專利名稱：：用滅活的或非感染性的細菌制備物控制腸道炎癥綜合征的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及滅活的或非感染性的革蘭氏陽性菌例如革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌如分枝桿菌的制備物用于治療腸道炎癥綜合征的用途。
背景技術(shù)：
：克隆病是一種見于兒童、青少年和成人的疾病，其可以是嚴重的疾病并且需要特殊的長期治療，其發(fā)病率逐年增加。潰瘍性結(jié)腸炎也是一種炎性腸病(IBD),它是一種未知病因的、影響年輕對象的致殘性疾病。這兩種病的累計發(fā)病率為每10萬人10到200人，不同國家有所不同。這些病變的發(fā)生可能涉及到近期的飲食改變和細菌菌群失調(diào)，但是沒有報道準確的結(jié)果。對于克隆病而言，鳥型分枝桿菌屬的類結(jié)核菌亞種sub.sp./anaft^en^/ow's)的細菌已經(jīng)被認為是克隆病的病因，其部分原因在于克隆病與Johne病相似，Johne病是一種影響牛的疾病，其在最初感染的數(shù)年后發(fā)病。最近，還提出了大腸桿菌黏附素(adhesin)、鞭毛蛋白或菌毛也涉及到疾病的病理過程。特發(fā)性炎性腸病(IBD)包括一組未知病因的胃腸道疾病，表現(xiàn)為腸道炎癥和與局部和全身并發(fā)癥相關(guān)的慢性復(fù)發(fā)性病程。IBD的發(fā)病機制仍不清楚，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病變和癥狀與促炎性細胞因子的過量產(chǎn)生相關(guān)。IBD包括兩大類潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克隆病以及這些疾病的中間變體，即表現(xiàn)出兩種主要形式的重疊特征的未定型結(jié)腸炎。這些炎性腸病都涉及到免疫應(yīng)答。表現(xiàn)為連續(xù)進展以及長期緩解的臨床譜提出了自身免疫機制參與其中的可能性，但是還不知道這是疾病的病因還是結(jié)果？特別是抗TNF-a帶來的積極治療也強調(diào)了涉及這些疾病的廣義上的免疫學機制，盡管仍然沒有提供任何準確的啟動機制。不同的小鼠試驗?zāi)Ｐ筒糠衷佻F(xiàn)了人類疾病。顯示出菌群參與了疾病。與具有常規(guī)菌群的小鼠不同的是，維持在無菌詞喂條件下的小鼠沒有發(fā)生炎性綜合征。一些大鼠或小鼠的炎性腸病(IBD)模型涉及局部地沉積于結(jié)腸內(nèi)的酚衍生物(TNBS)或數(shù)日攝入飲用水中的葡聚糖硫酸鈉(DSS)所引起的局部致敏作用。調(diào)節(jié)性T淋巴細胞已經(jīng)被認為是在IBD模型中發(fā)揮著作用。炎性腸病綜合征是致殘性的慢性病變，其可以是致命性的，因為它們可能帶來腸梗阻和需要反復(fù)手術(shù)處理。這些炎性綜合征的藥物治療主要依據(jù)于使用強的抗炎性藥、糖皮質(zhì)激素、抗有絲分裂藥和最近的抗TNF劑。任何造成所施用的抗炎性藥劑量的降低或者可以取代這些抗炎性藥的治療都是重要的。在分析可能控制小鼠的試驗性哮喘機制的過程中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了CD4+CD25+調(diào)節(jié)細胞。所分泌的IL-10反過來保證了抗炎癥活性的重要部分。在給那些經(jīng)深度凍干(Extendedfreeze2rying，EFD)滅活的牛分枝桿菌BCG處理過的動物的肺部施用過敏原后，炎性細胞數(shù)目的出現(xiàn)大量減少，這促使本發(fā)明人去確定EFD在其他己知其中具有免疫過敏或自身免疫現(xiàn)象的綜合征中的最終活性。在再現(xiàn)類風濕關(guān)節(jié)炎的模型中，也報道了CD4+T淋巴細胞參與其中，CD4+CD25+T淋巴細胞的存在或轉(zhuǎn)移可以終止疾病。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供腸道炎性綜合征例如炎性腸病(IBD)的治療方法。本發(fā)明的另一個目的是提供不需要抗炎藥物的或減少所需的抗炎藥物劑量的IBD治療方法。因此，本發(fā)明提供了革蘭氏陽性菌制備物用于預(yù)防和治療腸道炎性綜合征的用途，所述制備物的特點是革蘭氏陽性細菌是滅活的或非感染性的，并且含有50%以上，優(yōu)選地是90%以上的天然結(jié)構(gòu)的細菌蛋白組分。本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或治療因Thl/Th2失衡引起的疾病的方法，所述方法包括步驟a.提供滅活的或非感染性的革蘭氏陽性菌制備物或其保留了抑制腸道炎性綜合征的能力的部分；和b.給患有所述疾病的患者施用有效量的滅活的革蘭氏陽性細菌制備物或其部分。本發(fā)明仍提供了用于預(yù)防或治療腸道炎性綜合征的方法，所述方法包括給患者施用革蘭氏陽性細菌制備物的步驟，由此刺激產(chǎn)生白細胞調(diào)節(jié)細胞。本發(fā)明還提供了用于治療和/或預(yù)防腸道炎性腸病的組合物，其包含經(jīng)以下步驟制備的革蘭氏陽性細菌組合物a)收集活細菌細胞的培養(yǎng)物；b)在水中或鹽例如硼酸鹽的水溶液中洗滌細菌細胞；c)冷凍水中或鹽例如硼酸鹽的水溶液中的細菌細胞；d)通過在凍干機中將所述細菌細胞干燥來滅活冷凍的細菌細胞，干燥的時間足以去除至少98.5%的水，優(yōu)選地去除至少99%，更優(yōu)選地去除至少99.5%的水；和e)收集深度凍干的細菌細胞。圖1顯示了在向飲用水中加入2，/。DSS7天后(C57Bl/6雄性小鼠)體重和肛門炎癥的變化。圖2顯示了在接受含DSS的飲用水的小鼠和對照(非DSS飼喂)的小鼠之間的結(jié)腸長度的差異。試驗?zāi)Ｐ徒邮芎?.5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)的飲用水7天的C57Bl/6雄性小鼠。在開始DSS飼喂后第IO天收集結(jié)腸。圖3顯示了在經(jīng)EFD處理過的和未處理過的小鼠之間的結(jié)腸長度的差異。小鼠在7天內(nèi)接受含DSS的飲用水。一組小鼠經(jīng)過EFD處理在飼喂DSS前第21天皮下給予IOO嗎；或者在飼喂DSS之前第21、20、17和16天口服lmg。在開始DSS飼喂后的第IO天收集結(jié)腸。圖4顯示了對照組(無EFD處理和無DSS飼喂)、EFD處理小鼠(DSS飼喂)和未處理小鼠(DSS飼喂)之間的結(jié)腸長度的差異。EFD處理過的小鼠的結(jié)腸與那些對照小鼠的結(jié)腸相似。測量盲腸與肛門之間的結(jié)腸長度。圖5顯示了EFD處理對炎性腸病的預(yù)防作用。EFD處理小鼠的結(jié)腸與對照小鼠(無EFD和無DSS處理)的結(jié)腸相似p"表示經(jīng)ANOVA統(tǒng)計學檢驗p<0.001)。在第8天或第10天，即在結(jié)束DSS飼喂后的第1或3天，測量結(jié)腸的長度。圖6顯示了EFD處理對炎性腸病的預(yù)防作用。EFD處理小鼠沒有發(fā)生嚴重的腹瀉或沒有腹瀉，而對照組(DSS處理過的小鼠)則發(fā)生了。圖7顯示了對照(無DSS飼喂和無EFD處理)小鼠的結(jié)腸的組織學切片。圖8顯示了圖7的照片的一部分的放大圖。圖9顯示了經(jīng)DSS飼喂的小鼠的結(jié)腸的組織學切片。圖10顯示了圖9的照片的一部分的放大圖。圖11顯示了在DSS飼喂前經(jīng)EFD處理過的小鼠的結(jié)腸的組織學切片。圖12顯示了圖11的照片的一部分的放大圖。圖13a顯示了對照小鼠的結(jié)腸的組織學切片。圖13b顯示了經(jīng)DSS飼喂過的小鼠的結(jié)腸的組織學切片。圖13c顯示了在DSS之前經(jīng)EFD處理過的小鼠的結(jié)腸的組織學切片。圖14a、b和c分別是圖13a、b和c的放大圖。圖15顯示了TNBS的初步試驗。在第-5和0天，C57Bl/6雄性小鼠在結(jié)腸部位局部接受TNBS(lmg溶于lOOpl50%乙醇)兩次或未接受TNBS。觀察它們的大便10天。在第10天，稱量小鼠。一組小鼠在第一次施用TNBS前5天(即第-10天)時接受皮下注射的IOO昭EFD5天。第二組接受PBS。對照組沒有接受TNBS，也沒有接受EFD。圖中顯示出了以克為單位的體重(y軸)。圖16顯示了EFD在10天觀察期內(nèi)對方案2小鼠中的DSS誘導(dǎo)的IBD的作用a)體重和b)肛門炎癥和大便。根據(jù)方案2，C57Bl/6雄性小鼠在5天內(nèi)接受或未接受含葡聚糖硫酸鈉(DSS)的飲用水。一組在開始DSS飼喂前第21天接受皮下注射IOO嗎EFD。一組接受PBS。最后一組即對照組沒有飲用DSS。這個方案與圖6以及下面的圖17到24中的方案相同。x軸中的第0天對應(yīng)于DSS飼喂的第1天。EFD的預(yù)處理減輕了IBD癥狀。圖17顯示了EFD預(yù)處理對方案2的DSS飼喂小鼠的作用，用結(jié)腸和盲腸長度迸行評價。在開始DSS飼喂后第10天時測量結(jié)腸和盲腸長度。DSS飼喂引起的嚴重的炎癥反應(yīng)造成了PBS處理小鼠的腸壁增厚和結(jié)腸長度縮短，但是結(jié)腸重量未發(fā)生改變。EFD處理小鼠的結(jié)腸和盲腸與對照組相似(***表示ANOVA統(tǒng)計檢驗的pO.OOl)。圖18顯示了在開始DSS飼喂后第IO天對腸系膜淋巴結(jié)細胞數(shù)目的作用。收集腸系膜淋巴結(jié)，將其分離，并測定它們的細胞含量。觀察到了細胞數(shù)目的增加(x2.5)。當小鼠先前已經(jīng)接受過EFD處理時，所述細胞數(shù)目的增加是臨界的(***表示ANOVA統(tǒng)計檢驗的pO.OOl)。圖19顯示了EFD對結(jié)腸組織(a)中的細胞因子和淋巴因子的作用。在開始DSS飼喂后第10天，收集結(jié)腸組織樣本，稱重，并在蛋白酶抑制劑中將其分離。測定出其中不同的細胞因子和淋巴因子的含量。在PBS和EFD處理小鼠之間沒有觀察到IL-12p40禾bRANTES的統(tǒng)計學顯著性差異。圖20顯示了EFD對結(jié)腸組織(b)中的細胞因子和淋巴因子的作用。對于參與炎癥過程的IL-ip、TNF-a和MIP-la而言，在PBS和EFD處理小鼠之間觀察到了統(tǒng)計學顯著性差異，因此EFD處理預(yù)防了DSS飼喂誘導(dǎo)的炎癥。圖21顯示了EFD對結(jié)腸組織(c)中的細胞因子和淋巴因子的作用?；罨疶細胞產(chǎn)生的IL-17刺激不同的細胞系產(chǎn)生炎癥和造血相關(guān)的細胞因子。在EFD處理之后觀察到了更少的活化T細胞(根據(jù)測定到的IFN-y的量)和更少的IL-17產(chǎn)生。圖22顯示了EFD對結(jié)腸組織(d)中的細胞因子和淋巴因子的作用。KC(IL-8的鼠等價物)、IL-6和IL-la都是"炎性"細胞因子或者都參與了NFKB信號傳導(dǎo)途徑。在EFD處理后減少了它們的產(chǎn)生。圖23顯示了EFD對結(jié)腸組織(e)中的細胞因子和^^巴因子的作用。如先前顯示減少了IL-17產(chǎn)生的結(jié)果所示，EFD處理后減少了造血細胞因子IL-3、GM-CSF和G-CSF的產(chǎn)生。圖24顯示了EFD處理預(yù)防了飲用添加有DSS的水的小鼠脾臟中GATA-3蛋白水平增加。在EFD處理30天后，脾臟中產(chǎn)生了大量的T-bet蛋白。加工處理了來自DSS飼喂小鼠中的兩個樣品a和b。圖25顯示了接受含葡聚糖硫酸鈉(DSS)的飲用水3次的EFD處理和未處理小鼠在EFD處理后數(shù)天時的體重差異。這個模型探討了EFD對慢性IBD的預(yù)防性處理。小鼠(C57B1/6雄性小鼠)接受含1.5%DSS的飲用水7天、普通自來水8天、含1.5%DSS的飲用水5天、自來水10天、含1.5%DSS的飲用水5天、之后飲用自來水。一組小鼠接受過EFD處理在DSS飼喂第一天前第21天皮下給予IOO嗎；或者在第一次DSS詞喂前第23、22和21天口服lmg。它們沒有接受過更多的EFD處理。每周5天都要每天檢查每只小鼠的體重。在第52天結(jié)束試驗。圖26顯示了在預(yù)防性測試(圖25)所含的小鼠中進行的結(jié)腸炎評分。根據(jù)以下標準進行評分-0:大便無變化-1:肛門炎癥-2:肛門炎癥加軟便-3:肛門炎癥加腹瀉-4:肛門炎癥加血性腹瀉圖27上方顯示了預(yù)防性測試(圖25)中的小鼠在第52天時的結(jié)腸長度的差異，測量盲腸與肛門之間的結(jié)腸長度。EFD處理小鼠的結(jié)腸與從未飼喂過DSS的純真小鼠(naivemice)的結(jié)腸相似(**表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的pO.Ol，***表示？<0.001)。圖27下方顯示了所收集到的預(yù)防性測試(圖25)中的小鼠在第52天時的腸系膜淋巴結(jié)中的細胞數(shù)目。EFD處理小鼠的淋巴結(jié)比PBS處理小鼠的淋巴結(jié)有著更少的細胞數(shù)目(***表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的pO.OOl)。圖28顯示了預(yù)防性測試(圖25)中的小鼠在第52天時的脾臟重量和脾細胞數(shù)目。差異沒有顯著性。圖29顯示了在第52天時從預(yù)防性測試(圖25)中的小鼠中收集到的脾細胞自發(fā)釋放出一些炎癥細胞因子。將2xl()s個細胞在0.2ml組織培養(yǎng)基中37。C下孵育96h，收集上清液并用MultiplexBioRad檢測法測定出IFN-Y、IL-6和IL-17的濃度。觀察到了在PBS和EFD處理之后所有細胞因子濃度都有著極為顯著的差異，但是IL-17最為顯著。圖30上方顯示了轉(zhuǎn)錄因子NFk-B的濃度。按照產(chǎn)品說明書，用ActiveMotif出售的試劑盒測定NFk-B。測定第52天時從預(yù)防性測試(圖25)中的小鼠收集到的脾細胞的5pg核提取物的光密度作為所述轉(zhuǎn)錄因子。在PBS和EFD處理之后觀察到的差異是非常顯著的(**表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的p<0.01)或極為顯著的(***表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的pO.OOl)。圖30下方顯示了轉(zhuǎn)錄因子PPARy的濃度。按照產(chǎn)品說明書，用ActiveMotif出售的試劑盒測定PPARy。測定第52天時從預(yù)防性測試(圖25)中的小鼠收集到的脾細胞的5pg核提取物的光密度作為所述轉(zhuǎn)錄因子。在PBS和EFD處理之后觀察到的差異是非常顯著的(**表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的pO.Ol)或極為顯著的(***表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的pO.OOl)。圖31顯示了已經(jīng)接受含葡聚糖硫酸鈉(DSS)的飲用水5天的經(jīng)EFD處理和未處理的小鼠的體重的差異。這個模型探討了EFD對急性IBD的治療性處理。小鼠(C57Bl/6雄性小鼠)接受了含2.5%DSS的飲用水5天，隨后飲用自來水。一組小鼠接受EFD處理在DSS詞喂末日后24小時即第6天皮下給予IOO嗎；或者在DSS飼喂第一天后的第6、7、和8天口服lmg。此后它們不再接受更多的EFD處理。每周5天每天都檢査每只小鼠的體重。試驗在第34天結(jié)束。在EFD處理之后，在第13和15天觀察到了輕微的、具有顯著意義的治療作用(*p<0.05)，以及更快的體重恢復(fù)。圖32顯示了對治療性測試(圖31)中的小鼠進行的結(jié)腸炎評分。根據(jù)先前的描述(圖26)進行評分。EFD處理小鼠的臨床癥狀緩解得更快。圖33上方顯示了治療性測試(圖31)中的小鼠在第34天時的結(jié)腸長度的差異，測量盲腸與肛門之間的結(jié)腸長度。EFD處理小鼠的結(jié)腸與從未飼喂過DSS的純真小鼠的結(jié)腸相似(***表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的p〈0細)。圖33下方顯示了所收集到的治療性測試(圖31)中的小鼠在第34天時的腸系膜淋巴結(jié)中的細胞數(shù)目。EFD處理小鼠的淋巴結(jié)比PBS處理小鼠的淋巴結(jié)有著更少的細胞數(shù)目，差異是統(tǒng)計學顯著的。圖34顯示了治療性測試(圖31)中的小鼠在第34天時的脾臟重量(上)和脾細胞數(shù)目(下)。差異沒有顯著性差異。圖35顯示了在第34天時從治療性測試(圖31)中的小鼠中收集到的脾細胞自發(fā)釋放出一些炎癥細胞因子。將2xl()S個細胞在0.2ml組織培養(yǎng)基中37。C下孵育96h，收集上清液并用MultiplexBioRad檢測法測定出IFN-Y、IL-6和IL-17的濃度。觀察到了在PBS和EFD處理之后IL-17有著極為顯著的差異(pO.OOl)，而IFNi和IL-6沒有顯著性差異。圖36上方顯示了轉(zhuǎn)錄因子NFk-B的濃度，測定第34天時從治療性測試(圖31)中的小鼠收集到的脾細胞的5pg核提取物的光密度作為所述轉(zhuǎn)錄因子的濃度。在PBS和EFD處理之后觀察到的差異是極為顯著的(***表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的pO.OOl)。圖36下方顯示了轉(zhuǎn)錄因子PPARy的濃度，測定第34天時從治療性測試(圖31)中的小鼠收集到的脾細胞的5ng核提取物的光密度作為所述轉(zhuǎn)錄因子的濃度。在PBS和EFD處理之后觀察到的差異是極為顯著的(***表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的p<0.001)。圖37顯示了接受含葡聚糖硫酸鈉(DSS)的飲用水三次數(shù)日以及在第一系列DSS處理之后接受了EFD處理的EFD處理小鼠和未處理小鼠之間的體重差異。這個模型探討了EFD在慢性IBD中的治療性和預(yù)防性處理的作用。小鼠(C57B1/6雄性小鼠)接受含1.5Q/。DSS的飲用水7天、普通自來水8天、含1，5%DSS的飲用水5天、自來水10天、1.5%DSS5天，隨后飲用自來水。一組小鼠接受EFD處理在第一次DSS飼喂后第9天皮下給予100嗎；或者在DSS飼喂第一天后的第9、10、和ll天口服lmg。此后它們不再接受更多的EFD處理。每周5天每天都檢查每只小鼠的體重。試驗在第52天結(jié)束。在EFD處理之后，在第13和15天觀察到了輕微的、具有顯著意義的治療作用，以及更快的和穩(wěn)定的體重恢復(fù)。圖38顯示了對治療性和預(yù)防性測試(圖37)中的小鼠進行的結(jié)腸炎評分。根據(jù)先前的描述(圖26)進行評分。經(jīng)皮下EFD處理過的小鼠的臨床癥狀得到了緩解。圖39上方示了治療性和預(yù)防性測試(圖37)中的小鼠在第52天時的結(jié)腸長度的差異，測量盲腸與肛門之間的結(jié)腸長度。EFD處理小鼠的結(jié)腸與PBS小鼠的結(jié)腸基本相似。圖39下方顯示了所收集到的治療性和預(yù)防性測試(圖37)中的小鼠在第52天時的腸系膜淋巴結(jié)中的細胞數(shù)目。只有經(jīng)皮下EFD處理過的小鼠的淋巴結(jié)的細胞數(shù)目得到了減少(***表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的p〈0扁)。圖40顯示了治療性和預(yù)防性測試(圖37)中的小鼠在第52天時的脾臟重量(上)和脾細胞數(shù)目(下)。只有經(jīng)皮下EFD處理過的小鼠的脾臟重量和脾細胞數(shù)目得到了減少f^表示AN0VA統(tǒng)計學檢驗的pO.001)。圖41顯示了在第52天時從治療性和預(yù)防性測試(圖37)中的小鼠中收集到的脾細胞自發(fā)釋放出一些炎癥細胞因子。將2xl()s個細胞在0.2ml組織培養(yǎng)基中37。C下孵育96h，收集上清液并用MultiplexBioRad檢測法測定出IFN-y、IL-6和IL-17的濃度。觀察到了在PBS和EFD處理之后所有細胞因子濃度都有著極為顯著的差異，但是IL-17最為顯著。圖42上方顯示了轉(zhuǎn)錄因子NFk-B的濃度，測定第52天時從治療性和預(yù)防性測試(圖37)中的小鼠收集到的脾細胞的5pg核提取物的光密度作為所述轉(zhuǎn)錄因子的濃度。在PBS和EFD處理之后觀察到的差異是極為顯著的(***表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的pO.OOl)。圖42下方顯示了轉(zhuǎn)錄因子PPARy的濃度，領(lǐng)淀第52天時從治療性和預(yù)防性測試(圖37)中的小鼠收集到的脾細胞的5pg核提取物的光密度作為所述轉(zhuǎn)錄因子的濃度。在PBS和EFD處理之后觀察到的差異是極為顯著的(***表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的pO.OOl)。圖43顯示了接受含葡聚糖硫酸鈉(DSS)的飲用水三次數(shù)日以及在末次DSS處理之后接受了EFD處理的EFD處理小鼠和未處理小鼠之間的體重差異。這個模型探討了EFD在慢性IBD中的治療性處理作用。小鼠(C57Bl/6雄性小鼠)接受含1.5。/。DSS的飲用水7天、普通自來水8天、含1.5%DSS的飲用水5天、自來水10天、含1.5%DSS的飲用水5天，隨后飲用自來水。一組小鼠接受EFD處理在末次DSS飼喂后第7天皮下給予lOOpg;或者在首次DSS飼喂后的第42、43、和45天口服lmg。每周5天每天都檢查每只小鼠的體重。試驗在第54天結(jié)束。在皮下EFD處理之后，在第54天觀察到了輕微的治療作用，以及體重恢復(fù)。圖44顯示了對慢性IBD的治療性測試(圖43)中的小鼠進行的結(jié)腸炎評分。根據(jù)先前的描述(圖26)進行評分。經(jīng)皮下EFD處理過的小鼠的臨床癥狀得到了緩解。圖45上方顯示了慢性IBD的治療性測試(圖43)中的小鼠在第54天時的結(jié)腸長度的差異，測量盲腸與肛門之間的結(jié)腸長度。EFD處理小鼠的結(jié)腸與PBS小鼠的結(jié)腸基本相似(*表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的p<0.05)。圖45下方顯示了所收集到的慢性IBD的治療性測試(圖43)中的小鼠在第54天時的腸系膜淋巴結(jié)中的細胞數(shù)目。只有經(jīng)皮下EFD處理過的小鼠的淋巴結(jié)的細胞數(shù)目得到了減少(***表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的p<0.001)。圖46顯示了慢性IBD的治療性測試(圖43)中的小鼠在第54天時的脾臟重量(上)和脾細胞數(shù)目(下)。只有經(jīng)皮下EFD處理過的小鼠的脾臟重量和脾細胞數(shù)目得到了減少(*表示AN0VA統(tǒng)計學檢驗的p0.05，**表示pO.Ol)。圖47顯示了在第54天時從慢性IBD的治療性測試(圖43)中的小鼠中收集到的脾細胞自發(fā)釋放出一些炎癥細胞因子。將2xl()s個細胞在0.2ml組織培養(yǎng)基中37。C下孵育96h，收集上清液并用MultiplexBioRad檢測法測定出IFN-y、IL-6和IL-17的濃度。觀察到了在PBS和EFD處理之后所有細胞因子濃度都有著極為顯著的差異(pO.OOl)，但是IL-17最為顯著。圖48上方顯示了轉(zhuǎn)錄因子NFk-B的濃度，測定第54天時從慢性IBD的治療性測試(圖43)中的小鼠收集到的脾細胞的5pg核提取物的光密度作為所述轉(zhuǎn)錄因子的濃度。在PBS和EFD處理之后觀察到的差異是極為顯著的(*表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的p<0.05，***表示pO.OOl)。圖48下方顯示了轉(zhuǎn)錄因子PPARy的濃度，測定第54天時從慢性IBD的治療性測試(圖43)中的小鼠收集到的脾細胞的5Hg核提取物的光密度作為所述轉(zhuǎn)錄因子的濃度。在PBS和EFD處理之后觀察到的差異是非?；驑O為顯著的(**表示ANOVA統(tǒng)計學檢驗的p<0.01，***表示？<0.001)。發(fā)明詳述定義本發(fā)明中的表述"滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物"在此指的是如WO03049752所述的滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌的制備物。該革蘭氏陽性細菌制備物含有滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌，所述制劑是通過不會變性所含分子的結(jié)構(gòu)特別是所含蛋白的結(jié)構(gòu)的方法獲得的。有利地，革蘭氏陽性細菌制備物含有深度凍干滅活的細菌以及小于1.5%的殘余水，優(yōu)選地小于1%，更優(yōu)選地小于0.5%。通過收集活的細菌細胞、在水中或鹽例如硼酸鹽的水溶液中洗漆細菌細胞、冷凍水中或鹽例如硼酸鹽的水溶液中的細菌細胞、在凍干機中干燥細菌細胞一段足以去除至少98.5%的水分，優(yōu)選地至少99%的水分，更優(yōu)選地至少99.5%的水分的時間以滅活冷凍的細菌細胞、以及收集深度凍干滅活的細菌細胞來制備出這些深度凍干滅活的細菌。本發(fā)明的表述"革蘭氏陽性細菌制備物"也覆蓋了這種深度凍干滅活的細菌制備物的一部分。所述部分選自以下一組由所述滅活細菌制備物的有機溶劑提取物組成的部分、由所述滅活細菌制備物的糖苷酶處理的提取物組成的部分、由所述滅活細菌制備物的DNA酶和/或RNA酶消化過的提取物組成的部分、以及由經(jīng)有機溶劑、糖苷酶、DNA酶和/或RNA酶以及最后的蛋白酶連續(xù)處理過的所述滅活細菌制備物組成的部分。本發(fā)明中的表述"腸道炎癥綜合征"在此表示任何炎性腸病，包括兩大類疾病即克隆病和潰瘍性結(jié)腸炎以及這些疾病的中間變體，即中間型結(jié)腸炎，其表現(xiàn)出了先前提及的兩種疾病的重疊的特點。革蘭陽性細菌刮各物的用逄本發(fā)明也涉及革蘭氏陽性細菌制備物用于預(yù)防和治療腸道炎癥綜合征的用途，所述制備物的特點是其中革蘭氏陽性細菌是滅活的或非感染性的，以及含有超過50%以及優(yōu)選地超過90%的天然結(jié)構(gòu)的細菌蛋白組分。本發(fā)明的革蘭氏陽性細菌制備物也可以用于制備用于預(yù)防和/或治療腸道炎癥綜合征的藥物。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，革蘭氏陽性細菌制備物是革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌。革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌表示該革蘭氏陽性細菌能夠在合成培養(yǎng)基體外生長，并能夠體內(nèi)感染來自哺乳動物或非哺乳動物的真核細胞并在這些細胞例如巨噬細胞中增殖。在另一個優(yōu)選的實施方式中，細菌制備物含有選自由李斯特菌屬、棒桿菌屬、和包括分枝桿菌、奴卡菌和紅球菌的放線菌組成的組中的革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌。更優(yōu)選地，細菌制備物含有牛型分枝桿菌(^T少cok^eWwm6oW"，以及甚至更優(yōu)選地含有牛型分枝桿菌BCG。本發(fā)明也涉及滅活的或非感染性的細菌制備物或其部分用于制備用于治療和/或預(yù)防包括免疫失調(diào)例如Thl/Th2失衡的疾病的藥物的用途。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，所述疾病是克隆病或潰瘍性結(jié)腸炎。滅活細菌制備物或其部分可以與可藥用載體和/或免疫刺激劑、和/或佐劑和/或下面所定義的任何傳統(tǒng)的添加劑相連接?？梢酝ㄟ^口服、舌下、腸外或鼻內(nèi)途徑施用本發(fā)明的革蘭氏陽性細菌制備物和/或藥物。藥物組合物如上面所提及的那樣，本發(fā)明涉及滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物用于制備用于預(yù)防和/或治療腸道炎性疾病的藥物組合物的用途。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述組合物是通過以下步驟獲得的a)收集活細菌細胞的培養(yǎng)物；b)在水中或鹽例如硼酸鹽的水溶液中洗滌細菌細胞；c)冷凍水中或鹽例如硼酸鹽的水溶液中的細菌細胞；d)通過在凍干機中干燥細菌細胞來滅活冷凍的細菌細胞，干燥的時間足以去除至少98.5%的水分，優(yōu)選地至少99%的水分，更優(yōu)選地至少99.5%的水分；和e)收集深度凍干滅活的細菌細胞。本發(fā)明的組合物優(yōu)選地是適用于口服施用的形式。例如，組合物可以是用于口服施用的片劑、普通膠囊、凝膠膠囊或糖槳的形式。這些凝膠膠囊、普通膠囊和片劑形式都可以含有常用于藥物組合物中的賦形劑例如佐劑或結(jié)合劑如淀粉、樹膠和凝膠；佐劑如磷酸鈣；崩解劑例如玉米淀粉或海藻酸；潤滑劑如硬脂酸鎂；濕化劑或芳香劑。通過添加藥物兼容的溶劑可以在水性或非水性介質(zhì)中制備出溶液或懸浮液。這些溶劑包括乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、聚乙二醇醚、DMSO和乙醇。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的組合物優(yōu)選地是適用于腸外施用例如皮下注射的形式。對于腸外施用例如皮下注射，載體優(yōu)選地包括水、鹽緩沖液、乳糖、谷氨酸鹽、脂肪或石蠟。對于口服施用，可以采用任一上面的載體或固體載體例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、多糖鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂?？缮锝到獾奈⑶?例如polylacticgalactide)也可以用于本發(fā)明的藥物組合物。例如在美國專利4，897，268和5,075,109中闡述了合適的可生物降解的微球。本發(fā)明的組合物還可以含有添加劑和/或免疫刺激劑和/或佐劑例如含本發(fā)明的細菌細胞或其部分的脂質(zhì)體。用于制備本發(fā)明的藥物組合物的添加劑可以選自抗聚集劑、抗氧化劑、染料、香味增強劑、或光滑劑、組裝劑或分離劑，可以選自任一常用于藥物工業(yè)中的賦形劑。任何一種佐劑都可以用于本發(fā)明的組合物，以便增強免疫應(yīng)答。大多數(shù)佐劑都含有被設(shè)計用于保護抗原被快速代謝或產(chǎn)生可控的炎性反應(yīng)的物質(zhì)，例如氫氧化鋁或礦物油以及免疫應(yīng)答的非特異性刺激物如脂質(zhì)A、百日咳毒素。合適的佐劑也是商品化可獲得的，例如弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑，其不能被用于人體注射。其他可以用于人體的合適佐劑包括氫氧化鋁、可生物降解的微球、單磷酰脂A(monophospherylA)和QuilA。預(yù)防式治《的方法在本發(fā)明的一個實施方式中，滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物被用于預(yù)防和治療選自由克隆病和潰瘍性結(jié)腸炎組成的腸道炎性疾病。本發(fā)明的方法包括給患者施用足以刺激產(chǎn)生白細胞的調(diào)節(jié)細胞例如CD4+CD25+T細胞、B細胞和/或樹突狀細胞的有效量的滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了用于預(yù)防或治療因Thl/Th2失衡引起的疾病的方法。方法包括步驟a)提供本發(fā)明的滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物或其保留了抑制腸道炎癥綜合征的能力的部分或本發(fā)明的藥物組合物；和b)給患有所述疾病的患者施用有效量的革蘭氏陽性細菌制備物。如上提及的那樣，腸道炎癥綜合征可以是克隆病或潰瘍性結(jié)腸炎。本發(fā)明組合物中的革蘭氏陽性細菌制備物的量優(yōu)選地是治療有效量。治療有效量的革蘭氏陽性細菌制備物是使得革蘭氏陽性細菌制備物實現(xiàn)其抑制腸道炎癥綜合征的作用且不引起被施用組合物的宿主體內(nèi)的過多的負面作用所必需的量。所用的革蘭氏陽性細菌制備物和所施用的組合物的實際量可以有所不同，取決于下面的因素例如所治療的腸道炎癥綜合征的類型、施用方式以及組合物中的其他組分。優(yōu)選地，組合物是由從約lOpg到約10mg以及更優(yōu)選地從約100嗎到約lmg滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物組成的。"約"在此表示所述的滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物的量Oig或mg)可以在特定的范圍內(nèi)有所不同，這取決于用于評價所述量的方法的誤差范圍。例如，在口服施用本發(fā)明的組合物期間，被治療的宿主在連續(xù)3天內(nèi)每天接受l個劑量的約l(Hig到約10mg的滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物?？梢栽趌周后重復(fù)治療l次。對于腸外施用例如皮下注射，被治療的宿主可每個月或每6個月接受l個劑量的約10ng到約10mg以及更優(yōu)選地從約100嗎到約lmg的滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物。革蘭^陽性細菌刮備物的刮備方法例如，可以用"軟方法"滅活本發(fā)明的革蘭氏陽性細菌，所述"軟方法"不會變性來自細菌細胞的分子，因此當它們被施用給患有免疫失調(diào)的對象時，它們能夠體內(nèi)刺激白細胞調(diào)節(jié)細胞(CD4+CD25+T細胞和/或B細胞和/或樹突狀細胞)。因此，本發(fā)明的革蘭氏陽性細菌制備物可以包括熱滅活的分枝桿菌制備物。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，通過凍干法滅活革蘭氏陽性細菌。被稱作軟方法的這些方法包括但不限于使用破壞細菌細胞膜同時保留其大分子組分的結(jié)構(gòu)的物理方式。這些方法包括但不限于深度凍干、在硅珠(silicabead)或鋯珠中的碾磨、使用所謂的"法國壓(Frenchpress)"、超聲或伽瑪射線照射?？梢杂糜讷@得如上定義的滅活細菌制備物的其他方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。不會變性來自細菌細胞的分子的結(jié)構(gòu)的方法表示不會造成分子構(gòu)象的過多變性的方法。優(yōu)選地，這種方法保留了來自細菌細胞的微分子例如蛋白、多糖和脂質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。實施例一般信息為了檢驗EFD減輕IBD的炎癥反應(yīng)的能力，研究了兩種IBD的小鼠模型-繼發(fā)于TNBS局部致敏的IBD;-繼發(fā)于DSS飼喂的IBD。遂舒薦S眉繊敎助DTNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)是一種含有酚衍生物的化學物，其產(chǎn)生了"純的"T淋巴細胞依賴性的致敏作用。通過經(jīng)插入肛管內(nèi)的小管向結(jié)腸內(nèi)局部輸送TNBS溶液進行致敏。數(shù)天后，同一化學物的局部輸送產(chǎn)生了具有由局部T細胞應(yīng)答產(chǎn)生的潰瘍性的炎性病變。這個模型的優(yōu)點是能夠研究T細胞依賴性炎癥反應(yīng)。這個模型的缺點如下-每只小鼠都必須被麻醉兩次，要小心的操作以便將細管插入到肛門內(nèi)；-TNBS是人體的強致敏劑。致敏實驗室工作人員的危險很高，已知等效的酚衍生物在我們所處的環(huán)境中常見。必須要非常謹慎的進行操作。邀舒滯繊飾DDSS(葡聚糖硫酸鈉)是一種當攝入后能夠在小鼠內(nèi)產(chǎn)生局部的腸道病變的化學物。其經(jīng)飲用水的輸送是便利的。它是比TNBS更弱的致敏劑，對實驗室工作人員的危險更小。已經(jīng)了解了其部分致病機制，無細菌小鼠(germ-freemice)缺少DSS誘導(dǎo)的病變排除了直接的、單一的、免疫學機制。在人體的克隆病中也觀察到了存在腸道細菌的必要性，一些學者提出了DSS模型比TNBS模型更接近于人類疾病。實施例I:DSS誘導(dǎo)的IBD的預(yù)防模型(短期作用)方蚩方案16到7周大的C57Bl/6小鼠被分成4組，每組IO只小鼠_第l組的小鼠沒有接受任何處理，它們作為對照組；-第2組的小鼠接受了lOOpl等張鹽水的皮下注射。在21天后，用2.5%DSS水溶液取代它們的飲用水共7天；-在第1和2天用lmgEFD飼喂第3組的小鼠，以及在第8和9天再次用lmgEFD飼喂小鼠。在第21天起用DSS溶液取代它們的飲用水共7天；-第4組的小鼠在第1天接受含100嗎EFD的lOOpl鹽溶液的皮下注射。在第21天起用DSS溶液取代它們的飲用水共7天。第-21天EFD10CHjgs.c.或1mg口月艮x4(第-21,-20，-14和13)-DSS2.5%第8天第10天0在第8天(5只小鼠)或第10天(5只小鼠)處死全部小鼠，以便分析早期的病理學改變結(jié)腸長度、組織學表現(xiàn)。方案2這個方案與方案1相似。C57Bl/6雄性小鼠(每組IO只小鼠)接受或未接受含葡聚糖硫酸鈉(DSS)的飲用水5天。這個方案比方案1稍輕，給予DSS5天而不是7天。一組小鼠在DSS飼喂前第21天接受100pgEFD皮下注射。一組接受PBS而不是EFD。最后一組對照組沒有接受DSS也沒有接受EFD。第-21天EFDlOOygs.c.DSS2.5%第10天0在開始攝入DSS后8天或10天內(nèi)進行每日稱重和動物觀察。建立總結(jié)了所觀察到的征象的強度的臨床評分-0:正常小鼠；-1:肛門炎癥-2:肛門炎癥和軟便-3:肛門炎癥和腹瀉-4:肛門炎癥和血性腹瀉在幵始攝入DSS后的第8天，處死每組中的4只動物，收集并測量它們的結(jié)腸(肛門和盲腸之間的長度)，將其放入Tissue-TekO.CT.(SakuraFinetek)內(nèi)并冷凍用于組織學檢査。在第IO天處死幸存的小鼠。在第IO天收集結(jié)腸組織的樣品，以便用Multiplex試劑盒(BioRad)測定出它們的不同的細胞因子/淋巴因予的含量。結(jié)果7.z/、腐游沐^^必錄浙游^t^觀接受葡聚糖硫酸鈉溶液作為飲用水的未經(jīng)EFD處理過的小鼠(第2組)出現(xiàn)體重的快速下降(圖l左側(cè))。小鼠的活潑度在攝入DSS的第6天或第7天出現(xiàn)明顯下降；在停止DSS輸入后的24小時或72小時根本沒有恢復(fù)或者沒有恢復(fù)得很好。3只小鼠在第8天死亡。來自組3和4的經(jīng)口服或皮下EFD處理過的小鼠顯露出病態(tài)，但是不嚴重；它們?nèi)匀皇腔顫姷牟⑶沂侨菀谆謴?fù)的。這些組中沒有死亡。經(jīng)方案2的EFD處理過的小鼠組顯示出與對照小鼠組相似的重量曲線(圖16a),說明EFD預(yù)處理減輕了IBD癥狀。2,/緣粉未經(jīng)EFD處理過的小鼠在攝入DSS4天或5天后出現(xiàn)臨床評分的升高(炎癥和腹瀉)。該評分在7到8天后快速升高(圖1右側(cè))。當進行相互比較時，發(fā)現(xiàn)經(jīng)EFD處理過的小鼠在開始DSS攝入后的第4和5天表現(xiàn)出相同的臨床評分，所述評分比在未處理過的動物中觀察到的評分升高的更少。然后所述評分逐漸恢復(fù)到正常。已經(jīng)EFD處理過的小鼠在第7天和第8天沒有表現(xiàn)出肛門炎癥和腹瀉(圖6)。方案2中已經(jīng)EFD處理過的小鼠表現(xiàn)出與對照小鼠相似的臨床評分(圖16b)。3.薪應(yīng)游炎癥a)大體檢査在開始攝入DSS后第8或10天，即在停止所述攝入后第1或3天處死動物。沒有觀察到依賴于尸解日期的差異。對照動物的結(jié)腸含有很多糞便，隨著它們向肛門的移動逐漸變得更硬。結(jié)腸的平均長度是6.7cm(圖5)。接受了DSS的動物的結(jié)腸長度減少到了約3.8cm(圖2和5)。在DSS處理過的小鼠中，糞便是軟的，且結(jié)腸常常是出血性的。已經(jīng)EFD處理過的動物的結(jié)腸含有多少有點硬的糞便，其性狀與對照小鼠的糞便相同(圖4)。結(jié)腸的平均長度為5.8cm(圖5)。在不同施用模式的EFD處理的作用之間沒有觀察到顯著差異(圖5)。經(jīng)方案2的EFD處理過的小鼠顯示出與從未飼喂過DSS的對照小鼠相似的結(jié)腸和盲腸的長度(圖17)。b)顯微鏡下檢查對施用DSS后的病變的顯微鏡下檢查顯示出腸道黏膜水平的強烈的炎癥應(yīng)答、與腸壁增厚相關(guān)的腸系膜插入水平的嚴重的黏膜下水腫。腸絨毛是分離的和部分無結(jié)構(gòu)的(圖9和IO相對于作為對照的圖7和8、圖13和14)。在攝入DSS之前經(jīng)EFD處理過的動物中，病變明顯沒有這么嚴重(圖11禾卩12相對于作為對照的圖7和8)。腸絨毛具有與對照動物接近的形態(tài)(圖13和14)。c)結(jié)腸組織和脾臟中的炎癥調(diào)節(jié)物IL-12p40、IL-12p70、RANTES、IL-lp、TNFa、MIP-la、IL-17、IFNy、IL-IO、KC、IL國6、IL-la、IL-3、GM-CSF、和G-CSF的量。根據(jù)產(chǎn)家推薦(Bio-Rad)，用Bioplex方法測定出所有的細胞因子和淋巴因子。脾臟中T-bet和GATA-3蛋白的量。將從脾臟細胞中提取出的總蛋白溶解于7.5%SDS-PAGE中，然后用E.Schmitt禾BC.Richter(InstituteofImmunology,Mainz,Germany)惠贈的多克隆的兔抗小鼠FOXP3IgG抗體和小鼠單克隆抗T-bet抗體、小鼠單克隆的抗GATA-3抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)或小鼠單克隆的抗(3-actin抗體(Ac-15Abcam，Cambridge,UK)探測被轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上的蛋白條帶。用HRP標記的多克隆的山羊抗兔抗體(DakoCytomation,Denmark)作為二抗。用增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(Amersham，F(xiàn)rance)檢測出免疫復(fù)合物。在從飲用含DSS的飲用水的小鼠收集到的結(jié)腸樣品中存在著高濃度的炎癥細胞因子和淋巴因子。這些分子是小鼠中所觀察到的嚴重的病理學改變的起因或結(jié)果。在攝入DSS之前經(jīng)EFD皮下處理過的動物中，這些分子的濃度是在接受沒有DSS的自來水的對照動物中所觀察到的濃度的范圍內(nèi)。d)腸系膜淋巴結(jié)細胞數(shù)目腸系膜淋巴結(jié)大小的增加常與結(jié)腸疾病相關(guān)，特別是與炎性腸病相關(guān)。在開始DSS飼喂后的第10天，收集方案2中的小鼠的腸系膜淋巴結(jié)，并將其在細胞過濾器(Falcon)中壓碎。用加有5%FCS的AIMV培養(yǎng)基(Gibco)洗滌分離的細胞，離心并將沉淀的細胞重懸于0.5或lml培養(yǎng)基中。在馬拉色盒(Malassezcell)中，用臺盼蘭(0.1。/。PBS溶液)將細胞稀釋10倍，并在顯微鏡下計數(shù)。與對照小鼠相比較，在經(jīng)PBS處理的和DSS飼喂的小鼠中觀察到了細胞數(shù)目的增加(x2.5)。EFD預(yù)防性處理容許將所述細胞數(shù)目顯著地減少到了對照小鼠的數(shù)值(圖18)。實施例II:DSS誘導(dǎo)的慢性IBD的預(yù)防^莫型(長期作用)這個模型研究了EFD在慢性IBD中的預(yù)防性處理的作用。方蚩6到7周大的C57B1/6小鼠被分成4組，每組10只小鼠。小鼠(C57Bl/6雄性小鼠)接受含1.5%DSS的飲用水7天、普通自來水8天、含L5MDSS的飲用水5天、自來水10天、1.5。/。DSS5天，隨后接受自來水。一組小鼠接受EFD處理在DSS飼喂首日前第21天皮下注射100嗎或在DSS飼喂首日之前的第23、22和21天口服lmg。它們不再接受EFD治療。試驗在第52天結(jié)束。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>經(jīng)口服或皮下EFD處理的小鼠表現(xiàn)出與未經(jīng)EFD處理和經(jīng)DSS飼喂的小鼠相似的體重下降以及體重再次恢復(fù)，但在三個系列的DSS攝入后第50天試驗結(jié)束時，預(yù)防性處理使得小鼠具有與對照小鼠非常接近的體重(圖25)。在圖26中，在試驗結(jié)束時(第50天)，未經(jīng)EFD處理過的小鼠在DSS詞喂結(jié)束后表現(xiàn)出臨床評分的持續(xù)增加。EFD預(yù)處理容許小鼠在試驗結(jié)束時具有正常的臨床評分，而未經(jīng)EFD處理過的小鼠在三次IBD刺激之后表現(xiàn)出其臨床評分的持續(xù)增加。翁屋錄在試驗結(jié)束時(第52天)，EFD處理過的小鼠的結(jié)腸與從未飼喂過DSS的純真小鼠的結(jié)腸相似(圖27上)。浙^祭浙,嚴在試驗結(jié)束時(第52天)，EFD處理過的小鼠的淋巴結(jié)中的細胞數(shù)目要比PBS處理過的小鼠更少，預(yù)計其可以逐步恢復(fù)到從未飼喂過DSS的對照小鼠的細胞數(shù)目(圖27下)。如圖28所示，本預(yù)防性測試所含的小鼠在第52天時的脾臟重量和脾細胞數(shù)目的差異都不是統(tǒng)計學顯著性的差異。艦做艦,靜激研究了在試驗結(jié)束時(第52天)收集到的脾細胞自發(fā)釋放一些炎癥細胞因子的情況。對于所有的細胞因子(IFNy、IL-6和IL-17)而言，觀察到了PBS和EFD預(yù)處理之后的差異是極為顯著的，但是IL-17的差異則更為明顯。慢性IBD后的EFD預(yù)處理容許保持與從未飼喂過DSS的純真小鼠相似的細胞因子水平(圖29)。己知核因子kB(NF-kB)在炎性腸病中受到了活化，并上調(diào)了炎癥細胞因子。如圖30上所示，EFD預(yù)處理顯著地降低了反復(fù)DSS處理引發(fā)的高濃度的NF-kb。過氧化物酶體增生物激活受體-7(PPAR-力是一種主要表達于脂肪組織、腎上腺和脾臟的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的核受體超家族的成員，其涉及調(diào)節(jié)多種炎癥應(yīng)答，特別涉及腸道炎癥。已經(jīng)提出PPAR-y通過弱化核因子kB(NF-kB)的活性起到作為結(jié)腸炎的關(guān)鍵抑制劑的作用。如圖30下所示，脾臟的PPAR-y水平在慢性炎癥期是降低的。EFD對小鼠的預(yù)防性處理容許增加慢性IBD模型中的PPAR-y水平達到并超過純真小鼠(沒有慢性IBD)的水平。實施例III:DSS誘導(dǎo)的IBD的治療性模型(長期作用)本模型研究了EFD在急性IBD中的治療性處理的作用。方食6到7周大的C57B1/6小鼠被分成4組，每組10只小鼠。小鼠(C57Bl/6雄性小鼠)接受含2.5%DSS的飲用水5天，之后飲用自來水。一組小鼠接受EFD處理在DSS飼喂末日后第24小時(即第6天)皮下給予100昭或者在DSS飼喂首日后的第6、7和8天口服lmg。它們不再接受更多的EFD處理。試驗在第34天結(jié)束。第6天EFD100|jgs.c.或1mg口月艮x3在這個急性DSS誘導(dǎo)的IBD的治療性處理的模型中，從DSS飼喂的第l天開始到之后的第35天，每周5天，每天都檢査每只小鼠的體重。在用EFD治療之后，在第13和15天觀察到輕微的、具有顯著意義的治療性作用以及體重下降的快速恢復(fù)(圖31)。根據(jù)先前的描述檢查評分(見實施例1)。EFD處理小鼠中的臨床癥狀的減輕比PBS處理小鼠來得更快(圖32)。翁腳叛在試驗結(jié)束時(第34天)，EFD處理小鼠的結(jié)腸與從未詞喂過DSS的純真小鼠的結(jié)腸相似(圖33上)。淋巴翁浙#嚴在試驗結(jié)束時(第34天)，與PBS處理小鼠的淋巴結(jié)的細胞數(shù)目相比較，EFD處理小鼠的淋巴結(jié)的細胞數(shù)目明顯減少，差異是統(tǒng)計學顯著性的結(jié)果沐雄錄游床粉差異(圖33下)。如圖34所示，第34天時的脾臟重量和脾細胞數(shù)目的差異都不是統(tǒng)計學顯著性的差異。釋及游炎癥^蘿激研究了在試驗結(jié)束時(第34天)收集到的脾細胞自發(fā)釋放一些炎癥細胞因子的情況。對于IL-17而言，在PBS和EFD處理之間觀察到的差異是極為顯著的，但是對于IFN-y和IL-6并非如此(圖35)。如圖36上所示，在DSS攝入結(jié)束后1個月，PBS處理小鼠的脾臟都保持著高濃度的NF-kB。同時，EFD處理容許具有比未經(jīng)EFD處理顯著更低的NF-kB濃度，所述濃度與從未飼喂過DSS的純真小鼠的濃度相似。在試驗結(jié)束時，如圖36下所示，在PBS和EFD處理小鼠中觀察到的PPAR-Y水平是極為不同的。實施例IV:DSS誘導(dǎo)的慢性IBD的治療性和預(yù)防性模型(長期作用)(圖37-42)這個模型研究了EFD在慢性IBD中的治療性和預(yù)防性處理的作用。方食6到7周大的C57B1/6小鼠被分成4組，每組10只小鼠。小鼠(C57Bl/6雄性小鼠)接受含1.5%DSS的飲用水7天、普通自來水8天、含1.5。/。DSS的飲用水5天、自來水10天、1.5。/。DSS5天，隨后飲用自來水。一組小鼠接受EFD處理在DSS飼喂首日后第9天皮下注射IOO嗎或在首次詞喂DSS后的第9、10和11天口服lmg。它們不再接受EFD治療。試驗在第52天結(jié)束。第9天EFDIOO[jgs.c.或1mg口月艮x3<image>imageseeoriginaldocumentpage26</image>在這個慢性DSS誘導(dǎo)的IBD的治療性/預(yù)防性處理的模型中，從DSS攝入的第l天開始到之后的第52天內(nèi)，每周5天，每天都檢査每只小鼠的體重。在用EFD治療之后，在第13和15天觀察到輕微的、具有顯著意義的治療性作用以及體重下降的快速和穩(wěn)定的恢復(fù)(圖37)。游床伊分根據(jù)先前的描述檢查評分(見實施例1)。經(jīng)皮下EFD處理的小鼠中的臨床癥狀的減輕比PBS處理小鼠來得更快(圖38)。鄉(xiāng)艦在試驗結(jié)束時(第52天)，EFD處理小鼠的結(jié)腸與PBS處理小鼠的結(jié)腸大體相似(圖39上)。在試驗結(jié)束時(第52天)，只有經(jīng)皮下EFD處理小鼠的淋巴結(jié)的細胞數(shù)目得到了減少，與PBS處理小鼠之間的差異是極為顯著的(圖39下)。同樣，只有經(jīng)皮下EFD處理小鼠的脾臟重量和脾細胞數(shù)目得到了減少(圖40)。艦微微飾貫激研究了在試驗結(jié)束時(第52天)收集到的脾細胞自發(fā)釋放一些炎癥細胞因子的情況。對于所有細胞因子而言，在PBS和EFD處理之間觀察到的差異都是極為顯著的，但是IL-17更為明顯(圖41)。如圖42上方所示，在慢性IBD之后，PBS處理小鼠的脾臟中看到了高濃度的NF-kB。EFD處理小鼠的脾臟中的NF-kB濃度要低于PBS處理小鼠的脾臟，兩者之間的差異是極為顯著的。在慢性IBD之后，PBS和EFD處理小鼠的脾臟中觀察到的PPAR-y水平是非常不同的，差異極為顯著(圖42下)。實施例V:DSS誘導(dǎo)的慢性IBD的治療性模型(短期作用)(圖43-48)這個模型研究了EFD在慢性IBD中的治療性作用。方素6到7周大的C57Bl/6小鼠被分成4組，每組IO只小鼠。小鼠(C57Bl/6雄性小鼠)接受含1.5%DSS的飲用水7天、普通自來水8天、含1.5。/。DSS的飲用水5天、自來水10天、1.5n/。DSS5天，隨后飲用自來水。一組小鼠接受EFD處理在末次DSS詞喂后第7天皮下注射IOO昭或在首次詞喂DSS后的第42、43和44天口服lmg。它們不再接受EFD治療。試驗在第54天結(jié)束。第42天EFDlOOygs.c.或1mg口月艮x3"DS:S,1:5，D，S1:5%D，S,1;5%(0結(jié)果錢麟在這個慢性DSS誘導(dǎo)的IBD的治療性處理的模型中，從DSS攝入的第1天開始到之后的第54天內(nèi)，每周5天，每天都檢查每只小鼠的體重。在皮下EFD處理之后，在第54天觀察到輕微的治療性作用以及體重下降的恢復(fù)(圖43)。游床伊分根據(jù)先前的描述檢査評分(見實施例1)。只有在皮下EFD處理組中，臨床癥狀得到了減輕并接近于正常水平(圖44)。潛淑,在試驗結(jié)束時(第54天)，EFD處理小鼠的結(jié)腸與PBS處理小鼠的結(jié)腸大體相似(圖45上)。淋巴翁浙m^"在試驗結(jié)束時(第54天)，只有經(jīng)皮下EFD處理小鼠的淋巴結(jié)的細胞數(shù)目得到了減少，在EFD處理小鼠和PBS處理小鼠之間的差異是極為顯著的(圖45下)。同樣，只有經(jīng)皮下EFD處理小鼠的脾臟重量和脾細胞數(shù)28第54天目得到了減少(圖46)。微做艦贈微研究了在試驗結(jié)束時(第54天)收集到的脾細胞自發(fā)釋放一些炎癥細胞因子的情況。對于所有細胞因子而言，在PBS和EFD處理之間觀察到的差異都是極為顯著的，但是IL-17更為明顯(圖47)。如圖48上方所示，在慢性IBD之后，EFD處理小鼠的脾臟中的NF-KB濃度要低于PBS處理小鼠的脾臟，兩者之間的差異是非常顯著的(皮下處理)和極為顯著的(口服處理)。在慢性IBD之后，在PBS和EFD處理小鼠的脾臟中觀察到的PPAR-y水平顯示出了極為顯著的差異(圖48下)。無論哪種施用方式的EFD處理都容許小鼠具有比純真小鼠相似的或稍高的PPAR-y濃度。實施例VI:TNBS誘導(dǎo)的IBD的預(yù)防性模型(短期作用)方余C57Bl/6雄性小鼠在第-5和O天其結(jié)腸局部接受或未接受10(^1TNBS(lmg2,4，6-三硝基苯磺酸)50%乙醇溶液兩次。觀察小鼠的糞便10天。在第10天，給小鼠稱重。一組小鼠在第一次TNBS輸送前第5天(即第-10天)接受了皮下100昭EFD處理。第二組接受PBS。對照組沒有接受TNBS禾卩EFD。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>結(jié)條在開始TNBS處理后的第0天和第10天給動物稱重。接受過TNBS的小鼠體重下降了近2克，而未經(jīng)TNBS處理過的小鼠的體重增加了1克以上，而在TNBS之前接受過EFD的小鼠具有與試驗開始時相同的體重(圖15)。實施例總結(jié)DSS模型預(yù)P方性模型在急性模型(飼喂DSS5或7天-實施例I)和慢性模型(飼喂DSS5天，共三次，期間間隔5天-實施例II)中，在DSS飼喂之前第21天給予EFD(皮下或口服)。在臨床癥狀(體重、糞便情況)、組織病理學檢査、結(jié)腸組織和脾臟中的細胞因子/淋巴因子濃度、脾臟中的轉(zhuǎn)錄因子NFkB和PPARy水平等方面都觀察到了保護性作用。治疔性急性棋型在飼喂DSS5天后第24小時給予EFD(皮下或口服)(實施例III)。在試驗結(jié)束時(l個月后)，與PBS處理小鼠組相比較，EFD處理組小鼠的體重恢復(fù)的更快、癥狀更輕、生物學標記物更接近于正常值。治a牲和預(yù)^H生使性棋型在DSS飼喂7天后第48小時給予EFD(皮下或口服)，在第52天試驗結(jié)束前進行了共2個系列的5天DSS詞喂(實施例IV)。EFD處理組中的生物學標記物比PBS處理小鼠組更接近于正常值，存在EFD對臨床表現(xiàn)的作用，但并不顯著。治^性使性棋型在一系列DSS飼喂(包括DSS詞喂7天和2個系列的5天DSS飼喂)后第48小時給予EFD(皮下或口服)(實施例V)。在第54天試驗結(jié)束時，EFD處理組中的生物學標記物要比PBS處理小鼠組更接近于正常值。TNBS模型用TNBS進行的試驗包括少數(shù)小鼠的有限研究。在EFD處理后觀察到的炎癥反應(yīng)的減輕說明EFD能夠減輕純的T淋巴細胞依賴性免疫應(yīng)答。所有這些結(jié)果都說明EFD在不同的DSS誘導(dǎo)的IBD模型中都具有強大抗炎癥活性。在預(yù)防性處理中，EFD作用于臨床癥狀和生物學參數(shù)。在治療性處理中，它主要作用于生物學參數(shù)。存在著EFD對臨床癥狀的影響，但是在這些嚴重的慢性IBD模型中并不突出，不過要注意到處理和試驗結(jié)束(當進行測量時)之間的間隔是短短的12到19天。在TNBS誘導(dǎo)的IBD模型中也觀察到了EFD療效(實施例VI)，說明其在純的T淋巴細胞依賴的獲得性免疫應(yīng)答中也具有抗炎癥作用。通過這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明白本發(fā)明人已經(jīng)確認了本發(fā)明的革蘭氏陽性細菌制備物可以用于相關(guān)炎癥綜合征的預(yù)防和治療。事實上，本發(fā)明人已經(jīng)測定了涉及炎癥應(yīng)答的多個細胞因子(即IFNY、IL-6和IL-17)以及兩種轉(zhuǎn)錄因子(NFkB和PPAR力。實施例部分所示的結(jié)果表明本發(fā)明的革蘭氏陽性細菌制備物不僅具有作用于Thl信號傳導(dǎo)途徑(TNF-a、IL-12、IFN-y和T-bet與此途徑相關(guān))的性能，還具有作用于Th2信號傳導(dǎo)途徑(IL-4、IL-13和GATA-3與此途徑相關(guān))以及新的信號傳導(dǎo)途徑(IL-17和PPARy似乎與此途徑相關(guān))的性能(YoungY.CurrentGastroenteroloRep2006Dec;8(6):470-7)。權(quán)利要求1.革蘭氏陽性細菌制備物用于預(yù)防和治療腸道炎癥綜合征的用途，所述制備物的特征在于，所述革蘭氏陽性細菌是滅活的或非感染性的，并含有超過50％、且優(yōu)選地超過90％的天然結(jié)構(gòu)的細菌蛋白組分。2.權(quán)利要求1的革蘭氏陽性細菌制備物的用途，其中所述滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物是通過利用不會變性細菌所含分子的結(jié)構(gòu)的方法獲得的。3.權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌。4.權(quán)利要求3的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌是牛型分枝桿菌(Afyco6a"eWww6ov/力BCG。5.權(quán)利要求1到4中任一項的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是通過凍干法滅活的。6.權(quán)利要求1到5中任一項的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是被深度凍干滅活的。7.權(quán)利要求1到6中任一項的用途，其特征在于所述腸道炎癥綜合征是選自由克隆病和潰瘍性結(jié)腸炎組成的組中的炎性腸病。8.用于預(yù)防或治療因Thl/Th2失衡引起的疾病的方法，所述方法包括以下歩驟a)提供滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物或其保留了抑制腸道炎癥綜合征的能力的部分；和b)給患有所述疾病的患者施用有效量的所述滅活的革蘭氏陽性細菌制備物或其部分。9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于所述疾病是選自由克隆病和潰瘍性結(jié)腸炎組成的組中的炎性腸病。10.權(quán)利要求8或9的方法，其特征在于革蘭氏陽性細菌是革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌。11.權(quán)利要求10的方法，其特征在于革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌是牛型分枝桿菌BCG。12.用于預(yù)防或治療腸道炎癥綜合征的方法，所述方法的步驟包括給患者施用有效量的滅活的革蘭氏陽性細菌制備物，由此刺激產(chǎn)生白細胞的調(diào)節(jié)細胞。13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述腸道炎癥綜合征是克隆病或潰瘍性結(jié)腸炎。14.權(quán)利要求12或13的方法，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是通過凍干法滅活的。15.權(quán)利要求12或13的方法，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是深度凍干滅活的。16.權(quán)利要求12到15中任一項的方法，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌。17.權(quán)利要求16的方法，其特征在于所述革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌是牛型分枝桿菌BCG。18.權(quán)利要求12到17中任一項的方法，其特征在于所述白細胞的調(diào)節(jié)細胞是CD4+CD25+T細胞、B細胞和/或樹突狀細胞。19.用于治療和/或預(yù)防腸道的炎性腸病的組合物，其含有通過以下步驟制備的革蘭氏陽性細菌組合物a.收集活細菌細胞的培養(yǎng)物；b.在水中或在鹽如硼酸鹽的水溶液中洗滌所述細菌細胞；c.將所述細菌細胞冷凍于水中或鹽例如硼酸鹽的水溶液中；d.通過在凍干機中干燥一段足以去除至少98.5%的水、優(yōu)選地至少99%的水、更優(yōu)選地至少99.5%的水的時間來滅活所述冷凍的細菌細胞；和e.收集深度凍干的細菌細胞。20.革蘭氏陽性細菌制備物在生產(chǎn)用于預(yù)防或治療腸道的炎性腸病的藥物中的用途，其中在所述革蘭氏陽性細菌制備物中，革蘭氏陽性細菌是滅活的或非感染性的，并含有超過50%、且優(yōu)選地超過90%的天然結(jié)構(gòu)的細菌蛋白組分。21.權(quán)利要求20的用途，其中所述滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌制備物是通過利用不會變性細菌所含分子的結(jié)構(gòu)的方法獲得的。22.權(quán)利要求20的用途，其中如權(quán)利要求19所述制備革蘭氏陽性細菌制備物。23.權(quán)利要求20到22中任一項的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌。24.權(quán)利要求23的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌是牛型分枝桿菌BCG。25.權(quán)利要求20到24中任一項的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是通過凍干法滅活的。26.權(quán)利要求20到25中任一項的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是深度凍干滅活的。27.權(quán)利要求20到26中任一項的用途，其特征在于所述炎性腸病選自由克隆病和潰瘍性結(jié)腸炎組成的組。28.革蘭氏陽性細菌制備物用于預(yù)防或治療因Thl/Th2失衡引起的疾病的用途，所述制備物的特征在于所述革蘭氏陽性細菌是滅活的或非感染性的，并含有超過50%、且優(yōu)選地超過卯％的天然結(jié)構(gòu)的細菌蛋白組分。29.權(quán)利要求28的用途，其特征在于所述疾病是選自由克隆病和潰瘍性結(jié)腸炎組成的組中的炎性腸病。30.權(quán)利要求28或29中的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌。31.權(quán)利要求30的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌是牛型分枝桿菌BCG。32.革蘭氏陽性細菌制備物在生產(chǎn)用于預(yù)防或治療因Thl/Th2失衡引起的疾病的藥物中的用途，所述制備物的特征在于所述革蘭氏陽性細菌是滅活的或非感染性的，并含有超過50%、且優(yōu)選地超過90%的天然結(jié)構(gòu)的細菌蛋白組分。33.權(quán)利要求32的用途，其特征在于所述疾病是選自由克隆病和潰瘍性結(jié)腸炎組成的組中的炎性腸病。34.權(quán)利要求32或33中的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性細菌是革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌。35.權(quán)利要求34的用途，其特征在于所述革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌是牛型分枝桿菌BCG。全文摘要本發(fā)明涉及滅活的或非感染性的革蘭氏陽性細菌例如革蘭氏陽性的兼性胞內(nèi)菌例如分枝桿菌用于治療腸道炎癥綜合征例如克隆病或潰瘍性結(jié)腸炎的用途。文檔編號A61K35/74GK101384270SQ200680053234公開日2009年3月11日申請日期2006年12月21日優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日發(fā)明者G·馬沙爾,H·貝爾科維爾,M·拉格朗迪,M·阿布哈桑尼申請人:巴斯德研究院;伊薩姆研發(fā)公司