專利名稱：小腸sp細(xì)胞在制備治療腸損傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小腸SP細(xì)胞的一種新用途，特別涉及小腸SP細(xì)胞在制備治療腸損
傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小腸作為機(jī)體組織中最重要的吸收營養(yǎng)物質(zhì)的場所，是機(jī)體中不可缺少的重要 器官之一。目前雖然大部分小腸疾病均可通過各種有效的內(nèi)外科方法得到有效的治 療，但許多難治性的小腸疾病的治療存在著相當(dāng)?shù)睦щy，如短腸綜合癥以及盆腔腫 瘤術(shù)后放療照射引起的小腸放射性腸炎等。隨著腸內(nèi)腸外營養(yǎng)支持的迅速發(fā)展以及 小腸移植科學(xué)的出現(xiàn)，這些難治性小腸疾病的治療有了很大的進(jìn)步。但事物的發(fā)展 總是具有兩面性，長期的營養(yǎng)支持費(fèi)用太高，而且有些患者會(huì)出現(xiàn)相關(guān)并發(fā)癥。小 腸移植是目前難治性小腸疾病的終末治療手段，因?yàn)樾∧c又是機(jī)體中最大的淋巴組 織器官，所以小腸移植中存在的最大問題就是移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)，強(qiáng)烈的免 疫排斥反應(yīng)往往導(dǎo)致小腸移植的失敗。因此尋找一種有效的治療手段仍是目前胃腸 科學(xué)領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。
成體干細(xì)胞治療作為一種新興的治療手段為難治性小腸疾病的治療帶來了新 希望。干細(xì)胞是一種具有自我更新能力和多系分化潛能的種子細(xì)胞，人體所有的組 織器官細(xì)胞均由干細(xì)胞分化發(fā)育而來，理論上人體所有的組織和器官的損傷也可以 利用干細(xì)胞進(jìn)行損傷修復(fù)治療。干細(xì)胞按照機(jī)體發(fā)育的不同階段分為不同類別，如 胚胎干細(xì)胞，多能干細(xì)胞以及各種組織中的定向干細(xì)胞如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞 等，根據(jù)目前已經(jīng)取得的研究結(jié)果，胚胎干細(xì)胞在技術(shù)上還難以取得突破，短時(shí)間 內(nèi)無法應(yīng)用于臨床，同時(shí)還面臨取材限制及倫理挑戰(zhàn)等諸多問題。可喜的是，成體 干細(xì)胞因其最近在細(xì)胞可塑性上取得的一系列突破使得利用成體干細(xì)胞治療各種 組織器官損傷疾病成為了可能，同時(shí)成體干細(xì)胞來源方便，培養(yǎng)手段簡易，同時(shí)不 存在倫理方面的擔(dān)心，因此研究利用成體干細(xì)胞治療多種組織器官損傷性疾病是今 后研究臨床治療的創(chuàng)新思路之一。
SP細(xì)胞(side-population)是一種較特殊的成體干細(xì)胞群體，該類細(xì)胞根據(jù) 生命活力越強(qiáng)的細(xì)胞其mdr基因表達(dá)越豐富，排出Hoechst33342的能力越強(qiáng)，以及活細(xì)胞對PI染料拒染的原理使用流式細(xì)胞儀分選得到。在流式細(xì)胞儀上顯示該 細(xì)胞群體處于整個(gè)被分選的細(xì)胞群體的邊緣，因此被命名為SP (side-population 即邊緣群)細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供小腸SP細(xì)胞的一種新用途。
本發(fā)明所提供的小腸SP細(xì)胞的新用途是小腸SP細(xì)胞在制備治療腸損傷藥物中
的應(yīng)用。
在實(shí)際應(yīng)用中，所述小腸SP細(xì)胞可懸浮于生理鹽水中作為治療放射性腸炎損 傷的藥物；所述生理鹽水為0. 9%的氯化鈉水溶液。 所述小腸SP細(xì)胞具體可為小腸黏膜SP細(xì)胞。 所述腸損傷可為腸炎損傷，如小腸腸炎損傷。 上述腸損傷可為放射性腸損傷。
本發(fā)明將小腸SP細(xì)胞移植給腹腔照射的受體小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小腸SP細(xì)胞 能夠歸巢到小腸隱窩修復(fù)損傷，還可延長受致死量照射動(dòng)物模型的存活時(shí)間，明顯 改善放射性腸炎的慢性纖維化，對放射性小腸損傷取得了良好的修復(fù)效果。本發(fā)明 為小腸損傷疾病的臨床治療提供了一種創(chuàng)新并且簡便的方法和途徑。本發(fā)明為將來 尋找小腸黏膜干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物打下了基礎(chǔ)。


圖l為小腸SP細(xì)胞分選示意圖
圖2為小腸SP細(xì)胞的細(xì)胞周期分析
圖3為小腸SP細(xì)胞表型分析
圖4為顯微共聚焦染色顯示R0SA26小鼠來源的SP細(xì)胞注射C57BL/6小鼠后2個(gè)月
分布在小腸的黏膜和隱窩位置。
圖5A顯微共聚焦染色顯示R0SA26小鼠來源的SP細(xì)胞注射C57BL/6小鼠后2個(gè)月
分布在小腸的隱窩-絨毛部位
圖5B為LacZ染色顯示R0SA26小鼠來源的SP細(xì)胞注射C57BL/6小鼠后2個(gè)月分布
在小腸的隱窩-絨毛部位
圖6為實(shí)驗(yàn)組和對照組受全腹腔照射后第1、 2、 3、 4天的小腸HE切片照片 A、 B、 C、 D分別為對照組受照射后第l、 2、 3、 4天的小腸HE切片照片 Al、 Bl、 Cl、 Dl分別為實(shí)驗(yàn)組受照射后第l、 2、 3、 4天的小腸HE切片照片
圖7為實(shí)驗(yàn)組小鼠在全腹腔照射后第1、 2、 3、 4天LacZ染色的照片 圖8為實(shí)驗(yàn)組小鼠在全腹腔照射后第4天，小腸SP細(xì)胞向小腸各種組織細(xì)胞分化 的照片
圖9為小鼠受致死量照射后的生存率圖。
圖10為ROSA26小鼠小腸SP細(xì)胞移植后6個(gè)月在C57BL/6小鼠小腸的分布 A顯示R0SA26小鼠小腸SP細(xì)胞在注射六個(gè)月后主要分布在小腸隱窩潘氏細(xì)胞的 位置上。
B顯示R0SA26小鼠小腸SP細(xì)胞在注射六個(gè)月后也能分布在小腸絨毛-隱窩結(jié)構(gòu) 的多處位置上。
圖11為放射模型中小腸SP細(xì)胞移植后六個(gè)月的觀察結(jié)果
A為致死量照射(14Gy X射線)后第三天的對照組潘氏細(xì)胞特殊組織化學(xué)染色。 B為致死量照射(14Gy X射線)后第三天的實(shí)驗(yàn)組潘氏細(xì)胞特殊組織化學(xué)染色。 C為非致死劑量照射(10GyX射線)后六個(gè)月的對照組潘氏細(xì)胞特殊組織化學(xué) 染色。
D為非致死劑量照射(10GyX射線)后六個(gè)月的實(shí)驗(yàn)組潘氏細(xì)胞特殊組織化學(xué) 染色。
E為非致死劑量(10Gy X射線)后六個(gè)月的對照組Masson三色染色，顯示顯 著的黏膜下膠原累積現(xiàn)象。
F為非致死劑量(10Gy X射線)后六個(gè)月的實(shí)驗(yàn)組Masson三色染色，顯示SP 細(xì)胞的輸入有效減少了照射后出現(xiàn)的黏膜下膠原累及和黏膜萎縮等現(xiàn)象的出現(xiàn)。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)驗(yàn)在分離類器官片段的基礎(chǔ)上結(jié)合分離SP細(xì)胞的原理，將類器官片段 制作成單細(xì)胞懸液并從中分離出SP細(xì)胞群，對它的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，并將 其移植給全腹腔照射模型小鼠的小腸黏膜下，證實(shí)培養(yǎng)的小腸黏膜樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)中含 有小腸黏膜上皮的成熟細(xì)胞。分離出來的SP細(xì)胞高表達(dá)integrinPl (CD29)， 處于細(xì)胞周期的靜止期，符合干細(xì)胞的特性，SP細(xì)胞移植后能夠歸巢到損傷的小腸 黏膜部位并分化成所有的小腸黏膜成熟細(xì)胞，可用于小腸黏膜損傷的治療中。
實(shí)施例l、 SP細(xì)胞移植修復(fù)放射性腸炎損傷 一、SP細(xì)胞的制備和表型分析 本發(fā)明在目前尚缺乏理想小腸黏膜干細(xì)胞表面標(biāo)志物的情況下，結(jié)合前人的研 究成果和發(fā)明人對小腸黏膜類器官片段的體外培養(yǎng)研究成果，在己證實(shí)了小腸黏膜 類器官片段是已經(jīng)初步富集化的干/祖細(xì)胞群體的基礎(chǔ)上，以小腸黏膜的類器官片 段為起始材料，分離其中的SP細(xì)胞，并進(jìn)一步富集。具體方法如下
1、 小腸黏膜類器官片段的分離
小鼠小腸黏膜類器官片段的分離簡述如下。從新出生1-2天的R0SA26小鼠(購 于美國Jackson實(shí)驗(yàn)室)的腹腔中取出小腸，按長軸剖開，并剪成0.5公分的片 段，使用低鈣鎂的1XHBSS (Gibco公司)清洗7-10遍以清洗小腸中的內(nèi)容物。洗 凈后的片段再剪成小片(1-2mm2)并置含中性蛋白酶I (100mg/ml， Boehringer) 和膠原酶XI (300U/ml， Sigma)的1XHBSS中，在室溫和搖床上消化20分鐘。使 用含5% (體積百分含量)胎牛血清，2% (質(zhì)量百分含量)山梨醇，lOOOU/ml青霉 素，1000iig/ml鏈霉素的DMEM (Gibco公司，美國)30ml中止消化反應(yīng)。收集消 化后的上清液，并在250rpm的速度下離心3分鐘得到類器官片段。這些類器官片段 在含2% (質(zhì)量百分含量)山梨醇的DMEM中重懸。
2、 小腸SP細(xì)胞的制備和表型分析
將制備的類器官片段輕輕拍打搖晃成單細(xì)胞懸液。將已經(jīng)分散開的細(xì)胞按照 1X107個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度重懸在lXHBSS中，并按照2. 5mg/ml的濃度滴加 Hoechst33342。細(xì)胞隨后在37。C孵箱中孵育90分鐘，離心后重懸在1XHBSS中并 按照lmg/ml的濃度滴加PI染料，置冰上保存，直到上流式細(xì)胞儀檢測。
流式細(xì)胞儀選擇前射光和側(cè)射光由100mW氬離子激光器在488nm波長激發(fā)。 Hoechst33342和PI由100mW的氪離子激光器激發(fā)(范圍351-364nm) 。 Hoechst熒 光通過440/60nm濾波器測量，而PI熒光通過670/14nm濾波器測量。分選結(jié)果如圖 l所示，小鼠SP細(xì)胞群為Hoechst33342和PI雙陰性染色的細(xì)胞群。圖1中A:為分 選中去處細(xì)胞碎片及凋亡細(xì)胞區(qū)域選中的P1區(qū)域作為首選的分選區(qū)域；B:去處凋 亡的細(xì)胞P2區(qū)域C:在P1區(qū)域和P2區(qū)域的基礎(chǔ)上分選的P3區(qū)域作為選中的SP細(xì)胞 群。其中黑色代表細(xì)胞碎片及死亡的細(xì)胞、紅色代表凋亡的細(xì)胞、綠色代表成熟 的細(xì)胞、黃色代表分選的SP細(xì)胞。
對分離出來的SP細(xì)胞進(jìn)行有關(guān)細(xì)胞生物學(xué)特性的檢測，包括細(xì)胞周期測定以 及細(xì)胞表型分析。
細(xì)胞周期分析SP細(xì)胞分離出來后離心，以lXPBS按照lX106個(gè)/ml的細(xì)胞數(shù)量
重懸，加入低滲的PI染料(1 raM Tris， 0. 1 mM EDTA， 0. 1% triton-X100, 3. 4慮 枸櫞酸鈉鹽，0.05 mg propidium iodide)。這些細(xì)胞在進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析前15 分鐘一直放在冰上。DNA含量分析使用488nm直射光和455nm散射光進(jìn)行激發(fā)，并使 用CellQuestA v3. 2軟件(Becton-Dickenson公司)進(jìn)行分析，并使用ModFit LT v2. 0 軟件進(jìn)行繪圖(Verity Software House公司)。
用直接免疫熒光法檢測上述SP細(xì)胞的表型，細(xì)胞用異硫氰酸熒光素(FITC)或藻 紅蛋白(PE)標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD29、 CD44、 CD105、 CD34、 CD45、 Sea-1、 CD106、 CD117和H-AD (小鼠MHC分子)抗體(上述抗體均購自BD公司，美國)標(biāo)記后進(jìn)行流 式檢測，流式細(xì)胞儀為BD FACScan (Becton Dickinson)。具體方法如下在試管 中分別加入上述抗體，再加入含有l(wèi)X106個(gè)上述SP細(xì)胞的50ul細(xì)胞懸液，輕微振蕩 后混勻，暗處冰浴反應(yīng)15分鐘后，再輕微振蕩后加入lml洗液。300轉(zhuǎn)/分離心5分鐘， 棄上清。重懸在4度的1XPBS中，等待上機(jī)，上機(jī)前加PI。
細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示近92y。的細(xì)胞在Gl期，少于109&在S期，只有W的細(xì)胞在G2/M 期(圖2)。細(xì)胞周期分析顯示高達(dá)92%的細(xì)胞群體集中在6。/&期，這個(gè)結(jié)果與目 前國際上報(bào)道的所有類型的干細(xì)胞群體的細(xì)胞周期特征是完全一致的。細(xì)胞表型分 析的結(jié)果顯示，以前文獻(xiàn)報(bào)道的在小腸隱窩位置高表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白 InterginPl (CD29)在SP細(xì)胞中的表達(dá)高達(dá)76%左右，而其他文獻(xiàn)報(bào)道的間充質(zhì)干 細(xì)胞、血液干細(xì)胞的特征性細(xì)胞表型如CD105、 CD106、 Sca-l、 CD34等在SP細(xì)胞中 均不表達(dá)。也不表達(dá)CD44、 CD45 、 CD117和H-AD。
二、小腸SP細(xì)胞移植后在受體小腸中的分布
按照如下方法建立C57BL/6小鼠全腹腔照射模型C57BL/6小鼠放在獨(dú)立的透 明樹脂盒，使用鉛板遮蓋住頭、喉和下肢等其他部位，僅暴露腹部。全腹腔照射(吸 收劑量10Gy)是使用X射線放射源(照射速率，1Gy/分鐘)。執(zhí)行照射的技術(shù)方案
1、 使用Varian直線加速器(美國)
2、 6MV-X射線
3、 劑量分解250Gy/min
4、 SSD (射源與照射物距離)100 cm。
實(shí)驗(yàn)組照射后12小時(shí)，15只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠的小腸黏膜下注 射R0SA26小鼠SP細(xì)胞，具體方法如下小鼠麻醉后取仰臥位，使用75%的酒精消 毒后，取腹部正中切口 0.5cm，逐層進(jìn)腹。將屈式韌帶下至回盲部的所有小腸托出
體外。顯微鏡下使用顯微注射針取小腸中段其中任意一點(diǎn)的位置一次性將懸浮于
200ul生理鹽水中的2X105個(gè)細(xì)胞注射在小腸粘膜下疏松結(jié)締組織內(nèi)。
對照組照射后12小時(shí)，15只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠小腸黏膜下注射 同體積的生理鹽水。
在注射后2個(gè)月后，用LacZ染色(整體組織染色)和顯微共聚焦檢測R0SA26 小鼠SP細(xì)胞在小腸的分布情況。其中，LacZ染色(整體組織染色)方法如下實(shí) 驗(yàn)組和對照組小鼠使用Avertin麻醉后，按照中線切開暴露腹部、胸部。管腔插入 心臟的左心室，使用預(yù)冷的4'C的固定液灌注固定10分鐘。照射過的整個(gè)小腸和皮 膚、肝臟、胰腺、脾臟被切除，并使用PBS清洗三遍，小腸按它的長軸切開，并將 管腔面暴露朝上。在4X:的環(huán)境下組織固定30分鐘后使用預(yù)熱的X-gal緩沖液15 分鐘內(nèi)清洗3遍，并在染液中37'C環(huán)境下孵育4-5小時(shí)。然后將小腸巻曲成盤狀， 從小腸的遠(yuǎn)端開始巻曲最后在近端結(jié)束。即遠(yuǎn)端在小腸巻的內(nèi)側(cè)中心，近端在小腸 巻的外側(cè)。小腸巻和皮膚包埋在石蠟中，并按照長軸切成15微米厚的切片。陽性 細(xì)胞為藍(lán)綠色染色。顯微共聚焦的檢測方法如下實(shí)驗(yàn)組和對照組的小鼠的麻醉和 內(nèi)灌流方式同上。灌流結(jié)束后，迅速切下小腸、肝臟、照射部位的皮膚、胰腺、脾 臟等組織器官。其中小腸依然巻曲成盤狀。迅速在冰凍劑包裹下放在冰凍機(jī)上待結(jié) 凍后進(jìn)行切片。50微米厚的冰凍切片制作后在室溫下使用丙酮固定10分鐘，用流 水輕輕沖洗切片表面。使用同種血清孵育20分鐘后，切片使用抗P-gal抗體(BD 公司，美國)進(jìn)行染色，使用Hoechst33342 (Sigma公司)進(jìn)行核染色。染色結(jié)束 后保存在4"C黑暗環(huán)境下盡早進(jìn)行檢測，檢測前避免光線直接照射。顯微共聚焦檢 測時(shí)先行建立陰性對照和陽性對照，建立參照系后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組的檢測。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示將R0SA26小鼠SP細(xì)胞移植到C57BL/6小鼠小腸黏膜下后，它們 在損傷信號的誘導(dǎo)下能迅速移行到小腸黏膜的隱窩并分化成小腸絨毛的四種成熟 細(xì)胞。圖4顯示R0SA26小鼠來源的SP細(xì)胞注射C57BL/6小鼠后2個(gè)月分布在小腸的黏 膜和隱窩位置。圖中紅色為抗P-gal染色(表示供者細(xì)胞中的LacZ基因)細(xì)胞， 蘭色表示細(xì)胞核。
圖5A顯微共聚焦染色顯示R0SA26小鼠來源的SP細(xì)胞注射C57BL/6小鼠后2個(gè)月 分布在小腸的隱窩-絨毛部位，圖中紅色為抗P-gal染色(表示供者細(xì)胞中的UcZ 基因)細(xì)胞，蘭色表示細(xì)胞核。
圖5B為LacZ染色顯示ROSA26小鼠來源的SP細(xì)胞注射C57BL/6小鼠后2個(gè)月分布
在小腸的隱窩-絨毛部位。圖5B中箭頭所指為LacZ來源的細(xì)胞分布的區(qū)域。 三、SP細(xì)胞修復(fù)和減輕受致死量X射線照射引起的放射性小腸損傷 小腸是對放射線高度敏感的器官之一。本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物模型受到致死量照射的條
件下，通過黏膜下注射移植SP細(xì)胞，研究不同照射劑量分組之間的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
顯示SP細(xì)胞是能修復(fù)放射損傷腸組織的干細(xì)胞群體。具體實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如
下
按照上述步驟二的方法建立C57BL/6小鼠全腹腔照射模型，除照射的總吸收劑 量為14Gy (致死劑量)夕卜，其它處理方法同前。共照射29只C57/BL6小鼠，其中實(shí) 驗(yàn)組15只，對照組14只。
實(shí)驗(yàn)組照射后12小時(shí)，每只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠的小腸黏膜下注 射R0SA26小鼠SP細(xì)胞，具體方法如下小鼠麻醉后取仰臥位，使用75%的酒精消 毒后，取腹部正中切口 0.5cin，逐層進(jìn)腹。將屈式韌帶下至回盲部的所有小腸托出 體外。顯微鏡下使用顯微注射針取小腸中段其中任意一點(diǎn)的位置一次性將懸浮于 200ul生理鹽水中的2X10S個(gè)細(xì)胞注射在小腸粘膜下疏松結(jié)締組織內(nèi)。
對照組照射后12小時(shí)，每只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠小腸黏膜下注射 同體積的生理鹽水。
照射后第l、 2、 3、 4天實(shí)驗(yàn)組和對照組各取一只小鼠的小腸進(jìn)行LacZ染色后制 作切片和HE染色。小腸HE染色結(jié)果表明照射后第一天，實(shí)驗(yàn)組和對照組之間沒有觀 察到明顯變化(圖6A， Al)。照射后第二天，實(shí)驗(yàn)組小腸隱窩生長良好(圖6B1)， 與實(shí)驗(yàn)組比較，對照組隱窩的發(fā)育和生長較差(圖6B)。照射后第三天，實(shí)驗(yàn)組小 腸雖然后出現(xiàn)特征性的"鳥眼樣"損傷細(xì)胞，但同時(shí)以"實(shí)心團(tuán)狀或小腺體樣"， 細(xì)胞排列緊密，胞漿嗜堿性、多分裂象為特征的發(fā)育良好的隱窩數(shù)量仍然較多(圖 6C1)。對照組小腸中隱窩數(shù)量明顯減少，殘存的隱窩基本呈"鳥眼樣"狀態(tài)(圖 6C)。照射后第四天，實(shí)驗(yàn)組小腸呈蓬勃生長的狀態(tài)，小腸黏膜面絨毛覆蓋完整嚴(yán) 密，隱窩部位無"鳥眼樣細(xì)胞"或"透明樣細(xì)胞"出現(xiàn)(圖6D1)。對照組小腸黏 膜面絨毛基本消失，黏膜下殘存的隱窩基本呈透明樣，無生長良好的隱窩存在(圖 6D)。
LacZ染色結(jié)果如圖7所示，第1天，黏膜下注射的SP細(xì)胞散狀分布在小腸黏膜下 固有層內(nèi)，小腸的隱窩以及小腸的絨毛上沒有分布(圖7A)。第2天，注射的SP細(xì) 胞開始?xì)w巢(homing)到小腸隱窩位置，小腸黏膜下固有層內(nèi)仍有散狀分布(圖7B)。
第3天，注射的SP細(xì)胞基本均歸巢到小腸隱窩位置并開始向絨毛分化(圖7C)。第4 天，注射的SP細(xì)胞在隱窩以及小腸絨毛上均有分布和分化(圖7D)。圖7中，A、 B、 C、 D分別為實(shí)驗(yàn)組在照射后第l、 2、 3、 4天的LacZ染色的照片，綠色表示R0SA26 小鼠SP細(xì)胞。
對實(shí)驗(yàn)組照射后第4天的小腸進(jìn)行LacZ染色，按照文獻(xiàn)(易家農(nóng)，主編，組織 學(xué)和組織學(xué)技術(shù)[M].長沙湖南醫(yī)學(xué)院，1986年版)的方法進(jìn)行杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì) 胞、內(nèi)分泌細(xì)胞的特殊組織化學(xué)染色，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組照射后第4天，供者來源的 細(xì)胞(R0SA26小鼠SP細(xì)胞)能夠分化成小腸黏膜的成熟上皮細(xì)胞，如吸收細(xì)胞、內(nèi) 分泌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞及潘氏細(xì)胞(圖8)。圖8中，A、 B、 C為試驗(yàn)組小腸的LacZ染 色，Al、 Bl、 Cl分別為與A、 B、 C對應(yīng)的杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞的特 殊組織化學(xué)染色。綠色為LacZ染色陽性，蘭色為杯狀細(xì)胞染色陽性，紅色為潘氏 細(xì)胞染色陽性，紅棕色為內(nèi)分泌細(xì)胞染色陽性。
四、 小腸SP細(xì)胞移植顯著提高照射損傷動(dòng)物模型的生存率 對步驟三中的實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠從接受照射當(dāng)天開始進(jìn)行存活觀察，結(jié)果如
圖9所示，表明實(shí)驗(yàn)組有3只小鼠術(shù)后存活超過30天；對照組在一周內(nèi)全部死亡。
五、 小腸SP細(xì)胞移植后在受體內(nèi)的長期存活，SP細(xì)胞移植減輕小腸纖維化損傷 選用C57BL/6小鼠共8只，按照上述步驟二的方法建立C57BL/6小鼠全腹腔照
射模型(總吸收劑量10Gy)。
實(shí)驗(yàn)組照射后12小時(shí)，4只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠的小腸黏膜下注射 R0SA26小鼠SP細(xì)胞，具體方法如下小鼠麻醉后取仰臥位，使用75%的酒精消毒 后，取腹部正中切口0.5cra，逐層進(jìn)腹。將屈式韌帶下至回盲部的所有小腸托出體 外。顯微鏡下使用顯微注射針取小腸中段其中任意一點(diǎn)的位置一次性將懸浮于 200ul生理鹽水中的2X1()5個(gè)細(xì)胞注射在小腸粘膜下疏松結(jié)締組織內(nèi)。
對照組照射后12小時(shí)，4只全腹腔照射模型C57BL/6小鼠小腸黏膜下注射同 體積的生理鹽水。
在照射后6個(gè)月取小腸進(jìn)行LacZ染色，服染色，按照文獻(xiàn)(易家農(nóng)，主編，組 織學(xué)和組織學(xué)技術(shù)[M].長沙湖南醫(yī)學(xué)院，1986年版)的方法進(jìn)行杯狀細(xì)胞、潘氏 細(xì)胞的特殊組織化學(xué)染色，使用福建邁新公司的Masson三色試劑盒進(jìn)行Masson三 色特殊細(xì)胞染色。其中，Masson三色特殊細(xì)胞染色的結(jié)果判定如下膠原纖維、黏 液、軟骨、神經(jīng)細(xì)胞呈蘭色，肌肉、彈力纖維呈紅色。神經(jīng)軸索呈粉紅色。纖維素
呈紫紅色。紅細(xì)胞呈橘紅色。
結(jié)果表明R0SA26小鼠SP細(xì)胞在小鼠接受10Gy照射后6個(gè)月的腸管中依然能夠存 在，且通過染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能夠分布在小腸的絨毛-隱窩位置(圖10B)，但是主要 分布在小腸隱窩的基底部相當(dāng)于潘氏細(xì)胞的位置上(圖10A)。
潘氏細(xì)胞特殊染色表明實(shí)驗(yàn)組小腸的潘氏細(xì)胞正常存在，而對照組小腸中潘 氏細(xì)胞的特征性嗜酸性顆粒出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象。即使在實(shí)驗(yàn)組小腸中腸管增粗部位的 潘氏細(xì)胞亦出現(xiàn)特征性嗜酸性顆粒丟失現(xiàn)象(圖11C、 D)。在步驟三的致死量照射 組中，實(shí)驗(yàn)組和對照組在照射后第三天的潘氏細(xì)胞特殊染色出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象(圖 IIA、 B)。該現(xiàn)象提示放射性腸損傷中潘氏細(xì)胞的顆粒丟失現(xiàn)象與放射后腸管增粗 及纖維化可能存在某種聯(lián)系。
結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組小腸絕大部分腸段黏膜下層的膠原纖維、肌纖維、彈力纖維的 密度和分布與正常小腸組織基本一致，顯示已經(jīng)基本恢復(fù)正常。對照組小腸的黏膜 下層的膠原纖維的密度、厚度顯著增加，肌纖維的密度和厚度有所增加，彈力纖維 的厚度增加不明顯。在實(shí)驗(yàn)組小腸少量增厚的腸段中其對應(yīng)的黏膜下的膠原纖維的 密度和厚度與對照組一樣顯著增加，同樣肌纖維的厚度和密度也同時(shí)顯著增加(圖 IIE、 F)。
綜上所述，在小腸受到一定劑量照射后及時(shí)移植小腸SP細(xì)胞能夠有效避免和 減少小腸的潘氏細(xì)胞的丟失顆粒的異?，F(xiàn)象，從而避免和減輕放射后小腸纖維化現(xiàn) 象的出現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.小腸SP細(xì)胞在制備治療腸損傷藥物中的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述小腸SP細(xì)胞懸浮于生理鹽 水中作為治療放射性腸炎損傷的藥物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述小腸SP細(xì)胞為小腸黏 膜SP細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述腸損傷為腸炎損傷。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述腸損傷為小腸腸炎損傷。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述腸損傷為放射性腸損傷。
全文摘要
本發(fā)明公開了小腸SP細(xì)胞的一種新用途。該新用途是小腸SP細(xì)胞在制備治療腸損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明將小腸SP細(xì)胞原位移植給全腹腔照射模型的小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SP細(xì)胞能夠歸巢到小腸隱窩修復(fù)損傷，還可延長受致死量照射動(dòng)物模型的存活時(shí)間，明顯改善放射性腸炎的慢性纖維化，對放射性小腸損傷取得了良好的修復(fù)效果。本發(fā)明為小腸損傷疾病的臨床治療提供了一種創(chuàng)新并且簡便的方法和途徑。本發(fā)明為將來尋找小腸黏膜干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物打下了基礎(chǔ)。
文檔編號A61P1/00GK101371853SQ20071014207
公開日2009年2月25日 申請日期2007年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月22日
發(fā)明者何東南, 趙春華, 欽 韓, 黎介壽 申請人:何東南;韓 欽;黎介壽;趙春華