專利名稱：一種抑制1a6/drim基因表達的小干擾rna及其作用位點的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA及其作用位點。
背景技術：
乳腺癌的發(fā)病率在世界范圍呈逐漸升高的趨勢，在我國已達到52/10萬。乳腺癌的術后復發(fā)轉(zhuǎn)移嚴重影響乳腺癌病人的預后，對乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的高危人群進行個體化治療是改變?nèi)橄侔┎∪祟A后的關鍵手段。胃癌是嚴重威脅人類健康的重大疾病，在我國腫瘤發(fā)病中居第3位。要想改善胃癌病人的預后也需要針對病人基因表達情況進行個體化治療。
RNA干擾(RNA interference)是近年來廣泛應用于沉默基因表達的一個有效而特異的新技術(Lipardi，C.，Wei，Q.，& Paterson，B.M.RNAi as randomdegradative PCRsiRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degradedto generate new siRNAs.Cell 107，297-307(2001)；Nykanen，A.，Haley，B.& Zamore，P.D.ATP requirements and small interfering RNA structure in theRNA interference pathway.Cell 107，309-321(2001)；Elbashir，S.M.et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells.Nature 411，494-498(2001))。人們發(fā)現(xiàn)在動物和植物細胞中天然存在長為19nt或21nt的小雙鏈RNA，這些小雙鏈RNA能將特異基因的mRNA降解成小的片段，起到基因沉默作用，這樣的小雙鏈RNA稱為小干擾RNA(smallinterfernce RNA，siRNA，or RNA interference，RNAi)。SiRMA可用于研究基因的功能，同時由于其特異性強，效果好，對腫瘤基因進行沉默具有預防和治療腫瘤的應用前景。
柯楊，徐國威等首先從一對胃癌細胞系中通過差異顯示技術分離得到腫瘤相關基因1A6(柯楊，徐國威，Koichi H，等.化學致癌作用靶基因的分離與測序，中國科學，1996，2685-91)；Schwirzke M從乳腺癌細胞系中分離得到DRIM(Schwirzke M，Gnirke A，Bork P，Tarin D，Weidle UH(1998)DifferentialGene Expression in Mammary Carcinoma Cell LinesIdentification of DRIM，a New Gene Down-Regulated in Metastasis.Anticancer Res 18，1409-22)。BLAST分析發(fā)現(xiàn)1A6與DRIM是同一基因，將該基因命名為1A6/DRIM。Xing X，DuX等對1A6/DRIM的啟動子的研究已發(fā)表在Gene雜志上(Xing X，Du X，Lu Z，NingT，Su X and Ke Y.Characterization of the promoter of 1A6/DRIM，a novelcancer-related gene and identification of its transcriptional activator.Gene，2005，344161-169)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供小干擾RNA抑制1A6/DRIM基因表達的一個作用位點。
本發(fā)明所提供的小干擾RNA抑制1A6/DRIM基因表達的一個作用位點，是雙鏈寡核苷酸序列，其自5′→3′方向的鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中的序列1由19個核苷酸組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端。
本發(fā)明的第二個目的是提供一個抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA。
本發(fā)明所提供的抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA，名稱為1A6/DRIMsiRNA，是由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成的雙鏈RNA正義鏈具有序列表中序列2的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列。
序列表中的序列2由19個核苷酸組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端，序列表中的序列3由19個核苷酸組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端。
上述抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA的編碼cDNA(1A6/DRIMsiRNA)的也屬于本發(fā)明的保護范圍。
抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA的1A6/DRIMsiRNA編碼cDNA具體可由具有下述核苷酸序列的有義鏈和反義鏈組成有義鏈(正義鏈)(不做模板的DNA鏈)具有序列表中序列4的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做模板的DNA鏈)具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
序列表中序列4由47個脫氧核苷酸組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中序列5由47個脫氧核苷酸組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端。
含有1A6/DRIMsiRNA的編碼基因的表達載體、細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制胃癌和乳腺癌的藥物。
本發(fā)明所提供的抑制胃癌和乳腺癌的藥物，它們的活性成分是上述抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA或攜帶所述抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA編碼基因的表達載體，如pSUPER-2-8。
上述藥物中還可含有佐劑DDA和/或MPL和/或Quil-A和/或RIBI佐劑和/或saline(生理鹽水)或其它佐劑，如鋁佐劑，福氏佐劑等。
本發(fā)明的藥物可制成注射液、粉劑、膏劑、納米制劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照基因藥物/寡核苷酸藥物領域的方法制備。
上述藥物的用量一般為20-200μg 1A6/DRIMsiRNA或含有1A6/DRIMsiRNA編碼基因的表達載體/kg體重/天，療程為10至20天，或在每次放射治療或化療前12-24小時用一次。
本發(fā)明的實驗表明1A6/DRIM在85％的乳腺癌中表達，在低轉(zhuǎn)移的乳腺癌中1A6/DRIM表達率為68％，而在高轉(zhuǎn)移的乳腺癌中1A6/DRIM表達率為100％；1A6/DRIMsiRNA可抑制1A6/DRIM的表達，使高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞的侵襲力顯著下降。在胃癌的發(fā)生過程中，1A6/DRIM的表達可作為胃癌發(fā)生發(fā)展的預警信號，1A6/DRIM表達陽性的胃粘膜癌前病變發(fā)展為胃癌的風險較1A6/DRIM表達陰性的胃粘膜癌前病變的風險高10倍，而1A6/DRIMsiRNA通過抑制1A6/DRIM的表達顯著抑制了胃癌細胞的增殖。本發(fā)明的抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA可用于治療1A6/DRIM基因表達陽性的胃癌和乳腺癌。


圖1為1A6/DRIM基因在腫瘤細胞內(nèi)的表達圖2為免疫組化檢測1A6/DRIM基因在胃癌腫瘤組織中的表達照片圖3為免疫組化檢測1A6/DRIM基因在乳腺癌組織中表達的照片圖4為1A6/DRIMsiRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞BGC-823細胞的Western Blotting圖譜圖5為1A6/DRIM的表達被1A6/DRIMsiRNA抑制后細胞增殖能力下降圖6為轉(zhuǎn)染s2-8后高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231的細胞侵襲力實驗結果具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、1A6/DRIM基因在腫瘤中的表達特點一、單克隆抗體6D9的制備單克隆抗體6D9按照1998年趙虹的學位論文“新的腫瘤相關基因1A6的功能研究”描述的方法制備，主要步驟如下1、表達載體pGEX1893的構建將1A6/DRIM的第7000至8640bp的1641bp片段(Schwirzke M，Gnirke A，Bork P，Tarin D，Weidle UH(1998)DifferentialGene Expression in Mammary Carcinoma Cell LinesIdentification of DRIM，a New Gene Down-Regulated in Metastasis.Anticancer Res 18，1409-22)經(jīng)DNA重組技術克隆到原核表達載體pGEX-5X-1(Promema)中，得到表達載體pGEX1893，DNA序列分析證明序列及閱讀框架正確，構建了原核表達載體pGEX1893。
2、GST-1A6/DRIM重組蛋白的誘導、表達及純化將表達質(zhì)粒pGEX1893導入大腸桿菌BL21(DE3)菌株，用IPTG誘導，用無轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)樣品作對照，取大腸桿菌全裂解液、大腸桿菌裂解上清和包含體提取物，行SDS-PAGE膠電泳，用考馬斯亮蘭染色，pGEX1893在大腸桿菌BL21(DE3)中表達分子量約82kD的目的蛋白，并且以包含體形式存在，用堿變性、電洗脫法提取包含體重組蛋白得到了GST-1A6/DRIM融合蛋白。
3、單克隆抗體的制備、鑒定用上述純化的GST-1A6/DRIM融合蛋白常規(guī)免疫Balb/c小鼠，效價達10-4時，將免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合。HAT選擇培養(yǎng)第5天，雜交瘤細胞生長，融合率為60％。融合后通過ELISA篩選與GST-1A6/DRIM融合蛋白反應強陽性的單克隆。選出能穩(wěn)定分泌抗GST-1A6/DRIM融合蛋白的雜交瘤細胞株，體外連續(xù)培養(yǎng)2個月以上及液氮凍存4個月后，仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。將上述雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)，均能誘導Balb/c小鼠產(chǎn)生抗人1A6/DRIM的腹水。腹水中抗體用高鹽-Protein A Sepharose-4B柱進行層析純化，用ELISA檢測純化的抗體，結果表明純化的抗體能與融合蛋白GST-1A6/DRIM特異反應，表明得到抗1A6/DRIM的單克隆抗體，將其命名為6D9。
二、利用單克隆抗體6D9檢測1A6/DRIM基因在腫瘤中的表達提取宮頸癌Hela，白血病細胞K-562，淋巴瘤細胞U266(American Type CellCollection)，前列腺癌細胞PC-3m，乳腺癌細胞MCF-7，高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231，鼠成纖維細胞NIH3T3和胃癌細胞BGC-823的細胞核和細胞漿蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以6D9為一抗，以辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG為二抗(中山公司)進行Western Blotting檢測1A6/DRIM的表達。同時以抗β-actin的抗體(中山公司)為一抗檢測β-actin，作為上樣對照；以抗DNA拓撲異構酶TopoI的抗體(Santa Cruz公司)為一抗檢測DNA拓撲異構酶TopoI，作為細胞核標記物。結果如圖1所示，表明1A6/DRIM基因在宮頸癌Hela，白血病細胞K-562，前列腺癌細胞PC-3m，乳腺癌細胞MCF-7，高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231和胃癌細胞BGC-823的細胞核內(nèi)表達。圖1中，N為細胞核蛋白，C細胞漿蛋白。
用抗1A6/DRIM的抗體6D9對胃癌和正常胃粘膜組織進行免疫組織化學分析，結果如圖2所示，表明1A6/DRIM基因在胃癌組織中的表達率遠大于在正常胃粘膜組織組織中的表達率(表達率為1A6/DRIM染色陽性的胃癌腫瘤細胞占所有胃癌腫瘤細胞的百分數(shù))。其中，免疫組織化學染色方法如下1、石蠟切片常規(guī)脫蠟二甲苯3次，每次60min→100％乙醇兩次，每次3min→→95％乙醇3min→75％乙醇3min→1×PBS；3％H2O2室溫10min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；2、抗原微波修復切片放入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中修復抗原，92℃-98℃至少維持10min后室溫冷卻20-30min；1×PBS洗3次每次5min，10％正常羊血清37℃封閉1小時；吸去羊血清，加入抗1A6/DRIM的抗體6D9(1∶200)4℃放置8小時；1×PBS洗3次每次5min，加入生物素標記的羊抗鼠IgG(中山公司)，37℃作用30min；1×PBS洗3次每次5min，加入辣根過氧化物酶標記的三抗鏈霉卵白素(HRP-Strepavidin)(中山公司)，37℃作用30min；1×PBS洗3次每次5min，DAB避光顯色5～10min，用水沖洗終止反應，10％蘇木精復染，1％鹽酸-酒精分色；逐級酒精脫水、二甲苯透明(75％乙醇3min→95％乙醇3min→100％乙醇→二甲苯兩次，每次3min)；中性樹膠加蓋玻片封片。
用抗1A6/DRIM的抗體6D9利用免疫組化的方法，對胃癌高發(fā)現(xiàn)場10年前瞻性隨訪的人群胃鏡樣本染色，發(fā)現(xiàn)在不同階段的進展組中，早期1A6/DRIM陽性者發(fā)展成腫瘤的幾率明顯大于10年中非進展者(表1)，表明1A6/DRIM在胃的癌前病變中的表達與其預后高度相關，提示1A6/DRIM可以作為胃癌前病變轉(zhuǎn)歸的一個預測指標。
表11A6/DRIM基因在進展性和非進展性胃粘膜疾病中的表達

aP＜0.001(X2＝12.229)，與非進展組比較；bP＜0.01(X2＝7.984)，與腸化生→腸化生組比較；cP＜0.05(X2＝5.641)，與腸化生→腸化生組比較；dP＜0.05(X2＝6.557)，與萎縮性胃炎→萎縮性胃炎比較；表達率為表達1A6/DRIM的例數(shù)與總例數(shù)的比值。
用抗1A6/DRIM的抗體6D9進行免疫組化分析乳腺癌組織和正常乳腺組織中1A6/DRIM基因的表達情況，結果表明1A6/DRIM在乳腺癌組織中的表達顯著上調(diào)(圖3，棕色為陽性染色)，1A6/DRIM的表達與乳腺癌的轉(zhuǎn)移高度相關(表2)，1A6/DRIM在85％的乳腺癌中表達，在低轉(zhuǎn)移的乳腺癌中1A6/DRIM表達率為68％，而在高轉(zhuǎn)移的乳腺癌中1A6/DRIM表達率為100％。表2中，“-”表示1A6/DRIM不表達“+”、“++”、“+++”分別表示1A6/DRIM表達強度依次增強。
表2.1A6/DRIM在高轉(zhuǎn)移乳腺癌和低轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中的表達情況

經(jīng)x2(Chisquare)檢驗，高轉(zhuǎn)移與低轉(zhuǎn)移組1A6/DRIM的表達存在顯著性差異(p＝0.003)。
實施例2、1A6/DRIMsiRNA抑制1A6/DRIM基因的表達一、1A6/DRIMsiRNA的轉(zhuǎn)染1、1A6/DRIMsiRNA的設計合成SiRNA的設計合成根據(jù)RNA干擾的原理，在1A6/DRIM基因的mRNA序列上選擇可能的具有抑制1A6/DRIM蛋白質(zhì)表達的siRNA序列，選擇條件如下選擇范圍在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的終止密碼前100bp內(nèi)，5端以AA開始3端以TT結尾的長19nt的序列，最后選擇了如下序列5’-GCCATAGCCTGAAAGATTT-3’。設計小干擾1A6/DRIMsiRNA(s2-8)，s2-8的正義鏈為5′-gccauagccu gaaagauuu-3′(序列2)；反義鏈為5′-aaaucuuuca ggcuauggc-3′(序列3)。陰性對照siRNA(s-NC)正義鏈序列為5’-ACU ACC GUU GUU AUA GGU G-3’，反義鏈為5’-ACC UAU AACAAC GGU AGU-3’。
小干擾1A6/DRIMsiRNA(s2-8)和s-NC按常規(guī)方法化學合成，經(jīng)PAGE純化。
2、1A6/DRIMsiRNA的轉(zhuǎn)染將s2-8通過LipofectAMINE2000(Invitrogen公司產(chǎn)品)轉(zhuǎn)染胃癌細胞系BGC-823或高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞系MDA-MB231細胞，同時將陰性對照s-NC轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染48，72，96，120和144小時分別提取細胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用抗1A6/DRIM單克隆抗體6D9進行Western Blotting檢測1A6/DRIM的表達，同時以抗β-actin的抗體(中山公司)為一抗檢測β-actin，作為上樣對照。實驗結果顯示在轉(zhuǎn)染后48、72、96、120至144小時，1A6/DRIMsiRNA在BGC-823和MDA-MB231細胞中均能抑制1A6/DRIM的表達。其中，1A6/DRIMsiRNA抑制1A6/DRIM基因在BGC-823中的表達結果如圖4所示。圖4中，s2-8表示s2-8轉(zhuǎn)染的細胞，s-NC表示s-NC轉(zhuǎn)染的細胞。
s2-8或s-NC轉(zhuǎn)染BGC-82348小時后，分別將500個細胞接種于6mm培養(yǎng)皿，進行克隆形成實驗，并用抗1A6/DRIM單克隆抗體6D9進行Western Blotting檢測1A6/DRIM的表達，以抗β-actin的抗體為一抗檢測β-actin，作為上樣對照。結果表明轉(zhuǎn)染s2-8的BGC-823克隆形成能力降低，1A6/DRIM的表達量降低，說明內(nèi)源1A6/DRIM的表達被抑制后BGC-823細胞的生長被抑制(圖5)。圖5中，a為s2-8或s-NC轉(zhuǎn)染BGC-823細胞后，克隆形成實驗結果；823-s-NC為轉(zhuǎn)染s-NC的BGC-823細胞，823-s2-8為轉(zhuǎn)染s2-8的BGC-823細胞。圖5中b為s2-8或s-NC轉(zhuǎn)染BGC-82348小時后的Western blot分析結果，823為未轉(zhuǎn)染的BGC-823細胞，823-s-NC為轉(zhuǎn)染s-NC的BGC-823細胞，823-s2-8為轉(zhuǎn)染s2-8的BGC-823細胞，β-actin為上樣對照。圖5中c為三次克隆形成實驗結果的總結，823-s-NC為轉(zhuǎn)染s-NC的BGC-823細胞，823-s2-8為轉(zhuǎn)染s2-8的BGC-823細胞。
3、細胞侵襲實驗--Matrigel穿膜侵襲實驗取s2-8或s-NC轉(zhuǎn)染48小時后的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231(ATCC)，消化后進行活細胞計數(shù)，用含0.1％血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整至6×104個/ml。在Matrigel Invasion Chamber(BD公司產(chǎn)品)中加入含3×104個細胞的細胞懸液500μl，在Matrigel Invasion Chamber的下面加入0.75ml的含10％血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2孵育箱中培養(yǎng)24h。吸去上室液體，濕棉簽擦去膜表面未侵襲的細胞及Matrigel，生理鹽水漂洗，稍干，甲醇固定30min，常規(guī)H.E.染色。每組設3個平行樣本，計數(shù)每張膜的穿膜細胞數(shù)。每組實驗平行兩孔進行，實驗重復3次，將實驗結果進行統(tǒng)計學分析。同時并用抗1A6/DRIM單克隆抗體6D9對s2-8或s-NC轉(zhuǎn)染48小時后的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231進行WesternBlotting檢測1A6/DRIM的表達，以抗β-actin的抗體為一抗檢測β-actin，作為上樣對照。Western Blotting檢測結果如圖6中A所示，表明轉(zhuǎn)染s2-8的MDA-MB231的1A6/DRIM的表達量降低，β-actin為上樣對照。細胞侵襲實驗結果如圖6中B和表3所示，轉(zhuǎn)染s2-8的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231體外侵襲能力下降，MDA-MB231內(nèi)源性1A6/DRIM的表達被抑制后，細胞侵襲力下降10倍(表3)，說明抑制1A6/DRIM的表達對乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移起到顯著抑制作用。圖6中，MDA-MB231-s2-8為轉(zhuǎn)染s2-8的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231，MDA-MB231-s-NC為轉(zhuǎn)染s-NC的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231；A為Western Blotting檢測1A6/DRIM的抑制情況，B為具有侵襲力的細胞的穿過Matrigel Invasion Chamber的細胞染色。
表3、細胞侵襲力實驗結果

二、1A6/DRIMsiRNA表達載體的轉(zhuǎn)染1.1A6/DRIMsiRNA表達載體的構建根據(jù)構建siRNA載體pSUPER(Invitrogen公司)的要求，合成如下兩條寡核苷酸正義鏈5’-GATCCCC GCC ATA GCC TGA AAG ATTT ttcaagaga AAAT CTT TCAGGC TAT GGC GGG-3’，反義鏈5’-AGCTTTTCCAAAAA GCC ATA GCC TGA AAG ATTTtctcttgaa AAAT CTT TCA GGC TAT GGC GGG-3’。siDNA鏈上游和下游分別加了BglII粘性末端和Hind III粘性末端。按常規(guī)方法由奧科公司合成1A6/DRIMsiDNA寡核苷酸序列。將正義鏈和反義鏈經(jīng)退火反應形成5’端BglII粘性末端和3’端HindIII粘性末端的雙鏈DNA。
pSUPER質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Hind III酶切后，用T4DNA連接酶與以上的雙鏈DNA連接(4℃，12h)，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，涂含有50mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)平板，取單菌落搖菌測序。提取序列正確的菌落中的質(zhì)粒，得到在BamH I和HindIII識別位點間插入有1A6/DRIMsiDNA的結構正確的質(zhì)粒pSUPER2-8，即為1A6/DRIMsiRNA表達載體。
2.細胞轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒pSUPER2-8通過LipofectAMINE2000(Invitrogen公司產(chǎn)品)轉(zhuǎn)染胃癌細胞系BGC-823或高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞系MDA-MB231細胞，同時設一陰性對照pSUPER-NC(Invitrogen)，即攜帶不與任何人的基因配對的無關siDNA的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染48，72，96，120和144小時分別提取細胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用抗1A6/DRIM單克隆抗體6D9進行Western Blotting檢測1A6/DRIM的表達，同時以抗β-actin的抗體(中山公司)為一抗檢測β-actin，作為上樣對照。實驗結果顯示在轉(zhuǎn)染后48、72、96、120至144小時，1A6/DRIMsiRNA在BGC-823和MDA-MB231細胞中均能抑制1A6/DRIM的表達。轉(zhuǎn)染pSUPER2-8的抑制效果與轉(zhuǎn)染s2-8的相同。
pSUPER2-8或pSUPER-NC轉(zhuǎn)染BGC-82348小時后，分別將500個細胞接種于6mm培養(yǎng)皿，進行克隆形成實驗，并用抗1A6/DRIM單克隆抗體6D9進行WesternBlotting檢測1A6/DRIM的表達，以抗β-actin的抗體為一抗檢測β-actin，作為上樣對照。結果表明轉(zhuǎn)染pSUPER2-8的BGC-823克隆形成能力降低，1A6/DRIM的表達量降低，說明內(nèi)源1A6/DRIM的表達被抑制后BGC-823細胞的生長被抑制。轉(zhuǎn)染pSUPER2-8的抑制效果與轉(zhuǎn)染s2-8的相同。
4、細胞侵襲實驗-Matrigel穿膜侵襲實驗取pSUPER2-8或pSUPER-NC轉(zhuǎn)染48小時后的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231(ATCC)，消化后進行活細胞計數(shù)，用含0.1％血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整至6×104個/ml。在Matrigel Invasion Chamber(BD公司產(chǎn)品)中加入含3×104個細胞的細胞懸液500μl，在Matrigel Invasion Chamber的下面加入0.75ml的含10％血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2孵育箱中培養(yǎng)24h。吸去上室液體，濕棉簽擦去膜表面未侵襲的細胞及Matrigel，生理鹽水漂洗，稍干，甲醇固定30min，常規(guī)H.E.染色。每組設3個平行樣本，計數(shù)每張膜的穿膜細胞數(shù)。每組實驗平行兩孔進行，實驗重復3次，將實驗結果進行統(tǒng)計學分析。同時并用抗1A6/DRIM單克隆抗體6D9對pSUPER2-8或pSUPER-NC轉(zhuǎn)染48小時后的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231進行Western Blotting檢測1A6/DRIM的表達，以抗β-actin的抗體為一抗檢測β-actin，作為上樣對照。Western Blotting檢測結果表明轉(zhuǎn)染pSUPER2-8的MDA-MB231的1A6/DRIM的表達量降低，β-actin為上樣對照。轉(zhuǎn)染pSUPER2-8的抑制效果與轉(zhuǎn)染s2-8的相同。細胞侵襲實驗結果表明轉(zhuǎn)染pSUPER2-8的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB231體外侵襲能力下降，MDA-MB231內(nèi)源性1A6/DRIM的表達被抑制后，細胞侵襲力下降10倍，說明抑制1A6/DRIM的表達對乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移起到顯著抑制作用。
序列表<160>5<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gccatagcct gaaagattt19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gccauagccu gaaagauuu19<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3aaaucuuuca ggcuauggc 19<210>4<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gccatagcct gaaagatttt tcaagagaaa atctttcagg ctatggc 47<210>5<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>5gccatagcct gaaagatttt ctcttgaaaa atctttcagg ctatggc 4權利要求
1.小干擾RNA抑制1A6/DRIM基因表達的一個作用位點，是雙鏈寡核苷酸序列，其自5′→3′方向的鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列。
2.抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA，是由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成的雙鏈RNA正義鏈具有序列表中序列2的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列。
3.權利要求1所述的抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA的編碼基因。
4.根據(jù)權利要求3所述的基因，其特征在于所述抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA的編碼基因，是由具有下述核苷酸序列的有義鏈和反義鏈組成有義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID№4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權利要求3或4所述基因的表達載體。
6.含有權利要求3或4所述基因的細胞系。
7.含有權利要求3或4所述的基因的和宿主菌。
8.一種抑制胃癌的藥物，它的活性成分是權利要求2所述的抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA或攜帶所述抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA編碼基因的表達載體。
9.一種抑制乳腺癌的藥物，它的活性成分是權利要求2所述的抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA或攜帶所述抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA編碼基因的表達載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA及其作用位點。小干擾RNA抑制1A6/DRIM基因表達的一個作用位點，是雙鏈寡核苷酸序列，其自5′→3′方向的鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列。抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA，是由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成的雙鏈RNA正義鏈具有序列表中序列2的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列。本發(fā)明的抑制1A6/DRIM基因表達的小干擾RNA可用于治療1A6/DRIM基因表達陽性的胃癌和乳腺癌。
文檔編號A61K48/00GK1772894SQ200510112539
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月10日 優(yōu)先權日2005年10月10日
發(fā)明者柯楊, 杜曉娟, 呂文清, 寧濤, 趙紅, 李寧 申請人:北京大學