、纖維蛋白以及整合素家族的細胞表面受體結(jié)合，它與細胞表面的受體結(jié)合可改變細胞的粘附性能，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移事件中起重要作用。大量研究表明FN具有抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，但從血漿分離FN存在著血漿資源不足和可能傳播血源性傳染病的問題，同時由于FN分子量大，全分子表達又存在技術上的難題。因此利用基因工程技術表達FN的功能區(qū)多肽并研究其功能，以代替FN的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用不失為一種可行的方法。FN分子結(jié)構(gòu)中有二個與肝素結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，一個位于FN的N端，由五個I型的同源結(jié)構(gòu)組成，該結(jié)構(gòu)域的分子量為29kDa，由237個氨基酸組成。另一個位于FN的C端，由第12,13，14三個m型的同源結(jié)構(gòu)組成，該結(jié)構(gòu)域的分子量為36kDa，由272個氨基酸組成。重組FNN端及C端肝素結(jié)合域兩種多肽對惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響的研究不曾報道。因此，在前期成功制備重組FN的N端及C端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHN-29和rhFNHC-36)(制備方法與申請?zhí)枮?00710009192.2所公開方法相同)基礎上，以下本發(fā)明將研究rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽對惡性腫瘤(以B16細胞)粘附能力及惡性腫瘤(以B16細胞為例)相關粘附基因mRNA表達的影響，繼而以惡性腫瘤(以B16細胞為例)在C57小鼠體內(nèi)建立移植瘤和轉(zhuǎn)移瘤動物模型，研究rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽對小鼠黑色素瘤B16細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討此兩種多肽抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的分子機制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提出一種重組纖維連接蛋白N端及C端肝素結(jié)合域多肽在制備抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應用。本發(fā)明所采用的技術方案是所述的二種重組纖維連接蛋白N和C端肝素結(jié)合域多肽，其一的特征在于是由FN分子中N端的五個I型同源結(jié)構(gòu)組成，含有從Ser46-Gly282的237個氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從403bp到1113bp，長711bp，PCR擴增片斷長741bp，雙酶切后片斷長729bp;由酵母表達的多肽分子量為28.52kDa，纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽(簡稱rhFN麗-29)。所述的另一種重組纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽，其特征在于是由FN分子中的III-12、111-13、III-14三個in型同源結(jié)構(gòu)組成，含有從Tyrl720-Tyrl991的272個氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從5428bp到6244bp，長816bp，PCR擴增片斷長835bp，雙酶切后片斷長828bp，由酵母表達的多肽分子量為36.09kDa，纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽(簡稱rhFNHC-36)。本發(fā)明的重組FNN端肝素結(jié)合域和重組FNC端肝素結(jié)合域多肽酵母表達載體的構(gòu)建及多肽的制備根據(jù)FNcDNA序列及與FN分子結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列進行比對，確定纖維連接蛋白N端或C端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHN-29和rhFNHC-36)克隆位置，結(jié)合酵母表達載體的酶切特點，設計rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆的PCR擴增引物和酶切位點。利用所設計和合成的PCR引物，以FNcDNA為模板，PCR合成rhFNHN-29和rhFNHC-36基因。將rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆至pGEM-T載體上。將重組的pGEM-T-FN麗-29(rhFNHC-36)載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細胞，進行陽性克隆的選擇，挑取陽性克隆的單菌斑，進行DNA序列測定。正確的克隆進一步擴增，提取重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒。以雙酶切和連接的方法將rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因連接到pAo815SM載體中。將重組的pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細胞，進行陽性克隆的選擇，挑取陽性克隆的單菌斑，DNA序列測定和雙酶切鑒定，提取陽性克隆的重組。六08155^4-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒。以雙酶切和連接的方法將rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因連接到pPIC9K整合型酵母表達載體上。重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細胞，進行陽性克隆的選擇，挑取陽性克隆的單菌斑，進行DNA序列測定和雙酶切鑒定。正確的克隆進一步擴增，提取重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒。用BglII酶切重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒，使其線性化。將線性化的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)載體轉(zhuǎn)染GS115酵母細胞，進行篩選，挑選陽性克隆進行小規(guī)模誘導培養(yǎng)、鑒定rhFNHN-29(riiFNHC-36)多肽的表達量，挑選高水平表達的菌株進行大規(guī)模的表達。發(fā)酵液先用80%硫酸胺沉淀，沉淀物溶解后上S-100柱和SP柱純化rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽。對純化的rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽進行SDS-PAGE分析，并經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描計算其分子量。通過斑點雜交和Westernblot方法，檢測多肽結(jié)合肝素能力和FN的抗原性。本發(fā)明成功構(gòu)建了重組rhFNHN-29和rhFNHC-36酵母表達載體，并在酵母細胞中表達及制備了rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽。制備的rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，在凝膠圖象分析系統(tǒng)中測定分子量，rhFNHC-36多肽分子量為36.09kDa,rhFN朋-29多肽分子量為28.52kDa。斑點雜交實驗證明兩多肽均能與肝素結(jié)合，但都不能與FN抗體結(jié)合。說明所合成的多肽在體外具有結(jié)合肝素的能力而沒有FN的抗原性。說明利用酵母表達系統(tǒng)表達FN肝素結(jié)合域多肽是可行的。本發(fā)明所述的重組纖維連接蛋白N端及C端肝素結(jié)合域多肽，經(jīng)試驗證明能在制備抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中得到應用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明是利用基因工程技術表達FN的功能區(qū)多肽并研究其功能，以代替FN的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用。FNN端和C端的兩個肝素域是目前深受研究人員關注的區(qū)域。1)本發(fā)明的重組FN的肝素結(jié)合域具有下述多種生物學功能l.是血管內(nèi)皮生長因子的結(jié)合區(qū)域，增強了血管內(nèi)皮生長因子的活性,促進血管的生成；同時通過與血管內(nèi)皮細胞表面的肝素硫酸蛋白聚糖結(jié)合促進了血管內(nèi)皮細胞表達更多有活性的血管內(nèi)皮生長因子；2.增強了FN細胞結(jié)合域介導的細胞黏附與增殖；3.通過下調(diào)MMP-9和a5g3的表達抑制肝癌的生長和轉(zhuǎn)移；4.通過抑制p53和c-myc基因調(diào)節(jié)細胞的凋亡；5.能夠與細菌表面的蛋白結(jié)合，從而發(fā)揮其抗微生物活性；6.參與調(diào)節(jié)造血干細胞的增殖與分化。7.具有刺激組織纖溶酶原激活劑激活纖溶酶的活性；8.與淋巴細胞表面的CD44結(jié)合，參與免疫的調(diào)節(jié)；9.能誘導NO的產(chǎn)生和金屬蛋白酶的合成。2)本發(fā)明的重組纖維連接蛋白N端及C端肝素結(jié)合域兩種多肽進行對以小鼠黑色素瘤為例的腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響的實驗研究。本發(fā)明通過不同的細胞粘附實驗研究重組FN多肽對B16細胞與基底膜及B16細胞相互間的粘附力的影響，結(jié)果顯示B16細胞與重組FN多肽的粘附力和天然全長纖維連接蛋白基本一致；在各時相內(nèi)，經(jīng)過重組FN多肽干預的B16細胞與人工基質(zhì)基底膜的粘附力明顯增高，經(jīng)過重組FN多肽干預的B16細胞之間的粘附力明顯增高，經(jīng)0.02%乙二胺四乙酸處理后，重組FN多肽干預組脫落的B16細胞數(shù)目明顯減少，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示重組FN多肽可以增強B16細胞與基底膜及B16細胞之間的粘附能力，減弱B16細胞從基底膜及周圍細胞脫落的能力。本發(fā)明的重組FN多肽通過增加細胞表面FN表達，繼而增強FN和細胞表面整合素受體的結(jié)合力，從而增強細胞間及細胞與基底膜的粘附力。3)整合素是細胞表面的一種重要的粘附分子，主要介導細胞與細胞及細胞與細胞外基質(zhì)之間的相互粘附，并介導細胞與細胞外基質(zhì)之間的雙向信號傳導，調(diào)控細胞粘附、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡，其中整合素av33是整合素家族中的一種重要分子，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關。整合素avP3是血液中腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞結(jié)合，進而侵入內(nèi)皮下基質(zhì)的關鍵因子。而血液中的纖維蛋白原是整合素avP3的天然配體之一，可以促進腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞的粘附，然后腫瘤細胞通過ave3和內(nèi)皮下基質(zhì)結(jié)合，開始侵襲組織。同時，纖維蛋白原在整合素中只結(jié)合ave3，并能促進腫瘤細胞與avP3的其他配體結(jié)合，進而增強侵襲能力。本發(fā)明通過RT-PCR檢測重組FN多肽處理后B16細胞整合素av、e3基因的mRNA表達，結(jié)果顯示B16細胞經(jīng)重組FN多肽作用后，整合素av、e3基因的mRNA表達明顯降低。同時通過細胞粘附實驗檢測重組FN多肽對B16細胞與纖維蛋白原粘附力的影響，結(jié)果顯示經(jīng)過重組FN多肽處理后，B16細胞與纖維蛋白原的結(jié)合能力明顯減弱。腫瘤細胞和纖維蛋白原的結(jié)合能力減弱，可使具有高活性的avP3細胞減少。提示重組FN多肽不僅干擾整合素av、基因的表達，而且抑制整合素ave3和其他配體的結(jié)合，進而抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。這是重組FN多肽抗B16腫瘤細胞血行轉(zhuǎn)移的分子機制之一。4)細胞與ECM粘附可誘導一些重要的功能基因的表達，目前對于粘附誘導基因表達的機理還不清楚，推測可能通過整合素相關的信號轉(zhuǎn)導來實現(xiàn)，這一信號轉(zhuǎn)導的一個重要中間分子是粘附斑激酶(FAK)。FAK是一非受體型蛋白酪氨酸激酶，是介導細胞間、細胞與胞外基質(zhì)信號轉(zhuǎn)導的胞內(nèi)重要分子，參與多條信號轉(zhuǎn)導通路，在胞內(nèi)與FN-整合素-細胞骨架跨膜信息系統(tǒng)相結(jié)合，調(diào)節(jié)AP-1、PI-3K等多種信號通路，參與細胞增殖、轉(zhuǎn)化等多種生物學過程。細胞ECM粘附可誘導整合素分子聚集，并激活FAK，磷酸化細胞骨架蛋白，引起細胞骨架重建，且可通過RAS-MAPK通路影響基因表達。通過上述作用，粘附不僅可影響MMP基因表達及侵襲性質(zhì)，而且還可調(diào)節(jié)多種細胞功能，如錨定依賴性生長性質(zhì)和分化。本發(fā)明通過RT-PCR檢測重組FN多肽處理后B16細胞FAK基因的mRNA表達，結(jié)果顯示B16細胞經(jīng)重組FN多肽作用后，F(xiàn)AK基因的mRNA表達顯著降低。重組FN多肽可明顯抑制FAK基因的mRNA表達，提示重組FN多肽可以阻止FN-整合素-細胞骨架跨膜信息系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導，抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。5)腫瘤侵襲是指惡性腫瘤細胞離開原發(fā)生長部位，突破基底膜和細胞外基質(zhì)構(gòu)成的屏障，侵犯毗鄰的正常組織。侵襲是貫穿腫瘤轉(zhuǎn)移全過程的重要步驟，如能早期預防和抑制侵襲將可減少或預防轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本發(fā)明通過皮下接種B16黑色素瘤細胞建立皮下腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果顯示B16瘤細胞在小鼠皮下生長迅速，70%的小鼠皮下腫瘤發(fā)生腹腔侵襲，20%的小鼠皮下腫瘤發(fā)生肺臟轉(zhuǎn)移。經(jīng)過重組FN多肽干預后，小鼠皮下腫瘤的生長受到明顯的限制，rhFNHN-29多肽干預組只有10%的小鼠皮下腫瘤發(fā)生腹腔侵襲，未見肺臟轉(zhuǎn)移；而rhFNHC-36多肽干預組只有20%的小鼠皮下腫瘤發(fā)生腹腔侵襲，未見肺臟轉(zhuǎn)移，兩種多肽與對照組的差別均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示重組FN多肽不僅可以明顯抑制皮下腫瘤的生長，還可以減弱皮下腫瘤向腹腔侵襲及向肺臟轉(zhuǎn)移的能力。在轉(zhuǎn)移過程的早期步驟中，粘附可以使細胞不易脫離瘤體，實際上降低了轉(zhuǎn)移率。因此重組FN多肽能通過增強B16細胞與基底膜及細胞之間的粘附能力，減弱B16細胞從基底膜及周圍細胞脫落的能力，從而使皮下腫瘤局限生長，最終減少了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。6)腹腔接種瘤細胞后形成腫瘤結(jié)節(jié)依據(jù)大小可分為大結(jié)節(jié)(》lram)和小結(jié)節(jié)(<lmra)。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)節(jié)形成初期，都是小結(jié)節(jié)，隨著腫瘤組織的生長，大結(jié)節(jié)的數(shù)量逐漸增加，而小結(jié)節(jié)的數(shù)量卻逐漸停止增加，這可能與大腫瘤組織分泌腫瘤血管生長抑制因子有關。腹腔內(nèi)微小腫瘤結(jié)節(jié)具有更強的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而較大的腫瘤結(jié)節(jié)一般局限生長。本發(fā)明通過腹腔接種B16黑色素瘤細胞建立腹腔侵襲模型，結(jié)果顯示B16瘤細胞在腹腔內(nèi)形成大量的微小腫瘤結(jié)節(jié)(<lmm)，分布于腸系膜靜脈網(wǎng)及腹腔大血管周圍，具有很強的侵襲轉(zhuǎn)移能力。經(jīng)過重組FN多肽干預后，B16瘤細胞在腹腔內(nèi)局限生長，腹腔內(nèi)微小腫瘤結(jié)節(jié)明顯減少，其中，rhFNHN-29多肽對腹腔腫瘤結(jié)節(jié)的抑制率為62.7X，而rhFNHC-36多肽對腹腔腫瘤結(jié)節(jié)的抑制率為54.5%;重組FN多肽干預組與對照組相比，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示重組FN多肽對微小腫瘤結(jié)節(jié)的增加具有較強的抑制作用，可抑制小鼠黑色素瘤在腹腔的侵襲生長。7)腫瘤轉(zhuǎn)移指惡性腫瘤細胞借助血管、淋巴管等途徑，在遠離腫瘤原發(fā)生長部位的器官內(nèi)形成繼發(fā)瘤的過程。人工血行轉(zhuǎn)移模型集中體現(xiàn)了腫瘤細胞進入血液循環(huán)以后癌轉(zhuǎn)移的幾個步驟。因此，本發(fā)明通過尾靜脈接種B16黑色素瘤細胞建立黑色素瘤人工血行轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果顯示B16瘤細胞通過尾靜脈進入小鼠血液循環(huán)后，最終100%小鼠發(fā)生黑色素瘤肺臟轉(zhuǎn)移。經(jīng)過重組FN多肽干預后，rhFNHN-29多肽干預組只有50X小鼠發(fā)生黑色素瘤肺臟轉(zhuǎn)移，而rhFNHC-36多肽干預組只有40X小鼠發(fā)生黑色素瘤肺臟轉(zhuǎn)移，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示重組FN多肽能明顯減少荷瘤小鼠肺臟轉(zhuǎn)移。由于重組FN多肽和腫瘤細胞表面的整合素受體具有很強的粘附力，故我們認為，重組FN多肽可和血管內(nèi)皮細胞"競爭"腫瘤細胞表面的整合素受體，使腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞之間的粘附性減弱，腫瘤局限在血流中，不易突破基底膜侵入其他器官，從而減少肺臟及其他部位轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生。人工血行轉(zhuǎn)移模型是通過尾靜脈注射瘤細胞建立，大量腫瘤細胞通過血行而到達相應器官形成轉(zhuǎn)移癌，重組FN多肽有一定效果。綜上所述，本發(fā)明重組FN多肽通過影響整合素ave3的功能，進而干擾B16細胞與細胞外基質(zhì)粘附能力，并減弱粘附斑激酶的激活，從而起到抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。因此本發(fā)明的重組FN肝素結(jié)合域多肽能在制備抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應用，從小鼠黑色素瘤細胞B16細胞注射到小鼠的動物實驗數(shù)據(jù)可知本發(fā)明的重組FN肝素結(jié)合域多肽具有抑制惡6性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，能作為藥物；而且制備方法簡單，能替代從血漿分離FN，克服存在著血漿資源不足和可能傳播血源性傳染病的問題。圖1-1為本發(fā)明的rhFNHC-36和rhFNHN-29基因在重組載體上的PCR鑒定圖。圖中1、pUC8;2、rhFNHC—36:3、rhFNHN-29圖1-2為本發(fā)明的重組pAo815SM-FNHN-29載體EcoRI和BaraH雙酶切鑒定圖。圖中1、pUC18;2、pAo815SM-FNHN-29載體；3、空載體對照圖1-3為本發(fā)明的bacmid-FNHC-36重組載體上rhFNHC-36基因的PCR和雙酶切鑒定圖。圖中1、PCR鑒定；2、雙酶切鑒定；3、pUC8圖1-4為本發(fā)明的rhFNHN-29基因的正向測序圖。圖1-5為本發(fā)明的rhFNHN-29基因的反向測序圖。圖l-6為本發(fā)明的rhFNHC-36基因的正向測序圖。圖1-7為本發(fā)明的rhFNHC-36基因的反向測序圖。圖1-8為本發(fā)明的FNHC-36多肽的SDS-PAGE分析圖。圖1-9為本發(fā)明的純化后FNHF-29多肽SDS-PAGE分析圖。圖中1、純化的FNHC-36多肽；2、M圖1-10為本發(fā)明的rhFNHC-36多肽的分子量測定圖。圖1-11為本發(fā)明的rhFNHN-29多肽分子量測定圖。圖1-12為本發(fā)明的多肽結(jié)合肝素斑點雜交放射顯影圖。圖中左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽圖1-13為本發(fā)明的多肽結(jié)合肝素斑點雜交酶聯(lián)反應顯色圖。圖中左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽圖2為本發(fā)明的C57BL/6小鼠皮下腫瘤腹腔侵襲模型圖(接種后第30天)。圖中a:對照組；b:rhFNHC-36多肽組；c:rhFNHN-29多肽組圖3為本發(fā)明的C57BL/6小鼠皮下腫瘤照片(接種后第30天)。圖中上對照組；中rhFNHC-36多肽組；下rhFNHN-29多肽組。圖4為本發(fā)明的C57BL/6小鼠腹腔腫瘤移植侵襲模型圖(接種后第7天)。圖中a:對照組；b:rhFNHC-36多肽組；c:rhFNHN-29多肽組圖5為本發(fā)明的C57BL/6小鼠接種瘤細胞后第30天全肺照片圖(每組顯示3只小鼠全肺)。圖中a:對照組；b:rhFNHC-36多肽組；c:rhFNHN-29多肽組具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細描述下面以小鼠黑色素瘤細胞B16細胞注射到小鼠為例說明重組FN肝素結(jié)合域多肽能在制備抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應用。(一)材料與試劑1.主要試劑天然全長纖維連接蛋白(FN):采用明膠親和層析法從正常人血漿純化。重組FN多肽重組FNN端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHN-29)、重組FNC端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHC-36):本發(fā)明構(gòu)建FN1^端和<:端兩個肝素結(jié)合域多肽的酵母表達載體01〔9}(-rhFNHN-29、pPIC9K-rhFNHC-36，并篩選出高表達的酵母表達菌株，表達、純化出rhFNHN-29多肽及rhFNHC-36多肽。RPMI-1640培養(yǎng)液購自GIBC0L公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司，引物、Trizol均購自Invitrogen公司，AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司(編號:A3500)，PCR試劑盒購自大連寶生物(TaKaRa)公司，DNAMarker購自北京天為時代公司，MatrigelMatrix購自BD公司，纖維蛋白原、四甲基偶氮唑藍購自Sigraa公司，96孔、6孔細胞培養(yǎng)板購自Costar公司。2.細胞株小鼠黑色素瘤細胞B16細胞由福建醫(yī)科大學藥學院惠贈，置于含10M小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37°C、5WC02混合氣體培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。3.動物C57BL/6小鼠，6-8周齡，體重(19士0.6)g，雄性，由中國醫(yī)學科學院上海實驗動物繁育中心提供[為清潔級動物，合格證SCXX(滬)-2003-003],在SPF層流柜中詞養(yǎng)。4.主要儀器臺式低溫離心機為Beckman公司產(chǎn)品(型號J2-21)，紫外分光光度儀為Beckman公司產(chǎn)品(型號DU—640)，酶標儀為Stat公司產(chǎn)品(型號Fax-2100)，PCR擴增儀為美國AB公司產(chǎn)品(型號AB2720)，凝膠成像系統(tǒng)為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品(型號GelDOClOOO)，細胞培養(yǎng)箱為服ALFORCE公司產(chǎn)品，超凈工作臺為AIRTECH公司產(chǎn)品，微量加樣器為Eppendorf公司產(chǎn)品，水平電泳槽為北京東方儀器廠產(chǎn)品，電子天平為Ohaus公司產(chǎn)品，光學顯微鏡為01ympus公司產(chǎn)品。(二)重組FN肝素結(jié)合域多肽酵母表達載體的構(gòu)建及多肽的制備本發(fā)明將FN的C端的肝素結(jié)合域多肽基因和FN的N端的肝素結(jié)合域多肽基因克隆至酵母表達載體，并在GS115酵母細胞中進行表達。1.1)FNC端和FNN端肝素結(jié)合域多肽基因PCR擴增引物設計根據(jù)FNcDNA序列，及與FN分子結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列進行比對，確定纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHC-36)和N端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHN-29)的克隆位置，結(jié)合酵母表達載體的酶切位點，設計重組rhFNHN-29和rhFNHC-36基因的PCR引物和酶切位點。FNN端肝素結(jié)合域多肽是由FN分子中N端的五個I型同源結(jié)構(gòu)組成，含有237個氨基酸(Ser46-Gly282)。編碼該多肽的DNA序列長711bp(403bp-1113bp)，PCR擴增片斷長741bp,雙酶切后片斷長729bp,該多肽命名為rhFNHN-29。其目的基因片斷PCR擴增的引物如下上游引物5-ATGCTc4cGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCAGTCAMGCMGCCCGGTTGTTA-3下游引物5-ACGTAG丄AATTCTCCGCTCGATGTGGTCTGCA-3上游酶切位點XhoI，下游酶切位點EcoRI。FNC端肝素結(jié)合域多肽是由FN分子中的111-12、111-13、III-14三個III型同源結(jié)構(gòu)組成，含有272個氨基酸(Tyrl720-Tyrl991)。編碼該多肽的DNA序列長816bp(5428bp-6244bp)，PCR擴增片斷長835bp,雙酶切后片斷長828bp，該多肽命名為rhFNHC-36。其目的基因片斷PCR擴增的引物如下上游弓I物5-ATGCTC—CGAGAAAAGAGAGGCTGAAGGCACCAACTGAC-3下游引物5-ACGTAGiMTTCTCCGCTCGTCTGTCTTTTTCCTTCC-3上游酶切位點XhoI，下游酶切位點EcoRI。1.2)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因的PCR擴增及純化回收PCR擴增體系FNcDNA0.1u1(50ng),IOX緩沖液5ul,dNTP1p1，pfu1"1(3U)，上下游引物各lul(lOpmol)，雙蒸水41u1，構(gòu)成50u1反應體系。PCR擴增條件94X:5分鐘預變性，94。C30秒，63°C(rhFNHN-29，66'C)40秒，72°C40秒，25個循環(huán)，72'C10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%低溶點膠電泳，割取含目的基因的低溶點膠，用膠回收試劑盒回收純化目的基因片斷，加雙蒸水溶解，測OD值。1.4)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因連接至酵母表達載體1.4.1)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因連接到pGEM-T載體rhFNHN-29和rhFNHC-36基因末端加A。反應體系20pl:PCR回收產(chǎn)物12.4ul,MgCL21.6u1，ATP2u1,10X緩沖液2ul，Taq酶2ul，在72。C連接30分鐘。rhFNHN-29和rhFNHC-36基因連接pGEM-T載體。反應體系20u1:pGEM-T載體2w1，末端加A的rhFNHN-29基因6ul，2X緩沖液10ul，T連接酶2ul,4'C連接16小時。1.4.2)陽性重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)載體的選擇10u1連接產(chǎn)物加入到50ulDH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，42。C熱休克90秒，加150u1LB(AMP—)，37。C225rpm振搖1小時。100u1的轉(zhuǎn)染液涂至三塊AMP+的LB板上，37'C培養(yǎng)過夜。挑選單個菌斑至5nilAMP+的LB中37'C225rpm振搖6小時，提取質(zhì)粒進行DNA測序和酶切鑒定。1.4.3)rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因連接到pAo815SM載體將以上挑選鑒定正確的陽性菌斑進一步振搖擴增，用UNIQ-200柱式質(zhì)粒大量抽提試劑盒提取pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)陽性質(zhì)粒。操作按說明書進行。重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒的Xhol酶切重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒20ul(lul含100ng),10X緩沖液20ul，10XBSA20ul，Xhol1.5yl,雙蒸水138.5ul，200ul體系，37。C酶切2小時。酶切產(chǎn)物分兩管，分別用95%乙醇沉淀，一管加10ul雙蒸水，電泳觀察酶切效果。若已酶切徹底，另一管再用EcoRI酶切。重組pGEM-T-FNHN-29質(zhì)粒的EcoRI酶切另一管繼續(xù)EcoRI酶切，上述酶切沉淀質(zhì)粒，IOX緩沖液4ul，10XBSA4ul，EcoRI2ul，雙蒸水30iil.40nl體系，37°C2小時。1%低溶點瓊脂糖回收FNHN-29(rhFNHC-36)基因片斷，加10H1雙蒸水溶解。pAo815SM載體的酶切。取pAo815SM質(zhì)粒，用Xhol酶切，酶切體系pAo815SM質(zhì)粒20u1(lu1含100ng)，10X緩沖液20ul，10XBSA20ul，XhoI1.5ul，雙蒸水138.5Ul,200wl體系，37。C酶切2小時，瓊脂糖電泳檢測酶切效果，酶切完全后用95%乙醇沉淀，加10ul雙蒸水溶解。得到的產(chǎn)物再用EcoRI酶切，酶切體系上述酶切沉淀質(zhì)粒，10X緩沖液4ul，10XBSA4ul，EcoRI2ul，雙蒸水30ul.40ul體系，37°C2小時。1%低溶點瓊脂糖回收pAo815SM線性質(zhì)粒，加10ii1雙蒸水溶解。連接反應以上rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因酶切回收產(chǎn)物2ul，IOX緩沖液1.5u1,T連接酶lul，酶切回收的pAo815SM載體l"l，雙蒸水10p1，15.5ul體系，14°C連接過夜。1.4.4)重組pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細胞選擇陽性克隆以上15.5u1的連接產(chǎn)物加入到50u1DH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，42'C熱休克90秒，力H150u1LB(AMP—)，37。C225rpm振搖1小時。每100u1轉(zhuǎn)染后的DH5a菌液涂至三塊AMP+的LB板上，37。C培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化平板上挑出5個單菌落分別到5mlAMF的LB中，37°C225rpni振搖過夜。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，EcoRI酶切驗證。選出陽性克隆繼續(xù)下一步試驗。pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒雙酶切(EcoRI):pAo815SM-FNHN-29質(zhì)粒30jil，10X緩沖液(M)6iil,10XBSA6iil，EcoRI2iil,BamHI2nl雙蒸水14n1，60ii1體系，37'C酶切3小時。瓊脂糖電泳檢測酶切充分后，酶切物用2%瓊脂糖和1%低溶點膠回收rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因。雙蒸水溶解。1.4.5rhFNHN-29基因(rhFNHC-36)連接到酵母表達載體pPIC9KpPIC9K質(zhì)粒雙酶切(EcoRI和BamH):pPIC9K空質(zhì)粒用EcoRI和BamH在37。C酶切3小時。瓊脂糖電泳檢測酶切充分后，用2%瓊脂糖和1%低溶點膠回收pPIC9K線性質(zhì)粒，雙蒸水溶解。連接反應EcoRI和BamH雙酶切回收的FNHN-29(rhFNHC-36)基因6u1，EcoRI和BamHI雙酶切的pPIC9K1u1,T4緩沖液1u1，T4連接酶1u1，雙蒸水1u1，10iil體系，14。C連接16小時。1.4.6重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細胞選擇陽性克隆lu1重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)載體加入到50li1DH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，42。C熱休克90秒，力B150ia1LB(AMP—)，37°C225rpm振搖2時。每lOOlU轉(zhuǎn)染后的菌液涂至三塊AMP+的LB板上，37'C培養(yǎng)過夜。挑單菌斑至5mlAMP+的LB中37°C325rpm振搖6小時，測序和提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定。測序正確的質(zhì)粒進一步擴增，在100mlLB(AMP+)中振搖6時，測0D值，在對數(shù)生長期中，用大柱提取質(zhì)粒，按說明書進行操作，所提取的質(zhì)粒溶于50ul雙蒸水中。1.5)rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽在酵母細胞中的表達1.5.3)重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母細胞及rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的表達線性質(zhì)粒的準備取20ul重組的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒進行酶切。酶切體系質(zhì)粒20ul，10X緩沖液40ul，10XBSA40ul,BglII6ul，雙蒸水294u1，400ixl體系。37。C酶切過夜。酶切物用氯仿按1:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，上清用95%乙醇沉淀，70%乙醇清洗一次，真空抽干，加雙蒸水10ul溶解，得到重組的pPIC9K-FNHN-29線性質(zhì)粒(pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)/BglII)，-20'C保存?zhèn)溆?。線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母細胞取2ul重組的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GS115感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)染的GS115細胞涂布于RDB平板上，28。C培養(yǎng)4-5日，挑取10單菌斑至2mlYPD中，28°C，250rpm振搖培養(yǎng)過夜。取100u1菌液加100u130%甘油混合，-8(TC冰箱保存。剩余菌液全部倒入20mlB匿中，28°C，250rpm振搖培養(yǎng)過夜。再誘導48小時培養(yǎng)，早晚各補加0.25%甲醇誘導，48小時后，4'C中，離心取上清，4X緩沖液上樣電泳，鑒定是否表達及表達的量。挑選出表達最好的菌種，并保存菌種于-8(TC中。將表達量最高的菌液150u1接種到3mlYPD中，28°C，250rpm振搖培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)過夜的3ml菌液全部再接種到200mlBMGY中，28°C，250rpm振搖培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)過夜的菌液再按1:20比例接種到BMMY中，早晚各補加0.25%甲醇誘導，誘導48小時.誘導結(jié)束后，4°C中，6000rpm離心5分鐘，取40p1上清做SDS-PAGE電泳分析，鑒定是否表達及表達的1.5.4)rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的分離純化酵母發(fā)酵液的沉淀分離80%硫酸胺沉淀酵母發(fā)酵液上清(以4000ml為單位)，調(diào)Ph至7.3，放置30分鐘，2(TC，10000rpm離心20分鐘，去上清，沉淀物再用200ml去離子水溶解，離心，去上清，150ml去離子水再溶解，40u1做SDS-PAGE電泳分析。S-IOO柱的分離純化將以上沉淀分離的樣品液50ml，上樣至980ml的FFS-100柱子上。用平衡液進行洗脫純化，平衡液為10mmNaCl，20咖Tris-Cl，Ph8.5。洗脫純化過程中，收集各個峰洗脫液體，并做SDS-PAGE電泳分析，以確定rhFNHN-29多肽所在的峰。收集FNHN-29多肽所在峰的洗脫液體，再進行SP柱純化。SP柱的分離純化從S-100純化中收集的第二個峰洗脫液調(diào)Ph值至7.0，稀釋一倍后再上SP柱進一步純化。A液10mMNaCl，20mMTris-Cl,Ph7.0;B液200mMNaCl，ZOmMTris-CLPl^CK洗脫純化過程樣品上柱平衡好后，60%B液洗脫。收集FNHN-29多肽所在峰的洗脫液體，并進行SDS-PAGE電泳分析、分子量測定、含量測定、濃縮處理。1.6)純化rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的生物學特性分析1.6.1)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的含量測定用Bradford試劑盒測定純化液中目的蛋白的含量，按說明書操作，在酶標儀(354型，thermoLabSystems)上測590nm光密度值(OD值)，計算待測樣品濃度，再用透析袋透析濃縮。1.6.2)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽分子量測定將純化rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的SDS-PAGE電泳凝膠在凝膠圖象分析系統(tǒng)中測定多肽的分子量，以低分子量標準蛋白為參照。1.6.3)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽結(jié)合肝素活性與FN抗原性rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽是FN分子中的肝素結(jié)合區(qū)域。在完整的FN分子中該區(qū)域具有結(jié)合肝素的活性，為了驗證在昆蟲細胞中表達的rhFNHC-36多肽和在酵母細胞中表達的rhFNHN-29多肽是否保留結(jié)合肝素的能力及是否具有FN抗原性的特性，特設計了Westernblot和斑點雜交實驗。Westernblot:按SDS-PAGE常規(guī)方法制膠，分離膠濃度為7%，濃縮膠濃度為3%膠大小為10cmX10c邁，20ulrhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽樣品(40ug)，力Q20ul2X上樣緩沖液，煮沸5分鐘，上樣電泳(上樣時以相同的排列順序上樣兩處，中間以一空泳道相隔，以便制成兩張相似的膜，一張用于酶聯(lián)顯色，一張用于放射顯影)，電泳條件為濃縮膠8mA穩(wěn)流電泳30分鐘，分離膠18mA穩(wěn)流電泳2小時，電泳結(jié)束后，小心將膠移至轉(zhuǎn)膜儀上，在膠的上方放上一張同樣大小的硝酸纖維素膜，在穩(wěn)壓30V狀態(tài)下過夜轉(zhuǎn)膜。次日將轉(zhuǎn)好的膜切成兩張(一張用于酶聯(lián)顯色，一張用于放射顯影)，將硝酸纖維素膜置1%BSA的TBS緩沖液中封閉1小時，再將膜置含肝素鈉(625單位/ml)的TBS緩沖液中，室溫孵育l小時，TBS緩沖液漂洗二次后，將膜置于含大鼠抗肝素抗體(2iig/nil)的TBS緩沖液，室溫孵育1小時，TBS緩沖液漂洗后，加入辣根酶標記山羊抗大鼠IgG(H+L)，室溫孵育l小時，顯色液顯色。另一張進行放射顯影將膜放在保鮮膜上，于暗室中用化學發(fā)光工作液WesternBlot—tingLuminolReagent(SantaCruz)按每2cm2膜各力卩顯色液A，B0.5ml，均勻覆蓋NC膜，蓋上保鮮膜，室溫反應5分鐘。然后移入X射線膠片盒中，在預先裁減好的X射線膠片(KODAK)上爆光，時間為2分鐘、5分鐘。FN抗原性檢測的一抗為鼠抗人FN單抗，二抗為羊抗鼠IgG-HRP(斑點雜交相同)。斑點雜交取20ul的rhFNHC-36、rhFNHN-29多肽樣品(40Pg)直接點在硝酸纖維素膜上(同時處理兩張膜，一張用于酶聯(lián)顯色，一張用于放射顯影)，待樣品稍干后，封膜、結(jié)合肝素、結(jié)合抗肝素抗體、結(jié)合二抗和顯色同Westernblot。另一張膜進行放射顯影，方法同前。結(jié)果1目的基因在重組載體上的鑒定1.1rhFNHC-36和rhFNHN-29基因在重組載體上的PCR鑒定見圖1-11pUC8;2rhFNHC-36:3rhFNHN-291.2重組pAo815SM-FNHN-29載體EcoRI和BamH雙酶切鑒定見圖1-21pUC18;2pAo815SM-FNHN-29載體；3空載體對照1.3重組pAo815SM-FNHC-36載體的BamHI和HindIII雙酶切鑒定見圖1-3bacmid-FNHC-36重組載體上rhFNHC-36基因的PCR和雙酶切鑒定1、PCR鑒定；2、雙酶切鑒定；3、pUC81.5重組pGEM-T-FNHN-29載體中目的基因的DM序列測定見圖1-4rhFNHN-29基因的正向測序圖見圖1-5rhFNHN-29基因的反向測序圖1.4重組bacmid/FNHC-36載體中目的基因的DNA序列測定見圖1-6rhFNHC-36基因的正向測序圖見圖l-7rhFNHC-36基因的反向測序圖2.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽SDS-PAGE分析見圖1-8FNHC-36多肽的SDS-PAGE分析見圖1-9純化后FNHF-29多肽SDS-PAGE分析1、純化的FNHC-36多肽；2、M2.2rhFNHN-29多肽的分子量測定rhFNHN-29多肽的SDS-PAGE電泳圖，經(jīng)凝膠圖象分析儀掃描分析。見圖1-10rhFNHN-29多肽分子量測定2.3rhFNHC-36多肽的分子量測定rhFNHC-36多肽經(jīng)SDS-PAGE電泳，在凝膠圖像分析儀中掃描分析。見圖1-11rhFNHC-36多肽的分子量測定2.4斑點雜交斑點雜交法檢測rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽與肝素及FN抗體結(jié)合的能力，用酶聯(lián)顯色和放射顯影法，結(jié)果兩多肽均能與肝素結(jié)合，均不能與FN抗體結(jié)合。多肽結(jié)合肝素斑點雜交放射顯影圖，見圖1-12左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽12多肽結(jié)合肝素斑點雜交酶聯(lián)反應顯色圖，見圖1-13左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽討論本發(fā)明將纖維連接蛋白N端和C端的肝素結(jié)合域多肽基因片斷克隆至酵母表達載體中，成功獲得了重組的含纖維連接蛋白N端和C端肝素結(jié)合域多肽基因片斷的酵母表達載體pPICK-FNHN-29(FNHC-36),并在GS115酵母細胞中表達多肽。本發(fā)明在用Westernblot法檢測多肽結(jié)合肝素能力時，多肽未能與肝素結(jié)合，可能的原因是在Westernblot檢測中，多肽在SDS-PAGE電泳時其空間結(jié)構(gòu)被破壞，故不能與肝素結(jié)合。而在用FN抗體結(jié)合時，多肽同樣未能與FN抗體結(jié)合。多肽結(jié)合肝素的能力在斑點雜交實驗中得到了確認。在斑點雜交實驗中多肽仍不能與FN抗體結(jié)合，提示多肽不具有FN的抗原性。以上結(jié)果顯示利用酵母表達系統(tǒng)表達FN肝素結(jié)合域多肽是可行的。表達的多肽具有相應的結(jié)合肝素的活性。(三)實驗方法一、重組FN多肽對B16細胞粘附能力及B16細胞相關粘附基因niRNA表達的影響1.細胞粘附能力的測定[1]不同濃度的天然全長纖維連接蛋白及rhFNHN-29多肽、rhFNHC-36多肽包被96孔板，第l孔包被濃度為80ug/ml，對倍稀釋至第7孔(共4排)，4'C過夜；0.02XPBS液洗滌3次，加lXBSA封閉lh。包被孔中每孔加入B16細胞5X107ml，100ul/孔。置培養(yǎng)箱中溫育2h后，0.02XPBS液輕輕洗滌上述96孔板包被孔2次，除去未粘附的細胞，每孔再加入無血清培養(yǎng)液100ul，MTT20ul，37。C繼續(xù)孵育4h。吸出培養(yǎng)上清夜，每孔加入150nlDMSO，酶標儀上振蕩10min，測定492nm、630ran雙波長吸光值(OD值)。2.細胞-基質(zhì)粘附實驗[1]5mg/ral的MatrigelMatrix包被96孔板，4。C過夜，0.02XPBS液洗滌3次，力卩1XBSA封閉lh。在B16細胞培養(yǎng)中，加入重組FN多肽使其終濃度為20"g/ml，每天換液重新加入重組FN多肽；3d后，按照有無加入重組FN多肽將B16細胞分成重組FN多肽干預組和對照組，將兩組細胞分別接種于上述包被的96孔板中，包被孔中每孔加入細胞5X107ml，100ul/孔，37。C培養(yǎng)20、40、60、80及100分鐘。0.02XPBS液輕輕洗滌上述96孔板包被孔2次，除去未粘附的細胞，每孔加入無血清培養(yǎng)液100ul，MTT20yl，37。C繼續(xù)孵育4h。吸出培養(yǎng)上清夜，每孔加入150ulDMSO，酶標儀上振蕩10min，測定492nm、630nm雙波長吸光值(OD值)。3.同質(zhì)性粘附實驗[1]B16細胞培養(yǎng)中，加入重組FN多肽使其終濃度為20iig/ml，每天換液重新加入重組FN多肽；3d后，按照有無加入重組FN多肽將B16細胞分成重組FN多肽干預組和對照組，同時設立空白組(空白組的細胞不加重組FN多肽干預)。將重組FN多肽干預組、對照組及空白組的細胞分別接種于普通的96孔板中；待其長滿單層不留空隙后，重組FN多肽干預組和對照組分別加入5X107ml同種細胞，每孔100ul，空白組不加入細胞；37t搖床孵育，40r/fflin，分別于孵育20、40、60、80、IOO分鐘，吸出含有未粘附細胞的培養(yǎng)液，用O.25%胰蛋白酶消化粘附的細胞并計數(shù)細胞數(shù)。4.細胞分離實驗[1]B16細胞培養(yǎng)中，加入重組FN多肽使其終濃度為20yg/ml，每天換液重新加入重組FN多肽；3d后，按照有無加入重組FN多肽將B16細胞分成重組FN多肽干預組和對照組，將兩組細胞分別接種于普通的6孔板中，每孔加入細胞5X107ml，lml/孔，使其長滿單層不留空隙；再加入0.02X乙二胺四乙酸lml，37。C搖床孵育，40r/min，分別于孵育2、4、6、8、IO分鐘，吸出含有未粘附細胞的培養(yǎng)液，計數(shù)上述培養(yǎng)液中的細胞數(shù)得出脫落細胞數(shù)。5.B16細胞粘附纖維蛋白原活性的檢測w625ng/ml的纖維蛋白原包被96孔板，4。C過夜，0.02XPBS液洗滌3次，力Q1^BSA封閉lh。在B16細胞培養(yǎng)中，加入重組FN多肽使其終濃度為20ug/ml，每天換液重新加入重組FN多肽；3d后，按照有無加入重組FN多肽將B16細胞分成重組FN多肽干預組和對照組，將兩組細胞分別接種于上述包被的96孔板中，包被孔中每孔加入細胞5X105/1111，100ul/孔。置培養(yǎng)箱中溫育2h后，0.02XPBS液輕輕洗滌上述96孔板包被孔2次，除去未粘附的細胞，每孔加入無血清培養(yǎng)液lOOii1,MTT20ul，37。C繼續(xù)孵育4h，吸出培養(yǎng)上清夜，每孔加入150ylDMSO，酶標儀上振蕩10min，測定492nm、630nm雙波長吸光值(OD值)。6.B16細胞相關粘附基因mRNA表達的檢測B16細胞培養(yǎng)中，加入重組FN多肽使其終濃度為20lig/ni1，每天換液重新加入重組FN多肽；3d后，按照有無加入重組FN多肽將B16細胞分成重組FN多肽干預組和對照組，兩組各取1X1(T個細胞，抽提RNA，RT-PCR檢測av、P3、FAK基因的mRNA表達。6.1總RNA提取收集重組FN多肽干預組及對照組細胞，用0.02MPBS(ra7.4)洗滌后用RNA提取液(Trizol，Lifetechology)，氯仿、異丙醇、75%乙醇，分步分離提取、沉淀，步驟詳見Trizol試劑說明書。RNA沉淀加20-40ul經(jīng)O.1WDEPC處理的無菌去離子水溶解。所提取RNA經(jīng)紫外分光光度計定量0D260:OD280》1.8，取lng用于l.0%瓊脂糖凝膠(含1!xg/ml溴化乙錠)電泳，IOOV，15分鐘，用UV紫外分析儀分析結(jié)果。提取RNA所用的器具均為一次性無菌塑料制品，電泳緩沖液經(jīng)O.1WDEPC處理，高壓無菌，電泳槽用O.1WDEPC水浸泡后使用。6.2cDNA合成在0.2mlEP管中按順序加入下列逆轉(zhuǎn)錄成分各組總RNAl.OugMgCl2(25mM)4,On110XBuffer2.On1d證Mix(10mM)2.On1Oligo(dT)Primer1.On1RNasin0,5u1AMV(20U/u1)0.625u1加ddH20至總體積20ti1混勻后，置PCR儀42'C60分鐘，99。C5分鐘滅活AMV。cDNA作為PCR反應模板，-2(TC保存。6.3PCR擴增引物濃度均為25pmol/y1，加樣體積如下10XPCRbuffer(含鎂離子)5.Oul14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>引物序列、擴增片段長度、PCR反應條件等參數(shù)見表1表l引物名稱、擴增長度及PCR反應條件<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6.4PCR產(chǎn)物分析取5ylPCR產(chǎn)物加lul上樣緩沖液，2.0%瓊脂糖凝膠(含1111GoldView染料)電泳，IOOV，15分鐘，用UV紫外分析儀分析結(jié)果。測定各組B16細胞av、03、FAK和g-actin基因mRNA表達的光密度值，求出各組B16細胞相關粘附基因mRNA表達和P-actin基因mRNA表達的光密度相對比值。二、重組FN多肽對小鼠黑色素瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響1.重組FN多肽抑制B16瘤細胞皮下生長的實驗收集指數(shù)增殖期B16細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，置于無血清的培養(yǎng)液中，輕輕搖動，細胞懸液經(jīng)計數(shù)、錐蟲藍染色，檢測細胞活力在95%以上，調(diào)整細胞濃度為1X107ml。C57BL/6小鼠30只，用75%乙醇消毒小鼠右側(cè)腋下皮膚，取上述瘤細胞懸液接種于小鼠右腋皮下，每只接種2X107ml細胞(0.2ml);然后隨機分成對照組和rhFNHN-29多肽干預組、rhFNHC-36多肽干預組，每組10只。從接種B16瘤細胞當天開始，對照組連續(xù)接種部位注射7天PBS液(100yl/次.只)，重組FN多肽干預組連續(xù)接種部位注射7天重組FN多肽(100ug/次.只)。觀察小鼠生活情況及皮下腫瘤生長情況，第30天解剖未死亡小鼠，觀察小鼠皮下腫瘤生長情況，剝離皮下腫瘤并稱重；觀察心、肝、脾、肺、腎有無腫瘤轉(zhuǎn)移，觀察腹腔內(nèi)有無腫瘤結(jié)節(jié)形成。2.重組FN多肽抑制抑制B16細胞腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)形成的實驗上述方法收集B16黑色素瘤細胞，調(diào)整細胞濃度為lXl07ml。C57BL/6小鼠30只，用75%乙醇消毒小鼠腹部皮膚，取上述瘤細胞懸液接種于小鼠腹腔，每只接種2X107ml細胞(0.2ml);然后隨機分成對照組和rhFN麗-29多肽干預組、rhFNHC-36多肽干預組，每組IO只。從接種B16瘤細胞當天開始，對照組連續(xù)腹腔注射4天PBS液(100yl/次.只)，重組FN多肽干預組連續(xù)腹腔注射4天重組FN多肽(100ug/次.只)。觀察小鼠生活情況，第7天每組各解剖8只小鼠，觀察其腹腔腫瘤生長情況，計數(shù)腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)；觀察心、肝、脾、肺、腎有無腫瘤轉(zhuǎn)移。觀察各組剩余小鼠的生活情況，觀察其腹腔腫瘤生長情況，計數(shù)腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)；觀察心、肝、脾、肺、腎有無腫瘤轉(zhuǎn)移。3.重組FN多肽抑制小鼠黑色素瘤人工血行轉(zhuǎn)移的實驗上述方法收集B16黑色素瘤細胞，調(diào)整細胞濃度為lX107ml。C57BL/6小鼠30只，用75%乙醇消毒小鼠尾部皮膚，通過小鼠尾靜脈注射1.5Xl(f瘤細胞(0.15ml);然后隨機分成對照組和rhFNHN-29多肽干預組、rhFNHC-36多肽干預組，每組10只。從接種B16瘤細胞當天開始，對照組連續(xù)尾靜脈注射7天PBS液(100yl/次.只)，重組FN多肽干預組連續(xù)尾靜脈注射7天重組FN多肽(100ug/次.只)。觀察小鼠生活情況，第30天解剖未死亡小鼠，觀察其肺部腫瘤生長情況，計數(shù)肺臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。觀察心、肝、脾、腎、腹腔有無腫瘤轉(zhuǎn)移。三、統(tǒng)計學分析體外實驗均重復3次。應用SPSS13.0軟件包，采用t檢驗和卡方檢驗整理數(shù)據(jù)。(三)結(jié)果一、重組FN多肽對B16細胞粘附能力及B16細胞相關粘附基因mRNA表達的影響1.重組FN多肽對B16細胞粘附能力的影響OD值隨著FN及重組FN多肽的濃度增高而增加，F(xiàn)N及重組FN多肽濃度為40yg/ml時，OD值的增加達到平臺期。提示B16細胞與FN及重組FN多肽的粘附力均呈濃度依賴性；FN的ED50為23wg/ml，rhFNHN-29多肽的ED50為18ug/ml，rhFNHC-36多肽的ED50為20ug/ml，重組FN多肽的ED50和FN基本一致，提示B16細胞與rhFNHN-29多肽及rhFNHC-36多肽的粘附黏附力和FN基本一致。2.重組FN多肽對B16細胞與人工基底膜粘附力的影響OD值隨著時間的增加而增加，提示重組FN多肽干預組及對照組的B16細胞與人工基質(zhì)基底膜的粘附力均呈時間依賴性；在各時相內(nèi)，重組FN多肽干預組B16細胞與人工基質(zhì)基底膜的粘附力明顯高于對照組，兩者相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01);rhFNHN-29多肽組B16細胞與人工基質(zhì)基底膜的粘附力和rhFNHC-36多肽組基本一致，兩者相比，差別無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)。重組FN多肽組和對照組對比P<0.013.重組FN多肽對B16細胞之間粘附力的影響粘附細胞數(shù)隨著時間的增加而增加，提示重組FN多肽干預組及對照組的B16細胞之間的粘附力均呈時間依賴性；在各時相內(nèi)，重組FN多肽干預組B16細胞之間的粘附力明顯高于對照組，兩者相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.001);rhFNHN-29多肽組B16細胞之間的粘附力和rhFNHC-36多肽組基本一致，兩者相比，差別無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)。重組FN多肽組和對照組對比P<0.0014.重組FN多肽對B16細胞相互間分離的影響脫落細胞數(shù)隨著時間的增加而增加，提示重組FN多肽干預組及對照組脫落的B16細胞數(shù)目隨著時間的推移而逐漸增多；在各時相內(nèi)，重組FN多肽干預組脫落的B16細胞數(shù)目明顯低于對照組，兩者相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01);rhFNHN-29多肽組脫落的B16細胞數(shù)目和rhFNHC-36多肽組基本一致，兩者相比，差別無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)。重組FN多肽組和對照組對比P<0.015.重組FN多肽對B16細胞與纖維蛋白原粘附力的影響rhFNHN-29多肽組及rhFNHC-36多肽組的0D值明顯小于對照組，提示重組FN多肽組B16細胞與纖維蛋白原的粘附力明顯低于對照組，兩者相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05);rhFNHN-29多肽組0D值和rhFNHC-36多肽組基本一致，提示rhFNHN-29多肽組B16細胞與纖維蛋白原的粘附力和rhFNHC-36多肽組基本一致，兩者相比，差別無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)。重組FN多肽組和對照組對比P<0.056.重組FN多肽對B16細胞相關粘附基因mRNA表達的影響從總RNA電泳圖可知，各組總RNA均顯示28S和18S清晰的兩條rRNA帶，經(jīng)UV紫外分析儀分析28S和18S的比值都在1.82.O之間，說明提取的總RNA完整性較好。實驗表明重組FN多肽處理3天后，B16細胞的av、P3和FAK基因的mRNA表達受到明顯抑制。重組FN多肽干預組B16細胞相關粘附基因mRNA表達的光密度相對比值明顯低于對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，提示重組FN多肽對B16細胞的av、P3和FAK基因mRNA表達具有明顯的抑制作用；rhFNHN-29多肽組B16細胞相關粘附基因mRNA表達的光密度相對比值低于FNCHBD多肽，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示rhFNHN-29多肽對B16細胞的av、和FAK基因mRNA表達的抑制作用強于rhFNHC-36多肽。二、重組FN多肽對小鼠黑色素瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響1.重組FN多肽對B16瘤細胞皮下生長的影響接種當天小鼠生活習性均未見明顯改變，但18天后對照組小鼠乏力、活動減少、呆滯及厭食漸明顯，死亡3只(分別死于接種后第19天、接種后第21天和接種后第23天)，解剖發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)長有大量黑色結(jié)節(jié)，其中2只小鼠可見肺臟表面長有黑色結(jié)節(jié)；重組FN多肽干預組部分小鼠出現(xiàn)乏力、活動減少、呆滯及厭食，rhFNHN-29多肽組于接種后第25天死亡l只小鼠，rhFNHC-36多肽組于接種后第24天死亡1只小鼠，解剖均發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)長有大量黑色結(jié)節(jié)，但未見肺臟及其他部位出現(xiàn)黑色結(jié)節(jié)。接種后第30天解剖各組未死亡小鼠，對照組4只小鼠腹腔內(nèi)長有大量黑色結(jié)節(jié)，未見肺臟及其他部位出現(xiàn)黑色結(jié)節(jié)；rhFNHC-36多肽組l只小鼠腹腔內(nèi)長有大量黑色結(jié)節(jié)，未見肺臟及其他部位出現(xiàn)黑色結(jié)節(jié)；rhFNHN-29多肽組未見17腹腔、肺臟及其他部位出現(xiàn)黑色結(jié)節(jié)。對照組腹腔侵襲率為70%(7/10)，rhFNHN-29多肽組為10%(1/10)，rhFNHC-36多肽組為20X(2/10)，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);對照組小鼠死亡率為30%(3/10),rhFNHN-29多肽組為10X(1/10)，rhFNHC-36多肽組為10X(1/10)，與對照組相比，差別均無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)(見圖2)。rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽均可明顯抑制小鼠皮下腫瘤的生長，rhFNHN-29多肽組和rhFNHC-36多肽組皮下腫瘤的平均重量明顯輕于對照組，差別均有統(tǒng)計學意義(<0.05)(見圖3)。2.重組FN多肽對B16細胞腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)形成的影響接種當天小鼠生活習性均未見明顯改變。接種后第7天每組各解剖8只小鼠，對照組腫瘤細胞開始在腹腔內(nèi)中呈侵襲性生長，腹腔內(nèi)可見大量的微小黑色結(jié)節(jié)(<lmra),分布于腸系膜靜脈網(wǎng)及腹腔大血管周圍，肝臟、脾臟及腎臟表面可見大量黑色結(jié)節(jié)，肺臟及心臟表面未見黑色結(jié)節(jié)；而重組FN多肽干預組腫瘤細胞局限生長，腹腔內(nèi)微小黑色結(jié)節(jié)明顯減少，肝臟和脾臟表面可見少量黑色結(jié)節(jié)，腎臟、肺臟及心臟表面未見黑色結(jié)節(jié)。對照組腹腔腫瘤總結(jié)節(jié)數(shù)為(106.9±12.8)個，F(xiàn)NN朋DrhFNHN-29多肽組為(39.9±6.4)個，抑制率達62.7%，rhFNHC-36多肽組為(48.6±11.1)個，抑制率達54.5%。重組FN多肽對〈4咖的腫瘤結(jié)節(jié)的抑制作用較強，對^4mm的腫瘤結(jié)節(jié)沒有抑制作用(表2、圖4)。12天后對照組和干預組未解剖小鼠均有明顯乏力、活動減少、呆滯、厭食表現(xiàn)，最終死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)系腫瘤巨大或數(shù)目較多和(或)腫瘤轉(zhuǎn)移至肺或肝等而導致小鼠衰竭死亡。表2重組FN多肽對B16細胞腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)形成的影響組別鼠數(shù)腹腔腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目〈lrarn1_4咖》4,總數(shù)對照組1075.2±5.828.1±8.73.6±1.9106.9±12.8rhFNHC-36多肽組1032.0±7.014.2±5,12.4±1.748.6±11,1rh卿N-29多肽組1016.6±5.321.5±2.71.8±0.739.9±6.43.重組FN多肽對小鼠黑色素瘤人工血行轉(zhuǎn)移的影響接種后1一3小時，l只小鼠出現(xiàn)活動減少和暈厥樣表現(xiàn)，后漸好轉(zhuǎn)。15天后對照組小鼠乏力、活動減少、呆滯及厭食漸明顯，死亡8只(其中接種后第15天死亡3只小鼠，接種后第19天死亡1只小鼠，接種后第27天死亡4只小鼠)，解剖發(fā)現(xiàn)肺臟表面長滿黑色結(jié)節(jié)和(或)肝臟等腹腔部位長有黑色結(jié)節(jié)；rhFNHN-29多肽組部分小鼠出現(xiàn)乏力、活動減少、呆滯及厭食，死亡5只(其中接種后第25天死亡3只小鼠，接種后第27天死亡2只小鼠)，解剖發(fā)現(xiàn)肺臟表面局部長有黑色結(jié)節(jié)(其中l(wèi)只小鼠左肺及右肺前葉、中葉、后葉、心葉均長有黑色結(jié)節(jié)，2只小鼠右肺前葉、中葉、后葉均長有黑色結(jié)節(jié)，2只小鼠左肺長有黑色結(jié)節(jié))，其他部位未見黑色結(jié)節(jié)；rhFNHC-36多肽組部分小鼠出現(xiàn)乏力、活動減少、呆滯及厭食，死亡4只(均在接種后第27天死亡)，解剖發(fā)現(xiàn)肺臟表面局部長有腫瘤結(jié)節(jié)(其中l(wèi)只小鼠左肺及右肺前葉、中葉、后葉、心葉均長有黑色結(jié)節(jié)，l只小鼠右肺前葉、中葉、后葉均長有黑色結(jié)節(jié)，2只小鼠左肺長有黑色結(jié)節(jié))，其他部位未見黑色結(jié)節(jié)。接種后第30天解剖各組未死亡小鼠，對照組小鼠肺臟表面均長滿黑色結(jié)節(jié)，未見腹腔及其他部位長有黑色結(jié)節(jié)，rhFNHN-29多肽組和rhFNHC-36多肽組小鼠肺臟表面未見明顯的黑色結(jié)節(jié)。對照組小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移率為100%(10/10)，rhFNHN-29多肽組為50%(5/10)，rhFNHC-36多肽組為404/10)，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);對照組肺臟腫瘤結(jié)節(jié)平均數(shù)目為(96.4±4.6)/只，rhFNHN-29多肽組為(20.5±19.6)/只，rhFNHC-36多肽組為(19.1±25.6)/只，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);對照組小鼠死亡率為80%(8/10)，rhFNHN-29多肽組為50%(5/10)，rhFNHC-36多肽組為40%(4/10)，與對照組相比，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖5)。(四)結(jié)論1、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽具有抑制B16瘤細胞皮下生長，減弱皮下腫瘤腹腔侵襲的能力。2、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽具有抑制B16瘤細胞在腹腔形成微小腫瘤結(jié)節(jié)的能力。3、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽具有抑制小鼠黑色素瘤人工血行轉(zhuǎn)移的能力。4、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽通過影響整合素ave3的功能起到抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。因而，重組FN肝素結(jié)合域多肽能在制備抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應用。參考文獻1、高進，章靜波主編.癌的侵襲與轉(zhuǎn)移一基礎與臨床.北京:科學出版社.2003.5:236-239權利要求1、一種重組纖維連接蛋白N端及C端肝素結(jié)合域多肽，其特征在于在制備抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組FN肝素結(jié)合域多肽在制備抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應用，由FN分子中N端的五個I型同源結(jié)構(gòu)組成，含有從Ser46-Gly282的237個氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從403bp到1113bp，長711bp，PCR擴增片斷長741bp，雙酶切后片斷長729bp；由酵母表達的多肽分子量為28.52kDa。由FN分子中的III-12、III-13、III-14三個III型同源結(jié)構(gòu)組成，含有從Tyr1720-Tyr1991的272個氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從5428bp到6244bp，長816bp，PCR擴增片斷長835bp，雙酶切后片斷長828bp，由酵母表達的多肽分子量為36.09kDa。經(jīng)試驗證明本發(fā)明能在制備抗惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中得到應用。文檔編號A61P35/00GK101596307SQ20081007117公開日2009年12月9日申請日期2008年6月5日優(yōu)先權日2008年6月5日發(fā)明者鄒起練,陳元仲,陳顯凌,濤黃申請人:福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院