專利名稱：：基于六氫異α酸蛋白激酶調(diào)節(jié)的癌癥治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)提供一個(gè)重要的保持正常穩(wěn)態(tài)的總體調(diào)控機(jī)制，或者若受到擾動(dòng)，便作為一種與眾多疾病病理和病況相關(guān)的誘發(fā)或協(xié)助機(jī)制。在細(xì)胞級上，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是指信號或信號基從細(xì)胞外部運(yùn)動(dòng)到細(xì)胞內(nèi)部。到達(dá)受體目標(biāo)的信號可激活許多細(xì)胞活動(dòng)需要的配體-受體相互作用，其中一些細(xì)胞活動(dòng)還可作為后續(xù)信號。這種相互作用不僅作為一系列級聯(lián)，而且作為一種復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)或信號事件網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)能對穩(wěn)態(tài)過程提供精調(diào)控制。但是，此網(wǎng)絡(luò)一旦失去控制，會引發(fā)細(xì)胞活動(dòng)的改變，并引起反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)程序的改變。參見圖1，它顯示了對胰島素敏感性和抵抗進(jìn)行調(diào)節(jié)的相互作用激酶網(wǎng)絡(luò)的簡化圖。004信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體一般分為三類。第一類受體是滲入質(zhì)膜并具有某些內(nèi)在酶活性的受體。這類受體的典型代表包括酪氨酸激酶(例如PDGF、胰島素、EGF和FGF受體)、酪氨酸磷酸酶(例如T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的CD45[集束行列式-45]蛋白質(zhì))、鳥苷酸環(huán)化酶(例如鈉尿肽受體)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(例如活化素和TGF-P受體)。具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的受體自身可發(fā)生磷酸化作用，還可磷酸化其它底物。SH2域中的蛋白質(zhì)與RTK或受體相關(guān)酪氨酸激酶相互作用會使該蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化。由此引起的磷酸化會(積極地或消極地)改變活性。SH2中具有內(nèi)在酶活性的若干蛋白質(zhì)包括磷脂酶C-y(PLC-力、原癌基因c-Ras相關(guān)的GTP酶激活蛋白(rasGAP)、磷脂酰環(huán)己六醇_3-激酶(PI-3K)、蛋白酪氨酸磷酸酶-1C(PTP1C)以及其它蛋白酪氨酸激酶(PTK)Src家族成員。雖然對人類RA的病因和發(fā)病機(jī)理仍知之甚少，但其發(fā)展過程可分為三個(gè)階段。在啟始階段，樹突狀細(xì)胞對自身反應(yīng)性T細(xì)胞表現(xiàn)出自體抗原性。T細(xì)胞通過細(xì)胞因子激活自身反應(yīng)性B細(xì)胞，產(chǎn)生自身抗體，反過來又在關(guān)節(jié)中形成免疫復(fù)合物。效應(yīng)階段，免疫復(fù)合物結(jié)合巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的Fcf受體，從而釋放細(xì)胞因子、趨化因子、炎癥和疼痛。最后階段，細(xì)胞因子和趨化因子激活并募集滑膜細(xì)胞、破骨細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，它們可釋放蛋白酶、氨基酸和諸如02-的ROS，從而對軟骨和骨造成不可逆轉(zhuǎn)的破壞。在膠原誘導(dǎo)的RA動(dòng)物模型中，需要T細(xì)胞和B細(xì)胞的參與來誘發(fā)該疾病。通過脾酪氨酸激酶(Syk)和磷脂肌醇3激酶(PI3K)，抗原受體觸發(fā)后，B細(xì)胞激活信號[WardSG，F(xiàn)inanP.將異構(gòu)體特異性磷脂肌醇3激酶抑制劑作為治療劑；CurrOpinPharaiaco1,8月;3(4):426-34，(2003)]。參與B細(xì)胞上的抗原受體后，Syk對三種酪氨酸進(jìn)行磷酸化作用。Syk是一種72-kDa蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，它在將免疫識別受體耦連到若干下游信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。此作用的特性就是催化活性以及與含有SH2域的效應(yīng)蛋白發(fā)生相互作用的能力。Tyr-317、Tyr-342和Tyr-346的磷酸化作用為含蛋白質(zhì)的若干SH2域產(chǎn)生停泊位點(diǎn)。[Hutchcroft,J.E.、Harrison,M.L.與Geahlen，R.L.(1992):72-kDa蛋白質(zhì)酪氨酸激酶Ptk72與B細(xì)胞抗原受體結(jié)合。J.Biol.Chem.267:8613-8619，(1992)以及Yamada，T.、Taniguchi，T.、Yang，C.、Yasue，S.、Saito，H.禾卩Yamamura，H.與帶有蛋白質(zhì)酪氨酸激酶P72(Syk)的B細(xì)胞抗原細(xì)胞抗原受體結(jié)合并通過膜IgM激活，Eur.J.Biochem.213:455459,(1993)]。0018]已證明Syk用來激活響應(yīng)大量信號的PI3K，其中B細(xì)胞抗原受體(BCR)和巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞Fc受體參與此激活。[參見Crowley,M.T.等人JMW.1027-1039，(1997);Raeder,E.M.等人，《//附w"w/.163，6785—6793，(1999):和Jiang,K.等人，祝ooiHOl，236—244，(2003)]。在B細(xì)胞中，可以通過接頭蛋白(例如BCAP、CD19或Gabl)的磷化作用激活BCR刺激的6PI3K，該激活產(chǎn)生用于PI3K調(diào)節(jié)亞基P85的結(jié)合位點(diǎn)。由許多IgG受體傳遞的信號需要Syk和PI3K的參與活動(dòng)，并需要募集它們的集群受體點(diǎn)。在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中，有人建議將PI3K與FcgRIIA上磷酸化的免疫受體酪氨酸活化基序序列直接結(jié)合，作為受體的PI3K募集機(jī)理。而最近一篇文章報(bào)道了Syk和PI3K之間的分子直接相互作用[MoonKD，等「乂，Syk蛋白質(zhì)酪氨酸激酶和磷脂肌醇3激酶間直接相互作用的分子基礎(chǔ)J.Biol.Chem.280,No.2,IssueofJanuary14，pp.1543-1551,(2005)]。0019大量研究表明COX-2活性抑制劑可減少PGE2的生成，并能有效緩解慢性關(guān)節(jié)炎(例如RA)患者的疼痛。既然COX-1和COX-2參與組織(胃腸和心血管系統(tǒng))的重要修復(fù)工作，COX抑制酶活性制劑的副作用就更令人擔(dān)憂。所以，必須設(shè)計(jì)一個(gè)安全的、長期的治療方法以緩解患者的疼痛。既然通過Syk、PI3K、p38、ERK1/2禾QNF-kB依賴性通路，COX-2禾QiNOS合成信號誘導(dǎo)劑，那么這些通路抑制劑會對自身免疫疾病尤其對RA患者關(guān)節(jié)發(fā)炎和變形病癥產(chǎn)生療效。0020]在RAW264.7老鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型內(nèi)抑制PGE2生成的篩選過程中，發(fā)現(xiàn)酒花衍生物p異a酸(RIAA)。在本發(fā)明中，我們對RIAA能否直接抑制COX酶活性和/或它能否抑制COX-2和iNOS的誘導(dǎo)作用進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)RIAA并不直接抑制COX酶活性，而是抑制NF-kB驅(qū)動(dòng)的酶誘導(dǎo)，這引導(dǎo)我們對RIAA是否是一種激酶抑制劑進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)RIAA同時(shí)抑制Syk和PI3K，這使我們可測定針對各種自身免疫性疾病患者進(jìn)行的試點(diǎn)研究的療效。目前正在研究的與疾病癥狀相關(guān)的其它激酶包括Aurora、FGFB、MSK、RSE和SYK。。越來越多的證據(jù)證實(shí)GSK-3在調(diào)節(jié)骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)中存在副作用。例如，使用選擇性GSK-3抑制劑，針對抗胰島素的嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行的急性治療，可提高全身胰島素敏感度，并可增強(qiáng)作用在肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)上的胰島素效應(yīng)。使用特定GSK-3抑制劑，針對抗胰島素、前期糖尿病肥胖的Zucker大鼠進(jìn)行的慢性治療，可提高口服耐藥量和全身胰島素敏感度，改善血脂異常并增強(qiáng)骨骼肌中IRS-1依賴性胰島素信號傳導(dǎo)。這些結(jié)果有力地證明在肌肉中選擇性使用GSK-3可對肥胖相關(guān)的胰島素抵抗進(jìn)行有效干預(yù)治療。Syk為一種非受體酪氨酸激酶，它和參與來自B細(xì)胞受體以及IgE受體信號傳導(dǎo)的ZAP-70有關(guān)。Syk在這些受體內(nèi)與ITAM基序結(jié)合，并通過Ras、PI3激酶和PLCg信號傳導(dǎo)通路啟動(dòng)信號傳導(dǎo)。Syk在胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，因而它是炎癥性疾病和呼吸障礙研究的重要靶點(diǎn)。圖1描繪了調(diào)節(jié)胰島素敏感度和胰島素抵抗的部分激酶網(wǎng)絡(luò)。0035圖2描繪了MgRIAA(mgRho)對五種選擇性激酶的抑制作用。00361圖3描繪了五種酒花組分和一種金^Jt^y^羅提取物對PI3K亞型的抑制作用。0037]圖4描繪了RIAA(圖表A)禾卩IAA(圖表B)劑量相關(guān)的生物合成PGE2的抑制作用，其中白色柱表示在加入COX-2表達(dá)的LPS刺激，灰色柱表示加入測試材料之前隔夜的LPS刺激。圖5描繪了塞來昔布(圖A)和MgRIAA(圖B)對RAW264.7細(xì)胞中分析得到的LPS誘導(dǎo)的COX-2介導(dǎo)的PGE2生成的直接酶抑制作用。PGE2的測量單位用pg/ml表示。誤差帶表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=8)。圖10給出了評估金會^t富樣品#4909提取物對生長中和成熟脂肪細(xì)胞的脂肪性效應(yīng)的測定流程。使用3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞模型來研究測試化合物對脂肪細(xì)胞脂肪生成的潛在影響。0044圖11示意性描繪了相對于溶劑對照，利用會^^t霉樣品#4909提取物或作為陽性對照的吲哚美辛和曲格列酮處理3T3-L1脂肪細(xì)胞的非極性脂肪含量。誤差帶表示95%的置信區(qū)間(單尾)。0045圖12示意性給出了金合^t脣樣品糾909水提取物的二甲基亞砜可溶部分對抗胰島素3T3-L1脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素分泌物評估效應(yīng)的測試流程。圖17用圖表描述了通過各種會合Jt^乂L茶提取物誘發(fā)的脂聯(lián)素分泌相對最大值。圖中給出的數(shù)值是相對于溶劑對照的百分比；誤差帶表示95%的置信區(qū)間。圖20描述了p異a酸、異a酸、四氫異a酸、六氫異a酸、黃腐酚、酒花殘留物、六氫(3酸和陽性對照曲格列酮的Hofstee圖。利用Y截距方法估算相對溶劑對照的脂聯(lián)素分泌最大值，而利用斜率的負(fù)值計(jì)算脂聯(lián)素分泌半最大值處測試材料所需的濃度。00541圖21給出兩個(gè)條形圖，分別表示通過異a酸和p異a酸(圖A)以及六氫異a酸和四氫異a酸(圖B)誘發(fā)TNFa處理過的成熟3T3-L1細(xì)胞的相對脂聯(lián)素分泌情況。圖中給出的數(shù)值是相對于溶劑對照的百分比；誤差帶表示95%的置信區(qū)間。*與僅用TNFa處理的結(jié)果有著顯著性差異(p<0.05)。圖26圖示了不同濃度的THIAA或還原異a酸(RIAA)對SW480細(xì)胞系細(xì)胞增值的作用。計(jì)算空腹胰島素和血糖的HOMA分?jǐn)?shù)。圖39給出THIAA或塞來昔布姜黃素(1:3)對(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制百分比。0073圖40給出朋IAA和塞來昔布姜黃素(1:3)對(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制百分比。。所以，這顯示Aktl在確定尺寸大小方面發(fā)揮重要作用，而Akt2參與胰島素信號傳導(dǎo)。激酶數(shù)據(jù)和我們自己的結(jié)果結(jié)合，其中我們發(fā)現(xiàn)酒花化合物可抑制cPLA2蛋白表達(dá)(免疫印跡法，數(shù)據(jù)未給出)而非mRNA,這表明酒花化合物作用的抗炎模式可能是通過降低cPLA2蛋白質(zhì)水平，或許是更具體地通過抑制TOPmRNA翻譯的活性來抑制PI3K通路，從而降低底物對COX2的可用性。半數(shù)抑制濃度可隨意分成以下四類(1)IC5。值在0.1-0.3嗎/ral范圍內(nèi)的試劑具有最強(qiáng)抗炎反應(yīng)；(2)IC5。值在0.7-1.0(ig/ml的試劑具有高度抗炎反應(yīng)；(3)IC5(,值在2-7pg/ml的試劑具有中度抗炎反應(yīng)；(4)IC5。值大于12^g/ml(所測最大濃度)的試劑具有低抗炎反應(yīng)。00161]—阿司匹林和塞來昔布的陽性對照證明了它們在此模型體系中各自的環(huán)氧合酶選擇性(表9)。阿司匹林對C0X-1的選擇性接近1000倍，而塞來昔布對C0X-2的選擇性也達(dá)114倍。所有酒花原料都具有C0X-2選擇性，其中P-異a酸和異a酸已證實(shí)對C0X-2具有最高選擇性，分別為363倍和138倍。在低的半數(shù)抑制濃度下具有如此高的C0X-2選擇性，這在其它資源獲得的天然產(chǎn)物的有關(guān)報(bào)道中還從未出現(xiàn)過。在剩余的酒花衍生物中，只有香型酒花精油呈現(xiàn)出微弱的C0X-2選擇性，僅為3倍。為了推測臨床療效的#^/數(shù)據(jù)，通常假設(shè)當(dāng)C0X-2的選擇性達(dá)到5倍或以上時(shí)，就表明具有顯著保護(hù)胃粘膜層的臨床應(yīng)用潛力?；谶@種標(biāo)準(zhǔn)，P酸，C02酒花提取物，酒花殘留C02/乙醇，四氫化異a酸和六氫化異a酸都顯示出在臨床上潛在的C0X-2相關(guān)選擇性。表9酒花餾分及其衍生物在RAff264.7細(xì)胞中對C0X-2和C0X-1的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>e酸0.542954co2酒花提取物0.226.329a酸0.266,224酒花殘留C(V乙醇0.882124四氫化異a酸0.204.020六氫化異a酸0.293.010香型酒花精油1.64.13.0陽性對照阿司匹林1.160.00090.0008塞來昔布0.0050.57114實(shí)施例5由受LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中還原異構(gòu)a酸或異構(gòu)化a酸所導(dǎo)致的PGE2直接抑制不足測試材料一本實(shí)驗(yàn)使用表12中所示的酒花衍生物還原異構(gòu)a酸和異構(gòu)化a酸。阿司匹林，從Sig脇(St.Louis.MO)公司購得，其將作為COX-l選擇性的陽性對照?！褂肅alSyn(BI0S0FT,Ferguson,M0)軟件包，根據(jù)0.10、1.0、10和10(Hig/ml四種濃度測得的相關(guān)數(shù)據(jù)，得出劑量反應(yīng)曲線并計(jì)算置信區(qū)間為95%時(shí)的半數(shù)抑制濃度(IC50s)。001681結(jié)果一受LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中PGE2的產(chǎn)量與未受刺激的細(xì)胞相比，比值為1.4-2.1倍。阿司匹林陽性對照計(jì)算出的8.7叫/ml的半數(shù)抑制濃度(95%置信區(qū)間=3.9-19)與已報(bào)道的C0X-2直接抑制值1.4到50Hg/ml[Warner,T.D.等乂[非甾體類藥物對環(huán)氧化酶-1而非環(huán)氧化酶-2的選擇性與人胃腸毒性有關(guān)爾W全面分析尸roc.Afef人//cW.〃5X96:7563-7568，(1999)]以及該實(shí)驗(yàn)室關(guān)于A549細(xì)胞系歷史數(shù)據(jù)3.2pg/ml(95%置信區(qū)間=0.55-0.19)相一致。進(jìn)行，未作任何修改，該流程也稱WHMA-C0X-2方案。簡而言之，在植入A549細(xì)胞24小時(shí)后，加入白細(xì)胞介素-lIJ(10ng/ml)以誘導(dǎo)C0X-2的表達(dá)。24小時(shí)后，用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液出沖洗細(xì)胞。隨后，將溶于二甲亞砜和不含血清的RPMI中的測試材料加入孔中以獲得25、5.0、0.5和0.05pg/ml的最終濃度。每個(gè)濃度重復(fù)兩次。向?qū)φ湛字屑尤肱c測試孔中液體等體積的二甲亞砜。60分鐘后，將A23187(50^M)加入孔中以釋放花生四烯酸。30分鐘后從孔中取出25^培養(yǎng)基進(jìn)行PGE2測定。53,智^i,^^/7必潘一將人氣管上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞系(美國組織細(xì)胞培養(yǎng)收集中心，Bethesda,MD)按實(shí)施例6所述進(jìn)行培養(yǎng)和處理。將螨塵過敏原加入到培養(yǎng)基中并達(dá)到1000ng/ml的最終濃度。18小時(shí)后，對培養(yǎng)基取樣并進(jìn)行PGE2測定?！郎y化合物在二甲亞砜(DMSO)中配制，并在-20°C溫度下貯存。MgRIAA購自Metagenics公司(圣克萊門特，美國加州)。小白菊內(nèi)酯購自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美國密蘇里州)。PI3K抑制劑渥曼青霉素和LY294002購自EMDBiosciences公司(圣地亞哥，美國加州)。對應(yīng)COX-2和iNOS的抗體購自CaymanChemical公司(安娜堡，美國密西根州)。對應(yīng)GAPDH的抗體購自NovusBiological公司(利特爾頓，美國科羅拉多州)。與辣根過氧化物酶發(fā)生結(jié)合的二級抗體購自AmershamBiosciences公司(皮斯卡塔韋，美國新澤西州)。通過MgRIAA對RAW264.7細(xì)胞的核提取物進(jìn)行處理，再用LPS刺激4小時(shí)后分析NF-kB對DNA的結(jié)合情況。。簡單來講，先將細(xì)胞用冷PBS液潤洗兩次，然后加入緩沖液A(10mMHEPES,pH7.0;1.5mMMgCl2;10mMKC1;0.1%NP-40;抑肽酶5嗎/ml;胃酶抑素A1嗎/ml;亮肽酶素5pg/ml;氟化磺酰甲苯1mM)并逬行15分鐘的冰浴。然后將細(xì)胞刮入一個(gè)干凈的試管中，并循環(huán)冷凍與解凍三次。在4°C下10000xg加速度下離心5min所得上清液層即為細(xì)胞質(zhì)的組分。將剩余物重新懸浮在緩沖液C(20mM服PES，pH7.0;1.5mMKC1;420mMKC1;25%甘油；0.2MEDTA;抑肽酶5嗎/ml;胃酶抑素Alpg/ml;亮肽酶素5)ag/nil;氟化磺酰甲苯ImM)中，并進(jìn)行15分鐘的冰浴。在4°C下10000xg加速度下離心5min后收集上層核提取物組分。細(xì)胞核提取物的NF-kBDNA結(jié)合分析使用ActiveMotif公司(卡爾斯巴德，美國加州)的TransAMNF-kB試劑盒并按照生產(chǎn)商的使用說明來完成。如圖8所示，TransAM測試盒檢測96孔細(xì)胞板上結(jié)合到共有序列上的NF-kB的p50亞基。然后測定蛋白質(zhì)濃度(Bio-Radassay公司)并重復(fù)分析10嗎核蛋白提取物。重復(fù)進(jìn)行核提取物(10蛋白質(zhì))的分析并將結(jié)果以圖9所示的圖形表現(xiàn)出來。LPS(1pg/ml)的刺激會使NF-kB基因結(jié)合率增加兩倍。用LY294002(—種PI3激酶抑制劑)進(jìn)行處理會導(dǎo)致NF-kB結(jié)合率降低，這和以往文獻(xiàn)的報(bào)道相符。小白菊內(nèi)酯也能導(dǎo)致NF-kB結(jié)合率顯著降低，這點(diǎn)和我們的預(yù)期是一致的。使用MgRIAA時(shí)也能觀察到NF-kB的結(jié)合率大幅降低。以劑量反應(yīng)的方式也能觀察到這一影響。NF-kB結(jié)合力的降低可能導(dǎo)致包括COX-2、iNOS以及TNFa在內(nèi)的目標(biāo)基因翻譯活性降低。,人們還能對試劑的胰島素增敏和甘油三酸脂沉降能力進(jìn)行研究。。噻唑烷二酮類，如曲格列酮和吡格列酮這類藥物，已顯示出在脂肪細(xì)胞中能選擇性刺激脂肪生成活性，從而得到更大的脂肪分解胰島素抑制或?qū)⒅舅後尫诺窖獫{中[Yamauchi,T.,J.Kamon，寧義.雜合過氧化物酶體增殖激活受體y(PPARy)缺乏和PPARy激動(dòng)劑提高胰島素抵抗性的機(jī)制jBiolCh柳276(44):41245-54，(2001);0akes，N.D.，P.G.Thalen,寧乂.噻唑垸二酮類藥物增加血漿-脂肪組織FFA交換容量并增強(qiáng)胰島素介導(dǎo)游離脂肪酸體系控制的有效性。Diabetes50(5):1158-65，(2001)].該行為使其他組織可利用的游離脂肪酸更少[Yang，W.60S.，W.J.Lee，等乂.體重減輕會增加脂源型抗炎性蛋白質(zhì)、脂聯(lián)素的血漿水平。JClinEndocrinolMetab86(8):3815-9，(2001)]。因此，肌肉和肝臟中游離脂肪酸的胰島素減感效應(yīng)將由于噻唑烷二酮處理的結(jié)果而減弱。這些錄^/結(jié)果已在臨床上得到證實(shí)[Boden，G.不飽和脂肪酸在胰島素抵抗和非胰島素依賴型糖尿病發(fā)病機(jī)理中的作用。Diabetes46(1):3-10，(1997);Stumvoll,M.與H.U.HaringGlitazones:臨床效果與分子機(jī)制,AnnMed34(3):217-24，(2002)]。002031gr^Z/辨一曲格列酮購自Cayman化學(xué)制劑公司(安娜堡，美國密歇根州)，甲基異丁基黃嘌呤、地塞米松、茚甲新、油紅0以及胰島素購自Sigma公司(圣路易斯，美國密蘇里州)。測試材料為一種深褐色粉末，購自Bayir化學(xué)制劑公司(南十字星路68號，Basavanagudi，印度)，它是從會會^t顰植物樹膠脂第4909號樣品的50:50(體積比)水/酒精的提取物中制得的。提取物中兒茶酚含量標(biāo)準(zhǔn)需不低于20%。本例中所用批號為ACat/2304的提取物經(jīng)紫外分析兒茶酚含量達(dá)20.8%。青霉素、鏈霉素、杜爾貝科改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)購自Mediatech(美國弗吉尼亞州赫頓市)公司，而10%FBS-HI(熱滅活胎牛血清)購自MediatechandHyclone(Logan，UT)公司。所有其它標(biāo)準(zhǔn)試劑，除非另行說明，均購自Sigma公司。將AcE部分溶解于二甲亞砜(DMSO)中，在分化0天時(shí)加入培養(yǎng)基中使其濃度達(dá)到50pg/ml，并在整個(gè)成熟期內(nèi)保持這一濃度(直到第6天或第7天，D6/7)。無論何時(shí)加入新鮮培養(yǎng)基，都需要加入新的實(shí)驗(yàn)材料。選擇DMSO是因?yàn)樗臉O性并且它容易與液態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基混合的特性。分別加入吲哚美辛和曲格列酮作為陽性對照，二者最終濃度分別為5.0pg/ml和4.4pg/ml。用0.36%的油紅0或0.001%氟硼二吡咯對分化后的D6/D73T3-Ll細(xì)胞進(jìn)行染色。使用實(shí)驗(yàn)材料對細(xì)胞進(jìn)行分化和處理的完整流程概述于圖10中。002071浙iZ^染經(jīng)一D6/D7-分化的3T3-Ll細(xì)胞中甘油三酯含量的估算所用到的油紅0染色是根據(jù)Ka5t"n'/〃/m/j'游方茲[Kasturi，R.andJoshi，V.C.3T3-Ll細(xì)胞脂肪轉(zhuǎn)化過程中十八?；o酶A脫飽和酶活性和脂肪生成的激素調(diào)節(jié).JBiolChem，257:12224-12230,1982]。用PBS(磷酸鹽緩沖液，Mediatech)潤洗單層細(xì)胞，然后用10%甲醛固定10min。將三份0.6%油紅0/異丙醇原液與兩份水混合得到油紅0工作液，并將已固定的細(xì)胞在其中染色1小時(shí)，然后水洗一次去除過量的染料。用異丙醇從細(xì)胞中提取出染色油滴，并使用光譜光度測量技術(shù)在540nm波長下對其進(jìn)行定量分析(MEL312eBIO-KINETICSREADER,Bio-TekInstruments公司，文奴斯基，美國佛蒙特州)。實(shí)驗(yàn)材料和作為陽性對照的吲哚美辛以及曲格列酮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以540rai下溶劑的相對吸光度表示。濕/試^"棄一曲格列酮購自CaymanChemical(AnnArbor,MI)公司，而甲基異丁基黃嘌呤、地塞米松和胰島素購自Sigma(St.Louis,M0)公司。測試材料為一種黑褐色粉末，以50:50(體積比)水/酒精從金合歡屬樣品#4909的樹膠脂提取而來，該材料購自Bayir化學(xué)制劑(No.68,SouthCrossRoad,Basavanagudi，印度)公司。提取物中兒茶酚含量標(biāo)準(zhǔn)需不低于20%。本實(shí)施例中所用批號為ACat/2304的提取物經(jīng)紫外分析兒茶酚含量達(dá)20.8%。青霉素、鏈霉素、杜爾貝科改良的伊格爾培養(yǎng)基(MEM)購自Mediatech(美國弗吉尼亞州赫頓市)公司，而10%FBS-HI(熱滅活胎牛血清)購自MediatechandHyclone(Logan,UT)公司。所有其它的標(biāo)準(zhǔn)試劑，除非另有說明，均購自Sigma公司。002151一智應(yīng)i薌^^/7必潘一小鼠成纖維細(xì)胞系3T3-L1培養(yǎng)第6日脂肪細(xì)胞開始分化，如實(shí)施例10所述。在96孔細(xì)胞板中接種3T3-L1細(xì)胞，接種密度為lxl04個(gè)細(xì)胞/cm。經(jīng)過兩天的生長，細(xì)胞實(shí)現(xiàn)融合。融合后，加入分化培養(yǎng)基迫使細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化；培養(yǎng)基組成(1)10%的FBS/DMEM(高糖)；(2)0.5mM甲基異丁基黃嘌呤；(3)0.5M地塞米松；(4)10g/ml的胰島素(MDI培養(yǎng)基)。從第3日到第5日，將培養(yǎng)基換成10%FBS/DMEM中含有10pg/ml胰島素的后分化培養(yǎng)基。。簡而g之，第6日，將細(xì)胞在含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)三個(gè)小時(shí)，接著利用1胰島素/ml加溶劑或1嗎胰島素/ml加測試材料進(jìn)行處理。將曲格列酮溶解在二甲基亞砜中以獲得5、2.5、1.25和0.625)ng/ml的濃度。.會合^t霉提取物測試濃度為50、25、12.5和6.25|ng/ml。24小時(shí)后，對培養(yǎng)基上清液取樣以進(jìn)行脂聯(lián)素測定。利用測試材料對細(xì)胞進(jìn)行分化和處理的完整流程概述于圖12中。以確定表觀米氏常數(shù)和最大速度。利用自變量v/[S]替換{相對脂聯(lián)素分泌/[濃度]}，而利用應(yīng)變量&}替換{相對脂聯(lián)素分泌}，生成一個(gè)y=rax+b的關(guān)系式。利用Y截距方法估算相對溶劑對照的脂聯(lián)素分泌最大值，而利用斜率的負(fù)值計(jì)算測試材料必要的半最大值處的脂聯(lián)素分泌濃度。00220茲菜一在抗胰島素3T3-Ll細(xì)胞中，利用2.5嗎/ml的濃度，相對溶劑對照2.44倍的最大刺激，作為陽性對照的曲格列酮所有測試濃度增加了脂聯(lián)素分泌(圖13)。50和25^g/ml濃度的—會合Jt慮增加了脂聯(lián)素分泌，分別為溶劑對照的1.76倍和1.70倍。雖然合^^t慮的兩個(gè)濃度均不等于利用曲格列酮測定的脂聯(lián)素分泌最大值，但是它們可與濃度為1.25和0.625|ag/ml曲格列酮作用相當(dāng)。002211源自修正的Hofsteeplots脂聯(lián)素分泌最大估算值，表明脂聯(lián)素分泌的相對增加與半最大刺激處的濃度存在巨大差異。利用Y截距方法估算的曲格列酮和兒茶對脂聯(lián)素分泌最大值分別為溶劑對照的2.29倍和1.88倍。而剌激抗胰島素3T3-Ll細(xì)胞中脂聯(lián)素分泌的半最大值處曲格列酮和金合歡屬濃度分別為0.085^tg/ml和5.38pg/ml。根據(jù)最小的兒茶酚含量20%計(jì)算，金合歡屬大約為1.0ng/ml。脂聯(lián)素指數(shù)卞10ngTNFa/ml±95%CI-1.00±0.10溶劑對照一1.54*吲哚美辛5.01.67*曲格列酮0.6251.51*金^歡虜乂乙,#4909樹皮(甲醇提取物)501.41*—會會歡^fy^羅貼639心材(二甲亞砜提取物)501.26*金伶歡虜yg羅#5659樹皮(甲醇提取物)251.12*^^歡虜乂"芬#5667樹皮(甲醇提取物)50L26*—會^^ti7Zz芬貼668樹皮(樹脂膠)501.30*金會^bfy^羅#5640樹皮(二甲亞砜提取物)501.17*會斧Jt^乂Z茶#5669心材(二甲亞砜提取物)501.脂聯(lián)素指數(shù)—=[脂聯(lián)素][脂聯(lián)素]w。m*來自TNFa溶劑反應(yīng)的顯著增加(p〈0.05)。7000238實(shí)驗(yàn)觀察到不同.會會Jt富樣品或制劑會在這種代謝綜合征的第二模型中引發(fā)相似的響應(yīng)，這進(jìn)一步證實(shí)—會^^t犀植物中存在多種能正向改變脂肪細(xì)胞生理機(jī)能以增強(qiáng)胰島素作用的化合物。實(shí)施例16極性和非極性溶劑從金會^t^乂L茶對能在TNFa/3T3-Ll脂肪細(xì)胞模型中增加脂聯(lián)素分泌的化合物中進(jìn)行提取。00239這些實(shí)驗(yàn)中用到的是實(shí)施例11中所述的3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品如實(shí)施例11和13所述。將3T3-L1脂肪細(xì)胞用濃度為10ng/ml的TNFa按實(shí)施例13所述方法進(jìn)行處理。如實(shí)施例13詳述在第6天時(shí)取出培養(yǎng)基上清液并對脂聯(lián)素進(jìn)行分析。一使用5/8"金屬鉆頭在標(biāo)準(zhǔn)功率下對大片」會會^t^乂L芬心材樣品#5669(每片重量在5-10克之間)進(jìn)行低速鉆孔。然后將刨花收集到研缽中，在液氮冷凍下研磨至細(xì)粉狀。然后將粉末通過一個(gè)250微米的篩網(wǎng)進(jìn)行篩分以得到大約10g的自由流動(dòng)精細(xì)粉末。表14用于3T3-L1脂聯(lián)素分析的金^^t^7L芬提取物樣品描述<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>1胃液組成為2.90gNaCl、7.0ml濃縮HC1水溶液、3.2g胃蛋白酶(800-2500活性單位/mg)，并加入1000ml水進(jìn)行稀釋。最終pH為1.2。對于本提取操作，胃液-心材懸浮液要在40°C下保溫一小時(shí)，隨后在^^"，^移除胃液。然后將剩余殘留物溶解在甲醇中，通過0.45微米聚四氟乙烯注射式過濾器進(jìn)行過濾并在真空中濃縮。#^〃一這些實(shí)驗(yàn)中用到的是實(shí)施例11中所述的3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品如實(shí)施例11和13所述。將3T3-L1脂肪細(xì)胞用濃度為10ng/ml的TNFa按實(shí)施例13所述方法進(jìn)行處理。如實(shí)施例13詳述在第6天取出培養(yǎng)基上清液并對脂聯(lián)素進(jìn)行分析。002451濕^f/Y/V—.會^^^f乂乙齊樣品#5669根據(jù)以下流程進(jìn)行提取將堿性異丙醇溶液，(含有1.5NNaOH的1%(體積比)異丙醇溶液，)加入到裝有約50mg干燥A^^t^乂L芬心材粉末#5669的50ml試管中。然后將樣品簡單混合處理，超聲降解30分鐘，再離心分離一個(gè)小時(shí)使剩余固體材料成粒。隨后將上清液用0.45微米濾紙進(jìn)行過濾。實(shí)驗(yàn)中用到的堿性異丙醇pH為8.0，收集液的pH為7.0。將過濾后的清液部分在^^"5V^進(jìn)行干燥后得到白色固體。該樣品稱為干燥堿性提取物。T,對照卞卞值>1.11與TNFa對照(p<0.05)存在顯著性差異。實(shí)施例18通過金^^t處樣品水提取物的二甲亞砜可溶部分誘導(dǎo)TNFa-處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)白細(xì)胞介素-6分泌的減少。00248白細(xì)胞介素-6(IL-6)是一種多功能的細(xì)胞激素，在宿主防御、急性期反應(yīng)、免疫反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞功能、造血作用以及代謝綜合征方面均發(fā)揮重要作用。它可被多種正常和變異淋巴細(xì)胞及諸如脂肪細(xì)胞的非淋巴細(xì)胞表達(dá)。IL-6的產(chǎn)量可通過諸如細(xì)胞分裂激素或抗原刺激、脂多糖、鈣離子載體、細(xì)胞激素以及病毒等多種信號進(jìn)行上調(diào)[Hibi,M.，Nakajima,K.,HiranoT.IL-6細(xì)胞激素族和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞激素系統(tǒng)模型。JMolMed.74(1):1-12,(Jan1996)]。人們已經(jīng)在包括細(xì)菌和病毒感染、外傷、自身免疫性疾病、惡性腫瘤以及代謝綜合征等若干病理狀態(tài)中觀察到這種血清濃度水平的提高[Amer，P.II型糖尿病中的胰島素抵抗——脂肪素的作用。CurrMolMed.;5(3):333-9，(May2005)]。碧^菜一正如前述實(shí)施例中所示，TNFa能顯著降低脂聯(lián)素分泌，而吲哚美辛和金^^t^7乙芬提取物會在TNFa存在條件下增加脂聯(lián)素分泌。盡管吲哚美辛陽性對照和金會Jt^f乂Az芬提取物證明了脂聯(lián)素分泌劑量相關(guān)增加，但是這兩種材料均無法將脂聯(lián)素水平恢復(fù)到含TNFa的二甲亞砜對照中所示的濃度(表17)。在TNFa存在條件下，金合^t^乂Z茶提取物顯示出對IL-6分泌的有效劑量相關(guān)抑制，而吲哚美辛則顯示無抗炎效應(yīng)。/[脂聯(lián)素]，。對照1tIL-6指數(shù)=[IL-6測試-IL-6對照]/[IL-6,-IL-6對照]*這與TNFa對照有顯著差異(p<0.05)。在TNFa/3T3-Ll脂肪細(xì)胞模型中，」會會^t^乂乙芬樣品#4909呈現(xiàn)雙重抗炎作用。金會Jt^乂L芬提取物的成分會增加脂聯(lián)素分泌而減少IL-6分泌。金合^t^7/;^"的總體效果則會顯示相對于TNFa對照的強(qiáng)效抗炎性。這些結(jié)論支持會^Jt^乂乙茶在改變脂肪細(xì)胞生理機(jī)能以降低胰島素抵抗方面的應(yīng)用，從而可治療由胰島素抵抗引起的體重增加、肥胖、心血管病以及癌癥。實(shí)施例19金洽^t慮水提取物的二甲亞砜可溶成分對抗胰島素3T3-Ll脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素、IL-6以及抵抗素分泌的影響。/[脂聯(lián)素]&卞卞IL-6指數(shù)=[IL-6測試]/[IL-6R島素對照」卞卞卞抵抗素指數(shù)=[Resistin測試]/[Resistin胰島素對照]*指數(shù)值表示平均值±95%置信區(qū)間，它是根據(jù)方差分析的剩余均方計(jì)算而來。大于或小于胰島素對照±95%置信區(qū)間的數(shù)值與p<0.05時(shí)存在顯著差異。實(shí)施例20使用源自酒花的植物化學(xué)成分增加脂肪細(xì)胞中的脂肪生成。002611^"孟y—在這些實(shí)驗(yàn)中，采用實(shí)施例11中所述的3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞模型。所用的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品以及統(tǒng)計(jì)程序如實(shí)施例ll所述。00262一如表19中所述，測試中所用的酒花植物化學(xué)成分購自Betatech酒花產(chǎn)品公司(美國華盛頓特區(qū))。表19酒花測試材料說明。酒花測試材料說明78a酸溶液82%a酸/2.7°/。卩酸/2.95%異構(gòu)a酸(體積比)。a酸包括律草酮、聚律草酮和類律草酮。p異構(gòu)a酸(RIAA)p-異律草酮、p-異聚律草酮和p-異類律草酮。異a酸(IAA)以體積比計(jì)算，異a酸占25.3%。包括/銜式^7^式異律草酮、/#_^//7i義異聚律草酮以及/,^C//7^_^異類律草酮。四氫異a酸(THIAA)酒花復(fù)合物一以體積比計(jì)算，THIAA為8.9%。包括/#式四氫異律草酮、/,式四氫異聚律草酮以及/#式四氫異類律草酮。六氫異a酸(HHIAA)以體積比計(jì)算，THIAA為3.9%，HHIAA為4.4%HHIAA異構(gòu)體包括六氫異律草酮、六氫異聚律草酮和六氫異類律草酮。B酸溶液以體積比計(jì)算，P酸為10%;a酸含量<2%。B酸包括蛇麻酮、類蛇麻酮、聚蛇麻酮和前蛇麻酮。黃腐酚(XN)以質(zhì)量比計(jì)算，黃腐酚含量>80%。包括黃腐酚、黃腐酚A、黃腐酚B、黃腐酚C、黃腐酚D、黃腐酚E、黃腐酚G、黃腐酚H、脫甲基黃腐酚、黃原酚、4'-0-甲基黃腐酚、3，-香葉基酮-4，5,7-三羥黃垸酮、3',5，-二異戊烯二基酮-4，5，7-三羥黃烷酮、5，-異戊二烯基黃腐酚、醉椒黃烷酮、脫二氫黃腐酚以及異脫氫環(huán)化水合物黃腐酚。酒花殘留物黃腐酚A、黃腐酚B、黃腐酚C、黃腐酚D、黃腐酚E、黃腐酚G、黃腐酚H、反式羥基黃腐酚、l"O.2"-二羥基黃腐酚C,脫甲基黃腐酚B、脫甲基黃腐酚J、黃腐酚I、脫甲基黃腐酚、異黃腐酚、脫二氫黃腐酚、二異戊二烯基黃腐酚、5"-羥基黃腐酚、5'-異戊二烯基黃腐酚、6,8-二異戊二烯基柚皮素、8-異戊二烯-4,5，7—三羥黃垸酮、6-異戊二烯柚苷元、異黃腐酚、律草靈酮、副律草靈酮、4-羥基苯甲醛和谷甾醇-3-0-b-吡喃葡萄糖苷。六氫類蛇麻酮1%六氫類蛇麻酮(體積比，溶劑為KOH)。002651黃腐酚、a酸和J3酸和噴哚美辛及曲格列酮的脂肪生成反應(yīng)相當(dāng)，而酒花殘留物和六氫類蛇麻酮?jiǎng)t不能誘發(fā)比溶劑對照更大的脂肪生成反應(yīng)。替換{相對脂聯(lián)素分泌/[濃度]}，而利用應(yīng)變量{v}替換{相對脂聯(lián)素分泌}，生成一個(gè)y=mx+b的關(guān)系式。利用Y截距方法估算相對溶劑對照的脂聯(lián)素分泌最大值，而利用斜率的負(fù)值計(jì)算測試材料必要的半最大值處的脂聯(lián)素分泌濃度。卞.數(shù)最高分泌量時(shí)測試材料的濃度[Hg/ml]異a酸3.170,49黃腐酚2.470.037P異a酸2.380.10曲格列酮[2]2.290.085酒花殘留物2.212.8六氫異a酸[2]1.890.092六氫類蛇麻酮[2]1.833.2四氫異a酸1.600.11根據(jù)四種測試濃度的Hofstee點(diǎn)線性回歸分析估算[2]忽略一個(gè)異常數(shù)據(jù)，使用其它ZI個(gè)濃度估計(jì)劑量反應(yīng)800270如表20所示，由修正后的Hofstee的點(diǎn)(圖20)估計(jì)最大脂聯(lián)素分泌可有效支持上述觀察結(jié)果。最高脂聯(lián)素分泌的y軸截距估計(jì)大致分為三組(1)異a酸，(2)黃腐酚、p異a酸、曲格列酮和酒花殘留物，以及(3)六氫異a酸、六氫類蛇麻酮和四氫異a酸。如表20所示，由修正后的Hofstee的點(diǎn)(圖20)估計(jì)最大脂聯(lián)素分泌可有效支持上述觀察結(jié)果。最高脂聯(lián)素分泌的y軸截距估計(jì)大致分為三組(1)異a酸，(2)黃腐酚、P異構(gòu)d酸、曲格列酮和忽布?xì)埩粑铮约?3)六氫異a酸、六氫類蛇麻酮和四氫異a酸。刺激抗胰島素的3T3-L1細(xì)胞產(chǎn)生半數(shù)最大量脂聯(lián)素分泌所需測試材料的濃度大約為0.1pg/ml，曲格列酮、P異構(gòu)a酸、四氫異a酸和六氫異a酸在這點(diǎn)上類似。達(dá)到半數(shù)最大脂聯(lián)素分泌時(shí)，異a酸的濃度為0.49pg/ml，接近前面的5倍。黃腐酚顯示對半數(shù)最大脂聯(lián)素分泌所需的劑量最低，約為0.037pg/ml。達(dá)到半數(shù)最大脂聯(lián)素分泌時(shí)所需濃度最高的是酒花殘留物及六氫類蛇麻酮，分別為2.8pg/ml和3.2)ig/ml。刺激抗胰島素的3T3-L1細(xì)胞產(chǎn)生半數(shù)最大量脂聯(lián)素分泌所需測試材料的濃度大約為0.1pg/ml，曲格列酮、p異a酸、四氫異a酸和六氫異a酸在這點(diǎn)上類似。達(dá)到半數(shù)最大脂聯(lián)素分泌時(shí)，異a酸的濃度為0.49^g/ml，接近前面的5倍。黃腐酚顯示對半數(shù)最大脂聯(lián)素分泌所需的劑量最低，約為0.037pg/ml。達(dá)到半數(shù)最大脂聯(lián)素分泌時(shí)所需濃度最高的是酒花殘留物及六氫類蛇麻酮，分別為2.8pg/ml和3.2pg/ml。基于它們增強(qiáng)抗胰島素的3T3-L1細(xì)胞中脂聯(lián)素分泌的能力，本研究發(fā)現(xiàn)陽性酒花植物化學(xué)成分異a酸、p異a酸、四氫異a酸、六氫異a酸、黃腐酚、酒花殘留物和六氫類蛇麻酮，預(yù)計(jì)對血漿脂聯(lián)素降低的所有臨床病癥具有積極的影響。實(shí)施例22酒花植物化學(xué)成分通過增強(qiáng)抗胰島素的3T3—L1脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的分泌以及抑制對白細(xì)胞介素-6的分泌而呈現(xiàn)抗炎活性。翁—菜一在高濃度胰島素存在條件下，曲格列酮和所有測試過的酒花衍生物均能增加脂聯(lián)素的分泌(表21)。在此模型中曲格列酮不會減少IL-6的分泌。事實(shí)上，曲格列酮和HHCL在兩種濃度下顯示增加IL-6分泌的能力，而THIAA和酒花殘留物在最高濃度時(shí)可增加IL-6的分泌，在其它濃度下則不起作用。其它酒花衍生物對IL-6分泌的影響通常為雙相的。在測試的最高濃度，除IAA夕卜，RIAA、HHIAA和XN均可增加IL-6的分泌。而RIAA、IAA、THIAA和XN會顯著降低IL-6的分泌。表21酒花化合物對抗胰島素3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素和白細(xì)胞介素-6分泌的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>將^^^(^fyZf測試材料或吲哚美辛同濃度為166nM的胰島素一并加入到D53T3-Ll脂肪細(xì)胞中。隔日，對培養(yǎng)基上清液取樣進(jìn)行脂聯(lián)素、IL-6以及抵抗素測定。所有值都對胰島素單一對照取指數(shù)。卞脂聯(lián)素指數(shù)=[脂聯(lián)素]/[脂聯(lián)素]皿卞卞IL-6指數(shù)=[IL-6測試〗/[IL-6胰島桑對照]*指數(shù)值是平均值±95%置信區(qū)間，它是根據(jù)方差分析的剩余均方計(jì)算而來。對脂聯(lián)素或脂聯(lián)素/IL-6來說，數(shù)值<0.7或>1.3與胰島素對照有顯著差異；而對IL-6來說，數(shù)值<0.77或〉1.23與胰島素對照有顯著差異。#與胰島素對照pO.05有顯著差異。以上數(shù)據(jù)說明酒花衍生物RIAA、IAA、HHIA、THIAA、XN、HHCL和酒花殘留物可減弱脂肪細(xì)胞中由高胰島素血癥引起的促炎效應(yīng)?？偟膩碚f，酒花衍生物在單純由TNFa造成的高胰島素血癥條件下的抗炎效應(yīng)要高于曲格列酮的抗炎效應(yīng)。實(shí)施例23酒花植物化學(xué)成分增加TNFa處理后的3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的分泌。00277漠孟〃一在這些實(shí)驗(yàn)中，采用實(shí)施例11中所述的3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞模型。標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品和酒花化合物IAA、RIAA、HHIAA和THIAA分別如實(shí)施例13和20所述。酒花衍生物分別在濃度為0.625、1.25、2.5和5.0嗎/ml時(shí)進(jìn)行測試。脂聯(lián)素的分析如實(shí)施例12所述。混合在所有劑量下均顯示協(xié)同作用，而金合歡屬RIAA[10:1]在10和5.0pg/ml濃度下顯示協(xié)同租用，并在其它任何測試濃度下均未發(fā)生拮抗。金合歡屬IAA[10:1]混合物在兩個(gè)中等濃度下也呈現(xiàn)協(xié)同作用，并且未發(fā)生拮抗。而金合歡屬IAA[5:1]在濃度為50pg/ml時(shí)具有協(xié)同作用，在濃度為5.0(ag/ml時(shí)發(fā)生拮抗。00284類似地，所有混合物在一個(gè)或多個(gè)測試濃度下對增加脂聯(lián)素分泌均顯示協(xié)同作用(表23)。金合歡屬IAA[10:1]混合在所有劑量下均顯示協(xié)同作用，而金合歡屬RIAA[5:1]和金合歡屬RIAA[10:1]在三種劑量下顯示協(xié)同作用，而在一種濃度下發(fā)生拮抗。金合歡屬IAA[5:1]混合在濃度為1.0pg/ml時(shí)具有協(xié)同作用，在濃度高于10pg/ml時(shí)發(fā)生拮抗。表22抗胰島素3T3-1模型中^^歡厲乂Z茶和酒花衍生物誘發(fā)的脂肪生成反應(yīng)的觀測值和預(yù)期值。<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>卞脂肪生成指數(shù)呵OD]測a/[OD〗鵬對照。1)95%置信區(qū)間上限是1.03，最小顯著性差值=0.03。2)95%置信區(qū)間上限是1.03，最小顯著性差異=0.03。3)95%置信區(qū)間上限是1.07，最小顯著性差值=0.07。4)95%置信區(qū)間上限是1.02，最小顯著性差值=0.02。表23TNFa/3T3-1模型中i會歡^7Z茶和酒花衍生物誘發(fā)的脂聯(lián)素分泌觀測值和預(yù)期值。<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>卞脂聯(lián)素指數(shù)=[脂聯(lián)素]自/[脂聯(lián)素]TB對照1)95%置信區(qū)間上限是1.07，最小顯著性差值=0.07。2)95%置信區(qū)間上限是1.03,最小顯著性差異=0.03。漠產(chǎn)〃一在這些試驗(yàn)中，采用實(shí)施例11和13中所述的3T3-L1小鼠脂肪細(xì)胞模型。/[IL-6LPS-IL-6對照]*這與LPS對照有顯著差異(p<0.05)。表25酒花衍生物和選用的非甾體抗炎藥物對LPS/3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素分泌的最大刺激。<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>卞脂聯(lián)素指數(shù)=[脂聯(lián)素]獄/[脂聯(lián)素]LPS對照*數(shù)值大于1.07表示與LPS對照有顯著差異(p<0，05)。NS=與LPS對照無明顯差異。實(shí)施例26在TNFot/3T3-1模型中i合^t^/乙茶或酒花衍生物與姜黃素或黃腐酚混合時(shí)的協(xié)同效應(yīng)。淑/[脂聯(lián)素]T,對照1)95%置信區(qū)間從0.961到1.049，最小顯著性差異=0.049。實(shí)施例27共軛亞油酸與酒花衍生物。異a酸混合在抗胰島素3T3-L1脂肪細(xì)胞模型中對脂肪生成的體外協(xié)同作用。1501.261.15協(xié)同作用101.161.06協(xié)同作用5.01.161.10協(xié)同作用1.01.171.06協(xié)同作用卞脂肪生成指數(shù)=[OD]測試/[OD]腦。對照。1)95%置信區(qū)間上限是1.05，最小顯著性差異=0.05。實(shí)施例28酒花植物化學(xué)成分抑制TNFcc-處理后的3T3-L1脂肪細(xì)胞中NF-kB的活性。碧菜一經(jīng)TPA處理的Jurkat核提取物顯示出預(yù)期的NF_kBp65增加，這表明試劑盒中試劑的性能能夠滿足需要(圖22)。用濃度為10ng/ml的TNFa分別對D403T3-L1脂肪細(xì)胞處理3小時(shí)(圖22A)或24小時(shí)(圖22B)，核NF-kBp65會增加2.1和2.2倍。正如預(yù)期，TNFa處理3小時(shí)或24小時(shí)后PPARy激動(dòng)劑吡格列酮均未抑制核NF-kBp65的產(chǎn)量。TNFa處理3小時(shí)后，濃度為5.0和2.5pg/ml的RIAA對NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的抑制百分比分別為9.4%和25%。24小時(shí)后，只有經(jīng)過5.0pg/mlRIAA處理的樣品顯示出NF-kBp65的核轉(zhuǎn)位受到明顯的抑制(p<0.05)。TNFa處理后的3小時(shí)，5.0叫/ml和2.5pg/ml的黃腐酚對NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的抑制分別為15.6%和6.9%,而24小時(shí)后分別為13.4%和8.0%。根據(jù)3T3-L1細(xì)胞中所顯示的脂肪生成潛力，二甲雙胍和金合^^f乂L芬提取物的1:1混合物有望在臨床應(yīng)用中呈現(xiàn)協(xié)同作用。這種混合物將用來增加二甲雙胍療法的正向效果范圍，例如可降低血漿中甘油三酯含量或延長二甲雙胍藥物作用期。實(shí)施例30酒花衍生物和噻唑烷二酮類藥物對抗胰島素3T3-L1脂肪細(xì)胞模型中脂肪生成的沐《協(xié)同作用。003121^^孟〃一在這些實(shí)驗(yàn)中，采用實(shí)施例11和13所述的3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞模型。00313^f/試眾^懲^必潘一實(shí)驗(yàn)中用到的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品如實(shí)施例11所述。為計(jì)算脂肪生成指數(shù)，3T3-L1脂肪細(xì)胞須在發(fā)生分化前按實(shí)施例ll中所述進(jìn)行處理。曲格列酮購自Cayman化學(xué)制劑公司(美國伊利諾斯州芝加哥市)。吡格列酮為商品片劑(ACT0SE,Takeda制藥公司，美國伊利諾斯州林肯郡)。將片劑粉碎，所得全部藥粉均用于分析。根據(jù)活性成分含量計(jì)算所有結(jié)果。所用酒花衍生物p異ot酸和異a酸如實(shí)施例20所述。與RIAA和IAA混合的曲格列酮在4.0pg/ml濃度下進(jìn)行測試，而效力更強(qiáng)的吡格列酮與RIAA和IAA以1:1混合后于2.5ng/ml濃度下進(jìn)行測試。為計(jì)算實(shí)施例34中所述的脂肪生成指數(shù)，所有材料還在4.0pg/ml和2.5pg/ml兩個(gè)濃度下分別進(jìn)行測試。00314一當(dāng)在4.0pg/ml和2.5pg/ml兩個(gè)濃度下分別對曲格列酮和吡格列酮進(jìn)行測試時(shí)，p異a酸和異a酸均能與抗胰島素3T3-L1脂肪細(xì)胞模型中的噻唑烷二酮類藥物協(xié)同促進(jìn)甘油三酯的合成(表28)。00315酒花衍生物p異a酸和異a酸可協(xié)同增加噻唑垸二酮類藥物的胰島素增敏效應(yīng)，這將帶來劑量減少或良性反應(yīng)的病人數(shù)量增加等一系列潛在臨床優(yōu)勢。表2897酒花衍生物和噻唑烷二酮類藥物在抗胰島素3T3-L1脂肪細(xì)胞模型中的錄，/協(xié)同作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>卞脂肪生成指數(shù)=[OD]淑/[OD]DMS。對照。1)95%置信區(qū)間上限是1.02，最小顯著性差異=0.02。2)95%置信區(qū)間上限是1.05，最小顯著性差異=0.05。實(shí)施例31P-異a酸和二甲雙胍在TNFa/3T3-Ll脂肪細(xì)胞中的錤^/協(xié)同作用/[IL-6TNF。-IL-6對照]*數(shù)值小于0.93顯著(pO.05)低于TNFa對照。實(shí)施例32測試化合物對癌癥細(xì)胞錄》/增殖的影響混合物、XN:Acacia[1:10]混合物、Acacia:RIAA[5:1]混合物、黃腐酚、Acacia:IAA[5:1]混合物、異a酸和p-異a酸均可降低非空腹血糖，而對胰島素?zé)o效果。Acacia:RIAA[10:1]混合物和Acacia:IAA[10:1]混合物對血糖和胰島素均無效果(表30)。漠—:^一本實(shí)驗(yàn)使用C57BLKS/Jm+/m+L印rdb(db/db)雄鼠對測試材料降低空腹血糖或胰島素濃度的能力進(jìn)行分析。這一品系小鼠由于缺乏起作用的瘦素受體而對瘦素產(chǎn)生抗性。血漿胰島素從第10天到第14天這段時(shí)間開始升高，血糖從4到8周開始升高。在測試時(shí)(9周)動(dòng)物體重顯著增加50±5g，并呈現(xiàn)胰島肥大的跡象。003301一陽性對照二甲雙胍和羅格列酮連續(xù)三天每天分別按300mg/kg和1.0mg/kg的劑量給藥。金^^t^y^羅樣品#5659、酒花衍生物和它們的混合物如前文所述進(jìn)行給藥。碧—菜一相對于對照組，陽性對照二甲雙胍和羅格列酮均可降低血糖和胰島素濃度(表31)。僅RIAA和XN單獨(dú)作為測試材料時(shí)顯示出可接受的結(jié)果。RIAA降低血清胰島素，而XN降低血糖，對胰島素并無效果。在己測試的降低血清胰島素含量的試劑中，金合歡屬RIAA[5:1]混合物最有效，使血清胰島素水平降低21%，而二甲雙胍只能使胰島素濃度降低17%，噻唑垸二酮類羅格列酮使其降低15%。金合歡屬RIAA[5:1]混合物的反應(yīng)要高于兩者中的單獨(dú)成分，從而可顯示協(xié)同作用。單獨(dú)使用會^^t^yg羅不能減少血清葡萄糖或血清胰島素，而RIAA減少血清胰島素的程度與二甲雙胍相近。在剩余測試材料中，金合歡屬IAA[10:1]混合物還可有效降低血清胰島素濃度。00333在db/db鼠2型糖尿病模型中，由p-異a酸造成的血清胰島素含量快速下降以及由黃腐酚造成的血糖含量下降，表明它們在治療與胰島素不敏感癥和高血糖癥有關(guān)的人類疾病方面具有潛在的臨床療效。此外，p-異a酸和金合歡屬兒茶的5:1混合物在db/db鼠糖尿病模型中呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。p-異a酸、黃腐酚和金合歡屬RIAA[5:1]成分對2個(gè)獨(dú)立的糖尿病動(dòng)物模型和3個(gè)錄^/模型的陽性反應(yīng)表明它們可用于降低血糖或提高胰島素敏感性的臨床表現(xiàn)中。表31金會Jt^^,和酒花衍生物對db/db糖尿病鼠體內(nèi)非空腹血糖和胰島素的效應(yīng)。103測試材料劑量mg/kg-每天]葡萄糖[預(yù)治療百分比％]胰島素[預(yù)治療百分比％]<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>卞對每組中的5個(gè)動(dòng)物連續(xù)3天每天施加1次劑量。#顯著低于各自的對照(p<0.05)。實(shí)施例35在糖尿病db/db鼠模型中會會^t^yg羅和酒花衍生物比值的沐力優(yōu)化003341#"星^一使用C57BLKS/Jm+/m+L印rdb(db/db)雄鼠對測試材料降低空腹血糖或胰島素濃度的能力進(jìn)行分析。這一品系小鼠由于缺乏起作用的瘦素受體而對瘦素產(chǎn)生抗性。血漿胰島素從第10天到第14天這段時(shí)間開始升高，血糖從4到8周開始升高。在測試時(shí)(9周)動(dòng)物體重顯著增加50±5g，并呈現(xiàn)胰島肥大的跡象。的角鯊烯混合物。第21天重復(fù)進(jìn)行加強(qiáng)注射。第22-27天檢查小鼠關(guān)節(jié)炎體征，從研究中移除那些無反應(yīng)的小鼠。從第28天開始每天對小鼠用測試化合物以強(qiáng)詞法進(jìn)行治療，直到第42天結(jié)束，共持續(xù)14天。本實(shí)施例中所用化合物105RIAA(MgRho)劑量分別為10mg/kg(低)、50mg/kg(中)、或250mg/kg(高)；THIAA劑量分別為10mg/kg(低)、50mg/kg(中)、或250mg/kg(高)；塞來昔布劑量為20mg/kg以及脫氫皮質(zhì)(甾)醇劑量為10mg/kg。003421使用以下所述的關(guān)節(jié)炎指數(shù)對每只腳爪的關(guān)節(jié)炎癥狀進(jìn)行評估(分為0-4)。根據(jù)此關(guān)節(jié)炎指數(shù)，0=無可見跡象；1=水腫和/或紅斑單趾；2=水腫和/或紅斑雙關(guān)節(jié)；3=水腫和/或紅斑超過兩個(gè)關(guān)節(jié)；以及4=整個(gè)腳爪和腳趾出現(xiàn)嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎并伴隨有關(guān)節(jié)強(qiáng)直和關(guān)節(jié)畸形。邀恭^^t^/——在實(shí)驗(yàn)最后，對小鼠實(shí)施安樂死，并截取其一肢保存于福爾馬林緩沖液中。在取得關(guān)節(jié)炎指數(shù)分析的滿意結(jié)果之后，從每個(gè)治療組中隨機(jī)選取兩個(gè)動(dòng)物通過服E染色進(jìn)行組織學(xué)分析。軟組織、關(guān)節(jié)和骨骼的變化以四分制進(jìn)行評定，得分4表明嚴(yán)重?fù)p傷。圖31顯示關(guān)節(jié)組織損傷的組織學(xué)檢測結(jié)果，并顯示在THIAA處理的個(gè)體治療中沒有或極小存在關(guān)節(jié)損傷的跡象。這里有明確劑量反應(yīng)標(biāo)識并且在250mg/kg禾n50mg/kg下的組織學(xué)得分分別降低了40%和28%。這與關(guān)節(jié)組織只有106輕微損傷的塞來昔布治療組相差無幾。需注意塞來西布(20mg/kg)治療組的組織學(xué)得分實(shí)際上增加33%。動(dòng)物個(gè)體間存在顯著差異，例如一個(gè)經(jīng)賦形劑處理的動(dòng)物顯示中度關(guān)節(jié)損傷跡象，而其他動(dòng)物明顯未受任何損傷。除了脫氫皮質(zhì)(甾)醇治療組的一個(gè)動(dòng)物外，其他所有治療組均呈現(xiàn)關(guān)節(jié)膜炎癥狀。(3片/天)N3535性別男性11(31%)12(34%)女性24(69%)23(66%)平均值標(biāo)準(zhǔn)差平均值標(biāo)準(zhǔn)差年齡(年)46.013.247.913.4體重(磅)220.635.2219.531.6體質(zhì)指數(shù)(kg/m2)35.04.035.44.0收縮壓(mm)131.015.1129.713.9舒張壓(ram)83.78.582.67.8腰圍(英尺)42.94.942.94.5臀圍(英尺)47.14.047.63.2空腹胰島素含量(incIU/mL)13.25.217.512.1餐后兩小時(shí)胰島素含量(mcIU/mL)肌252.199.3*59.2*空腹血糖含量(mg/dL)96.59.099.010.3餐后兩小時(shí)血糖含量(mg/dL)109.230.5128.436.9空腹甘油三酯含量(mg/dL)231.2132.2255.5122.5*若實(shí)驗(yàn)主體胰島素值、體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)代謝指數(shù)、血壓值、甘油三酯和高密度脂蛋白值異常，則在分析時(shí)將其排除。108組之間的差異在第8周(p<0.05)時(shí)顯著。使用已發(fā)表的方法[(胰島素(mcIU/mL盧血糖(mg/dL))/405]計(jì)算空腹胰島素和血糖的HOMA得分。c=X/[T]x+Y/[T]y，式中T=毒性，其代表生長受抑制或被殺死的細(xì)胞所占分?jǐn)?shù)，X、Y是測試混合物每種成分的相對分?jǐn)?shù)，且X+Y=l。圖示觀察值是在95%置信區(qū)間內(nèi)所得8個(gè)觀察值的平均數(shù)。當(dāng)估計(jì)的百分?jǐn)?shù)下降落于相應(yīng)觀察分?jǐn)?shù)的95%置信區(qū)間之下時(shí)，就表示具有協(xié)同作用。現(xiàn)在本發(fā)明已充分描述完畢，顯而易見本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離隨附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)均可對本發(fā)明做出變更和修改。權(quán)利要求1.用以治療哺乳動(dòng)物中對其所需蛋白激酶調(diào)節(jié)敏感的癌癥方法，其中所述方法包括使用有效治療劑量的六氫異α酸給哺乳動(dòng)物用藥。2.權(quán)利要求1的方法中，六氫異a酸從以下組群中進(jìn)行選擇六氫異律草酮、六氫異類律草酮和六氫聚律草酮。3.權(quán)利要求1的方法中，進(jìn)行調(diào)節(jié)的蛋白激酶選自以下組群中Abl(T3151)、Aurora-A、Bmx、CDK9/cyclinTl、CK1y1、CK1y2、CK1y3、cSRC、DAPK1、DAPK2、EphBl、ErbB4、Fer、FGFR2、GSK3J3、GSK3a、HIPK3、IGF-1R、MAPKAP-K2、MSK2、PAK3、PAK5、PI3K、Pim-l、PKA(b)、PKBJ3、PKBy、PRAK、Rsk2、Syk、Tie2、TrkA、TrkB、以及ZIPK。4.權(quán)利要求1的方法中，對激酶調(diào)節(jié)敏感的癌癥選自以下組群中膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌和子宮癌。5.哺乳動(dòng)物中對其所需蛋白激酶調(diào)節(jié)敏感的癌癥治療混合物，其中混合物包括有效治療劑量的六氫異a酸，這里有效治療的劑量調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)的蛋白激酶。6.權(quán)利要求5的混合物中，六氫異a酸從以下組群中進(jìn)行選擇六氫異律草酮、六氫異類律草酮和六氫聚律草酮。7.權(quán)利要求5的混合物中，還包括藥用可接受的輔料，其可從以下組群中選擇涂料、等滲和吸收延緩劑劑、粘結(jié)劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、著色齊U、調(diào)味劑、甜味劑、吸收劑、去污劑以及乳化劑。8.權(quán)利要求5的混合物中，該混合物還包括選自以下組群的一種或多種成分抗氧化劑、維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪以及碳水化合物。全文摘要本發(fā)明公開了用于癌癥治療的蛋白激酶調(diào)節(jié)的化合物和方法。本發(fā)明公開的化合物和方法基于酒花中常見的六氫異α酸。文檔編號A61K31/122GK101505743SQ200780030611公開日2009年8月12日申請日期2007年6月20日優(yōu)先權(quán)日2006年6月20日發(fā)明者杰弗里·布蘭德,琳達(dá)·帕西奧雷蒂,約翰·G·巴比士,維拉·康達(dá),艾米·杰尼·霍爾,艾紐·德賽,馬修·L·特里普申請人:麥特普羅泰歐米克斯有限公司