專利名稱：：抑制腫瘤和白血病細胞VEGF表達和增殖的siRNA及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為抑制VEGF蛋白表達和增殖的siRNA序列及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：RNAi是雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)，在此情況下啟動子是活躍的，靶基因能被轉(zhuǎn)錄，但不能正常積累mRNA。各種體內(nèi)外實驗證實21-23個nt的短雙鏈RNA,即siRNA(shortinterferenceRNA，siRNA)，可在哺乳動物細胞組織內(nèi)引起基因封閉作用，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無須象反義核苷酸那樣進行廣泛的化學(xué)修飾以提高其半衰期，并能在低于反義核苷酸幾個數(shù)量級的濃度下，使靶基因降至極低水平甚至完全"敲除"，從而產(chǎn)生缺失突變表型。siRNA的干預(yù)效應(yīng)關(guān)鍵取決于其靶基因序列的選擇，任一nt的錯誤均會導(dǎo)致RNAi效應(yīng)的喪失，這種高度序列特異性使其對點突變、序列插入和缺失的選擇性基因靜寂有很重要的藥理作用。已證明，siRNA技術(shù)可單獨或與其它現(xiàn)有的治療手段一同用于突變所致的疾病，如病毒感染、脊髓延髓肌肉萎縮癥(SBMA)，還可用于治療腫瘤。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通過促進內(nèi)皮細胞的增殖、生存和遷移而刺激血管的生成，在胚胎生成、骨骼的生長以及生殖活動中是一種生理性血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在各種腫瘤和白血病細胞中，都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF表達上調(diào)，而且它與腫瘤和白血病的進展和預(yù)后差密切相關(guān)。肝癌作為實體瘤，其發(fā)生、發(fā)展與腫瘤血管生成有著密切的聯(lián)系。VEGF在肝癌中高表達，與肝癌的分期、分級以及預(yù)后密切相關(guān)。將VEGF作為RNA干擾的靶標，利用VEGFsiRNA阻斷VEGF及其受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而阻斷VEGF促血管形成，達到抑制肝癌細胞增殖的目的。因此，通過干擾VEGFmRNA，阻斷血管形成，抑制腫瘤的生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為腫瘤治療的一種新策略。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供能在細胞和蛋白水平上抑制肝癌和白血病細胞株VEGF表達的siRNA以及提供該siRNA在制藥中的應(yīng)用。為達上述目的，發(fā)明人采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA序列，通過實驗篩選以下9條高效VEGFsiRNA序列(見表l):<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述任一條VEGFsiRNA可用于制備抗腫瘤、抗肝癌或抗白血病的藥物。RNA干擾技術(shù)是將一段雙鏈的siRNA導(dǎo)入細胞，使具有同源序列的基因表達受到抑制，是腫瘤基因治療的新領(lǐng)域。本發(fā)明的siRNA序列的長度均為19bp，這些siRNAs既足夠長誘導(dǎo)基因特異性抑制，又足夠短，逃避宿主干擾素反應(yīng)。本發(fā)明將上述針對VEGFmRNA編碼區(qū)不同位置的9條VEGFsiRNA序列分另導(dǎo)入肝癌7721細胞和白血病細胞HL60，結(jié)果顯示肝癌細胞和白血病細胞的增殖受到抑制，同時VEGF蛋白的表達量降低。雖然針對同一靶基因，但位置不同，效果不同。本發(fā)明從細胞的增殖和靶基因蛋白的表達得到的結(jié)果是一致的。9條VEGFsiRNA序列均能抑制肝癌細胞和白血病細胞的生長和增殖，以VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6和VEGFsiRNA9的效果好，且均優(yōu)于反義寡核苷酸對照組。ELISA法檢測，與空白對照組相比，VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9組細胞VEGF蛋白的表達水平明顯地降低，VEGFsiRNA2和VEGFsiRNA7抑制靶基因表達的效果最好?？梢?，RNA干擾在腫瘤和白血病的基因治療方面的效果優(yōu)于與反義技術(shù)。VEGFsiRNA因其序列的特異性，可以特異地降解VEGFmRNA，從而降低VEGF蛋白的表達水平；VEGFsiRNA具有雙鏈結(jié)構(gòu)，比反義寡核苷酸更易抵御細胞內(nèi)核酶的降解；VEGFsiRNA不需要化學(xué)修飾，可以避免反義寡核苷酸全硫代修飾引起的細胞毒性。因此，VEGFsiRNA可成為腫瘤和白血病基因治療的重要工具。圖l是各實驗組分別作用于SMMC7721細胞后MTT法測得各組細胞的存活率比較圖。*表示有統(tǒng)計學(xué)意義。圖2是各實驗組分別作用于SMMC7721細胞后CCK8法測得各組細胞的存活率比較圖。*表示有統(tǒng)計學(xué)意義。圖3是各實驗組分別作用于SMMC7721細胞后ELISA法測得各組細胞VEGF蛋白表達水平比較圖。*表示有統(tǒng)計學(xué)意義。圖4是各實驗組分別作用于HL60細胞后MTT法測得各組細胞的存活率比較圖。具體實施方式實施例一VEGFsiRNA的設(shè)計與合成。從Genbank獲得VEGFmRNA全序列，采用以下原則設(shè)計siRNA序列-①在mRNA的起始密碼子AUG的下游50100nt處開始設(shè)計；②以AA(N19)為模式；③G/C的百分比為30%~70%;④一行中不要有4個以上的A或T;⑤一行中不要有4個及以上的G;⑥一行中不要有7個連續(xù)的GC鏈延伸；⑦完成序列比對(BLAST),以保證特異性；⑧結(jié)合RNAstructure3.7軟件，計算總自由能overallAG37。表2顯示，設(shè)計VEGFsiRNA序列9條，同時設(shè)計反義寡核苷酸對照(中國專利申請?zhí)?3139788.3)，陽性對照(針對GAPDH基因)。siRNA模板和反義藥物(全硫代修飾)由上海生工生物工程有限公司合成，使用Ambion公司的siRNA構(gòu)建試劑盒合成VEGFsiRNA。表2設(shè)計的VEGFsiRNA及反義對照、陽性對照<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例二MTT法分析各實驗組對SMMC7721細胞增殖的抑制效果。人的肝癌SMMC7721細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度為100U/毫升)，置于37"C、含5%002溫箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。取對數(shù)生長期的SMMC7721細胞，配制2.0xlO"mL起始濃度細胞，每孔加100ML到96孔培養(yǎng)板內(nèi)(Coming,美國)，設(shè)空白對照組、脂質(zhì)體對照組(Invitrogen公司)、陽性對照組(針對GAPDH基因)、反義組(25nmol/L)及siRNAl-9組(25nmol/L)。每組5孔，接種24h后棄去上清，轉(zhuǎn)染siRNA1-9和對照組，置37。C，飽和濕度，5%C02培養(yǎng)箱中無血清繼續(xù)培養(yǎng)4h，再各補加無雙抗含10%胎牛血清的1640lOOpL,72h后加入MTT20^iL/孔，孵箱內(nèi)孵育4h后棄上清，加入DMSO150^L/孔，在570nm的波長的酶標儀下檢測各組的吸光度。MTT實驗中通過方差分析發(fā)現(xiàn)各個組別之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.21，PO.Ol)。VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9組與空白對照組之間均有顯著差異，其中VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA9對細胞增殖的抑制效果均好于反義藥物組。結(jié)果見圖1和表3。表3MTT法分析各實驗組對SMMC7721細胞增殖的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>與空白對照組相比，承表示P0.05，**表示？<0.01與反義藥物組相比，A表示P0.05，AA表示P0.01實施例三CCk8法檢測各實驗組siRNA抑制肝癌SMMC7721細胞增殖的效果。人的肝癌SMMC7721細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度為100U/毫升)，置于37。C、含5%032溫箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。取對數(shù)生長期的7721細胞，配制1.0xl()S/mL起始濃度細胞，接種96孔板，每孔100ul，置37。C，飽和濕度，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于72h每孔加入10ul的CCK8試劑，然后把培養(yǎng)板放在C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2小時，在450nm波長處測定吸光度，參考波長為655nm。細胞存活率=實驗組吸光度/對照組吸光度xlOOQ/。。使用CCK8試劑盒測定各個藥物組別。經(jīng)過方差分析，各個實驗組之間有統(tǒng)計學(xué)差異(F-17.46,PO.Ol)，VEGFsiRNAlVEGFsiRNA9組與空白對照組之間均有顯著差異(P<0.01);兩兩比較分析發(fā)現(xiàn)VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFs麵A9的效果均好于反義藥物組，而VEGFsiRNAl、VEGFsiRNA3、VEGFsiRNA5與反義藥物組沒有差異。結(jié)果見圖2和表4。表4CCK8法分析各實驗組對SMMC7721細胞增殖的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與空白對照組相比，承表示P0.05，w表示PO.Ol與反義藥物組相比，A表示P0.05，AA表示PO.Ol實施例四VEGFsiRNA抑制肝癌SMMC7721細胞VEGF蛋白表達的測定。人的肝癌SMMC7721細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度為100U/毫升)，置于37'C、含5。/。C02溫箱孵育，用0.25%的胰蛋白酶消化。將對數(shù)生長期的SMMC7721細胞接種96孔板，每孔100ul，置37。C，飽和濕度，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。SiRNAl-9組和反義寡核苷酸藥物組按25nm分別轉(zhuǎn)染細胞，72h后離心收取上清夜，VEGF蛋白測定按人VEGFELISA試劑盒說明書操作(晶美生物工程有限公司)，加入終止液混勻后即刻用酶標儀(BIO-RID公司)測定OD45。值，標準品和樣品孔的OD值減去空白孔的OD值。以標準品的OD值為縱坐標，標準品的濃度(pg/ml)為橫坐標，繪制標準曲線并求出標準曲線方程。通過樣品的OD值在標準曲線方程內(nèi)求出樣品VEGF濃度。結(jié)果見圖3和表5。表5ELISA法分析各實驗組的細胞VEGF蛋白的表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與空白對照組相比，*表示？<0.05，m表示PO.OI與反義藥物組相比，A表示P〈0.05，AA表示P〈0.01實施例五CCK8法檢測各實驗組siRNA抑制白血病HL60細胞增殖的效果。分別用25nM,50nM,100nM的VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7和反義藥物組作用HL60細胞，結(jié)果轉(zhuǎn)染24小時，采用嵌套設(shè)計資料的方差分析發(fā)現(xiàn)，同一藥物的不同濃度之間無統(tǒng)計學(xué)差異，而不同組別之間差異顯著(F=4.231，P=0.016)，其中VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7與空白對照組有差異，而反義藥物組與空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見圖4和表6。表6轉(zhuǎn)染藥物24小時后的細胞生長狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例六VEGFsiRNA在制備抗肝癌和白血病藥物中的應(yīng)用。取實施例一合成的VEGFsiRNAl9中任一條序列，配制成濃度為25nmo1/1的抗肝癌或抗白血病藥品，臨床上可以通過靜脈注射或者直接將siRNA藥物直接注射到瘤體內(nèi)進行治療。實施例七VEGFsiRNA在制備抗肝癌和白血病藥物中的應(yīng)用。取實施例一合成的VEGFsiRNA2和VEGFsiRNA7，混合配制成濃度為25nmol/l的抗肝癌或抗白血病藥品，臨床上可以通過靜脈注射或者直接將siRNA藥物直接注射到瘤體內(nèi)進行治療。SEQUENCELISTING<110>暨南大學(xué)<120>抑制腫瘤和白血病細胞VEGF表達和增殖的siRNA及應(yīng)用<130>1<160>18<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNAl序列正義鏈<400>1ucaucacgaaguggugaaguu21<210>2<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNAl序列反義鏈<400>2uuaguagugcuucaccacuuc21<210>3<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA2序列正義鏈<400>3ugcagaccaaagaaagauauu21<210>4<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA2序列反義鏈<400>4uuacgucugguuucuuucuau21<210>5<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA3序列正義鏈<400>5gauccgcagacguguaaauuu21<210>6<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA3序列反義鏈<400>6uucuaggcgucugcacauuua21<210>7<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA4序列正義鏈<400>7ggccagcacauaggagagauu21<210>8<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA4序列反義鏈<400>8uuccggucguguauccucucu21<210>9<211〉21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA5序列正義鏈<400>9ggcgaggcagcuugaguuauu21<210>10<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA5序列反義鏈<400>10uuccgcuccgucgaacucaau21<210>11<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA6序列正義鏈<400>11cguacuugcagaugugacauu21<210>12<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA6序列反義鏈<400>12uugcaugaacgucuacacugu21<210>13<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA7序列正義鏈<400>13gauagagcaagacaagaaauu21<210>14<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA7序列反義鏈<400>14uucuaucucguucuguucuuu21<210>15<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA8序列正義鏈<400>15cgaacguacuugcagauguuu21<210>16<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA8序列反義鏈<400>16uugcuugcaugaacgucuaca21<210>17<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA9序列正義鏈<400>17ucaguucgaggaaagggaauu21<210>18<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>采用siRNA設(shè)計法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計VEGFsiRNA9序列反義鏈<400>18uuagucaagcuccuuucccuu2權(quán)利要求1、一種抑制腫瘤和白血病細胞VEGF表達和增殖的siRNA，其特征在于所述siRNA序列如下VEGFsiRNA2正義鏈UGCAGACCAAAGAAAGAUAUU，反義鏈UUACGUCUGGUUUCUUUCUAU。2、權(quán)利要求l所述的siRNA序列用于制備抗腫瘤的藥物。3、權(quán)利要求l所述的siRNA序列用于制備抗肝癌的藥物。4、權(quán)利要求l所述的siRNA序列用于制備抗白血病的藥物。全文摘要本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為9條抑制VEGF蛋白表達的增殖的siRNA序列。經(jīng)過MTT和CCK8法檢測，9條VEGFsiRNA改變SMMC7721細胞的生物學(xué)特性，抑制腫瘤和白血病細胞的生長和增殖，ELISA檢測9條VEGFsiRNA序列均可下調(diào)VEGF蛋白的表達。形態(tài)學(xué)觀察，VEGFsiRNA能引起腫瘤和白血病細胞發(fā)生形態(tài)變化。因此，VEGFsiRNA可用于制備抗腫瘤和白血病的藥物。文檔編號A61P35/02GK101113444SQ20071013725公開日2008年1月30日申請日期2005年6月3日優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日發(fā)明者洹張,荊春霞申請人:暨南大學(xué)