專利名稱：子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型及模型建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型及模型建立方法。
背景技術(shù)：
子宮頸癌是人體最常見的腫瘤之一，不但在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中占首位，而且是女性各 種惡性腫瘤中最多見的腫瘤。我國(guó)宮頸癌死亡率占總癌癥死亡率的第四位，占女性癌的第二 位。子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intra印ithelial neoplasia, CIN)是與子宮頸浸潤(rùn)癌相 關(guān)的一組癌前病變，能反映子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的連續(xù)過(guò)程。CIN的病理特點(diǎn)是局限于子宮 頸鱗狀上皮層的瘤變，包括細(xì)胞排列異常及核異常。按其程度不同可分為非典型增生CINI 級(jí)、CINII級(jí)及C頂m級(jí)，分別為輕度、中度和重度(包括原位癌)。隨著CIN病變程度加重， 細(xì)胞DNA非整倍體和中心體復(fù)制增加。隨著分子生物學(xué)發(fā)展和臨床研究的深入，發(fā)現(xiàn)CIN并 非是簡(jiǎn)單的病理生理學(xué)發(fā)展過(guò)程，而是具有兩種不同的生物學(xué)行為。其一是由病毒引起的病 變，常自然消退，很少發(fā)展為浸潤(rùn)癌；另一種是多因素(包括病毒)誘發(fā)的病變，具有癌變潛 能，可能發(fā)展為浸潤(rùn)癌。免疫缺陷小鼠，可以克服異種間的免疫排斥反應(yīng)，接受人類正常和腫瘤組織移植，移植 后的組織仍保持原有的組織形態(tài)及生化特征，更接近人類疾病的病理變化。子宮頸上皮內(nèi)瘤變CINI 、 CINII、 CINIII三個(gè)病理級(jí)別反應(yīng)著子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的連續(xù) 過(guò)程，這一過(guò)程是可以被阻斷的，關(guān)鍵在于及時(shí)診斷和處理，顯然，建立相應(yīng)的動(dòng)物模型將 有利于探討子宮頸上皮內(nèi)瘤變向子宮頸癌轉(zhuǎn)化的機(jī)制。但是，迄今為止，沒有建立相關(guān)動(dòng)物 模型的報(bào)導(dǎo)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，提供一種子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型，并提供 該模型的建模方法，為研究子宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，逆轉(zhuǎn)子宮頸上皮內(nèi)瘤變向子宮頸癌轉(zhuǎn)化提 供了新的研究策略。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型的特點(diǎn)是將子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，埋植到免疫缺陷小鼠 體內(nèi)建立子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型。本發(fā)明子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型的特點(diǎn)也在于所述子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織包括CIN I 、 CINII和CINIII三個(gè)病理級(jí)別組織。
所述免疫缺陷小鼠包括N0D-SCID鼠和裸鼠。子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型建立方法的特點(diǎn)是按如下歩驟操作a、 取材子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織取自陰道鏡下活檢并經(jīng)病理確診的組織，所取組織置 入培養(yǎng)液無(wú)菌瓶，隨即置于冰盒；并送入動(dòng)物房接種；b、 取免疫缺陷小鼠，6-8周齡，性成熟，雌性；C、接種前處理所取組織用2 — 8'C磷酸緩沖鹽溶液洗去血塊和黏液，于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi) 剪成小塊，分裝在盛有培養(yǎng)液的無(wú)菌管內(nèi)為備用標(biāo)本；d、種植腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，消毒備皮，并做小口， 將已備標(biāo)本種植于皮下，無(wú)菌絲線縫合即成。本發(fā)明子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型模型建立方法的特點(diǎn)也在于在所述步驟a中，子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織包括CINI 、 CINII、 CINIII三個(gè)病理級(jí)別的組織。所述步驟b的培養(yǎng)液中含有100U / ml青霉素和100 U / ml鏈霉素。 子宮頸上皮內(nèi)瘤變分為三級(jí)CINI級(jí)即輕度不典型增生。上皮下1/3層細(xì)胞核增大， 核質(zhì)比例略增大，核染色稍加深，核分裂相少，細(xì)胞極性保存。CINII級(jí)即重度不典型增生。 上皮下1/3 2/3層細(xì)胞核明顯增大，核質(zhì)比例增大，核深染，核分裂相較多，細(xì)胞數(shù)量明 顯增多，細(xì)胞極性尚存。CINIII級(jí)即重度不典型增生和原位癌。病變細(xì)胞幾乎或全部占據(jù)上 皮全層，細(xì)胞核異常增大，核質(zhì)比例顯著增大，核型不規(guī)則，染色較深，核分裂相增多，細(xì) 胞擁擠，排列紊亂，無(wú)極性。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在1、 本發(fā)明中三種病理級(jí)別的子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織是來(lái)源于陰道鏡活檢確診的組織， 組織來(lái)源豐富，穩(wěn)定可靠。2、 免疫缺陷小鼠的機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織呈現(xiàn)免疫豁免狀態(tài)，由此導(dǎo) 致子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織容易異位種植，為造模提供了更好的理論依據(jù)。3、 可以通過(guò)對(duì)CINI、 CINII、 CINIII三種動(dòng)物模型轉(zhuǎn)歸的研究，探討子宮頸癌癌變的 機(jī)制。4、 本發(fā)明模型可以分別用于觀察CIN I動(dòng)物模型的病變組織轉(zhuǎn)化到CINII或者好轉(zhuǎn)的周 期，用于觀察CINII動(dòng)物模型的病變組織轉(zhuǎn)化到CIN I或者CINIII的周期，以及用于觀察CIN m動(dòng)物模型的小鼠的生存期和癌灶轉(zhuǎn)移周期，為逆轉(zhuǎn)CINI、 CINII病變組織的惡性轉(zhuǎn)化， 提供了可行的臨床動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。免疫缺陷小?如NOD-SCID、裸鼠等)可以克服異種間的免疫排斥反應(yīng)，接受人類腫
瘤組織的移植，移植后的組織仍保持原有的組織形態(tài)及生化特征，更接近人類疾病的病理變 化；此類小鼠遺傳背景明確，體內(nèi)微生物可控制，模型性狀顯著且穩(wěn)定，質(zhì)量和規(guī)格可選擇，價(jià)格適中，來(lái)源豐富；本發(fā)明模型建立成功率高，模型性狀顯著且穩(wěn)定，觀察周期短，實(shí)驗(yàn) 結(jié)果具有較大的臨床參考意義。


圖1為CIN I級(jí)動(dòng)物模型的子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，光鏡下HE染色圖(X 200)。 圖2為CINII級(jí)動(dòng)物模型的子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，光鏡下HE染色圖(X 200)。 圖3為CINIII級(jí)動(dòng)物模型的子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，光鏡下HE染色圖(X 200)。 以下通過(guò)具體實(shí)施方式
，并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
具體實(shí)施方式
本實(shí)施例中子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型是將子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，包括CINI、 CINII、 CINIII，分別埋植到非肥胖性糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷N0D-SCID小鼠體內(nèi)建立子宮頸上皮內(nèi) 瘤變模型。模型的建立按如下步驟在常溫下進(jìn)行操作 取材子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINI、 CINII、 CINIII)組織分別取自陰道鏡下活檢并經(jīng)病理確診 的組織，所取組織置入5毫升RPMI1640培養(yǎng)液無(wú)菌瓶，隨即置于冰盒；具體實(shí)施中，PMRI1640 培養(yǎng)液中可含有100U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素，用于預(yù)防小鼠感染。K動(dòng)物取NOD-SCID， 6-8周齡，性成熟，雌性。2、 接種前處理所取蛻膜用磷酸緩沖鹽溶液洗去血塊和黏液，于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)剪成1 X 2毫米小塊， 分裝在盛有RPMI1640培養(yǎng)液的無(wú)菌管內(nèi)為備用標(biāo)本。3、 種植以氯胺酮100毫克/千克腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，將已備標(biāo) 本種植于皮下。具體實(shí)施中，可以是對(duì)其背部進(jìn)行消毒備皮，并在兩側(cè)各做一只0. 5厘米長(zhǎng) 小口，將己備標(biāo)本種植于皮下，無(wú)菌絲線縫合即成，皮下種植更有利于觀察。分組16只NOD-SCID鼠分4組。實(shí)驗(yàn)鼠12只A組為4只小鼠，種植CIN I級(jí)病變組 織；B組為4只小鼠，種植CINII級(jí)病變組織；C組4只小鼠，種植CIW11級(jí)病變組織；D 組(對(duì)照組)4只小鼠，為不作任何處理的空白對(duì)照。移植后處理分別在移植后8周、16周、32周、48周，取出背部皮下病灶，10%福爾
馬林固定，乙醇逐級(jí)脫水，常規(guī)石蠟包埋，做HE染色。 結(jié)果1、 NOD-SCID鼠存活及生長(zhǎng)情況 16只均存活，可以排除飼養(yǎng)條件引起的感染。2、 于8周從實(shí)驗(yàn)鼠皮下取出移植物經(jīng)HE染色，有11只小鼠皮下兩側(cè)均見到子宮內(nèi)膜 的腺體和間質(zhì)，成功率為91. 67% 。3、 移植物病理第8周從小鼠背部皮下取出病灶，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組中有3 只為CIN I級(jí)(圖1)，種植成功率為75%; B組均為CINII級(jí)(圖2)，成功率為100%; C 組分別為CINIII級(jí)(圖3)，成功率為100%。
權(quán)利要求
1、一種子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型，其特征是將子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，埋植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型，其特征是所述子宮頸上皮內(nèi)瘤變組 織包括CIN I 、 CINII和CINIII三個(gè)病理級(jí)別組織。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型，其特征是所述免疫缺陷小鼠包括 N0D-SCID鼠和裸鼠。
4、 一種權(quán)利要求l所述模型的建立方法，其特征是按如下步驟操作a、 取材子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織取自陰道鏡下活檢并經(jīng)病理確診的組織，所取組織置 入培養(yǎng)液無(wú)菌瓶，隨即置于冰盒；并送入動(dòng)物房接種；b、 取免疫缺陷小鼠，6-8周齡，性成熟，雌性；c、 接種前處理所取組織用2 — 8'C磷酸緩沖鹽溶液洗去血塊和黏液，于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi) 剪成小塊，分裝在盛有培養(yǎng)液的無(wú)菌管內(nèi)為備用標(biāo)本；d、 種植腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，消毒備皮，并做小口， 將已備標(biāo)本種植于皮下，無(wú)菌絲線縫合即成。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述模型的建立方法，其特征是在所述步驟a中，所述子宮頸上皮 內(nèi)瘤變組織包括CINI、 CINII、 CINIII三個(gè)病理級(jí)別的組織。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述模型的建立方法，其特征是所述歩驟b的培養(yǎng)液中含有100U / ml青霉素和100 U / ml鏈霉素。
全文摘要
子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型及模型建立方法，其特征是將子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，埋植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立子宮頸上皮內(nèi)瘤變模型。建模方法的特征是子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織分別取自陰道鏡下活檢并經(jīng)病理科確診的組織，接種在小鼠背部皮下；本發(fā)明免疫缺陷小鼠可以克服異種間的免疫排斥反應(yīng)，接受人類腫瘤組織的移植，移植后的組織模型性狀顯著且穩(wěn)定，觀察周期短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的具有較大的臨床參考意義?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)CIN I、CIN II、CIN III動(dòng)物模型的轉(zhuǎn)歸，病理過(guò)程探討子宮頸癌癌變的機(jī)制。并且觀察動(dòng)物模型的子宮頸上皮內(nèi)瘤變組織轉(zhuǎn)歸的周期，為逆轉(zhuǎn)CIN I、CIN II病變組織的惡性轉(zhuǎn)化提供了可行的臨床動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 文檔編號(hào)A61B19/00GK101125102SQ20071013253
公開日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2007年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月19日
發(fā)明者馮定慶, 斌 凌, 穎 周, 朱園園, 敏 李, 沈國(guó)棟, 趙衛(wèi)東, 高宗俠 申請(qǐng)人:安徽省立醫(yī)院