專利名稱：一種c－FLIP反義寡核苷酸納米粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種c-FLIP反義寡核苷酸納米粒的制備方法。
背景技術(shù)：
反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)即為人工合成長度為10-30個堿基的DNA分子及其類似物，通過Watson-Crick堿基配對，與特定的mRNA或DNA發(fā)生特異性結(jié)合，從而抑制或封閉基因的表達(dá)，使其喪失活性，達(dá)到基因治療的目的。c-FLIP蛋白是細(xì)胞凋亡過程中的抑制蛋白，已證實c-FLIP表達(dá)于多種腫瘤中，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡障礙。c-FLIP-ASODN序列為5′-ACT TGT CCC TGC TCCTTG AA-3′，Mr＝6 000，下劃線部分為硫代修飾提高其穩(wěn)定性[Bannerman DD，Tupper JC，Ricketts WA，et al.Aconstitutive cytoprotective pathway protects endothelial cells from li-popolysaccharide-induced apoptosis [J]. J Biol Chem，2001，276(18)14924-14932.]。它可在mRNA水平抑制c-FLIP表達(dá)，從而恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的凋亡敏感性。
眼眶橫紋肌肉瘤(RMS)為兒童期最常見的原發(fā)性眶內(nèi)惡性腫瘤，該腫瘤惡性度高，發(fā)展迅速，死亡率高，嚴(yán)重威脅患兒的生命。目前主要采取手術(shù)與放、化療結(jié)合的綜合治療，但治療效果不理想，預(yù)后較差。c-FLIP在RMS中高表達(dá)，而針對c-FLIP的ASODN，成為重建RMS腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的有效基因治療方法。
然而未經(jīng)包裹修飾的單純ASODN片段為親水性的聚陰離子，生物膜的通透性差，在體液中易受核酸酶的降解，并且對腫瘤組織缺乏靶向性，使其應(yīng)用受到了限制。因此，選擇安全有效的導(dǎo)入載體成為這項基因治療技術(shù)開展的關(guān)鍵。作為非病毒類載體系統(tǒng)新成員的納米粒(nanoparticles，NP)，因其穩(wěn)定性遠(yuǎn)好于脂質(zhì)體，且克服了病毒載體的生物毒性，原料來源廣泛，安全性高，成為研究的熱點。經(jīng)過納米材料包裹，可對ASODN起到保護(hù)和控釋作用。尤其在各種可作為傳遞ASODN的納米粒載體中，聚乳酸-聚羥乙酸(PolyD，L-lacticco-glycolic acid，PLGA)是經(jīng)過美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的一種高分子聚合體，成為基因載體的良好選擇。已有報道采用二次超聲乳化和溶劑揮發(fā)技術(shù)，PLGA制備成納米粒用于傳遞c-FLIP-ASODN。制備步驟簡要描述如下c-FLIP-ASODN(600μg)凍干粉適量溶于150ml超純水中，作為水相；將適量(50mg)PLGA溶于1.5ml乙酸乙酯中，作為油相；將水相與油相混合，冰浴條件下超聲乳化20s(功率20W)，形成初乳；取3ml1％PVA溶液加至初乳中，冰浴條件下再次超聲乳化20s(功率20W)，形成復(fù)乳；將復(fù)乳加至30ml 0.3％PVA溶液中，37℃水浴攪拌(400r/min)揮發(fā)有機(jī)溶劑乙酸乙酯，然后用高速離心機(jī)20000r/min離心10min，收集沉淀，超純水洗滌3次，制成凍干粉備用。[聶有華，魏銳利，李國棟等，載c-FLIP反義寡核苷酸聚乳酸-聚羥乙酸納米粒的制備及評價。第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，26(5)547-550.]該方法實用有效、簡便易行，但在制備過程中存在有機(jī)溶劑及聚乙烯醇(PVA)殘留較多的情況，它們對正常細(xì)胞都存在一定的毒性；同時制得的納米粒存在粒徑分布范圍偏廣(50-150nm)、平均粒徑較大(95.5nm)、載藥量低(0.579％)的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種有機(jī)溶劑及PVA殘留少、粒徑分布范圍窄、平均粒徑較小、載藥量提高的c-FLIP反義寡核苷酸納米粒制備的方法。本發(fā)明采用復(fù)乳-干燥法，是對上述制備方法的改進(jìn)，通過對有機(jī)溶劑和分散介質(zhì)的改變，增加了納米粒使用的安全性及納米粒粒徑大小的可控性，同時載藥量增加。一是有機(jī)溶劑以二氯甲烷替代了乙酸乙酯，因為二氯甲烷較乙酸乙酯的沸點低、易揮發(fā)，這樣有機(jī)溶劑殘留少，更加安全；二是在形成復(fù)乳的過程中分散介質(zhì)以泊洛沙姆188(Poloxamer188)替代了聚乙烯醇(PVA)。Poloxamer188(Pluronic F68)是目前可用于靜脈注射的水包油乳化劑之一，更為安全，且用其制備的乳劑，乳粒小，吸收率高。因此本發(fā)明采用Poloxamer188水溶液加入初乳后形成復(fù)乳，制備的納米粒的粒徑比較一致，物理性質(zhì)更加穩(wěn)定，平均粒徑較小，載藥量增加；另外，在形成復(fù)乳后，再與致孔劑PVA結(jié)合，減少了制備過程中PVA的使用與吸收，增加了使用的安全性。
具體方法為1.組分與配比c-FLIP反義寡核苷酸 330-1650μg聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA RG503H) 15-80mgPoloxamer1880.1％-5％(w/v)聚乙烯醇(PVA) 0.2-0.6％(w/v)二氯甲烷0.5-2.4ml緩沖液 75-350μl2.制備c-FLIP反義寡核苷酸納米粒(1)制備油相按配比將PLGA溶于有機(jī)溶劑二氯甲烷制成油相，濃度為30mg～50mg/ml；
(2)制備內(nèi)水相按配比將c-FLIP反義寡核苷酸溶于緩沖液形成內(nèi)水相，緩沖液可選自PBS(PH＝7.4)和TE緩沖液；(3)制備納米粒將內(nèi)水相加入上述油相冰浴超聲乳化形成初乳，按配比將Poloxamer188水溶液加入至初乳，繼續(xù)冰浴超聲乳化，形成復(fù)乳，將復(fù)乳倒入PVA水溶液中，室溫下繼續(xù)低速攪拌4小時(攪拌速度為300～600rpm)形成納米粒，用水洗滌，離心收集沉淀，冷凍干燥即可得納米粒干粉。
上述制備所得的c-FLIP反義寡核苷酸納米粒粒徑圓整、大小較均勻，粒徑集中分布在50-80nm內(nèi)，平均65.77nm；平均包封率達(dá)到48％，平均載藥量為0.697％；體外釋藥于第17.9天達(dá)到最終基本穩(wěn)定的平臺期；能有效保護(hù)寡核苷酸的水解。
具體實施例方式
現(xiàn)結(jié)合實施例，對本發(fā)明作詳細(xì)描述實施例1復(fù)乳-干燥法制備c-FLIP反義寡核苷酸納米粒取反義寡核苷酸660μg溶于150ul的緩沖液中(PBS pH＝7.4)作為內(nèi)水相，將50mg PLGA(RG503H)溶于1.5ml二氯甲烷中作為油相，將內(nèi)水相加入到油相冰浴超聲乳化20s(功率為20W)得初乳，將1％(w/v)poloxamer188水溶液3ml加入至初乳，繼續(xù)冰浴超聲乳化30s(功率為20W)形成復(fù)乳，將復(fù)乳倒入30ml 0.3％(w/v)的PVA水溶液中，室溫下低速攪拌4小時(攪拌速度為400rpm)，揮發(fā)去除有機(jī)溶劑，離心收集納米粒，超純水洗滌三次，冷凍干燥，得到本發(fā)明納米粒。
本發(fā)明制備方法所得的納米粒粒徑分布范圍窄，平均粒徑小，載藥量大，有機(jī)溶劑揮發(fā)較徹底，吸附的PVA少，使用更為安全。
權(quán)利要求
1.一種c-FLIP反義寡核苷酸納米粒的制備方法，按如下比例操作(1)制備油相將聚乳酸-羥基乙酸共聚物15-80mg溶于有機(jī)溶劑二氯甲烷0.5-2.4ml制成油相；(2)制備內(nèi)水相將c-FLIP反義寡核苷酸330-1650μg溶于緩沖液75-350μl形成內(nèi)水相，緩沖液為PH＝7.4的PBS或TE緩沖液；(3)制備納米粒將內(nèi)水相加入上述油相冰浴超聲乳化形成初乳，將0.1％-5％泊洛沙姆188水溶液加入至初乳，繼續(xù)冰浴超聲乳化，形成復(fù)乳，將復(fù)乳倒入0.2-0.6％聚乙烯醇水溶液中，室溫下以300-600rpm繼續(xù)攪拌形成納米粒，水洗后，離心收集沉淀，冷凍干燥即可得納米粒干粉制劑。
2.按權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于制備油相時所用的聚乳酸-羥基乙酸共聚物50mg，所用的二氯甲烷為1.5ml；制備內(nèi)水相時，所用的c-FLIP反義寡核苷酸為660μg，所用的緩沖液為PH7.4的PBS 150μl；制備納米粒時所用的泊洛沙姆188水溶液濃度為1％，用量為3ml，所用的聚乙烯醇水溶液濃度為0.3％，用量為30ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種c－FLIP反義寡核苷酸納米粒的制備方法。本發(fā)明采用復(fù)乳－干燥法制備c－FLIP反義寡核苷酸納米粒制劑。將適量c－FLIP－ASODN(600μg)溶于超純水中，作為水相；將適量聚乳酸－羥基乙酸共聚物(PLGA RG503H)溶于二氯甲烷中，作為油相；將水相與油相混合，冰浴條件下超聲乳化形成初乳；取泊洛沙姆188(Poloxamer188)溶液加至初乳中，冰浴條件下再次超聲乳化得到復(fù)乳；將復(fù)乳加至聚乙烯醇(PVA)溶液中，室溫下低速攪拌揮發(fā)有機(jī)溶劑，然后用離心收集沉淀，水洗后，制成凍干粉即可。本發(fā)明制備方法所得的納米粒粒徑分布范圍窄，平均粒徑小，載藥量大，有機(jī)溶劑揮發(fā)較徹底，吸附的PVA少，使用更為安全。
文檔編號A61K9/19GK1857224SQ20061002474
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月16日
發(fā)明者魏銳利, 聶有華, 馬曉曄, 朱煌, 梁莉 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)