專利名稱：一種含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥制劑及其制備方法。具體的說是一種含有丹參水溶性成分提取物和降香揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的凍干粉針及其制備方法。

背景技術(shù)：
丹香冠心注射液、香丹注射液、復(fù)方丹參注射液是治療心絞痛、心肌梗塞的注射液，具有活血化淤、理氣開竅、擴(kuò)張血管、增進(jìn)冠狀動(dòng)脈血流量、降低心肌耗氧量的作用。其處方均為降香和丹參以不同配比構(gòu)成。
丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根及根莖；丹參有祛瘀生新，消腫止痛，活血通經(jīng)，清心除煩之功能。
降香為豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T.Chen樹干和根的干燥心材。別名絳香、降真香等。具有行氣活血，止痛，止血的功能。主治脘腹疼痛，肝郁脅痛，胸痹刺痛，跌撲損傷，外傷出血等。
兩藥合用具有擴(kuò)張血管、增加冠狀動(dòng)脈血流量、保護(hù)缺血缺氧的心肌、清除自由基、改善血液流變性、改善微循環(huán)、抗血小板聚集、防止血栓形成、降低血粘度、降血壓、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種作用，為治療心腦血管疾病的藥物，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用。
丹參中主要有效成分有水溶性成分和脂溶性成分兩大類脂溶性成分為二萜醌類化合物，主要是丹參酮、丹參酮IIA、隱丹參酮等；水溶性成分為酚酸類化合物，是丹參心血管系統(tǒng)藥理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，主要有丹參酚酸、丹參素、原兒茶醛等。藥理研究表明丹參酚酸類成分具有抗血小板聚集作用，抗血栓形成作用，改善微循環(huán)作用，抗氧化損傷作用和多途徑發(fā)揮心肌保護(hù)作用。丹參酚酸B有抗心肌缺血，抗血小板聚集，提高心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞耐缺氧能力，減輕炎性因子對內(nèi)皮、心肌細(xì)胞的損害的作用。丹參素有縮小心肌梗塞范圍和減輕病變程度的作用，還具有保護(hù)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化酶的作用。
降香的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油，揮發(fā)油中主要成分為反式-橙花叔醇，反式-β-金合歡烯、β-沒藥烯等。降香對心腦血管系統(tǒng)發(fā)揮作用的主要成分是揮發(fā)油，有實(shí)驗(yàn)表明降香揮發(fā)油及芳香水可明顯抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性血栓形成，提高孵育兔血小板cAMP的水平，促進(jìn)兔血漿纖溶酶活性，具有抗血栓形成的作用。
眾所周知，由于降香揮發(fā)油是脂溶性成分，在水中溶解度較小，幾乎不溶于水，且穩(wěn)定性較差；而目前現(xiàn)有的制備工藝均為將降香刨成薄片，加水浸潤后，水蒸氣蒸餾，收集蒸餾液，冷藏，分去油層。只采用降香揮發(fā)油的水飽和溶液，油層部分被棄之，造成藥材資源的極大浪費(fèi)。
而丹參中含有丹參素、原兒茶醛等多種水溶性酚類化合物，性質(zhì)不穩(wěn)定，在水溶液中易被氧化，在制成注射液，尤其是水針時(shí)，由于長時(shí)間存在于水溶液中易發(fā)生變化，從而導(dǎo)致成品色澤加深；有的還含有丹參酮等脂溶性成分，在水溶液中易發(fā)生水解、氧化、聚合等理化變化，使活性物質(zhì)含量下降，毒性增加。因此，該方制成水針存在一定弊端。


發(fā)明內(nèi)容
為突破目前丹參、降香方制成注射用粉針存在的瓶頸，本發(fā)明提供一種質(zhì)量穩(wěn)定、有效成分含量高的含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針及其制備方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針，它是由丹參的水溶性成分提取物與降香揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物組成。其中丹參水溶性成分提取物2～6份；降香揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物4～8份，其中降香揮發(fā)油與羥丙基-β-環(huán)糊精的體積重量比為1∶1～150。較好為1∶5～70，最佳為1∶10～45。
本發(fā)明所述的丹參的水溶性成分提取物，是采用水或任意比例的乙醇，優(yōu)選30-95％乙醇提取，經(jīng)大孔吸附樹脂分離純化制成。具體步驟包括取丹參藥材粉碎成粗粒；分別用水或任意比例的乙醇提取，提取方法包括反復(fù)煎煮、熱回流、滲漉、超聲、微波；提取液經(jīng)減壓(60～70℃)濃縮或不經(jīng)濃縮；提取液除盡乙醇后用2M鹽酸調(diào)pH值至1～4，優(yōu)選調(diào)至2～3，靜置，濾過，濾液經(jīng)HPD-100、D101、AB-8或者LSA-30大孔樹脂柱吸附，水洗脫雜質(zhì)，用30％～70％的乙醇洗脫；收集洗脫液，除盡乙醇，制得含丹參素、丹酚酸B含量為20～95％的丹參水溶性成分提取物。優(yōu)選制得的提取物中含丹參素、丹酚酸B、為60～95％。
本發(fā)明所述的羥丙基-β-環(huán)糊精包合降香揮發(fā)油，制備方法為包括下列步驟 1.按體積重量比(ml/g)1∶1～150稱取降香揮發(fā)油和羥丙基-β-環(huán)糊精。將羥丙基-β-環(huán)糊精溶于水中，比例為1∶1～200(重量體積比)。
2.將含羥丙基-β-環(huán)糊精的水溶液在水浴中高速攪拌，緩慢滴加降香揮發(fā)油，全部滴加完畢后，密閉容器，繼續(xù)高速攪拌0.5～16小時(shí)，其中高速攪拌包括電力攪拌器攪拌、膠體磨研磨、高壓/低壓均漿機(jī)均漿。室溫靜置或冰箱中冷藏1～36小時(shí)； 3.用0.22μm或0.45μm微孔濾膜過濾，濾液經(jīng)灌裝，冷凍干燥。得疏松白色粉末，即為降香揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。
復(fù)方丹參凍干粉針的制備包括下列方法 1.丹參水溶性成分提取物溶液加入羥丙基-β-環(huán)糊精攪拌溶解，在30～70℃水浴中，將降香揮發(fā)油緩慢滴加到劇烈攪拌的上述溶液中，滴加完畢后繼續(xù)劇烈攪拌30～300分鐘，靜置，用2M氫氧化鈉溶液調(diào)pH至偏酸性，優(yōu)選調(diào)至pH5～6，得降香揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物藥液；或 2.用注射用水溶解羥丙基-β-環(huán)糊精，照上述方法包合降香揮發(fā)油后再與丹參水溶性成分提取物混合，用2M氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至偏酸性，優(yōu)選調(diào)至pH5～6。
3.上述兩種方法制得的溶液，經(jīng)超濾膜濾過，微孔濾膜濾過，分裝，冷凍干燥，制得含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針。
丹參水溶性成分提取物以丹參素、丹參酚酸B為含量測定指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定含量，色譜條件C18柱(200×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相甲醇-乙腈-水-冰醋酸(33∶9∶56∶2)，流速1.0ml/min，檢測波長280nmm。
降香揮發(fā)油以反式-橙花叔醇為含量測定指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定含量，色譜條件C18柱(250×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相甲醇-水(85∶15)，流速1.0ml/min，檢測波長210nm。
經(jīng)初步試驗(yàn)，丹參水溶性成分凍干粉針穩(wěn)定性好，藥理作用強(qiáng)；降香揮發(fā)油與羥丙基-β-環(huán)糊精按一定比例包合后，降香揮發(fā)油的溶解度極大地提高，穩(wěn)定性也有較大提高。
為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的積極效果，采用本發(fā)明制得的含有丹參酚酸B、丹參素的丹參水溶性成分提取物進(jìn)行部分藥理實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果表明 1、對心肌的作用 (1)具有縮小心肌梗死范圍和減輕病情的作用。觀察結(jié)扎兔心左前降支1/2處所造成的小范圍心肌梗死，丹參水溶性成分提取物治療組與生理鹽水對照組有明顯的差異；對于結(jié)扎兔心左前支上1/3處所造成的較大范圍的心肌梗死，丹參水溶性成分提取物治療組明顯小于對照組。提示提取物具有明顯縮小心肌梗死范圍和減輕病變程度的作用。
(2)具有對在鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。采用Langendorff灌注模型，對心肌缺血再灌注損傷中氧自由基清除酶系統(tǒng)超氧化歧化酶(SDD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)和超微結(jié)構(gòu)的變化及丹參素的抗氧化效應(yīng)進(jìn)行了觀察，證實(shí)其具有保護(hù)心肌缺血的作用，提取物的保護(hù)作用明顯優(yōu)于公認(rèn)的具有抗氧化作用的亞硒酸鈉。
2、改善微循環(huán)及抗凝作用 (1)具有改善微循環(huán)障礙及降低血漿乳酸含量的作用。對靜脈注射高分子右旋糖苷造成家兔微循環(huán)障礙，給予丹參水溶性成分提取物可明顯增加兔眼球結(jié)膜毛細(xì)血管數(shù)并降低兔血漿乳酸含量。這表明提取物具有改善微循環(huán)障礙作用，從而改善細(xì)胞缺血缺氧所導(dǎo)致的代謝障礙。
(2)具有提高機(jī)體抗凝和纖溶活性作用。用放免法測定6-Keto-PGF，用發(fā)色底物測定纖溶活性(PA)以及它的抑制物(PAI)，用發(fā)色底物間接測定血栓調(diào)理蛋白的活性，證明丹參水溶性成分提取物能促進(jìn)牛皮細(xì)胞PA，提高PGI的產(chǎn)量，降低PAI的活性。
(3)具有明顯的抗凝血及抑制體外血栓形成的作用。采用大白鼠靜脈注射前后自身對照的方法，間歇不同時(shí)間從心臟抽血，測定各種指標(biāo)，結(jié)果顯示注射含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針后體外血栓形成時(shí)間延長，血栓長度縮短，重量減輕。顯示凍干粉針有抑制體外血栓形成的作用。
3、對血管的作用 (1)對冠脈的影響。采用改良的Ogltee離體冠脈恒速灌流裝置，以灌流壓變化反映冠脈的舒縮活動(dòng)，證明丹參水溶性成分提取物在1.0mg/L時(shí)，能顯著舒張離體豬冠狀動(dòng)脈，降低灌注壓。而丹參的其他成分DS-201，DS-781或原兒茶醛都顯著收縮豬的冠脈。嗎啡能引起清醒狗的冠脈收縮，但給予丹參水溶性成分提取物后可使收縮的冠脈舒張，表明在急性心肌梗死時(shí)如用嗎啡鎮(zhèn)痛的同時(shí)給予提取物以拮抗其潛在的收縮冠脈效應(yīng)可能會(huì)是有益的。
(2)拮抗低氧性肺血管收縮作用。將離體豚鼠肺動(dòng)脈誘發(fā)低氧性肺血管收縮(HPV)。丹參水溶性成分提取物濃度在1.25-5g/L時(shí)均能抑制HPV。劑量越大，抑制作用越強(qiáng)，最后達(dá)到完全抑制。
4、對血細(xì)胞的作用 (1)對血小板聚集性及血小板膜流動(dòng)性的影響。丹參水溶性成分提取物能明顯抑制血小板的聚集性，而且在抑制血小板聚集劑量的丹參素作用下，血小板膜流動(dòng)性明顯增加，表明丹參水溶性成分提取物治療冠心病有效，可能與糾正冠心病患者血小板膜的分子缺陷，增加血小板膜的流動(dòng)性有關(guān)。
(2)對體外循環(huán)中血細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)表明，丹參水溶性成分提取物可減少紅細(xì)胞的破壞，其作用途徑是提高紅細(xì)胞的負(fù)電荷，使彼此不易聚集，激活纖溶酶系統(tǒng)；增加紅細(xì)胞膜的機(jī)械強(qiáng)度。
為進(jìn)一步證明本發(fā)明凍干粉針的穩(wěn)定性及實(shí)用性，分別進(jìn)行了加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、安全性試驗(yàn)，結(jié)果表明本發(fā)明的凍干粉針質(zhì)量穩(wěn)定，安全性符合注射劑質(zhì)量要求，可滿足臨床用藥需要?，F(xiàn)分述如下 1、含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 材料與方法 樣品含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針樣品批號實(shí)施例2凍干粉針。
試驗(yàn)條件37～40℃，相對濕度75％。
考察時(shí)間0月、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月。
考察項(xiàng)目性狀、pH值、水分、熱原、無菌、丹酚酸B含量測定； 表1樣品加速穩(wěn)定性試驗(yàn)報(bào)告 試驗(yàn)結(jié)果含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針在本試驗(yàn)條件下很穩(wěn)定。
2、安全性試驗(yàn) (1)溶血性試驗(yàn) 試驗(yàn)?zāi)康挠^察含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對紅細(xì)胞狀態(tài)的影響 藥物含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針，每支加5％的葡萄糖溶液200ml供試驗(yàn)用。
動(dòng)物家兔大耳白種，體重2-2.5kg，雌雄兼用，由天津藥物研究院動(dòng)物室提供。
儀器TU-1800/1800S紫外-可見分光光度計(jì)。
試驗(yàn)方法與結(jié)果 選用健康大耳白家兔，頸動(dòng)脈取血約20ml，用玻璃棒攪拌除去纖維蛋白后，用約10倍量的生理鹽水混勻、離心，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用生理鹽水如上洗滌3-4次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞按其體積，用生理鹽水稀釋成2％的紅細(xì)胞懸液進(jìn)行試驗(yàn)。取試管7支，編號排列于試管架上，按下表配比量依次加入2％紅細(xì)胞懸液、生理鹽水及不同量的含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針溶液，第6管不加含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針溶液，作為空白對照管，第7管不加含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針溶液，并用蒸餾水代替生理鹽水，作為陽性對照管，各管搖勻后，置37℃恒溫水浴中溫育。開始每隔15分鐘觀察1次，1小時(shí)后，每隔1小時(shí)觀察1次，連續(xù)3小時(shí)，結(jié)果見表1。
結(jié)果判斷 溶液呈透明紅色，即表示溶血；溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，表示有紅細(xì)胞凝集作用。一般以0.3ml含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針(第3管)，在2小時(shí)內(nèi)不產(chǎn)生溶血反應(yīng)，認(rèn)為可供注射用。
表1含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對紅細(xì)胞的影響(肉眼觀察法) 注“+”表示溶血“-”表示不溶血 表1結(jié)果顯示，肉眼觀察，在3小時(shí)內(nèi)含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針各試驗(yàn)管均不產(chǎn)生溶血和紅細(xì)胞凝集。
觀察完畢，將各管溶液2500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液在紫外分光光度計(jì)545nm處，以蒸餾水作為空白對照讀取各管OD值，結(jié)果見表2。
結(jié)果判斷用下式計(jì)算各試驗(yàn)管的溶血率(％)。
溶血率(％)＝(ODt-ODnc)/(ODpc-ODnc))×100％ 式中ODt試驗(yàn)管吸光度 ODnc陰性對照管吸光度 ODpc陽性對照管吸光度 溶血率＞5％表明出現(xiàn)溶血，不宜注射使用。
表2含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對溶血的影響(分光光度法) 表2結(jié)果顯示，含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針各試驗(yàn)管溶血百分率均小于5％。表明含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針符合注射劑使用規(guī)定。
試驗(yàn)結(jié)論含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針溶血性試驗(yàn)符合注射劑使用規(guī)定，可供注射用。
(2)血管和股四頭肌刺激試驗(yàn) 試驗(yàn)?zāi)康挠^察含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針連續(xù)3次靜脈注射給藥，對血管及其周圍組織所產(chǎn)生的刺激反應(yīng)；觀察含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針一次股四頭肌注射給藥，對股四頭肌及其周圍組織所產(chǎn)生的刺激反應(yīng)。
藥物含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針 動(dòng)物家兔大耳白種，體重2～2.5kg，雌雄兼用。
試驗(yàn)方法與結(jié)果 ①含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針靜脈注射給藥對家兔血管刺激的影響 選用上述健康成年家兔12只，體重2～2.5kg，雌雄兼用(雌者無孕)。按性別、體重分為3組，含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針兩個(gè)給藥濃度組(0.22、0.44g生藥/ml)及一個(gè)5％葡萄糖注射液對照組，每組均為4只，按無菌操作的方法進(jìn)行耳靜脈注射給藥，給藥體積均為5ml/kg，對照組給予等容量葡萄糖注射液，每天1次，連續(xù)3天，每次給藥后肉眼觀察注射部位有無紅腫、充血等刺激反應(yīng)，3天后處死動(dòng)物，剪下兔耳做病理組織學(xué)檢查。
結(jié)果顯示，含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針給兔耳靜脈連續(xù)注射給藥3天，肉眼觀察，血管清晰可見，未見紅腫、充血等刺激反應(yīng)。病理組織學(xué)檢查顯示，家兔血管內(nèi)皮光滑完整，內(nèi)皮細(xì)胞未見水腫、變性、脫落，血管腔內(nèi)未見血栓形成，管壁及其周圍未見明顯炎癥反應(yīng)。
以上結(jié)果表明含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對血管無明顯刺激反應(yīng)。
②含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針肌肉注射給藥對家兔股四頭肌刺激的影響 選用上述健康成年家兔12只，體重2～2.5kg，雌雄兼用(雌者無孕)。按性別、體重分為3組，含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針兩個(gè)濃度組及一個(gè)5％葡萄糖注射液對照組，每組均為4只，按無菌操作的方法進(jìn)行肌肉注射給藥，給藥體積均為1ml/只，對照組給予等容量葡萄糖注射液。48小時(shí)后，對注射部位進(jìn)行肉眼觀察。然后，處死家兔，取注射部位進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。按表3換算成相應(yīng)的反應(yīng)級數(shù)。
表3注射劑刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)；家兔平均反應(yīng)級數(shù)小于2，認(rèn)為刺激反應(yīng)合格。
結(jié)果顯示，肉眼觀察，各組的4只家兔活動(dòng)正常，注射部位無紅腫、充血等刺激反應(yīng)；病理組織學(xué)檢查顯示，含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針兩個(gè)濃度組與對照組的每只動(dòng)物骨骼肌纖維排列整齊，橫紋清晰，肌纖維結(jié)構(gòu)、形態(tài)及間質(zhì)未見明顯異常。
按照注射劑刺激反應(yīng)的評分方法，各組家兔平均反應(yīng)級數(shù)均小于2，表明含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對股四頭肌無明顯刺激反應(yīng)。
試驗(yàn)結(jié)論含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對家兔耳靜脈血管、股四頭肌刺激性試驗(yàn)結(jié)果表明，對家兔耳靜脈血管、股四頭肌均無明顯刺激作用。符合注射劑刺激性試驗(yàn)規(guī)定，可供注射用。
(3)過敏性試驗(yàn) 試驗(yàn)?zāi)康挠^察含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對豚鼠的全身主動(dòng)過敏反應(yīng)；觀察含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對大鼠的皮膚被動(dòng)過敏反應(yīng)。
藥物含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針 山聯(lián)泰吸附無細(xì)胞百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗，批號20041123-1，成都生物制品研究所產(chǎn)品。
卵白蛋白Sigma公司產(chǎn)品。
動(dòng)物大鼠體重160～200g，雌雄兼用。豚鼠體重300～400g，雌雄各半。
試驗(yàn)方法與結(jié)果 ①含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)的影響選取健康豚鼠20只，體重300～400g，按性別、體重隨機(jī)分組，含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針兩個(gè)不同濃度給藥組(0.55、1.1g生藥/ml)及陽性藥4％卵白蛋白各6只，空白對照組2只，均雌雄各半。按無菌操作，給藥組隔日腹腔注射含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針1ml/只，陽性藥組腹腔注射4％卵白蛋白0.5ml/只，共5次。然后將各組動(dòng)物均分為2組，第一組于首次注射后的第14天，第二組于首次注射后的第21天，給藥組靜脈注射與致敏濃度相同的含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針2ml/只，陽性藥組腹腔注射4％卵白蛋白2ml/只進(jìn)行攻擊，按下列項(xiàng)目觀察注射后即刻至30分種每只動(dòng)物的反應(yīng)癥狀，并按表4、表5進(jìn)行過敏反應(yīng)評價(jià)。
過敏反應(yīng)癥狀0正常 1不安寧 3發(fā)抖 4搔鼻 5噴嚏 6咳嗽7呼吸急促 8排尿 9排便 10流淚 11呼吸困難 12羅音13紫癜 14步態(tài)不穩(wěn) 15跳躍 16喘息 17痙孿 18橫轉(zhuǎn)19；潮式呼吸 20死亡 表4全身致敏性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 表5豚鼠過敏反應(yīng)級數(shù) 注反應(yīng)級數(shù)達(dá)2級以上(包括2級)時(shí)，該供試品可認(rèn)為過敏試驗(yàn)不合格。攻擊注射后，如發(fā)現(xiàn)有過敏反應(yīng)時(shí)，應(yīng)取健康未致敏豚鼠2只，靜脈注射供試品2ml，排除由于藥物作用引起的類似過敏反應(yīng)癥狀，供作結(jié)果判斷的參考。
試驗(yàn)結(jié)果顯示致敏第14天，含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針1.1g生藥/ml濃度組2只豚鼠出現(xiàn)抓鼻，1只出現(xiàn)發(fā)抖；0.55g生藥/ml濃度組1只出現(xiàn)抓鼻，2只無反應(yīng)；陽性藥組2只死亡，1只出現(xiàn)呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍等；正常對照無反應(yīng)。
致敏第21天，含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針1.1g生藥/ml濃度組1只出現(xiàn)抓鼻，2只無反應(yīng)；0.55g生藥/ml濃度組3只均無反應(yīng)；陽性藥組1只死亡，2只呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)、痙攣、大小便失禁等；正常對照無反應(yīng)。
以上結(jié)果表明，含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針全身主動(dòng)過敏反應(yīng)級數(shù)小于2，認(rèn)為過敏試驗(yàn)合格。
②含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對皮膚被動(dòng)過敏試驗(yàn)的影響 致敏選用健康雌性大鼠4只，體重160～200g，隨機(jī)分為4組，正常對照組、含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針兩個(gè)不同濃度給藥組(0.55、1.1g生藥/ml)及陽性藥4％卵白蛋白對照組。各給藥組均隔日腹腔注射0.5ml/只，正常對照組給予等容量5％葡萄糖注射液。在肌肉注射的同時(shí)，均腹腔注射百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗0.25ml/只，連續(xù)2次。首次致敏后14天，眼眶取血約2.5ml，2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，制備抗血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 激發(fā)另選健康大鼠16只，體重160～180g，雌雄兼用。隨機(jī)分為正常對照組、含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針兩個(gè)不同濃度給藥組(0.55、1.1g生藥/ml)及陽性藥4％卵白蛋白對照組，每組均為4只。各組大鼠均在背部中線兩側(cè)距脊柱1.5cm處脫毛3×5cm2，在脫毛部位皮內(nèi)注射各組抗血清0.1ml，每只動(dòng)物均從高到低(從尾部至頭部)注射同一藥物的3個(gè)不同濃度的抗血清稀釋液(分別為1∶2，1∶8，1∶32)，48小時(shí)后，再靜脈注射與致敏濃度相同的激發(fā)抗原和0.8％的伊文思藍(lán)各0.5ml。30分鐘后處死動(dòng)物，用千分卡尺測量各注射點(diǎn)藍(lán)班的直徑，直徑大于5mm判定為陽性。將各呈陽性反應(yīng)的斑點(diǎn)皮膚剪碎，放入丙酮-生理鹽水(7∶3)混合溶液5ml中浸泡24小時(shí)，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，在紫外可見分光光度計(jì)610nm處測定光密度(OD值)，見表6。
表6陽性斑點(diǎn)光密度(λ＝610nm) 結(jié)果顯示生理鹽水各測量點(diǎn)均無藍(lán)班出現(xiàn)；陽性藥除抗血清稀釋液1∶32出現(xiàn)2個(gè)直徑小于5mm的藍(lán)班外，其余測量點(diǎn)藍(lán)班直徑均大于5mm，表明有明顯過敏反應(yīng)。含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針3個(gè)不同比例抗血清溶液各8個(gè)測量點(diǎn)均無藍(lán)班出現(xiàn)，表明含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針無明顯被動(dòng)過敏反應(yīng)。
試驗(yàn)結(jié)論根據(jù)過敏反應(yīng)評價(jià)要求，含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針無全身過敏反應(yīng)，也無皮膚被動(dòng)過敏反應(yīng)，符合注射劑過敏反應(yīng)規(guī)定，表明過敏反應(yīng)試驗(yàn)合格。
綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 1.有效成分明確，便于質(zhì)量控制丹參素、丹酚酸B和反式-橙花叔醇為主要有效成分，成分清楚，含量高，質(zhì)量控制準(zhǔn)確，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。
2.粉針劑穩(wěn)定性好，由于已除去水分，能有效地防止有效成分在水中的氧化、水解、失活、聚合、沉淀，可以更好地保證制劑的質(zhì)量和療效。
3.本發(fā)明的含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針對急性心肌缺血具有較好的保護(hù)作用，克服了口服制劑有效成分的胃內(nèi)分解，肝首過效應(yīng)等缺點(diǎn)。起效快，作用強(qiáng)，生物利用度高，更適合用于治療心血管系統(tǒng)疾病。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，實(shí)施例僅為解釋性的，決不意味著它以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 取丹參藥材適量，粉碎，過10目篩。稱取100g，混合后加入濃度60％乙醇浸泡24小時(shí)，移至滲漉筒中，以0.6mL/min的速度滲漉，收集900ml滲漉液，減壓濃縮至無醇味(0.1MP，60℃)。以2M鹽酸調(diào)pH2.0，靜置，濾過，濾液通過HPD-100型大孔吸附樹脂柱(400ml)純化，先用4BV蒸餾水洗脫，再用60％乙醇6BV洗脫，收集60％乙醇洗脫液，并減壓濃縮(0.1MP，60℃)至100ml，(丹酚酸B45mg/ml)，測定含量為85％。再向濃縮液中加入8g羥丙基-β-環(huán)糊精，待羥丙基-β-環(huán)糊精溶解后，置于40℃水浴中，將0.17ml降香揮發(fā)油緩慢滴加于上述溶液中，同時(shí)劇烈磁力攪拌60分鐘。靜置24小時(shí)后，以2M NaOH調(diào)節(jié)pH5.0，0.22μm微孔濾膜過濾，每只西林瓶2ml灌裝，冷凍干燥，得含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針。
實(shí)施例2 取丹參藥材適量，粉碎，稱取粗粉1000g，以30％乙醇30L滲漉，滲漉液減壓濃縮至0.5g/ml(按藥材量計(jì))，以2M鹽酸調(diào)節(jié)PH 2.5，靜置，濾過，濾液過HPD400樹脂，水洗部分棄去，收集40％乙醇洗脫部分，減壓濃縮至無醇味，加注射用水至450ml，(丹酚酸B90mg/ml)，測定含量為90％。另稱取羥丙基-β-環(huán)糊精75g，溶解于約450ml注射用水中，在30℃水浴中，劇烈電力攪拌的條件下逐滴緩慢的加入降香揮發(fā)油1.7ml，密閉容器，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，室溫靜置過夜。得降香揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物水溶液，將上述兩種溶液混合均勻，加入2M NaOH調(diào)節(jié)pH5.5，加注射用水至1000ml，0.22μm微孔濾膜微濾，無菌條件下分裝(每瓶2ml)，冷凍干燥，壓蓋，即得含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針。
實(shí)施例3 取丹參藥材適量，粉碎，過10目篩，稱取粗粉800g，加入濃度50％乙醇加熱回流1小時(shí)，濾出藥液，藥渣同上再提取一次，合并藥液，減壓濃縮至無醇味(0.1MP，60℃)。以2M鹽酸調(diào)pH2.8，靜置，濾過，濾液通過D101型大孔吸附樹脂柱(200ml)純化，先用4BV蒸餾水洗脫，再用30％乙醇6BV洗脫，收集30％乙醇洗脫液，并減壓濃縮(0.1MP，60℃)至800ml(丹酚酸B31mg/ml)，測定含量為55％。將150g羥丙基-β-環(huán)糊精溶于1200ml注射用水中，置于50℃水浴，電力劇烈攪拌下，緩慢滴加3.5ml降香揮發(fā)油，繼續(xù)攪拌180分鐘，靜置12小時(shí)，得降香揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物水溶液，將上述兩種溶液混合均勻，以2M NaOH調(diào)節(jié)pH6.0，超濾膜濾過(6000分子量)，每只西林瓶2ml灌裝，冷凍干燥，得含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針。
權(quán)利要求
1、一種含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針，它是由丹參的水溶性成分提取物與降香揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物組成。
2、如權(quán)利要求1所述的凍干粉針，其特征在于它是由下述重量份數(shù)的原料組成丹參水溶性成分提取物2～6份；降香揮發(fā)油的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物4～8份；其中降香揮發(fā)油與羥丙基-β-環(huán)糊精的體積重量比為1∶1～150。
3、如權(quán)利要求2所述的凍干粉針，其中，所述的降香揮發(fā)油與羥丙基-β-環(huán)糊精的體積重量比為1∶10～45。
4、如權(quán)利要求1或2所述的凍干粉針，其中，所述丹參水溶性成分提取物中含丹參酚酸B、丹參素在20～95％。
5、如權(quán)利要求1或2所述的凍干粉針，其特征在于所述的丹參的水溶性成分提取物，是以水或任意比例乙醇為溶劑將丹參藥材提取，濃縮后，調(diào)pH值至酸性，經(jīng)大孔吸附樹脂分離純化，濃縮，即得。
6、如權(quán)利要求1～3所述的凍干粉針，其特征在于所述的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，是將降香揮發(fā)油緩慢滴加到羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，劇烈攪拌、超聲振蕩或研磨制成；其中劇烈攪拌包括電力攪拌器攪拌、膠體磨研磨、高壓/低壓均漿機(jī)均漿。
7、權(quán)利要求1所述含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針的制備方法
(1)取丹參水溶性成分提取物溶液加入羥丙基-β-環(huán)糊精攪拌溶解，在30～70℃水浴中，將降香揮發(fā)油緩慢滴加到劇烈攪拌的上述溶液中，滴加完畢后繼續(xù)劇烈攪拌30～300分鐘，靜置，調(diào)pH值至偏酸性，濾過，分裝，冷凍干燥；或
(2)采用注射用水首先溶解羥丙基-β-環(huán)糊精，然后將降香揮發(fā)油緩慢滴加到此溶液中，劇烈攪拌30～300分鐘，靜置，再與丹參水溶性成分提取物混合，調(diào)pH值至偏酸性，濾過，分裝，冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有2－6份丹參水溶性成分提取物和4－8份降香揮發(fā)油的羥丙基－β－環(huán)糊精包合物的凍干粉針及其制備方法；其中羥丙基－β－環(huán)糊精與降香揮發(fā)油的比例為10－45∶1。本發(fā)明的含丹參和降香揮發(fā)油的凍干粉針以丹參素、丹酚酸B和反式－橙花叔醇為主要有效成分，有效成分明確，便于質(zhì)量控制；對急性心肌缺血具有較好的保護(hù)作用，起效快，作用強(qiáng)，生物利用度高，更適合用于治療心血管系統(tǒng)疾病。
文檔編號A61P9/00GK1961911SQ20051001593
公開日2007年5月16日 申請日期2005年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月8日
發(fā)明者張鐵軍, 侯文彬, 王靖, 吳疆 申請人:天津藥物研究院