專利名稱：土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化合物的新用途，具體涉及一種土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物的應用。
背景技術(shù)：
中藥土槿皮為松科植物金錢松(Pseudolarix Kaempferi Gorden)的干燥根皮或近根樹皮。最早見于清代趙學敏所著的《本草綱目拾遺》，性溫、味辛、有毒。歸肺、脾經(jīng)。具有殺蟲、止癢的功效。中醫(yī)臨床用于殺蟲止癢、手足癬、神經(jīng)性皮炎、癌腫等。
土槿皮乙酸是從土槿皮中提取出的一種有效成分，其化學結(jié)構(gòu)為二萜酸。在以往的應用和研究中，土槿皮乙酸主要用于抗真止血和神經(jīng)性皮炎等方面。有實驗報道，土槿皮乙酸能抑制肝癌細胞系的增殖，但作用機制不明確。土槿皮雖然已用于治療腫瘤，有一定療效，但由于其活性成分的作用機制尚不明確，限制了其作為抗癌藥物的開發(fā)以及與其他藥物的配伍使用。
土槿皮乙酸化學結(jié)構(gòu)式

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物的應用。
上述的目的通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)一種從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物的應用。
上述從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物直接作為抗癌藥物的應用。
上述從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物作抗癌藥物的先導化合物的應用。
這個技術(shù)方案有以下有益效果1.本發(fā)明，從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸可以與其他藥物配伍成抗癌新藥進行使用。
2.本發(fā)明，從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸也可以直接開發(fā)成抗癌藥物。
3.本發(fā)明，從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸作為抗癌藥物具有劑量小，起效快，效果明顯的特點。
4.本發(fā)明從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸作為抗癌藥物，其可以抑制腫瘤細胞的生成，促使腫瘤細胞的凋亡。


附圖1為在倒置顯微鏡觀察正常的HeLa細胞和加入濃度為5μM的土槿皮乙酸的HeLa細胞的示意圖；附圖2為在熒光顯微鏡下觀察正常的HeLa細胞和加入濃度為5μM的土槿皮乙酸的HeLa細胞的示意圖；附圖3為在倒置顯微鏡觀察正常的A375-S2細胞和加入濃度為5μM的土槿皮乙酸的A375-S2細胞的示意圖；附圖4為在熒光顯微鏡下觀察正常的A375-S2細胞和加入濃度為5μM的土槿皮乙酸的A375-S2細胞的示意圖；附圖5為土槿皮乙酸誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡后的HeLa細胞示意圖；附圖6為土槿皮乙酸誘導A375-S2細胞發(fā)生凋亡后的A375-S2細胞示意圖。
本發(fā)明的
具體實施例方式實施例1本發(fā)明采用2種細胞株進行細胞培養(yǎng)，通過形態(tài)學觀察方法、核熒光染色觀察及DNA片段化分析實驗證實了土槿皮乙酸誘導HeLa細胞和A375-S2細胞死亡機制為誘導細胞凋亡。土槿皮乙酸可以作為抗癌藥物的先導化合物，也可以直接開發(fā)成抗癌新藥或與其他藥物配伍成抗癌新藥。
土槿皮乙酸作為抗癌藥物具有劑量小，起效快，效果明顯的特點。
實驗一、細胞形態(tài)學觀察一、原理本實驗從細胞形態(tài)學上證實土槿皮乙酸的抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡的特征。有效的抗癌成分對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞有特定的生物學效應，能使提外腫瘤細胞產(chǎn)生形態(tài)學上的變化，抑制腫瘤細胞的生成，促使腫瘤細胞的凋亡。在光學顯微鏡下，凋亡細胞表現(xiàn)出，細胞核固縮，染色體斷裂，斷片沿核膜濃聚成多形性高密度顆粒區(qū)；核膜皺縮，崩解后包裹染色體彌散于細胞漿中；細胞全面皺縮，細胞膜皺縮外突；但細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能仍保持完整，內(nèi)容物無溢出；最后，細胞膜包裹細胞器或核片段形成比細胞小的凋亡小體。體外培養(yǎng)的貼壁細胞發(fā)生凋亡時，細胞變小變圓，失去粘附力從附著處脫落。經(jīng)熒光染料Hoechst 33258染色后，細胞內(nèi)會有顆粒形成。
實驗材料(一)材料和儀器1、人宮頸癌HeLa和人黑色素瘤A375-S2細胞；2、RPMI-1640培養(yǎng)液，10％胎牛血清、2mmol·L-1谷氨酰胺；3、0.25％胰蛋白酶；4、CO2培養(yǎng)箱，5％CO2，37℃；5、倒置顯微鏡；6、熒光顯微鏡(二)實驗方法1、倒置顯微鏡觀察以每瓶1×105個細胞的密度接種于50mL細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后加入濃度為0和5μM的土槿皮乙酸，分別于0，24h用倒置顯微鏡觀察。
2、熒光染色以每瓶1×105個細胞的密度接種于50mL細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后加入濃度為0和5μM的土槿皮乙酸，培養(yǎng)24h，收集細胞，PBS洗1次，1000×g離心5min，以1mL 3.7％多聚甲醛重懸細胞，室溫固定1h，1000×g離心5min，棄上清，用PBS洗1次，將細胞重懸于100μL PBS中，取細胞懸液10μL，加入2μL Hoechst 33258(1mM)，37℃染色15min，熒光顯微鏡下觀察。
三、結(jié)果如圖1-4所示，光學顯微鏡下觀察5μM土槿皮乙酸作用于細胞24h后細胞變圓，發(fā)泡，產(chǎn)生凋亡小體。熒光顯微鏡下觀察正常胞全部藍染，細胞壁完整，土槿皮乙酸5μM作用細胞24h后，可見明顯的粒狀熒光體聚集，即凋亡小體，是細胞發(fā)生凋亡的典型形態(tài)。
實驗二酶標儀檢測一、原理顯色劑噻坐藍(MTT)能被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物并沉積在細胞中，而死亡的細胞無此現(xiàn)象。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的藍紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接的反映活細胞的數(shù)量。在一定細胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細胞數(shù)成正比。本方法靈敏度高、重復性好、操作簡單、經(jīng)濟、實惠、易自動化、無放射性污染。
二、實驗材料(一)材料和儀器1、RPMI-1640培養(yǎng)液(Hyclone，Logan，UT，USA)；2、MTT；3、DMSO；4、酶聯(lián)免疫檢測儀(Tecan，Salzburg，Austria)(二)實驗方法以每孔5×104的細胞密度接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)過夜后分別加入0，0.16，0.8，4，20，100，500μM的土槿皮乙酸，于12，24，36，48h后每孔加入5mg/ml MTT 15μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，舍棄上清。每孔加DMSO 150μL，振蕩10min，以酶聯(lián)免疫儀在490nm測定OD值。
結(jié)果

實驗三DNA片段化電泳實驗一、原理細胞凋亡時核內(nèi)的內(nèi)切核酸酶活化，活化了的內(nèi)切核酸酶將DNA鏈在核小體連接區(qū)切成缺口，形成若干180～200bp或其倍數(shù)的寡核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈“階梯狀”圖譜(DNA ladder)。這被作為判斷有無凋亡發(fā)生的客觀指標之一。
二、實驗材料(一)材料和儀器1、RPMI-1640培養(yǎng)液；2、溴化乙錠；3、瓊脂糖；4、RNase；5、proteinase K(二)實驗方法收集1×106個以上的細胞，1000×g離心10min，用PBS洗2次，加入100μL細胞裂解液(10mM Tris-HCl pH 7.4，10mM EDTA pH 8.0，0.5％TritonX-100)4℃裂解10min，25000×g離心20min，收集上清液。加入40ng/LRNase，37℃孵育1h，再加入40ng/L proteinase K，37℃孵育1h，加入20μL5M NaCl和120μL異丙醇，-20℃過夜。25000×g離心15min，去上清，再次25000×g離心5min，去上清，用Tris-EDTA(pH7.5)緩沖液溶解沉淀，在加2μL的溴酚藍。用2％瓊脂糖凝膠100V電泳40min，0.5mg/L溴化乙錠染色15min，蒸餾水洗30min，紫外燈下拍照。
三、結(jié)果如圖5-6所示，2.5，5，10μM土槿皮乙酸作用36h后，可誘導HeLa、A375-S2細胞發(fā)生明顯的DNA片段化，即誘導細胞發(fā)生凋亡。
權(quán)利要求
1.一種從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物直接作為抗癌藥物的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物作抗癌藥物的先導化合物的應用。
全文摘要
土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物的應用，土槿皮乙酸是從土槿皮中提取出的一種有效成分，在以往的應用和研究中，土槿皮乙酸主要用于抗真止血和神經(jīng)性皮炎等方面。有實驗報道，土槿皮乙酸能抑制肝癌細胞系的增殖，但作用機制不明確。土槿皮雖然已用于治療腫瘤，有一定療效，但由于其活性成分的作用機制尚不明確，限制了其作為抗癌藥物的開發(fā)以及與其他藥物的配伍使用。本發(fā)明從金錢松根皮中提取的土槿皮乙酸作為誘導腫瘤細胞凋亡的藥物的應用，可以有效的解決以上的問題。本發(fā)明適合于與其他藥物配伍成抗癌新藥進行使用或直接制成抗癌藥物使用。
文檔編號A61P35/00GK101062026SQ200610009948
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日
發(fā)明者龔顯峰, 安巍巍, 李強, 趙學玲, 王陽, 吳振 申請人:黑龍江大學