專利名稱：：用于改善線粒體功能的含有心磷脂的脂質(zhì)體的制作方法用于改善線粒體功能的含有心罅脂的脂質(zhì)體
背景技術(shù)：
：氧自由基或活性氧類(reactiveoxygenspecies)(ROS)是具有高度反應(yīng)性的物質(zhì)，已知它們是脂類、蛋白質(zhì)、酸等的細(xì)胞氧化和后續(xù)功能修復(fù)的主要因子.實(shí)際上，活性氧已被認(rèn)為是衰老和包括癌癥在內(nèi)的幾種疾病的主要誘因。具體而言，已知ROS損害線粒體，線粒體的氧損傷據(jù)認(rèn)為是細(xì)胞老化和細(xì)胞最終死亡的主要因素。線粒體是體內(nèi)每個(gè)細(xì)胞的組成部分，其含有遣傳物質(zhì)，實(shí)際上，在所有真核細(xì)胞中都可發(fā)現(xiàn)線粒體。線粒體負(fù)責(zé)加工氧并將食物中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞作用所必需的能量。線粒體產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)形式的能量，然后三磷酸腺苷被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的胞質(zhì)中用于多種細(xì)胞功能。線粒體被稱為細(xì)胞的動(dòng)力工廠，因?yàn)榫€粒體產(chǎn)生的ATP供應(yīng)多細(xì)胞生物所用代謝能量的大約90°/。.線粒體在氧代謝中的作用使其成為氧自由基傷害的主要靶標(biāo)。具體來講，線粒體呼吸鏈(即電子傳遞鏈)已被鑒定為ROS的主要細(xì)胞內(nèi)來源。線粒體中ATP的形成導(dǎo)致釋放高反應(yīng)性的超氧自由基，它們可轉(zhuǎn)化為其他ROS，例如過氧化氫和羥基自由基。細(xì)胞具有應(yīng)對這種氧化應(yīng)激(oxidativestress)的機(jī)制，但是這種應(yīng)對的效率隨著年齡(的增加)和外來因素(例如應(yīng)激)的影響而下降。最終，線粒體喪失了產(chǎn)生ATP的能力和效率，導(dǎo)致細(xì)胞功能的喪失，甚至常常導(dǎo)致細(xì)胞死亡，ROS能夠通過降解線粒體內(nèi)膜中的蛋白質(zhì)和脂類而損傷線粒體。最具傷害性的ROS物質(zhì)之一是造成脂類過氧化的羥基自由基。因?yàn)橹愡^氧化隨時(shí)間而增加，所以線粒體內(nèi)膜中的主要脂類之---心磷脂產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化。這些結(jié)構(gòu)變化對內(nèi)膜及相關(guān)的心磷脂蛋白相互作用造成傷害，而這些對電子傳遞至關(guān)重要。例如，在健康的、功能正常的線粒體中，細(xì)胞色素c連接于心磷脂。但是當(dāng)心磷脂降解之后，細(xì)胞色素c被釋放，繼而引發(fā)級聯(lián)事件，導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡，4有提議認(rèn)為外源加入心磷脂可能會(huì)使整體的線粒體功能不良得到改善。然而，在嘗試外源遞送心褲脂的過程中遇到了很多困難，心磷脂不穩(wěn)定，并且極易氧化降解。例如，人心磷脂含有多不飽和脂肪酸，其中超過85%屬于亞油酸系列。與飽和或單不飽和脂肪酸不同，多不飽和脂肪酸(如亞油酸)容易被ROS降解。此外，在基于復(fù)雜、功能完全的細(xì)胞的模型中，預(yù)期簡單的局部給予心磷脂不能夠穿透到線粒體內(nèi)膜中，在體內(nèi)尤其如此，因?yàn)轶w內(nèi)會(huì)發(fā)生心磷脂的氧化降解并且存在運(yùn)送屏障。當(dāng)前還有幾種其他方法來解決線粒體功能不良的問題，但每一種方法都不能解決與線粒體老化相關(guān)的最重要的線粒體衰竭問題，因此這些方法都存在局限性，例如，提議的一種解決方案旨在通過僅提供產(chǎn)ATP的底物從而增加ATP產(chǎn)量，但是這種方案完全沒有解決整體的線粒體功能不良問題，針對線粒體功能不良提議的另一種解決方案基于外源加入抗氧化劑.這種方法通過維持線粒體的現(xiàn)有狀態(tài)和功能而取得了一定程度的成功.然而，這種方法沒有解決已有損傷的修復(fù)問題，因此也不是一種理想的解決方案。例如還有一種解決方案是NeoLipid⑧，具體來說是NeoPharm(Waukegan，伊利諾斯州)公司的脂偶聯(lián)的吉西他濱(LipidConjugateGemcitabine)(心磷脂偶聯(lián)的吉西他濱)。NeoLipid是一種包埋在磷脂酰膽堿脂質(zhì)體中的陽離子修飾的心磷脂.然而，即使是這種解決方案對于旨在治療線粒體失常的局部給藥來說也并不理想.簡述線粒體功能不良與氧化損傷直接相關(guān)，氧化損傷包括ROS引起的脂類過氧化和心辨脂從線粒體膜中缺失。線粒體功能不良還與細(xì)胞老化和死亡直接相關(guān)。本發(fā)明基于一種獨(dú)特的組合物，它不僅維持了線粒體功能，而且還改善和恢復(fù)了線粒體功能和/或修復(fù)了線粒體膜。具體而言，本發(fā)明組合物是包埋了心磷脂的脂質(zhì)體與抗氧化劑的獨(dú)特組合，一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的組合物是包埋了心磷脂和抗氧化劑的脂質(zhì)體.另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的組合物是脂質(zhì)體，例如包埋有心磷脂和一種或多種抗氧化劑，主要由碌脂酰膽堿構(gòu)成的脂質(zhì)體，其中所迷心磷脂是四油酰-心確月旨(tetraoleoyl-cardiolipin)、四棕抽1油耽-心褲脂(tetrapalmitoleoyl-cardiolipin)或四肉豆蔻耽-心褲脂(tetramyristoyl-cardiolipin)之一，并包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中；所述一種或多種抗氧化劑包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層或水性中心中，或包埋在兩者中。一個(gè)實(shí)例中，至少一種抗氧化劑可以是水溶性抗氧化劑，另一個(gè)實(shí)例中，所述至少一種抗氧化劑可以是脂溶性抗氧化劑。另一個(gè)實(shí)例中，至少一種抗氧化劑可以是單線態(tài)氧清除劑(singlet-oxygenscavenger),另一個(gè)實(shí)例中，包含在本發(fā)明組合物中的抗氧化劑可以是水溶性單線態(tài)氧清除劑或脂溶性單線態(tài)氧清除劑。另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的組合物是主要由磷脂酰膽堿構(gòu)成的脂質(zhì)體，其包埋有心磷脂，例如四油酰-心磷脂和至少一種抗氧化劑，例如甲基龍膽酸酯(或龍膽酸甲酯)和l-肌肽中的一種或多種。另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的組合物是脂質(zhì)體，例如主要由磷脂酰膽堿構(gòu)成的脂質(zhì)體，其中包埋有得自種子油的心礴脂和至少一種抗氧化劑，另一個(gè)實(shí)例中，所述至少一種抗氧化劑可以是龍膽酸甲酯、l-肌肽、丁幾甲笨(butylatedhydroxytoluene)(BHT)、叔丁基氫載(TBHQ)或它們的一些組合。另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的組合物可包含一種或多種脂類、磷脂、滲透增強(qiáng)劑、保濕劑、香料、神經(jīng)酰胺、鞘脂、蛋白、膽固醇、植物甾醇(phytostero服)、硫酸膽固醇(cholesterolsulfate)、糖、維生素、礦物質(zhì)或細(xì)胞膜中天然存在的任何其他化合物.一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明化合物以霜?jiǎng)?、洗劑、凝膠、補(bǔ)劑Uonic)、水包油型乳液、油包水型乳液、糊劑或噴霧劑的形式局部給藥.其他實(shí)例中，本發(fā)明化合物可口服給藥或胃腸外給藥，例如注射給藥.另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明組合物在室溫(約68T721.11C)儲(chǔ)存以下任何一段時(shí)間都是穩(wěn)定的且不易發(fā)生實(shí)質(zhì)性的氧化損傷從至少1小時(shí)到l天、到幾天、到1周、到幾周、到1個(gè)月、到幾個(gè)月、到1年、到幾年'另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明組合物在約lOt!-約601C,理想為約20"C-約55匸，理想為約30iC-約50"的溫度下存貯時(shí)是穩(wěn)定的，且不易受到實(shí)質(zhì)性的氧化損傷。另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供改善、恢復(fù)或維持線粒體功能的方法，其包括局部給予組合物，所述組合物包含包埋有心磷脂和抗氧化劑的脂質(zhì)體。一個(gè)實(shí)例中，所述脂質(zhì)體主要由磷脂跣膽堿構(gòu)成，并包埋有心磷脂和一種或多種抗氧化劑，其中心磷脂是例如四棕櫚油酰-心磷脂、四肉豆蔻酰-心磷脂或四油酰-心磷脂之一并包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中；所述一種或多種抗氧化劑包埋在脂質(zhì)體的鱗脂雙層或脂質(zhì)體的水性中心中，或包埋在兩者中。一個(gè)實(shí)例中，至少一種抗氧化劑可以是水溶性抗氧化劑，另一個(gè)實(shí)例中，至少一種抗氧化劑可以是脂溶性抗氧化劑。另一個(gè)實(shí)例中，至少一種抗氧化劑可以是單線態(tài)氧清除劑.另一個(gè)實(shí)例中，包含在本發(fā)明組合物中的抗氧化劑可以是水溶性單線態(tài)氧清除劑或脂溶性單線態(tài)氧清除劑.另一個(gè)實(shí)例中，所述包埋在脂質(zhì)體中的抗氧化劑可以是龍膽酸甲酯、1-肌肽或兩者。另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明是修復(fù)線粒體膜的方法，其包括局部給予組合物，所述組合物包含包埋有心磷脂和抗氧化劑的脂質(zhì)體.一個(gè)實(shí)例中，所述脂質(zhì)體主要由磷脂酰膽堿構(gòu)成，并包埋有心褲脂和一種或多種抗氧化劑，其中心磷脂優(yōu)選是四棕櫚油酰-心磷脂、四肉豆蔻跣-心磷脂或四油酰-心磷脂之一并包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中；所述一種或多種抗氧化劑包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層或脂質(zhì)體的水性中心中，或包埋在兩者中.一個(gè)實(shí)例中，至少一種抗氧化劑可以是水溶性抗氧化劑.另一個(gè)實(shí)例中，至少一種抗氧化劑可以是脂溶性抗氧化劑。另一個(gè)實(shí)例中，至少一種抗氧化劑可以是單線態(tài)氧清除劑，另一個(gè)實(shí)例中，包含在本發(fā)明組合物中的抗氧化劑可以是水溶性單線態(tài)氧清除劑或脂溶性單線態(tài)氧清除劑.另一個(gè)實(shí)例中，所述包埋在脂質(zhì)體中的抗氧化劑可以是龍膽酸甲酯、l-肌肽或兩者，附圖簡述圖l是線粒體的圖示，其顯示線粒體的(l)嵴、(2)基質(zhì)、(3)外膜和(4)內(nèi)膜.圖2是心鱗脂的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖示。圖3是脂質(zhì)體的圖示，其顯示磷脂雙層(l)，其包括親水性脂質(zhì)頭部(2);疏水性脂質(zhì)尾部(3);水性中心(4);和疏水性尾部之間的空間<5),圖4是磷脂酰膽堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖示.圖5是示出ATP產(chǎn)生的圍，使用以下物質(zhì)實(shí)現(xiàn)ATP產(chǎn)生(a)l-肌肽；(b)1。/。DC龍膽酸甲酯；(c)空脂質(zhì)體(只有心磷脂)；(d)加栽的脂質(zhì)體(即加栽有l(wèi)-肌肽、龍膽酸甲酯和心磷脂的脂質(zhì)體)；和(e)加栽的脂質(zhì)體(即加栽有1-肌肽、龍膽酸甲酯和心磷脂的脂質(zhì)體).困6比較了使用帶有ESI的Zeiss-902電子顯微鏡拍攝的兩幅TEM圖片(照片)。圖6(a)是含有包埋有心磷脂、龍膽酸甲酯和l-肌肽的脂質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)霜?jiǎng)┲苿┑腡EM圖片(照片)，圖6(a)中的TEM圖片(照片)是在制成霜?jiǎng)┲苿┲笪唇?jīng)任何存儲(chǔ)而立即拍攝的，所述霜?jiǎng)┖邪裼行牧字?、龍膽酸曱酯和l-肌肽的脂質(zhì)體。圖6(b)是與圖6(a)相同的含有包埋有心磷脂、龍膽酸甲酯和l-肌肽的脂質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)霜?jiǎng)┲苿┑腡EM圖片(照片)，但圖6(b)是霜?jiǎng)┲苿┰?0X:存儲(chǔ)l個(gè)月后拍攝的，詳述應(yīng)理解，本發(fā)明不限于本文描迷的具體組合物、方法學(xué)或方案規(guī)程。此外，除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員常規(guī)理解的含義相同。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語只是出于描述具體實(shí)例的目的，并非用于限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明范圍僅由權(quán)利要求限定.本發(fā)明基于如下驚人發(fā)現(xiàn)當(dāng)施用(例如局部施用)包埋有心磷脂和至少一種抗氧化劑的脂質(zhì)體的獨(dú)特組合時(shí)，能夠改善、保持或恢復(fù)線粒體功能和/或修復(fù)線粒體膜.一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的脂質(zhì)體例如主要由磷脂酰膽堿構(gòu)成；所述心磷脂是例如四油酰-心磷脂、四棕櫚油酰-心磷脂或四肉豆蔻酰-心磷脂之一；所述抗氧化劑是例如龍膽酸甲酯和l-肌肽中的一種或多種。此外，本發(fā)明的獨(dú)特組合具有這樣的驚人優(yōu)點(diǎn)在約室溫或更高溫度下儲(chǔ)存時(shí)是穩(wěn)定的并且抗氧化損傷、降解或不穩(wěn)定性。例如，如下文實(shí)施例3中所討論的，包含主要由磷脂跣膽械構(gòu)成并包埋有四油跣-心磷脂、龍膽酸甲酯和1-肌肽的脂質(zhì)體的本發(fā)明組合物在501C的存貯條件下儲(chǔ)存至少1個(gè)月而顯示明顯的穩(wěn)定性，據(jù)信，在本發(fā)明中，所迷至少一種抗氧化刑使心砩脂穩(wěn)定，直到心磷脂被遞送到細(xì)胞中，例如通過局部施用含有本發(fā)明脂質(zhì)體的組合物。一個(gè)實(shí)例中，所述穩(wěn)定心磷脂的至少一種抗氧化劑是龍膽酸甲酯，它是一種保護(hù)心磷脂不被氧化的強(qiáng)抗氧化劑。此外，由于脂質(zhì)體遞送技術(shù)的性質(zhì)，脂質(zhì)體含有水性內(nèi)部(waterinterior).參見例如閨3.為防止心碑脂在脂質(zhì)體中被氧化，本發(fā)明可包含笫二抗氧化劑，例如l-肌肽，它是一種基于肽的水溶性強(qiáng)抗氧化劑.由于本發(fā)明既含有抗氧化劑(例如l-肌肽)來保護(hù)細(xì)胞不受氧化損傷，又含有心磷脂(例如四油跣-心磷脂)來改善、維持或恢復(fù)線粒體功能和/或修復(fù)線粒體膜，因此本發(fā)明的組合物可實(shí)現(xiàn)改善細(xì)胞功能，通過例如體外測試數(shù)據(jù)，提供了證明改善、維持或恢復(fù)線粒體功能活性的支持證據(jù)。例如，實(shí)施例2中所討論的方法表明，施用包含主要由磷脂醜膽堿構(gòu)成并包埋有四油酰-心磷脂、龍膽酸甲酯和1-肌肽的脂質(zhì)體的本發(fā)明組合物所導(dǎo)致的ATP產(chǎn)量比任何單獨(dú)成分都要高得多*線粒體在所有細(xì)胞中以不同數(shù)量存在的線粒體(存在量取決于細(xì)胞的代謝活性)是本發(fā)明組合物的意向靶標(biāo)。實(shí)際上，本發(fā)明組合物設(shè)計(jì)用于將心磷脂遞送到線粒體的整體結(jié)構(gòu)(線粒體膜)中，線粒體是桿狀細(xì)胞器，可認(rèn)為它是細(xì)胞中將氧氣和營養(yǎng)物轉(zhuǎn)換為三磷酸腺苷(ATP)的動(dòng)力發(fā)生器，ATP是細(xì)胞中為細(xì)胞代謝活性提供能量的化學(xué)能量"流"。任何給定細(xì)胞中線粒體的數(shù)貝幾乎完全取決于該細(xì)胞的代謝活性。線粒體柔性很大，活細(xì)胞的時(shí)間推移研究已證明，線粒體幾乎一直在迅速發(fā)生形狀改變并在細(xì)胞內(nèi)到處移動(dòng).線粒體運(yùn)動(dòng)似乎在某些方面Unsomeway)同細(xì)胞中存在的微管相聯(lián)系，線粒體可能沿著動(dòng)力蛋白(motorprotein)的網(wǎng)絡(luò)移動(dòng)，因此，基于細(xì)胞的具體需要和其微管網(wǎng)絡(luò)的特征，可將線粒體組織成為冗長的移動(dòng)鏈、緊密壓縮成相對穩(wěn)定的群(groups)或成為很多其他的形態(tài).線粒體具有精巧的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對該細(xì)胞器發(fā)揮功能至關(guān)重要.兩個(gè)特化的膜包圍著細(xì)胞中存在的線粒體，將該細(xì)胞器分為狹窄的膜間間隙和大得多的內(nèi)部基質(zhì)，它們各自含有高度特化的蛋白質(zhì)。線粒體外膜含有由通道蛋白形成的很多通道，并起類似篩的作用，將太大的分子過濾掉。類似地，高度回旋形成很多內(nèi)折(稱為峰)的內(nèi)膜也只允許某些分子通過它，并且比外膜的選擇性更大。為確保只有對基質(zhì)非常重要的那些物質(zhì)進(jìn)入內(nèi)膜，內(nèi)膜利用了一組只轉(zhuǎn)運(yùn)正確分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，線粒體的各腔室(compartments)一起能夠協(xié)調(diào)地工作，通過復(fù)雜的多步過程產(chǎn)生ATP.具體而言，ATP是通過復(fù)雜的反應(yīng)鏈產(chǎn)生的通過4秤復(fù)合體傳遞電子并驅(qū)使質(zhì)子濃度累加、產(chǎn)生質(zhì)子運(yùn)動(dòng)力.所述4種復(fù)合體是NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase)、bci復(fù)合體和細(xì)胞色素c氧化酶。電子傳遞和相關(guān)的氧化磷酸化發(fā)生在線粒體內(nèi)膜中，內(nèi)膜中約含有75%的蛋白質(zhì)和20%的心褲脂。對官能完整性而言，不可或缺的是在內(nèi)膜脂類、心磷脂和包含復(fù)合體的蛋白質(zhì)及轉(zhuǎn)運(yùn)栽體之間形成的四元結(jié)構(gòu)。例如Mileykovskaya等所報(bào)道的，細(xì)胞色素C氧化酶和含有緊密結(jié)合的心磷脂的ATP/ADP栽體，它們對于結(jié)構(gòu)和功能都非常重要，參見，Mileykovskaya等,"CardiolipininEnergyTransducingMembranes."Biochemistry(Mosc).2005.70(2):154-8，其全部內(nèi)容通過參考納入本文。此外，Gorbenko等詳細(xì)描迷了細(xì)胞色素c和心磷脂之間的相互作用。參見Gorbenko等，"CytochromecInteractionwith心褲月旨/PhosphatidylcholineModelMembranes:Effectof心褲月旨o(jì)nProtonation."BiophysJ.2006.90(11):4093-103,其全部內(nèi)容通過參考納入本文.另參見Petrosillo等，"RoleofReactiveOxygenSpeciesandCardiolipinintheReleaseofCytochromecfromMitochondria."FASEBJ.2003，17:2202-2208，其全部內(nèi)容通過參考納入本文，另外，Paradies等已證明在電子傳遞機(jī)制中心磷脂和復(fù)合體m之間存在重要(pivotal)關(guān)系，參見Paradies等，"ReactiveoxygenspeciesgeneratedbythemitochondrialrespiratorychainaffectthecomplexIIIactivityviaCardiolipinperoxidationinbeef-heartsubmitochondrialparticles."Mitochondrion2001.1:151-159，其全部內(nèi)容通過參考納入本文。另參見Paradies等，"ReactiveoxygenspeciesaffectmitochondrialelectrontransportcomplexIactivitythroughoxidativeCardiolipindamage."Gene.2002.286:135-141，其全部內(nèi)容通過參考納入本文.線粒體在凋亡誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用.細(xì)胞色素c從線粒體中的幹放似乎是凋亡級聯(lián)誘導(dǎo)中的中心亊件，最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡，然而，細(xì)胞色素c從線粒體中釋放并引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)的機(jī)制似乎很大程度上是由ROS介導(dǎo)的。此外，已證明細(xì)胞色素c從線粒體中釋放之前先從線粒體內(nèi)膜解離。細(xì)胞色素c與線粒體內(nèi)膜磷脂(主要是心褲脂分子)的外表面結(jié)合.已對細(xì)胞色素c和心磷脂的結(jié)合進(jìn)行了廣泛研究，并已闡釋了這種相互作用的某些分子方面.心躊脂富舍不飽和脂肪酸，這似乎對心磷脂與細(xì)胞色素c結(jié)會(huì)從而將該蛋白錨定到膜上是必要的。預(yù)期ROS對心磷脂的氧化損傷可能會(huì)妨礙細(xì)胞10色素C與線粒體內(nèi)膜上的磷脂相互作用，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從內(nèi)膜上解離，使其釋放到線粒體外的空間中。因此，已報(bào)道了由于脂類過氧化造成的細(xì)胞色素c和心磷脂之間的分子相互作用的喪失。此外，已發(fā)現(xiàn)在凋亡過程中由于氧化損傷或其生物合成途徑的改變而造成的心磷脂含量變化會(huì)引發(fā)細(xì)胞色素c從線粒體中釋放。心磷脂心磷脂包埋在本發(fā)明脂質(zhì)體中，供遞送到線粒體中。只在細(xì)菌膜和線粒體膜中發(fā)現(xiàn)心磷脂。心褲脂的這種在線粒體膜中獨(dú)特和有限的定位顯示本發(fā)明脂質(zhì)體將靶向，和/或包埋在脂質(zhì)體中的心磷脂將靶向線粒體膜。此外，如上所述，心褲脂是線粒體內(nèi)膜的主要成分，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)線粒體多種獨(dú)立的功能。實(shí)際上，由于心磷脂是線粒體的特殊脂類成分，心磷脂在該細(xì)胞器中的生物功能顯然是非常重要的，例如，心磷脂至少部分負(fù)責(zé)維持膜的流動(dòng)性，實(shí)際上，當(dāng)線粒體失去心磷脂時(shí)，它將變得更加僵硬，失去其官能性并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，本發(fā)明組合物的一個(gè)附加優(yōu)點(diǎn)是，將心磷脂遞送到線粒體和線粒體膜中，這將有助于維持、恢復(fù)或修復(fù)線粒體和/或線粒體膜的流動(dòng)性.如上所述，心磷脂主要位于線粒體內(nèi)膜上，在那里它和大量線粒體蛋白相互作用。這種相互作用影響某些酶(特別是牽涉氧化磷酸化的那些酶)的功能活化，所有牽涉氧化磷酸化的線粒體蛋白復(fù)合體都含有整合入其四元結(jié)構(gòu)的心磷脂分子，它們是復(fù)合體和其環(huán)境之間或復(fù)合體內(nèi)各亞基之間界面的重要成分.由于線粒體心磷脂分子的不飽和脂肪酸含量高并且它們在線粒體內(nèi)膜中的位置靠近ROS產(chǎn)生的位點(diǎn)，因此線粒體心璘脂分子是氧自由基攻擊的靶標(biāo)。從線粒體膜中去除心磷脂導(dǎo)致復(fù)合體崩裂并喪失官能性，例如，心磷脂在細(xì)胞色素bcl復(fù)合體中起到關(guān)鍵作用，細(xì)胞色素bcl復(fù)合體是呼吸鏈中的一種膜蛋白復(fù)合體，它將泛醇和細(xì)胞色素c之間的電子傳遞與跨脂質(zhì)雙層的質(zhì)子易位相偶聯(lián).具體而言，1個(gè)心磷脂分子結(jié)合到靠近泛載還原位點(diǎn)，據(jù)信這確保了催化位點(diǎn)的穩(wěn)定性并參與攝取質(zhì)子.心躊脂是一種具有不尋常結(jié)構(gòu)，尤其富含不飽和脂肪酸的磷脂。通常，亞油酸占心磷脂中存在的不飽和脂肪酸的至少85%。因此，在一個(gè)實(shí)例中，將包含約85%亞油酸的心磷脂包埋在脂質(zhì)體中，例如包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中.在另本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，將四油酰-心磷脂包埋在脂質(zhì)體中.四油跣-心磷脂由四個(gè)油酸組分構(gòu)成(C18:l，四油酰-心磷脂)，其與亞油酸心磷脂相比更不易受到氧化損傷和破壞，其它實(shí)例中，本發(fā)明的心磷脂可以是四棕櫚油酰-心磷脂、四肉豆蔻酰-心磷脂、或得自種子油的心磷脂，可用于本發(fā)明組合物和方法中的心磷脂的其他例子可購自例如AvantiPolarLipids,Inc.(Alabaster,AL)?？少徸訟vantiPolarLipids,Inc.的心磷脂的例子包括如下1，，1，，2，，2，-四肉豆蔻酰心磷脂(銨鹽)(產(chǎn)品號(hào)770332);1，，1，，2，，2，-四肉豆蔻酰心磷脂(鈉鹽)(產(chǎn)品號(hào)750332或710335);1，，1，-油耽-2，,2，-(12-生物素基(氨基十二烷酖))心磷脂(銨鹽)(產(chǎn)品號(hào)860564);心磷脂(大腸桿菌，二鈉鹽)(產(chǎn)品號(hào)841199);心磷脂(心，牛-二鈉鹽)(產(chǎn)品號(hào)"00U);心磷脂(心，牛-二鈉鹽)(產(chǎn)品號(hào)840012);氫化心磷脂(心，牛-二鈉鹽)(產(chǎn)品號(hào)8300S7);雙溶性心磷脂(Dilysocardiolipin)(心，牛-二鈉鹽)(產(chǎn)品號(hào)850082);雙溶性心磷脂(心，鈉鹽);氫化心磷脂(心)；可溶性心磷脂(lysocardiolipin);單可溶性心磷脂(MonolysocardioUpin)(心，牛-二鈉鹽)(產(chǎn)品號(hào)850081);以及單可溶性心磷脂(心，鈉鹽)。另一個(gè)實(shí)例中，包埋在脂質(zhì)體中的心磷脂可以是雙磷脂酰甘油或更確切地講是1，3-雙(sn-3，-辨脂缺)-sn-甘油(l，3-bis(sn-3，-phosphatidyl)-sn-glycerol).所有形式的心磷脂一般都具有二聚體結(jié)構(gòu)，有4個(gè)?；?，可能攜帶兩個(gè)負(fù)電荷，參見例如圖2。即使帶有4個(gè)相同的?；捎诖嬖趦蓚€(gè)手性中心(每個(gè)外部甘油基團(tuán)中各一個(gè))，心磷脂仍然具有兩個(gè)化學(xué)上不同的磷脂酰部分，這會(huì)產(chǎn)生非對映異構(gòu)體，雖然天然的二磷脂酰甘油具有R/R構(gòu)型。結(jié)杲，兩個(gè)磷酸根(phosphate)基團(tuán)具有不同的化學(xué)環(huán)境，相對于中心的甘油，它們分別稱為1，-磷酸根和3，-磷酸根,每種形式的心磷脂含有一個(gè)酸性質(zhì)子，但它們的酸性水平不同，例如pKl-2.8,pK2>7.5。第2個(gè)磷酸根的酸性弱據(jù)信是由于和中心的2，-羥基形成了穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵。實(shí)際上，在正常的生理?xiàng)l件下，心磷脂分子可能僅帶有一個(gè)負(fù)電荷，此外，心磷脂模型顯示，其磷酸根可形成緊密的(tight)雙環(huán)結(jié)構(gòu)，如果捕獲了質(zhì)子，形成酸-陰離子，得到非常緊密的結(jié)構(gòu)，在動(dòng)物組織中，據(jù)信心磷脂是膽固醇從線粒體膜外部易位到內(nèi)部的重要因子，在生成類固醇的組織中，心褲脂激活線粒體膽固醇側(cè)鏈的斷裂，是膽固醇生成的強(qiáng)效刺激物。心磷脂還可在將蛋白質(zhì)輸入線粒體中起到特定作用。它以高度特異性的方式結(jié)合于染色質(zhì)中的DNA，實(shí)際上所有存在于染色質(zhì)中的心磷脂均結(jié)合于DNA，在染色質(zhì)中心磷脂和DNA均具有共同的"磷酸間"結(jié)構(gòu)的動(dòng)力。因此，心磷脂似乎在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中具有功能性作用.例如，與X染色體連鎖的Barth綜合征---種人類疾病(心肌癥)和心磷脂的脂肪酸組成嚴(yán)重異常(即四-亞油酸分子種類的減少以及單溶性心磷脂的積累)有關(guān).抗氧化劑根據(jù)本發(fā)明，至少一種抗氧化劑與心磷脂一起包埋在脂質(zhì)體中，抗氧化劑可以例如包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中、包埋在脂質(zhì)體的水性中心中、或包埋在二者中.如上所述，包含在本發(fā)明組合物中的抗氧化劑可通過保護(hù)心磷脂不受來自脂質(zhì)體的水性中心或來自脂質(zhì)體外部的ROS的氧化損傷或降解來發(fā)揮作用。實(shí)際上，細(xì)胞中抗氧化劑的一個(gè)主要作用是防止因ROS的作用而引起的損傷.活性氧類包括過氧化氫(11202)、超氧陰離子((V)和自由基，例如羥基自由基(Off).這些分子不穩(wěn)定，具有高度反應(yīng)性，可通過化學(xué)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(如脂類超氧化)而損傷細(xì)胞，很多抗氧化劑可包含在本發(fā)明組合物中.例如，包埋在本發(fā)明脂質(zhì)體中的抗氧化劑可以是水溶性的，因此可包埋在脂質(zhì)體的水性中心中，另一個(gè)實(shí)例中，包埋在脂質(zhì)體中的抗氧化劑可以是脂溶性的，因此可包埋在脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層中，另一個(gè)實(shí)例中，包埋在本發(fā)明脂質(zhì)體中的抗氧化劑可以是單線態(tài)氧清除劑。另一個(gè)實(shí)例中，抗氧化刑可以是水溶性的并且是單線態(tài)氧清除劑，或者是脂溶性的并且是單線態(tài)氧清除劑.另一個(gè)實(shí)例中，可將多于一種抗氧化劑包埋在本發(fā)明脂質(zhì)體中。例如，可將一種或多種以下抗氧化劑包埋在本發(fā)明的脂質(zhì)體中龍膽酸甲酯、l-肌肽、丁羥甲苯(BHT)、叔丁基氫醌(TBHQ)、或它們的一些組合，一個(gè)實(shí)施例中，龍膽酸甲酯用作本發(fā)明的抗氧化劑，因?yàn)辇埬懰峒柞ナ侵苄缘牟⑶夷軌蚍€(wěn)定心磷脂.雖然下文討論的實(shí)施例l說明龍膽酸甲醋不顯示明顯的防止氧化應(yīng)激的作用，但龍膽酸甲酯具有高的氧自由基吸收能力("ORAC")(25,605jimolTeq/g)，表明它是一種很強(qiáng)的抗氧化劑。所以，有可能基于其ORAC值來選擇用于本發(fā)明的抗氧化劑，例如通過選擇ORAC值高的抗氧化劑，因此，在一個(gè)實(shí)例中，選擇龍膽酸甲酯用于本發(fā)明，因?yàn)辇埬懰峒柞サ腛RAC值高，在這種實(shí)例中，本發(fā)明包括包埋有心罅脂和龍膽酸甲酯的脂質(zhì)體(例如包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中).另一個(gè)實(shí)例中，1-肌肽用作本發(fā)明的抗氧化劑，因?yàn)樗撬苄缘牟⑶夷軌虮Ｗo(hù)心磷脂不受脂質(zhì)體水性中心的氧化損傷。因此，在一個(gè)實(shí)例中，脂質(zhì)體水性中心含有l(wèi)-肌肽，另一個(gè)實(shí)例中，脂質(zhì)體的砩脂雙層包埋有心轔脂和龍膽酸甲酯，脂質(zhì)體水性中心含有l(wèi)-肌肽，另一個(gè)實(shí)例中，包埋在本發(fā)明脂質(zhì)體中的抗氧化劑可以是在線粒體中發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑，例如谷胱甘肽，已證明當(dāng)人為耗竭細(xì)胞中的谷胱甘肽時(shí)，氧化損傷增加，線粒體中的谷胱甘肽水平可能比細(xì)胞其他部位中的谷胱甘肽水平更重要.相對于細(xì)胞其他部位中的谷胱甘肽水平，線粒體谷胱甘肽水平隨年齡降低得更多.這種降低似乎使線粒體更容易受到氧化損傷?？箟难?即維生素C)和維生素E(即生育紛)是和心磷脂一起包埋在本發(fā)明脂質(zhì)體中的其他抗氧化劑例子。應(yīng)理解，很多其他抗氧化劑可包埋在本發(fā)明脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體根據(jù)本發(fā)明，用脂質(zhì)體將心磷脂(可能和抗氧化劑一起)遞送到線粒體中，已知脂質(zhì)體是局部施用化妝品和皮膚病學(xué)產(chǎn)品時(shí)有效的藥物遞送系統(tǒng)。具體說，脂質(zhì)體是一種球形小泡(sphericalvesicle)，具有由磷脂雙層構(gòu)成的膜。脂質(zhì)體可包含多種磷脂，所述礴脂包括具有混合脂質(zhì)鏈的天然來源的磷脂(例如卵磷脂酰乙醇胺)，或由純成分構(gòu)成，例如DOPE(二油耽褲脂酰乙醇胺)。脂質(zhì)體通常尺寸小，在約25-1000nm范圍內(nèi).脂質(zhì)體是一種由磷脂雙層構(gòu)成的封閉結(jié)構(gòu)，能夠在褲脂雙層的水性核中包裹水溶性、親水分子，在疏水性區(qū)域中包裹油溶性、疏水分子.圖3表示脂質(zhì)體的一般結(jié)構(gòu).通常，脂質(zhì)體可以是中性(neutral)脂質(zhì)體、陰離子(negative)脂質(zhì)體或陽離子(positive)脂質(zhì)體。例如，陽離子脂質(zhì)體可形成自含有磷脂酰膽堿、膽固醇、心磷脂和磷脂酰絲氨酸的溶液。脂質(zhì)體可以是多層小泡和單層小泡的混合物。14脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層可與其他雙層(例如細(xì)胞膜和/或線粒體膜)融合，因此可遞送脂質(zhì)體的內(nèi)容物，所以，在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明通過與線粒體膜融合并將包埋的心磷脂遞送到線粒體而實(shí)現(xiàn)改善、維持、恢復(fù)或修復(fù)線粒體和/或線粒體膜。如上所述，脂質(zhì)體由磷脂構(gòu)成.磷脂分子具有親水性"頭部基團(tuán)(headgroup)"和由兩個(gè)酖基鏈構(gòu)成的疏水性"尾部"。磷脂的水溶性取決于疏水性尾部的長度和頭部基團(tuán)與水的親和性兩者。例如，各酰基鏈含有14個(gè)或更多個(gè)直鏈(未分支)飽和C-C形式碳原子的純脂質(zhì)不溶于水。通常，隨著脂質(zhì)的g鏈長度增加，臨界膠束濃度迅速降低，本發(fā)明的脂質(zhì)體可主要由存在于細(xì)胞膜中的脂類構(gòu)成，包括磷脂、神經(jīng)酰胺、鞘脂、膽固醇、甘油三酯或其他脂質(zhì)，例如來自植物的植物甾醇。一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體可主要由磷脂酖膽堿構(gòu)成，磷脂酰膽堿是一種磷脂，它是細(xì)胞膜的主要組成成分，磷脂耽膽堿也稱為1，2-二棕櫚耽-sn-甘油基-3-膽4^褲酸(1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、PtdCho和卵磷脂。不飽和罅脂耽膽堿含有膽喊、11-6不飽和脂肪酸(例如亞油酸)、ft-3脂肪酸(例如y-亞麻酸)，甘油酯戎基含量低(或沒有)，圖4顯示了磷脂酰膽堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)，磷脂酰膽堿對于正常的細(xì)胞膜組成和修復(fù)都是重要的。具體而言，磷脂酰膽械在維持細(xì)胞膜完整性方面的作用對所有基本的生物學(xué)過程都非常重要，這些生物學(xué)過程包括細(xì)胞中發(fā)生的從DNA到RNA到蛋白質(zhì)的信息流、細(xì)胞能量的形成和細(xì)胞內(nèi)通訊或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).磷脂酰膽堿，胞J^流動(dòng)性減;和細(xì)胞膜完整性的破壞以及細(xì)胞膜修復(fù)機(jī)制的損傷與很多疾病相關(guān)，這些疾病包括肝臟疾病、神經(jīng)疾病、各種癌癥及細(xì)胞死亡。因此，本發(fā)明組合物的一個(gè)實(shí)例(具體是當(dāng)脂質(zhì)體主要由磷脂跣膽堿構(gòu)成時(shí))的附加優(yōu)點(diǎn)是脂質(zhì)體可為細(xì)胞膜和線粒體膜提供額外的磷脂醜膽堿.脂質(zhì)體研究的選艮已使得脂質(zhì)體能夠避免被身體免疫系統(tǒng)(具體而言是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細(xì)胞)探測到，此類脂質(zhì)體稱為"秘密(stealth)脂質(zhì)體"，構(gòu)建有PEG(聚乙二醇)作為涂層.在體內(nèi)呈惰性的PEG涂層使藥物遞送系統(tǒng)的循環(huán)時(shí)間更長.因此，本發(fā)明的組合物可以AI旨質(zhì)體，所述脂質(zhì)體主要由磷脂酰膽堿構(gòu)成并包埋有心磷脂(例如四油跣-心磷脂)和至少一種抗氧化劑(例15如龍膽酸甲酯和/或I-肌肽)，并可另外包含PEG"秘密"涂層，除PEG涂層之外，本發(fā)明組合物中使用的秘密脂質(zhì)體還可連接有配體，使脂質(zhì)體能夠結(jié)合到遞送的把位點(diǎn).在皮膚護(hù)理產(chǎn)品或化妝品中，可將脂質(zhì)體配制在合適的基質(zhì)例如漿液(serum)、洗液、凝膠或霜?jiǎng)┲校瑑?yōu)選地，本發(fā)明的脂質(zhì)體在不存在表面活性劑條件下制備.實(shí)際上，在制備本發(fā)明脂質(zhì)體時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，使脂質(zhì)體不穩(wěn)定的因素包括表面活性劑、溫度、pH和脂類過氧化。罔此，應(yīng)加以必要的小心以減少這些因素帶來的不良影響。應(yīng)理解，本發(fā)明的脂質(zhì)體可用各種技術(shù)制備和/或從多種來源獲得。例如，可用微流化技術(shù)、在水中聲處理脂類、或用乳化劑(例如卵磷脂)在乳液中形成膠束來制備本發(fā)明的脂質(zhì)體。其他實(shí)例中，本發(fā)明脂質(zhì)體可獲得自Centerchem，Inc.，(NorwalkjCT)或Lipotech(西班牙)。用微流化技術(shù)制備本發(fā)明脂質(zhì)體的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠連續(xù)大量產(chǎn)生脂質(zhì)體，微流化技術(shù)不需要任何有機(jī)溶劑來溶解脂類；而且該技術(shù)中可使用處于水相的高濃度脂類.因此，微流化技術(shù)非常適合在化妝品領(lǐng)域例如本發(fā)明中使用。更具體地說，微流化技術(shù)包括將漿液狀、濃縮的脂類/水分散液引入到微流化器中，微流化器在很高的壓力(10，000-20，000psi)下將分散液泵送通過l-5jim孔徑的濾器，通過迫使以很高速度移動(dòng)的流體進(jìn)入兩個(gè)預(yù)定的微通道而將該流體分為兩股.然后使這兩股流體以正確的角度以非常高的速度碰撞在一起。高壓力和高速度帶來的大量能量使液體自組裝為脂質(zhì)體。使末端處收集的流體再次通過直至獲得看起來均質(zhì)的分散液。如上所述，也可通過在水中聲處理磷脂而獲得脂質(zhì)體.低剪切速率產(chǎn)生多層脂質(zhì)體，其具有類似洋蔥的許多層，連續(xù)的高剪切聲處理趨于產(chǎn)生更小的單層脂質(zhì)體。該技術(shù)中，脂質(zhì)體內(nèi)容物可以和水相的內(nèi)容物相同，表l(見下)顯示了脂質(zhì)體的一些例子，包括其大小、一般制備方法、相應(yīng)的合適包泉容積(encapsulationvolumn)、包裹效率(encapsulationefficiency)和POPC(l-棕櫚酰，2-油跣褲脂酰膽堿)分子的計(jì)算值.實(shí)際捕獲體積或包泉效率根據(jù)脂質(zhì)體制備方法、脂類類型和活性物質(zhì)本身而不同。負(fù)栽的類型和數(shù)量影響脂質(zhì)體穩(wěn)定性.可溶于油的分子的包裹效率接近100%,因?yàn)檫@些分子例如心磷脂位于磷脂雙層的疏水區(qū).表1最后一欄顯示特定大小的POPC脂質(zhì)體中POPC分子數(shù)目的計(jì)算值。表l還顯示了主要熱相變溫度(Tra)，該數(shù)值對于選擇用于形成脂質(zhì)體的脂類是非常重要的參數(shù)a它還可用于確定脂質(zhì)體的合適存貯條件，表l:示例性脂質(zhì)體的制備方法、特征和POPC分子的計(jì)算數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>脂質(zhì)體類型制備方法包裹容積((U/pmol月旨質(zhì))包裹效率，％包裹的活性物質(zhì)(水溶性)POPC脂質(zhì)體中POPC分子的計(jì)算數(shù)目小泡互成角度配置的(interdigitated)-融合小泡(IFV):將乙醇加入到用飽和長鏈PC(例如DPPC)制備的SUV中，形成以互成角度配置的?；湠樘卣鞯膶訝钇瑢?，在溫度循環(huán)(>Tmi<Tm)之后,形成>lfun的單層小泡疏水和親水分子均可包埋進(jìn)脂質(zhì)體中，如果脂質(zhì)體制備過程中包埋有水溶性分子，則稱為"被動(dòng)加栽".被動(dòng)加栽可通過將親水分子預(yù)先溶解在將用于水合無水脂類的緩沖液中來實(shí)現(xiàn)，因此，可通過針對空白緩沖液透析或使分散液通過SephadexTM凝膠柱來去除沒有被包埋的分子。對于大多數(shù)化妝品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品而言，由于去除未包埋分子的過程成本高，且常用水平的化妝品分子是無毒的，因此去除未包埋分子不是關(guān)鍵的，與被捕獲在脂質(zhì)體核中的親水分子相反，疏水分子通常被捕獲在脂質(zhì)雙層的疏水區(qū)域中，該過程涉及分配加工，其中疏水分子和脂類一起溶解在合適的有機(jī)溶劑中，然后，抽真空除去溶劑，然后使脂質(zhì)水合。如果該分子可溶于乙醇，可將其與脂質(zhì)一起溶解在乙醇中；然后通過乙醇注射方法產(chǎn)生脂質(zhì)體.在主動(dòng)加栽(也稱為反相加栽)中，首先在脂質(zhì)體內(nèi)部和外部之間產(chǎn)生pH或離子梯度.首先在低pH(檸檬酸鹽緩沖液，pH-4)制備空白(空的)脂質(zhì)體。然后將含有活性物質(zhì)(例如弱有機(jī)酸)的高pH(pH-7.4)緩沖液加入到空白脂質(zhì)體中，由于pH梯度，活性物質(zhì)(例如弱酸)在內(nèi)部核中分配.18影響脂質(zhì)體的分子包埋效率的因素包括脂質(zhì)體制備中所用的脂質(zhì)組成、脂質(zhì)體類型(SUV/LUV/MLV)、脂質(zhì)體制備方法和脂質(zhì)體的加栽物。緩沖液強(qiáng)度(高強(qiáng)度的緩沖液降低包裹的數(shù)量)和待包埋的分子性質(zhì)也是影響包裹效率的重要因素，水溶性負(fù)栽(由于與脂質(zhì)頭部基團(tuán)的相互作用)和疏水性負(fù)栽(由于與雙層膜的脂肪酸酰基鏈的相互作用)均影響脂質(zhì)雙層對分子的包裹作用.最終，這些因素影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。對于脂質(zhì)體具有最優(yōu)的穩(wěn)定性而言優(yōu)選pH約6.5,本發(fā)明組合物因此，本發(fā)明組合物包含包埋有心磷脂和至少一種抗氧化劑的脂質(zhì)體，可有效維持、恢復(fù)或改善線粒體功能和/或修復(fù)線粒體膜。應(yīng)理解，本發(fā)明組合物可包含添加劑，例如水、蓖麻油、乙二醇單丁酸、二甘醇單乙醚、玉米油、二甲基亞砜、乙二醇、異丙醇、大豆油、丙三醇、可溶性膠原或高嶺土。更具體地說，本發(fā)明組合物還可包含一種或多種濕潤劑，包括但不限于鄰笨二曱酸二丁酯、可溶性膠原或2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉。可用于本發(fā)明中的濕潤劑的其他例子可見《CTFA化妝品成分手冊》(CTFACosmeticIngredientHandbook)，該手冊相關(guān)部分通過參考納入本文。此外，本發(fā)明組合物還可包含一種或多種潤膚劑，包括但不限于丁烷-1，3-二醇；棕櫚酸十六烷酯；二甲基聚硅氧烷；單蓖麻酸甘油酯;單硬脂酸甘油酯；棕櫚酸異丁酯；硬脂酸異十六烷酯；棕櫚酸異丙酯；硬脂酸異丙酯；硬脂酸丁酯；月桂酸異丙酯；月桂酸己酯；油酸癸酯；肉豆蔻酸異丙酯；乳酸十二烷酯；十八烷基-2-醇(octadecan-2-ol);三辛酸甘油酯(caprylictriglyceride);三癸酸甘油酯(caprictriglyceride);聚乙二醇；丙烷-l，2-二醇；三甘醇；^油；椰子油；紅花油；月桂酸異戊酯；壬基酚聚氧乙烯(9)醚；泛醇；氫化植物油；乙酸生育酚酯，'亞油酸生育酚酯;丙二醇；花生油；蓖麻油；異硬脂酸；棕櫚酸；亞油酸異丙酴；乳酸十二烷酯；乳酸十四烷酯；油酸癸酯；肉豆蔻酸十四烷酯，可用于實(shí)施本發(fā)明的潤膚劑的其他例子可見于《CTFA化妝品成分手冊》中，該手冊相關(guān)部分通過參考納入本文.19其他實(shí)例中，本發(fā)明組合物還可含有一種或多種滲透增強(qiáng)劑，包括但不限于吡咯烷酮，例如2-吡咯烷酮；醇，例如乙醇；烷醇如癸醇；二醇如丙二醇、二丙二醇、丁二醇；或薛類.本發(fā)明組合物還可含有多種已知的或常規(guī)的化妝品佐劑，只要它們對本發(fā)明組合物提供的維持、改善、恢復(fù)和修復(fù)線粒體的所需功能沒有不利影響。例如，本發(fā)明組合物還可包含本領(lǐng)域熟知的一種或多種添加劑或其他任選成分，包括但不限于填充劑(例如，固體、半固體或液體等)；載體；稀釋劑；增稠劑；膠凝劑；維生素，視黃素(retinoids)和視黃醇(例如，維生素B3、維生素A等)；色素；香料；遮光劑(sunscreens)和防曬劑(sunblocks);去角質(zhì)劑(exfoliants);皮膚調(diào)理劑；保濕劑；神經(jīng)耽胺、類神經(jīng)耽胺(pseudoceramides)、磷脂、鞘脂、膽固醇、葡糖胺、藥學(xué)上可接受的滲透劑(例如，正癸基甲基亞砜(n-decylmethylsulfoxide),卵褲脂有機(jī):^、酪氨酸、賴氨酸，等);殺菌劑；氨基酸(例如脯氨酸)、吡咯烷酮羧酸、其衍生物及鹽，異構(gòu)糖(saccharideisomerate)、泛醇、緩沖液連同基質(zhì)(base)例如三乙醇胺或氬氧化鈉;蠟，例如蜂蠟、地蠟、石蠟；植物提取物，包括但不限于例如庫拉索,薈(AloeVera)、矢車菊、金縷梅(witchhazel)、接骨木的花(elderflower)、黃瓜；不透明劑；懸浮劑；粘合劑；防腐劑；和它們的組合。其他合適的添加劑和/或佐劑描述于美國專利6，184，247中，其全部內(nèi)容通過參考納入本文。本發(fā)明組合物還可含有其他非活性成分，包括但不限于共溶劑、賦形劑。有用的共溶劑包括醇和多元醇、聚乙二醇瞇、跣胺、酯、其他合適溶劑，和它們的混合物，本發(fā)明組合物還可包含賦形劑或添加劑例如甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、抗氧化劑、防腐劑、螯合劑、粘度調(diào)節(jié)劑、等張化劑(tonicifier)、加臭劑(odorant)、乳蝕劑(opacifier)、懸浮劑、粘合劑、及它們的組合，可包含在本發(fā)明組合物中的其他添加劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，它們包含在本發(fā)明范圍中.給藥方式本發(fā)明組合物可口服給藥、注射給藥或局部給藥，本發(fā)明組合物一般至少以天為基礎(chǔ)給藥，可在任何合適的時(shí)間段中給予本發(fā)明組合物.應(yīng)理解，美容增強(qiáng)程度和維持、改善、恢復(fù)或修復(fù)線粒體的程度直接根據(jù)使用組合物的總量和頻率而發(fā)生改變，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法和技術(shù)制備有用的劑型，在生產(chǎn)合適劑型的過程中可包括使用其他成分。一個(gè)實(shí)例中，含有包埋了心褲脂的本發(fā)明脂質(zhì)體和至少一種抗氧化劑的本發(fā)明制劑至少每天局部給藥一次。另一個(gè)實(shí)例中，該制劑可每天給藥兩次，另一個(gè)實(shí)例中，該制劑可每天給藥3-5次。另一個(gè)實(shí)例中，對每天給予的制劑數(shù)量無限制。上文詳細(xì)描迷意在闡釋本發(fā)明而非限制本發(fā)明，通過下文實(shí)驗(yàn)研究和實(shí)施例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明，這些也不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。本申請中引用的所用參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請的內(nèi)容均通過參考納入本文。實(shí)施例實(shí)施例1:測定對氧化應(yīng)激的保護(hù)本實(shí)施例中描述的試驗(yàn)測定發(fā)生在線粒體中的氧化應(yīng)激。如上所討論的，線粒體用于產(chǎn)生能量(ATP分子)的生化反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物即具有高度氧化性的超氧自由基，利用流式細(xì)胞術(shù)，下文實(shí)施例通過監(jiān)測用各測試物質(zhì)處理后MitoSOX紅(MitoSOXRed)線粒體超氧化物指示劑(Invitrogenca橫M36008)是一種被線粒體選擇性吸收的熒光染料，一旦進(jìn)入線粒體中，MitoSOX與超氧化物自由基反應(yīng)形成結(jié)合于線粒體核酸的熒光產(chǎn)物(M/發(fā)射最大值-510/580nm),較高的熒光讀數(shù)對應(yīng)于線粒體內(nèi)存在較高水平的超氧化物自由基，細(xì)胞培養(yǎng)每個(gè)樣本使用一個(gè)6孔板，可同時(shí)準(zhǔn)備多個(gè)板.見表I中對板的描述，以1.5x106個(gè)細(xì)胞/孔的密度將THP-1單核細(xì)胞(ATCCcat#TIB-202)接種于6錄(含有2毫升/孔的RMPI1640培養(yǎng)基，補(bǔ)充有10%FBS)中，孵育1小時(shí)后處理。表II:板描述<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>處理谷胱甘肽單乙酯(Gluta他ionemonoethylester)(GMEE，100jiM終濃度)用作陽性對照，更具體地說，如下制備陽性對照將4mg谷胱甘肽單乙酯溶解在10ml培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%FBS的RMPI1640培養(yǎng)基)中制備1.2mM儲(chǔ)液'然后將2.5ml儲(chǔ)液加入到7.5ml培養(yǎng)基中制備陽性對照工作溶液(300HM)。在板的每孔中加入lml陽性對照工作溶液，得到終處理濃度為100nM谷胱甘肽單乙酯。將lral培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%FBS的RMPI1640培養(yǎng)基)加入到板上的指定的孔中(每個(gè)對照l孔)制備陰性對照和正常對照?？扇缦轮苽錅y試樣本稱取lOOmg測試樣本放入IS毫升一次性(disposable)離心管中，加入10ml去離子水，從而制備濃度為10mg/ml的樣本儲(chǔ)液，本實(shí)施例中，測試樣本包括四油酰心磷脂、四肉豆蔻酰心磷脂、Neoliph^心磷脂、L-肌肽和龍膽酸甲酯(每個(gè)樣本使用一個(gè)培養(yǎng)板)。然后系列稀釋樣本儲(chǔ)液，得到濃度為30(Hig/ml的樣本工作溶液。然后在板剩余3個(gè)孔的每一個(gè)(三復(fù)孔)中加入lml樣本工作溶液，這樣各樣本孔中的測試樣本終濃度為100jig/ml。然后，將既含有測試樣本孔又含有對照孔的板在37GC、5%C02中孵育3小時(shí)。攻擊孵育3小時(shí)后，通過引入攻擊溶液使分別含有測試樣本、陽性對照和陰性對照的孔中的細(xì)胞經(jīng)受氧化應(yīng)激。如下制備攻擊溶液852|il8.8MH202+4.15ml培養(yǎng)基(-1.5MH202)1ml1.5MH202+9ml培養(yǎng)基(-150mMH202)1ml150mM+30ml培養(yǎng)基(-5mMH202)將1ml5mM11202加入到板的所有孔中，但正常對照除外，正常對照孔中加入1ml培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%FBS的RMPI1640培養(yǎng)基).然后，板在370C、5%<:02中孵育3小時(shí).染色與攻擊液一起孵育以后，將所有孔中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞管中，100xg離心5分鐘,去除細(xì)胞上的培養(yǎng)基，通過各管中加入1mlMitoSOX(5jiM)將細(xì)胞染色，具體說，通過使用13^iLDMSO/瓶溶解兩小瓶MitoSOX(50嗎/瓶，Invitrogencat#M36008)得到5mM/瓶的溶液(mw=760克/摩爾)，由此獲得MitoSOX染料.將兩小瓶中的內(nèi)容物均轉(zhuǎn)移到26ml(5jiM)培養(yǎng)基中，將細(xì)胞與染料室溫黑暗孵育15分鐘。流式細(xì)胞術(shù)染色后，用流式細(xì)胞儀(例如Becton-DkkinsonFACSCaliber)分析樣本，使用488nm激發(fā)激光和FL2588mn發(fā)射濾器。將數(shù)據(jù)線性化為曲線，該曲線由陰性對照和正常對照的響應(yīng)來限定(0%保護(hù)=未處理的/攻擊的陰性對照，100%保護(hù)-未處理的/未攻擊的正常對照)，在這些條件下，陽性對照(lOOpM谷胱甘肽甲酯(glutathionemethylester))提供針對氧化應(yīng)激的35%的保護(hù)。結(jié)果該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果報(bào)告于下表HI中。如結(jié)果所示，四油酰-心磷脂提供了對氧化應(yīng)激的平均97%的顯著保護(hù)，表HI:針對氣化應(yīng)激的保護(hù)測試樣本針對氧化應(yīng)激的保護(hù)(％對照)四油酰心磷脂97%四肉豆蔻酰心磷脂52%Neolipin心磷脂0%L-肌肽61%龍膽酸甲酯0%實(shí)施例2:ATP水平的測定細(xì)胞中ATP水平是細(xì)胞和線粒體健康的一個(gè)標(biāo)志，如本實(shí)施例所闡釋的，可用在ATP存在下發(fā)光的ATP依賴性熒光酶來監(jiān)測ATP水平。產(chǎn)生的光的量與ATP存在量直接成比例。CHO-K1(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞購自ATCC(Manassas,VA)(細(xì)胞登錄號(hào)ATCCCCL61)。在不透明96孔板中以1x104個(gè)細(xì)胞/孔接種細(xì)胞培養(yǎng)物.貼壁后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到低葡萄糖培養(yǎng)基(lg/1)中，孵育過夜，在低葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞具有降低的ATP含量，過夜培養(yǎng)后，使細(xì)胞接觸叔丁基過氧化物(1mM)2小時(shí)以誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激。過氧化物比單獨(dú)的葡萄糖使ATP水平降得更低，模擬了受損傷的細(xì)胞狀態(tài)，接觸過氧化物后，將新鮮的低葡萄糖培養(yǎng)基加回到細(xì)胞中。用過氧化物攻擊后立即將細(xì)胞暴露于測試樣本，終濃度通常是l、10、和100mg/ml。細(xì)胞和測試樣本一起于37flC孵育4小時(shí)*如下表IV所示，本試驗(yàn)所用測試樣本包括l-肌肽、DC龍膽酸甲酯、空的脂質(zhì)體(僅含心磷脂)、加栽有四油酰-心磷脂、l-肌肽和龍膽酸甲酯的購自AGIDermatics，Inc.(Fre印ort，NY)的脂質(zhì)體及加栽有四油跣-心磷脂、1-肌肽和龍膽酸甲酯的購自Centerche加，Inc.(Norwalk，CT)的脂質(zhì)體。本試驗(yàn)篩選在模擬受損細(xì)胞狀態(tài)的應(yīng)激條件(stressedconditions)之后能夠恢復(fù)ATP水平的化合物。因此，受攻擊的細(xì)胞與測試樣本孵育之后，用購自Promega(Madison,Wl)的CeU-TiterGio試劑按照生產(chǎn)商提供的說明書測定相對細(xì)胞ATP水平。簡而言之，將細(xì)胞平衡到室溫，此時(shí)去除孔中的培養(yǎng)基。將稀釋的試劑加入到孔中，室溫孵育板15分鐘，在Wallach板讀數(shù)儀上讀取熒光(hrniinescence)24計(jì)算各處理組的平均熒光，通過用每一個(gè)測試組的平均值除以未處理對照組的平均值來確定。/。未處理對照。未處理對照認(rèn)為是100%，因此任何大于100%的結(jié)果都認(rèn)為是細(xì)胞ATP水平凈增加的陽性結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果報(bào)告于下表IV和圖5中.表IV:細(xì)胞ATP產(chǎn)量測試成分給藥劑量(Hg/ml)%對照ATP產(chǎn)量L-肌肽1109.3%±0.0%1097.1±11.3%10099,5±6.2DC龍膽酸甲酯1%187,5土6.1%1082.5±4.7%10035.8士12.7%空脂質(zhì)體(僅含心磷脂)181.7%±0.0%1086.9±17,4%100193.6±6.3%加栽有四油酰-心磷脂、1-肌肽和龍膽酸甲酯的脂質(zhì)體(購自AGIDermatics，Inc,(Freeport，NY))11S0.0±7.4%10183.4±0.9%100189,0±7.1%加栽有四油酰-心褲脂、l-肌肽和龍膽酸甲酯的脂質(zhì)體(購自Centerchem，Inc.(Norwalk^CT))1150.2±8.7%10152.3±16.2%100185.4±17.0%測試成分%對照ATP產(chǎn)量高葡萄糖對照153.0士5.8%低葡萄糖對照120.8±33.3%高葡萄糖對照(含叔丁基)(Highglucosecontrolwitht-butyl)115.7±6.1%低葡萄糖對照(含叔丁基)100.0%±17.0%25這些結(jié)果表明，加栽的脂質(zhì)體以低的濃度增強(qiáng)了暴露于氧化應(yīng)激的細(xì)胞中的ATP水平.空脂質(zhì)體(僅含心鱗脂)以高濃度增強(qiáng)了ATP水平，這說明加栽到脂質(zhì)體中的其他成分對低濃度的、加栽的脂質(zhì)體的效果非常重要，結(jié)果還表明，當(dāng)檢測這些所述其他成分自身時(shí)，它們幾乎沒有效果。這些結(jié)果說明，脂質(zhì)體遞送栽體有助于使心褲脂和抗氧化劑進(jìn)入細(xì)胞中。實(shí)施例3:脂質(zhì)體穩(wěn)定性透射電子顯微鏡(TEM)常用于測定脂質(zhì)體的尺寸和形態(tài)特征.一種常用于TEM成像的樣本制備方法是將一滴脂質(zhì)體懸浮液施加到涂敷有塑料的柵格(grid)上，然后用磷鴒酸或鉬酸銨負(fù)染色.結(jié)果得到包埋在負(fù)染色(negativestain)中的脂質(zhì)體單層，更具體地說，可如下制備用于TEM成像的樣本將1%的瓊脂糖凝膠水溶液(w/v)倒入塑料Petri培養(yǎng)皿中，室溫下風(fēng)干10分鐘。通過輝光放電使formvar或火棉膠涂敷的柵格呈親水性，柵格置于Whatman1號(hào)濾紙上。各柵格上加1滴樣本懸浮液，當(dāng)大多數(shù)液體被濾紙吸收到柵格的外周時(shí)，將柵格轉(zhuǎn)移到瓊脂糖凝膠板上30分鐘至1小時(shí)以促進(jìn)鹽和液體擴(kuò)散到瓊脂糖中。使用帶有ESI的Zeiss-902觀察未被染色的柵格并照相.脂質(zhì)體應(yīng)該是離散的圓形結(jié)構(gòu)，不應(yīng)該觀察到團(tuán)塊，該方法用于測定本發(fā)明脂質(zhì)體的穩(wěn)定性.拍攝TEM照片以測定本發(fā)明霜?jiǎng)┬问街|(zhì)體在存貯前和存貯后l個(gè)月時(shí)的大小和結(jié)構(gòu)。具體而言，被分析的脂質(zhì)體主要由磷脂跣膽堿構(gòu)成，并包埋有四油酰-心磷脂、龍膽酸甲酯和l-肌肽，將脂質(zhì)體加入霜?jiǎng)┲罅⒓磁臄zTEM照片，約室溫(50t:)存貯1個(gè)后再拍攝脂質(zhì)體(在霜?jiǎng)┲?的TEM照片。圖6顯示了存貯前和存貯1個(gè)月后獲得的本發(fā)明脂質(zhì)體的TEM照片。如這些TEM照片所示，存貯l個(gè)月后這些脂質(zhì)體保持具有完整膜的離散、穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。上文描述了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式.可進(jìn)行很多改變和變化而不脫離如所附權(quán)利要求中定義的本發(fā)明的精神和本發(fā)明更廣的方面，應(yīng)根據(jù)專利法的原則包括等同原則來解釋本發(fā)明的精神和更廣的方面，權(quán)利要求中提到的任何單數(shù)形式的元素，例如"一"、"該"或"所述"不應(yīng)理解為將該元素限定為單數(shù)，權(quán)利要求1.用于改善、維持或恢復(fù)線粒體功能的組合物，其包含脂質(zhì)體、心磷脂和至少一種抗氧化劑，其中心磷脂包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中，所述至少一種抗氧化劑包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中、和/或含于脂質(zhì)體的水性中心內(nèi)。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體主要由磷脂酰膽堿構(gòu)成.3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述心磷脂是四油耽-心磷脂，4，如權(quán)利要求3所迷的組合物，其中所迷至少一種抗氧化劑是龍膽酸甲酯，另外其中龍膽酸甲酯與心磷脂一起包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中.5.如權(quán)利要求4所述的組合物，還包含第二抗氧化劑，其中所述第二抗氧化劑是l-肌肽，另外其中1-肌肽包含在脂質(zhì)體的水性中心內(nèi).6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物包含約0.01-約10重量％的四油跌-心磷脂；約0.01-約10重量％的龍膽酸甲酯；和約0.01-約10重量％的l-肌肽，7.如權(quán)利要求l所述的組合物，其中所述心磷脂是四肉豆蔻酰心磷脂。8.如權(quán)利要求l所述的組合物，其中所述心磷脂是四棕櫚油酰心磷脂.9.如權(quán)利要求l所述的組合物，其中所述心磷脂得自種子油，10.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體還包含一種或多種下述物質(zhì)膽固醇、膽固醇硫酸醋、神經(jīng)酖胺、植物甾醇和糖。11.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物以霜?jiǎng)?、洗劑、■、補(bǔ)劑、水包油型乳液、油包水型乳液、糊劑或噴霧劑形式局部給藥，12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述組合物還包含一種或多種潤膚劑、濕潤劑、滲透增強(qiáng)劑、維生素、香料、色素和保濕劑.13.用于修復(fù)線粒體膜的組合物，其包含脂質(zhì)體、心磷脂和至少一種抗氧化劑，其中心磷脂包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中，所述至少一種抗氧化劑包埋在脂質(zhì)體的鱗脂雙層中、和/或含于脂質(zhì)體的水性中心內(nèi)，14.如權(quán)利要求13所迷的組合物，其中所速脂質(zhì)體主要由磷脂酰膽威構(gòu)成。15.如權(quán)利要求14所迷的組合物，其中所述心磷脂是四油酰-心磷脂。16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述至少一種抗氧化劑是龍膽酸甲酯，另外其中;Oa酸甲酯與心磷脂一起包埋在脂質(zhì)體的磷脂雙層中。17.如權(quán)利要求16所述的組合物，還包含第二抗氧化劑，其中所述第二抗氧化劑是l-肌肽，另外其中l(wèi)-肌肽包含在脂質(zhì)體的水性中心內(nèi).18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述組合物包含約0.01-約10重量％的四油酖-心鱗脂；約0.01-約10重量％的龍膽酸甲酯；和約0.01-約10重量％的l-肌肽，19.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述心磷脂是四肉豆蔻酰心磷脂、四棕櫚油酰心磷脂或得自種子油.20.如權(quán)利要求17所迷的組合物，其中所迷組合物以霜?jiǎng)?、洗劑、凝膠、補(bǔ)劑、水包油型乳液、油包氷型乳液、糊劑或噴霧劑形式局部給藥。21.如權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述組合物還包含一種或多種潤膚劑、濕潤劑、滲透增強(qiáng)劑、維生素、香料、色素和保濕劑，22.改善、維持、或恢復(fù)細(xì)胞中線粒體功能的方法，其包括給予所述細(xì)胞權(quán)利要求5所述的組合物.23.修復(fù)細(xì)胞中線粒體膜的方法，其包括給予所迷細(xì)胞權(quán)利要求17所迷的組合物.全文摘要本申請公開了含有脂質(zhì)體、心磷脂和至少一種抗氧化劑的組合物，其中所述組合物用于改善、維持或恢復(fù)線粒體膜和/或線粒體功能。一個(gè)實(shí)例中，所述脂質(zhì)體主要由磷脂酰膽堿構(gòu)成，心磷脂是四油酰-心磷脂，至少一種抗氧化劑是龍膽酸甲酯、l-肌膚或二者。所述組合物可局部給藥、口服給藥或胃腸外給藥，例如注射給藥。如果是局部給藥，所述組合物可以是例如霜?jiǎng)?、洗劑、凝膠、糊劑、噴霧劑、補(bǔ)劑或其他合適的形式，或可含有各種添加劑，例如，一種或多種潤膚劑、濕潤劑、滲透增強(qiáng)劑、維生素、香料、色素和保濕劑。文檔編號(hào)A61K38/05GK101557803SQ200780045715公開日2009年10月14日申請日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日發(fā)明者D·J·法斯特,J·C·萊弗里特,S·R·米斯勒申請人:捷通國際有限公司