專(zhuān)利名稱(chēng)：(3aR,5R,11bR)-3,3a,5,11b-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-呋[3,2-b]萘并[2,3-d]吡喃-2,6 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是(3aR， 5R, 11bR)-3， 3a， 5， llb-四氫 -7-羥基-5-甲基-2H-吹[3, 2-b]萘并[2， 3-d]吡喃-2， 6， 11-三酮的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)統(tǒng)計(jì)，從1981年l月到2006年6月總共開(kāi)發(fā)新藥1184種，天然產(chǎn) 物或天然產(chǎn)物來(lái)源的藥物占42%。從1940年以來(lái)，155個(gè)小分子化療藥中， 47%為天然藥物或半合成天然藥物(Newman, D. J. ， et a7. , Natural products as sources of new drugs over the last 25 years, /. iV".尸rocf. 2007， 70: 461-477 )。該結(jié)果表明大自然是重要的藥物寶庫(kù)。
在耐藥菌廣泛出現(xiàn)后，尤其是近年來(lái)由于環(huán)境惡化和人口流動(dòng)造成抗 藥性產(chǎn)生周期日趨縮短的問(wèn)題，加之耐受藥物的種類(lèi)日益增多，使得人們 對(duì)新型抗生素的需求比以往任何時(shí)候都更加迫切。隨著惡性腫瘤發(fā)病率的 不斷提高，對(duì)新型抗腫瘤抗生素的需求也日益迫切。二十世紀(jì)人們將目光 轉(zhuǎn)向蘊(yùn)藏著豐富微生物資源的海洋，海洋生態(tài)環(huán)境的特殊性和多樣性，決 定了海洋微生物種類(lèi)及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性，從海洋微生物發(fā)現(xiàn)具有 抗腫瘤和抑菌作用的先導(dǎo)化合物，成為發(fā)現(xiàn)新生物活性物質(zhì)的一條解決途 徑。分別來(lái)自意大利撒丁島和日本相模灣的兩株海洋微生物所貢獻(xiàn)的頭孢 霉素C和小諾(相模)霉素，充分說(shuō)明了海洋微生物在產(chǎn)生活性先導(dǎo)化合 物方面的潛力。(Marwick， J. D. , et aL , Bioprocess intensif icat ion f or production of novel marine bacterial antibiotics through bioreactor operation and design, Marine 5iotechno2ogy, 1999， 1 ( 5 ): 495—507; Jensen, P. R. ， ， Strategies for the discovery of secondary
metabol i tes f rom mar ine bacteria: ecologica 1 perspect ives, i!]肌i ev. MicroWo!， 1994, 48: 559-584 )。
同陸地放線(xiàn)菌產(chǎn)生抗生素相似，海洋微生物中的海洋放線(xiàn)菌也是新型 抗生素的重要來(lái)源。從海洋鏈霉菌S"印to/Hyces sioyae"sis SA-1758中 分離到的結(jié)構(gòu)新穎、含硫和氮的生物堿altemicidin，具有單薛骨架，顯示 強(qiáng)體外抗L1210淋巴瘤和IMC癌細(xì)胞活性，ICs。分別為0. 84和0. 82 (ig/raL， 但它對(duì)小鼠也有毒性(LD5 = 0.3 (ig/mL)。 (Takahashi， A. ， et a2.， Altemicidin， a new acaricidal and antitumor substance I, taxonomy, fermentation ， isolation and physico—chemical and biological properties,丄y^"Wot. , 1989, 42 ( 11 ): 1556-1561; Takahashi, A., ai. , Altemicidin, a new acaricidal and antitumor substanceII， Structure determination,丄ht^fot. , 1989, 42 ( 11 ): 1562-1566 )。 稀有放線(xiàn)菌Saihwspora strain CNB-392是從經(jīng)過(guò)熱處理的海洋沉積物樣 品中分離出來(lái)的，利用含海水的瓊脂平板進(jìn)行培養(yǎng)，并通過(guò)細(xì)胞毒活性跟蹤分離，得至U了化合物salinosporamide A。 Salinosporamide A對(duì)NCI的 60株腫瘤細(xì)胞系顯示出強(qiáng)烈而有選擇性的活性，平均GL。小于10nM,并且 抗性細(xì)胞株和敏感細(xì)胞株的差異大于4 log LC5。。該化合物對(duì)NCI-H226、 SF-539 CNS、 SK-MEL-28和MDA-MB-435細(xì)胞株抑制作用最強(qiáng)烈(L"都小于 10 nM),對(duì)人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的ICs。為11 ng/mL (Feling RH," a7. Salinoaporamide A: highly cytotoxic proteasome inhibitor from a novel microbial source, a marine bacterium of the new genus Sa"愿pora. 細(xì)ezo a扁丑tl 2003, 42: 35 )。 分離自珊瑚 Pa"Hgotgio sp.體表的鏈霉菌PG-19,從中得到兩個(gè)八元環(huán)內(nèi)酯 octalactins A和B, octalactins A在體外對(duì)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞及人 結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞有顯著細(xì)胞毒性(I"分別為7. 2xl(T3 lag/mL, 0.5 |Lig/mL)，而octalactins B無(wú)細(xì)胞毒性(Fenical, W. , and Jensen, P. R., In Marine 5iotecn]oJogy， Volume 1: Pi〗ar/naceutica2 Sioacd.ve "'ra7 Rroduc"; Attaway, D. H. , Zaborsky， 0. R. , Eds.; Plenum Press: New York, 1993; pp 419-457 )。Lomaiviticins A禾口 B是由一株分離自——種海銷(xiāo)(PoJysyi!crato" h'〃〗ostroa訓(xùn))體內(nèi)的嗜鹽性小單孢菌新種 Micro膨nospora 2o鵬！'W "e力sis LL-371366產(chǎn)生的。通過(guò)BIA (biochemical induction assay)法跟蹤活性分離，發(fā)現(xiàn)Lomaivi t icins A和B顯示出強(qiáng)烈的DNA破 壞性，能夠在特定條件下切斷DNA雙螺旋，兩個(gè)化合物的最小作用濃度都 小于或等于每孔0.1 ng。 Lomaiviticin A還顯示強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性(I"為 0.01-98 ng/mL)。 (He， H. ， aL , Lomaiviticins A and B. , potent antitumor antibiotics from Microfflonospora Jo/Haivfteusis. /. 乂ffl. CAe/h. Soc. 2001, 123: 5362-5363 )。本發(fā)明目的在于提供一種(3aR, 5R， llbR)-3， 3a， 5， lib-四氫-7-羥基 -5-甲基-2H-呋[3， 2-b]萘并[2， 3-d]吡喃-2， 6, ll-三酮的應(yīng)用。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為(3aR, 5R， llbR)-3, 3a, 5, llb-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-p夫[3, 2-b]萘并 [2, 3-d]吡喃-2，6, 11-三酮在制備抗腫瘤抗生素的藥中的應(yīng)用。所述(3aR， 5R， 11bR)-3， 3a, 5, llb-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-p夫[3, 2-b] 萘并[2， 3-d]吡喃-2， 6, 11-三酮的制備方法為將鏈霉菌M097接種于M2瓊脂 平板培養(yǎng)基上，于25-35。C下培養(yǎng)3-4天，而后釆用接種環(huán)將一環(huán)孢子接種 到200-300mL豆粉液體培養(yǎng)基上于25 - 30°C，以90-120 rpm搖床培養(yǎng)3-4 天；培養(yǎng)產(chǎn)物過(guò)濾而后用乙酸乙酯萃取3-4次濃縮得粗提物，濃縮得粗提發(fā)明內(nèi)容物經(jīng)硅膠柱層析，用環(huán)己烷和二氯甲烷梯度洗脫，待洗脫組分中釆用二氯甲烷作為展開(kāi)劑 ^ = 0.40-0.60 時(shí)，該組分即為 (3aR, 5R， llbR) -3， 3a， 5， lib-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-吹[3， 2-b]萘并 [2，3-d]吡喃-2,6,11-三酮；其中鏈霉菌M097保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No. 2445。所述M2瓊脂平板培養(yǎng)基成份為大麥提取物9-11 g,酵母粉3-5 g, 葡萄糖3-5 g,瓊脂粉12-18 g, 1 L天然海水，pH 7.5-8.0;所述豆粉液 體培養(yǎng)基為大豆粉19-21 g,甘露醇19-21 g， 1L天然海水，pH 7.5-8.0。所述過(guò)濾后的培養(yǎng)產(chǎn)物分成菌體和菌液兩部分，菌液用乙酸乙酯萃取， 菌體在超聲波下處理10-20分鐘，用乙酸乙酯抽提。所述乙酸乙酯抽次數(shù) 為2-5次，每次10 L;所述梯度范圍為2L環(huán)己烷，2L環(huán)己烷/5(T/。二氯甲 烷。所述洗脫組分經(jīng)環(huán)己烷洗滌1-3次，保存。 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1. 本發(fā)明化合物具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，對(duì)37株人體腫瘤細(xì)胞的平均半 致死濃度為0.06 jig/mL，可作為抗腫瘤藥物活性強(qiáng)的化合物。2. 本發(fā)明充分利用豐富的海洋微生物資源，得到可作為抗腫瘤藥物活 性強(qiáng)的化合物，其對(duì)多種人體腫瘤細(xì)胞如膀胱癌細(xì)胞1218L, T24;宮頸 癌細(xì)胞498NL, SF268;結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116， HT29;胃癌細(xì)胞251L; 頭頸癌細(xì)胞536L;肺癌細(xì)胞1121L, 289L, 526L， 529L, 629L, H460; 乳腺癌細(xì)胞401NL， MCF7, MDA231等37株人體腫瘤細(xì)胞有抑制作用，可作 為臨床藥物或先導(dǎo)化合物。3. 釆用選用價(jià)格低廉的大豆粉和甘露醇為原料發(fā)酵微生物，乙酸乙酯 抽提制備粗提物，操作步驟簡(jiǎn)單，具有可重復(fù)性，并且成本低廉，對(duì)環(huán)境 不造成損害。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例詳述本發(fā)明。 實(shí)施例1制備(3aR， 5R， llbR)-3, 3a, 5, 11b-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-p夫[3， 2-b] 萘并[2, 3-d]吡喃-2，6, ll-三酮1. 菌株釆集從青島膠州灣釆集海泥樣品，進(jìn)行梯度稀釋(1(T3, 10-2， 10—0劃線(xiàn)培養(yǎng)，利用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，純化得到海洋鏈霉菌(S"印t哪yc" sp. ) M097，海洋鏈霉菌M097保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心CGMCC,保藏編號(hào)為CGMCC No. 2445。所述高氏一號(hào)培養(yǎng)基 為可溶性淀粉20 g，硝酸鉀l g,磷酸二氫鉀O. 5 g,硫酸鎂O. 5 g，氯化 鈉0. 5 g,硫酸亞鐵0. 01 g,重鉻酸鉀0. 1 g，瓊脂粉15 g,天然海水1 L， pH 7. 2。2. 鏈霉菌M097的平板培養(yǎng)將海洋鏈霉菌M097接種于M2瓊脂平板培養(yǎng)基上，于28°C下培養(yǎng)3-4天，其中M2瓊脂平板培養(yǎng)基大麥提取物10 g， 酵母粉4 g，葡萄糖4 g，瓊脂粉15 g, 1 L天然海水，pH 7.8。3.搖床培養(yǎng)將平板種子接種到100個(gè)1000 mL的Erle腿eyer三角瓶 中，每個(gè)三角瓶含有250 mL豆粉液體培養(yǎng)基置于28。C下以90 rpm往復(fù)式 搖床培養(yǎng)3天；其中豆粉液體培養(yǎng)基大豆粉20 g，甘露醇20 g, 1 L天然 海水，pH 7. 8。4. 萃取將搖床培養(yǎng)產(chǎn)物，利用板式過(guò)濾器過(guò)濾，分成菌體和菌液兩 部分。菌液用乙酸乙酯萃取3次；菌體在超聲波下處理15分鐘，用乙酸乙 酯抽提3次，菌體和菌液萃取后的有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，合并即5. 純;七將濃縮粗提物經(jīng)硅膠柱層析，用環(huán)己烷/二氯甲烷梯度洗脫， 按照10 mL/min的流速，首先釆用2 L環(huán)己烷洗脫去掉粗提物中的油脂類(lèi) 組分，再用2L環(huán)己烷/50y。二氯甲烷洗脫，組分A和B。組分B含有一黃色 條帶，經(jīng)6N的堿處理變紅色(用毛吸管吸取堿溶液，滴加到TLC層析板上 的黃色條帶)，釆用二氯甲烷作為展開(kāi)劑Af = 0. 51，該條帶即為 (3aR, 5R, llbR) -3， 3a， 5, lib-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-吹[3, 2_b]萘并 [2,3-d]吡喃-2， 6,11-三酮。所得化合物用環(huán)己烷洗滌該組分2次，棄油， 保存。實(shí)施例2(3aR， 5R, 11bR)-3， 3a， 5， lib-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-p夫[3， 2-b]萘并 [2，3-d]吡喃-2， 6,11-三酮的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)由德國(guó) Oncotest生物公司進(jìn)行測(cè)定，選用人體腫瘤細(xì)胞系(Human Cancer Cell Lines),包括膀胱癌細(xì)胞1218L, T24;宮頸癌細(xì)胞498NL, SF268;結(jié) 腸直腸癌細(xì)胞HCT116, HT29;胃癌細(xì)胞251L;頭頸部腫瘤536L;肺 癌細(xì)胞1121L, 289L, 526L, 529L, 629L， H460;乳腺癌細(xì)胞術(shù)NL， MCF7, MDA231;黑瘤細(xì)胞276L, 394NL, 462NL, 514L, 520L;卵巢癌細(xì) 胞1619L, 899L， 0VCAR3;胰腺癌細(xì)胞1657L, PANC1;前列腺癌細(xì)胞 22RV1, DU145, LNCAP, PC3M;胸膜瘤1752L;腎癌細(xì)胞1781L, 393NL, 486L, 944L;子宮癌細(xì)胞1138L。釆用細(xì)胞熒光染色法，對(duì)每一細(xì)胞株分 別測(cè)定五個(gè)化合物濃度梯度，重復(fù)測(cè)定兩次，計(jì)算IC5Q、 IC,。和IC9 。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果kalamycin的有效濃度平均ICs。分別為0. 06 pg/mL。實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于所述(3aR， 5R， llbR)-3， 3a, 5, llb-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-吹[3， 2-b] 萘并[2， 3-d]吡喃-2， 6, 11-三酮的制備方法為將鏈霉菌M097接種于M2瓊脂 平板培養(yǎng)基上，于25。C下培養(yǎng)3-4天，而后釆用接種環(huán)將一環(huán)孢子接種到 200 mL豆粉液體培養(yǎng)基上于25°C,以120 rpm搖床培養(yǎng)3-4天；培養(yǎng)產(chǎn)物 過(guò)濾而后用乙酸乙酯萃取4次濃縮得粗提物，濃縮得粗提物經(jīng)硅膠柱層析，用環(huán)己烷和二氯甲烷梯度洗脫，待洗脫組分中釆用二氯甲烷作為展開(kāi)劑^^ =0. 40時(shí)，該組分即為(3aR, 5R， llbR)-3， 3a, 5， lib-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-吹[3, 2-b]萘并[2， 3-d]吡喃-2， 6, ll-三酮;所述M2瓊脂平板培養(yǎng)基成份為大麥提取物9g,酵母粉3g，葡萄糖 3 g，瓊脂粉12 g， 1 L天然海水，pH 7.5;所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆粉 19 g，甘露醇19 g， 1 L天然海水，pH 7.5。所述過(guò)濾后的培養(yǎng)產(chǎn)物分成菌體和菌液兩部分，菌液用乙酸乙酯萃取， 菌體在超聲波下處理IO分鐘，用乙酸乙酯抽提。所述乙酸乙酯抽次數(shù)為2 次，每次10L;所述洗脫組分經(jīng)環(huán)己烷洗滌l次，保存。 實(shí)施例4與實(shí)施例l不同之處在于所述(3aR, 5R, 11bR)-3， 3a， 5， llb-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-呔[3, 2-b] 萘并[2， 3-d]吡喃-2，6, 11-三酮的制備方法為將鏈霉菌M097接種于142瓊脂 平板培養(yǎng)基上，于35。C下培養(yǎng)3-4天，而后釆用接種環(huán)將一環(huán)孢子接種到 300 mL豆粉液體培養(yǎng)基上于3(TC,以100 rpm搖床培養(yǎng)3-4天；培養(yǎng)產(chǎn)物 過(guò)濾而后用乙酸乙酯萃取4次濃縮得粗提物，濃縮得粗提物經(jīng)硅膠柱層析，用環(huán)己烷和二氯甲烷梯度洗脫,待洗脫組分中釆用二氯甲烷作為展開(kāi)劑i /^ 0. 60時(shí)，該組分即為(3aR, 5R， llbR)-3, 3a， 5， lib-四氫-7-羥基_5-甲基-2H-呋[3， 2-b]萘并[2， 3-d]吡喃-2, 6, 11-三酮；所述M2瓊脂平板培養(yǎng)基成份為大麥提取物11 g，酵母粉5 g,葡萄 糖5 g,瓊脂粉18 g, 1 L天然海水，pH 8.0;所述豆粉液體培養(yǎng)基為大豆 粉21 g，甘露醇21 g, 1 L天然海水，pH 8.0。所述過(guò)濾后的培養(yǎng)產(chǎn)物分成菌體和菌液兩部分，菌液用乙酸乙酯萃取， 菌體在超聲波下處理20分鐘，用乙酸乙酯抽提。所述乙酸乙酯抽次數(shù)為5 次，每次10L;所述洗脫組分經(jīng)環(huán)己烷洗滌3次，保存。
權(quán)利要求
1.(3aR，5R，11bR)-3，3a，5，11b-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-呋[3，2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2，6，11-三酮的應(yīng)用，其特征在于所述化合物在制備抗腫瘤抗生素的藥中的應(yīng)用。
2. 按權(quán)利要求1所述的(3aR, 5R, llbR)-3, 3a， 5, lib-四氫-7-羥基-5-甲 基-2H-吹[3, 2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2，6, ll-三酮的應(yīng)用，其特征在于所 述(3aR， 5R， llbR)-3, 3a, 5， lib-四氫-7-羥基-5_甲基-2H-吹[3， 2-b]萘并 [2， 3-d]吡喃-2, 6， 11-三酮的制備方法為將鏈霉菌M097接種于M2瓊脂平板 培養(yǎng)基上，于25-35 。C下培養(yǎng)3-4天，而后釆用接種環(huán)將一環(huán)孢子接種到 200-300 mL豆粉液體培養(yǎng)基上于25 - 30°C，以90-120 rpm搖床培養(yǎng)3-4 天；培養(yǎng)產(chǎn)物過(guò)濾而后用乙酸乙酯萃取3-4次濃縮得粗提物，濃縮得粗提 物經(jīng)硅膠柱層析，用環(huán)己烷和二氯甲烷梯度洗脫，待洗脫組分中釆用二氯 甲烷作為展開(kāi)劑 ^ = 0.40-0.60 時(shí)，該組分即為 (3aR， 5R， llbR)-3, 3a, 5， lib-四氫_7-羥基-5-甲基-2H-吹[3, 2-b]萘并 [2，3-d]吡喃-2，6, 11-三酮；其中鏈霉菌M097保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No. 2445。
3. 按權(quán)利要求2所述的(3aR， 5R, llbR)-3， 3a, 5， 11b-四氫-7-羥基-5-甲 基-2H-p夫[3,2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2,6,ll-三酮的應(yīng)用，其特征在于所 述M2瓊脂平板培養(yǎng)基成份為大麥提取物9-11 g，酵母粉3-5 g，葡萄糖 3-5 g,瓊脂粉12-18 g, 1 L天然海水，pH 7.5-8.0;所述豆粉液體培養(yǎng) 基 為大豆粉19-21 g,甘露醇19-21 g, 1 L天然海水，pH 7.5-8.0。
4.按權(quán)利要求2所述的(3aR, 5R， 11bR)-3， 3a， 5， llb-四氫-7-羥基-5-甲 基-2H-吹[3，2-b]萘并[2,3-d]吡喃-2，6，11-三酮的應(yīng)用，其特征在于所 述過(guò)濾后的培養(yǎng)產(chǎn)物分成菌體和菌液兩部分，菌液用乙酸乙酯萃取，菌體 在超聲波下處理10-20分鐘，用乙酸乙酯抽提。
5. 按權(quán)利要求2所述的(3aR， 5R， 11bR)-3， 3a， 5， llb-四氫-7-羥基-5-甲 基-2H-吹[3，2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2，6，ll-三酮的應(yīng)用，其特征在于所 述乙酸乙酯抽次數(shù)為2-5次，每次10L;所述梯度范圍為2 L環(huán)己烷，2L 環(huán)己烷/50%二氯甲烷。
6. 按權(quán)利要求2所述的(3aR, 5R, 11bR)-3， 3a, 5， llb-四氫-7-羥基-5-甲 基-2H-p夫[3，2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2,6, ll-三酮的應(yīng)用，其特征在于所 述洗脫組分經(jīng)環(huán)己烷洗滌l-3次，保存。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是(3aR，5R，11bR)-3，3a，5，11b-四氫-7-羥基-5-甲基-2H-呋[3，2-b]萘并[2，3-d]吡喃-2，6，11-三酮的應(yīng)用。所述化合物在制備抗腫瘤抗生素的藥中的應(yīng)用。本發(fā)明化合物具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，對(duì)37株人體腫瘤細(xì)胞的平均半致死濃度為0.06μg/mL?？勺鳛榭鼓[瘤藥物活性強(qiáng)的化合物，其對(duì)多種人體腫瘤細(xì)胞有抑制作用，可作為臨床藥物或先導(dǎo)化合物。
文檔編號(hào)A61K31/352GK101317836SQ200810017159
公開(kāi)日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2008年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者玲 丁, 哈特穆特·拉赤, 張偉杰, 李富超, 松 秦 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所