專利名稱：治療肽的清蛋白結(jié)合型衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰高血糖素樣多肽-1(GLP-1)及其片段的新型衍生物、這些片段的具有延長(zhǎng)作用特性的類似物、以及生產(chǎn)和使用它們的方法。本發(fā)明還涉及exendin的新型衍生物及其用途。
背景技術(shù)：
肽被廣泛用于醫(yī)學(xué)實(shí)踐，而且由于它們可以通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，因此預(yù)計(jì)它們的重要性在未來的幾年里還將升高。在將天然肽或其類似物用于治療時(shí)，通常發(fā)現(xiàn)它們具有較高的清除率。在希望將治療劑以高血液水平維持較長(zhǎng)時(shí)間的情況中，清除率高是不便的，因?yàn)樾枰磸?fù)進(jìn)行施藥。清除率高的肽的實(shí)例有ACTH、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、血管緊張素、降鈣素、胰島素、胰高血糖素、胰高血糖素樣多肽-1、胰高血糖素樣多肽-2、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子-2、抑胃肽、生長(zhǎng)激素釋放因子、可激活垂體腺苷酸環(huán)化酶的多肽、胰泌素、腸抑胃素(enterogastrin)、促生長(zhǎng)素抑制素、促生長(zhǎng)素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、甲狀旁腺激素、血小板生成素、促紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子(hypothalamic releasing factors)、催乳素、促甲狀腺激素、內(nèi)啡肽、腦啡肽、加壓素、催產(chǎn)素、阿片樣物質(zhì)及其類似物、超氧化物歧化酶、干擾素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、和核糖核酸酶。在有些情況中，有可能通過運(yùn)用合適的藥物組合物來改變肽的釋放特性，但是這種方法具有多方面的缺點(diǎn)，而且通常不適用。
具有受關(guān)注的生物學(xué)活性的已知內(nèi)源肽和蛋白質(zhì)的數(shù)目正在迅速增加，這也是正在進(jìn)行的人類基因組探索的結(jié)果。由于它們的生物學(xué)活性，這些多肽中的許多原則上可以用作治療劑。然而，由于肽酶的快速降解和/或由于腎過濾并排泄到尿中，這些肽常常只具有幾分鐘的半衰期，因此內(nèi)源肽并非始終是合適的候選藥物。多肽在人血漿中的半衰期變化巨大，由幾分鐘至超過一周。類似的，小分子藥物的半衰期也是高度變化的。然而，尚未完全理解肽、蛋白質(zhì)、或其它化合物的血漿半衰期的這種高可變性。由此，需要修飾治療性化合物以提供更長(zhǎng)的體內(nèi)作用持續(xù)時(shí)間，同時(shí)保持低毒性和治療優(yōu)勢(shì)。
血清清蛋白的半衰期超過一周，提高肽的血漿半衰期的一種方法是用與血清清蛋白結(jié)合的化學(xué)實(shí)體對(duì)肽進(jìn)行衍生化作用。
Knudsen等，J.Med.Chem.431664-1669，2000顯示了?；疓LP-1肽在豬中展示高受體效力和升高10倍的血漿半衰期。
Zobel等，Bioorg.Med.Chem.Lett.131513-1515，2003顯示了通過與血清清蛋白結(jié)合的基于磷酸酯的小分子對(duì)氨基末端進(jìn)行的衍生化作用，抗凝肽在兔中的血漿半衰期升高了10-50倍。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含治療性多肽且其通過親水性間隔物與清蛋白結(jié)合殘基相連的化合物。
本發(fā)明還涉及包含治療性多肽且其通過這樣的親水性間隔物與清蛋白結(jié)合殘基相連的化合物，即所述間隔物以包含至少5個(gè)非氫原子的化學(xué)部分(moiety)將多肽與清蛋白結(jié)合殘基分開，這些非氫原子中的30-50％是N或O。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，間隔物定義為-(CH2)1D[(CH2)nE]m(CH2)pQq-，其中1、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)1D[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，或其制藥學(xué)可接受鹽或前藥。
本發(fā)明還涉及具有通式(I)的化合物A-W-B-Y-治療性多肽 (I)，其中A是清蛋白結(jié)合殘基，B是親水性間隔物-(CH2)1D[(CH2)nE]m(CH2)pQq-，其中1、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)1D[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，Y是連接B與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，且W是連接A與B的化學(xué)基團(tuán)。
本發(fā)明還涉及具有通式(II)的化合物A-W-B-Y-治療性多肽-Y′-B′-W′-A′(II)，其中A和A′是清蛋白結(jié)合殘基，B和B′是獨(dú)立選自-(CH2)1D[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-的親水性間隔物，其中1、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)1D[(CH2)nG]m(CH2)p-，
q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，Y是連接B與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，而Y′是連接B′與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，且W是連接A與B的化學(xué)基團(tuán)，而W′是連接A′與B′的化學(xué)基團(tuán)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有通式(III)的化合物A＞W(wǎng)″-B-Y-治療性多肽(III)，A′其中A和A′是清蛋白結(jié)合殘基，B是選自-(CH2)1D[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-的親水性間隔物，其中1、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)1D[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，Y是連接B與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，且W″是連接B與A和A′的化學(xué)基團(tuán)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在治療性肽與一個(gè)或多個(gè)清蛋白結(jié)合殘基之間包含親水性間隔物的化合物，所述化合物相對(duì)于治療性多肽具有延長(zhǎng)的作用特性，其中所述化合物的清蛋白結(jié)合部分和游離部分都能夠與介導(dǎo)治療性多肽作用的受體結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，親水性間隔物是兩個(gè)末端都含有合適官能團(tuán)、在治療性多肽的氨基與清蛋白結(jié)合殘基的官能團(tuán)之間形成橋的無支鏈寡聚乙二醇部分(moiety)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，治療性多肽是GLP-1肽。
定義在本說明書中，下列術(shù)語具有所示的含義術(shù)語“清蛋白結(jié)合殘基”在用于本文時(shí)指與人血清清蛋白非共價(jià)結(jié)合的殘基。附著到治療性多肽上的清蛋白結(jié)合殘基所具有的針對(duì)人血清清蛋白的親和力通常低于約10μM，優(yōu)選低于約1μM。已知的清蛋白結(jié)合殘基的范圍包括含4-40個(gè)碳原子的線性和分支親脂性部分(moiety)、具有環(huán)戊烷并菲環(huán)骨架的化合物、具有10-30個(gè)氨基酸殘基的肽等。
術(shù)語“親水性間隔物”在用于本文時(shí)指以包含至少5個(gè)非氫原子的化學(xué)部分(moiety)將肽與清蛋白結(jié)合殘基分開的間隔物，這些非氫原子中的30-50％是N或O。
術(shù)語“治療性多肽”在用于本文時(shí)指為了治療用途而正在或已經(jīng)開發(fā)的多肽。
術(shù)語“多肽”和“肽”在用于本文時(shí)指由至少五個(gè)氨基酸成分通過肽鍵相連而組成的化合物。氨基酸成分可以來自由遺傳密碼編碼的氨基酸，而且它們可以是不是由遺傳密碼編碼的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不是由遺傳密碼編碼的天然氨基酸有例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、鳥氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸、和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通過化學(xué)合成制造的氨基酸，即由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體諸如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基異丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨甲基苯甲酸、氨茴酸。
術(shù)語“類似物”在用于本文指多肽時(shí)指經(jīng)過修飾的肽，其中肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸已經(jīng)用其它氨基酸殘基替代和/或其中肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)刪除和/或其中肽中已經(jīng)添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些氨基酸殘基的添加或刪除可以發(fā)生在肽的N端和/或C端。使用一種簡(jiǎn)單的系統(tǒng)來描述類似物例如，[Arg34]GLP-1(7-37)Lys指第34位天然存在的賴氨酸已經(jīng)用精氨酸替代且C末端(第38位)已經(jīng)添加賴氨酸的GLP-1類似物。依照IUPAC-IUB命名法使用氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫表述肽類似物及其衍生物的化學(xué)式。
術(shù)語“衍生物”在用于本文關(guān)于肽時(shí)指經(jīng)過化學(xué)修飾的肽或其類似物，其中至少一個(gè)取代基在未經(jīng)修飾的肽或其類似物中不存在，即指經(jīng)過共價(jià)修飾的肽。典型的修飾有酰胺、碳水化合物、烷基、?；Ⅴサ鹊?。GLP-1(7-37)衍生物的一個(gè)實(shí)例是Nε26-(γ-Glu(Nα-十六?；?))-[Arg34，Lys26])GLP-1(7-37)。
術(shù)語“GLP-1肽”在用于本文時(shí)指GLP-1(7-37)(SEQ ID NO1)、GLP-1類似物、GLP-1衍生物、或GLP-1類似物的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽是促胰島素劑。
術(shù)語“促胰島素劑”在用于本文時(shí)指作為人GLP-1受體激動(dòng)劑的化合物，即在含人GLP-1受體的合適介質(zhì)中刺激cAMP形成的化合物。促胰島素劑的效力是通過如下所述由劑量-應(yīng)答曲線計(jì)算EC50值而測(cè)定的。
用GLP-1和肽類似物刺激來自表達(dá)人GLP-1受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系BHK467-12A(tk-ts13)的純化細(xì)胞膜，并使用AlphaScreenTMcAMP測(cè)定試劑盒(Perkin Elmer Life Sciences)測(cè)量生成cAMP的效力。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是在NN制備的，并選擇高表達(dá)克隆用于篩選。在含5％FCS、1％青霉素/鏈霉素、和0.5mg/ml G418的DMEM中于5％CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
用PBS將大約80％匯合的細(xì)胞清洗2次，并用Versene收獲細(xì)胞，以1000rpm離心5分鐘，并除去上清液。其它步驟都是在冰上進(jìn)行的。將細(xì)胞沉淀在10ml緩沖液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA，pH＝7.4)用Ultrathurax勻漿20-30秒，以20,000rpm離心15分鐘，并將沉淀重懸于10ml緩沖液2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA，pH＝7.4)。將懸浮液勻漿20-30秒，并以20,000rpm離心15分鐘。將懸于緩沖液2、勻漿、和離心重復(fù)一次，并將膜重懸于緩沖液2，此時(shí)可用于進(jìn)一步分析或保存于-80℃。
功能受體測(cè)定法是通過使用AlphaScreen技術(shù)測(cè)量由肽誘導(dǎo)的cAMP產(chǎn)量來進(jìn)行的。AlphaScreen技術(shù)的基本原理是內(nèi)源cAMP與外源添加生物素-cAMP之間的競(jìng)爭(zhēng)。對(duì)cAMP的捕捉是使用綴合在受體珠上的特異抗體來完成的。在AlphaFusion微板分析儀上對(duì)形成的cAMP進(jìn)行計(jì)數(shù)和測(cè)量。使用Graph-Pad Prisme軟件計(jì)算EC50值。
術(shù)語“GLP-2肽”在用于本文時(shí)指GLP-2(1-33)、GLP-2類似物、GLP-2衍生物、或GLP-2類似物的衍生物。
術(shù)語“exendin-4肽”在用于本文時(shí)指exendin-4(1-39)、exendin-4類似物、exendin-4衍生物、或exendin-4類似物的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，exendin-4肽是促胰島素劑。
術(shù)語“穩(wěn)定的exendin-4肽”和“穩(wěn)定的GLP-1肽”在用于本文時(shí)指由exendin-4(1-39)或GLP-1(7-37)衍生的經(jīng)過化學(xué)修飾的肽，即根據(jù)如下方法的測(cè)定，在人體中展示至少10小時(shí)的體內(nèi)血漿清除半衰期的類似物或衍生物。用于測(cè)定exendin-4肽或GLP-1肽在人體中的血漿清除半衰期的方法是將肽溶于等滲緩沖液pH7.4的PBS或任何其它合適緩沖液。外周注射藥劑，優(yōu)選腹部或大腿上部。以頻繁間隔和足以覆蓋最終清除部分的時(shí)程(例如服藥前、服藥后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第3天)、60(第3天)、72(第4天)、和84(第4天)小時(shí))采集血樣，用于測(cè)定活性肽。如Wilken等，Diabetologia43(51)A143，2000中所述測(cè)定活性肽的濃度。使用商業(yè)性軟件2.1版WinNonlin(Pharsight，卡雷，北卡羅來納州，美國(guó))通過非房室化方法對(duì)每一位受試者由濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)計(jì)算導(dǎo)出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。通過濃度-時(shí)間曲線最終對(duì)數(shù)線性部分的對(duì)數(shù)線性回歸，評(píng)估最終清除速率常數(shù)，并用于計(jì)算清除半衰期。
術(shù)語“DPP-IV保護(hù)的”在用于本文指多肽時(shí)指為了使所述化合物耐受血漿肽酶二肽酰氨肽酶-4(DPP-IV)而經(jīng)過化學(xué)修飾的多肽。已知血漿中DPP-IV酶牽涉幾種肽激素的降解，例如GLP-1、GLP-2、Exendin-4等。由此，為了降低DPP-IV的降解速率，為了開發(fā)易受DPP-IV介導(dǎo)水解影響的多肽的類似物和衍生物正在做出巨大努力。
肽對(duì)二肽酰氨肽酶IV降解的抵抗力是通過如下降解測(cè)定法測(cè)定的將幾份肽與一份純化的二肽酰氨肽酶IV在pH7-8的合適緩沖液(緩沖劑不是清蛋白)中于37℃保溫4-22小時(shí)。添加三氟乙酸終止酶促反應(yīng)，并通過HPLC或LC-MS分析將肽降解產(chǎn)物分離和量化。用于進(jìn)行這種分析的一種方法是將混合液施加到Zorbax 300SB-C18(30nm孔徑，5μm顆粒)150×2.1mm柱上，并用乙腈在0.1％三氟乙酸中的線性梯度(0％-100％乙腈，30分鐘)以流速0.5ml/min進(jìn)行洗脫。可以通過它們?cè)?14nm(肽鍵)或280nm(芳香族氨基酸)的吸光率來監(jiān)測(cè)肽及其降解產(chǎn)物，并通過將它們的峰面積積分而量化。可以使用LC-MS來測(cè)定降解模式，其中可以測(cè)定各個(gè)峰的MS譜。根據(jù)在指定時(shí)間的完整/降解化合物百分率，評(píng)估肽的DPPIV穩(wěn)定性。
當(dāng)根據(jù)完整化合物在指定時(shí)間的百分率，肽比天然肽穩(wěn)定10倍時(shí)，將它定義為對(duì)DPPIV穩(wěn)定的。由此，DPPIV穩(wěn)定化的GLP-1化合物至少比GLP-1(7-37)穩(wěn)定10倍。
術(shù)語“C1-6烷基”在用于本文時(shí)指具有1-6個(gè)碳原子的飽和的、分支的、直鏈的、或環(huán)鏈烴基。代表性實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、正己基、異己基、環(huán)己烷等等。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包含治療性多肽且其通過親水性間隔物與清蛋白結(jié)合殘基相連的化合物。
本發(fā)明還涉及包含治療性多肽且其通過這樣的親水性間隔物與清蛋白結(jié)合殘基相連的化合物，即所述間隔物以包含至少5個(gè)非氫原子的化學(xué)部分(moiety)將多肽與清蛋白結(jié)合殘基分開，這些非氫原子中的30-50％是N或O。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，間隔物定義為-(CH2)1D[(CH2)nE]m(CH2)pQq-，其中1、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)1D[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，或其制藥學(xué)可接受鹽或前藥。
本發(fā)明還涉及具有通式(I)的化合物A-W-B-Y-治療性多肽(I)，其中A是清蛋白結(jié)合殘基，B是親水性間隔物-(CH2)1D[(CH2)nE]m(CH2)pQq-，其中1、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)1D[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，Y是連接B與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，且W是連接A與B的化學(xué)基團(tuán)。
本發(fā)明還涉及具有通式(II)的化合物A-W-B-Y-治療性多肽-Y′-B′-W′-A′(II)，其中A和A′是清蛋白結(jié)合殘基，B和B′是獨(dú)立選自-(CH2)1D[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-的親水性間隔物，其中1、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)1D[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，Y是連接B與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，而Y′是連接B′與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，且W是連接A與B的化學(xué)基團(tuán)，而W′是連接A′與B′的化學(xué)基團(tuán)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Y′選自下組-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)NHCH2-、CH2NHC(O)-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，W′選自下組-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有通式(III)的化合物A＞W(wǎng)″-B-Y-治療性多肽(III)，A′其中A和A′是清蛋白結(jié)合殘基，B是選自-(CH2)1D[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-的親水性間隔物，其中1、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)1D[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，Y是連接B與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，且W″是連接B與A和A′的化學(xué)基團(tuán)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在治療性肽與一個(gè)或多個(gè)清蛋白結(jié)合殘基之間包含親水性間隔物的化合物，所述化合物相對(duì)于治療性多肽具有延長(zhǎng)的作用特性，其中所述化合物的清蛋白結(jié)合部分以及游離部分都能夠與介導(dǎo)治療性多肽作用的受體結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，親水性間隔物是兩個(gè)末端都含有合適官能團(tuán)、在治療性多肽的氨基與清蛋白結(jié)合殘基的官能團(tuán)之間形成橋的無支鏈寡聚乙二醇部分(moiety)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，Y選自下組-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)NHCH2-、CH2NHC(O)-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，W選自下組-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，W″選自下組 其中s是0、1、或2。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，1是1或2，n和m獨(dú)立的是1-10，且p是0-10。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，D是-O-。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，E是-O-。
在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施方案中，親水性間隔物是-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)pQq-，其中m是1-10，p是1-3，且Q是-Z-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)p-。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，q是1。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，G是-O-。
在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施方案中，Z選自下組-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、和-OC(O)NH-。
在還有一個(gè)實(shí)施方案中，q是0。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，1是2。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，n是2。
在還有一個(gè)實(shí)施方案中，親水性間隔物B是-[CH2CH2O]m+1(CH2)pQq-。
在還有一個(gè)實(shí)施方案中，親水性間隔物B是-(CH2)1-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p-[C(O)NH-(CH2)1-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p]q-，其中1、m、n、和p獨(dú)立的是1-5，且q是0-5。
在還有一個(gè)實(shí)施方案中，-W-B-Y-選自下組 在還有一個(gè)實(shí)施方案中，＞W(wǎng)″-B-Y-是
在還有一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基A選自下組 其中手性碳原子或是R或是S， 其中手性碳原子或是R或是S， 其中手性碳原子或是R或是S，
其中兩個(gè)手性碳原子獨(dú)立的或是R或是S， 其中兩個(gè)手性碳原子獨(dú)立的或是R或是S， 其中兩個(gè)手性碳原子獨(dú)立的或是L或是D， 其中手性碳原子或是R或是S， 其中手性碳原子或是R或是S， 其中兩個(gè)手性碳原子獨(dú)立的或是R或是S， 其中兩個(gè)手性碳原子獨(dú)立的或是R或是S，

在還有一個(gè)實(shí)施方案中，親水性間隔物的摩爾量在80-1000D范圍內(nèi)，或在80-300D范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基是親脂性殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基在生理pH帶負(fù)電荷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基包含可以帶負(fù)電荷的基團(tuán)?？梢詭ж?fù)電荷的一種優(yōu)選基團(tuán)是羧酸基團(tuán)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基與清蛋白非共價(jià)結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基所具有的針對(duì)人血清清蛋白的親和力低于約10μM或低于約1μM。
在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基選自直鏈烷基、分支烷基、具有ω-羧酸基團(tuán)的基團(tuán)、部分或完全氫化的環(huán)戊烷并菲環(huán)骨架。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基是cibacronyl殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基具有6-40個(gè)碳原子、8-26個(gè)碳原子、或8-20個(gè)碳原子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基是選自下組的?；鵆H3(CH2)rCO-，其中r是4-38的整數(shù)，優(yōu)選4-24的整數(shù)，更優(yōu)選選自下組CH3(CH2)6CO-、CH3(CH2)8CO-、CH3(CH2)10CO-、CH3(CH2)12CO-、CH3(CH2)14CO-、CH3(CH2)16CO-、CH3(CH2)18CO-、CH3(CH2)20CO-、和CH3(CH2)22CO-。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基是直鏈或分支烷烴α，ω-二羧酸的?；?br> 在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基是選自下組的?；鵋OOC(CH2)sCO-，其中s是4-38的整數(shù)，優(yōu)選4-24的整數(shù)，更優(yōu)選選自下組HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)20CO-、和HOOC(CH2)22CO-。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基是通式為CH3(CH2)vCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-的基團(tuán)，其中v是10-24的整數(shù)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基是通式為CH3(CH2)wCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-的基團(tuán)，其中w是8-24的整數(shù)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基是通式為COOH(CH2)xCO-的基團(tuán)，其中x是8-24的整數(shù)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基是通式為-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)yCH3的基團(tuán)，其中y是8-18的整數(shù)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基是肽，諸如包含少于40個(gè)氨基酸殘基的肽。在J.Biol.Chem.277(38)35035-35043，2002中找到了許多作為清蛋白結(jié)合殘基的小肽及其鑒定方法。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基經(jīng)由間隔物和接頭附著到所述治療性多肽中賴氨酸殘基的ε-氨基上。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，清蛋白結(jié)合殘基經(jīng)由間隔物和接頭附著到所述治療性多肽中的半胱氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸上。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽是GLP-1肽。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽是包含氨基酸序列通式(IV)的GLP-1肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46通式(IV)(SEQ ID NO2)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、同組氨酸(homohistidine)、Nα-乙酰基-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸、或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；Xaa16是Val或Leu；Xaa18是Ser、Lys、或Arg；Xaa19是Tyr或Gln；Xaa20是Leu或Met；Xaa22是Gly、Glu、或Aib；Xaa23是Gln、Glu、Lys、或Arg；Xaa25是Ala或Val；Xaa26是Lys、Glu、或Arg；Xaa27是Glu或Leu；Xaa30是Ala、Glu、或Arg；Xaa33是Val或Lys；Xaa34是Lys、Glu、Asn、或Arg；
Xaa35是Gly或Aib；Xaa36是Arg、Gly、或Lys；Xaa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或是不存在；Xaa38是Lys、Ser、酰胺或是不存在；Xaa39是Ser、Lys、酰胺或是不存在；Xaa40是Gly、酰胺或是不存在；Xaa41是Ala、酰胺或是不存在；Xaa42是Pro、酰胺或是不存在；Xaa43是Pro、酰胺或是不存在；Xaa44是Pro、酰胺或是不存在；Xaa45是Ser、酰胺或是不存在；Xaa46是酰胺或是不存在；倘若Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45、或Xaa46不存在的話，那么下游的每一個(gè)氨基酸殘基也不存在。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是包含氨基酸序列通式(V)的GLP-1肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38通式(V)(SEQ ID NO3)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、同組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸、或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；Xaa18是Ser、Lys、或Arg；
Xaa22是Gly、Glu、或Aib；Xaa23是Gln、Glu、Lys、或Arg；Xaa26是Lys、Glu、或Arg；Xaa30是Ala、Glu、或Arg；Xaa34是Lys、Glu、或Arg；Xaa35是Gly或Aib；Xaa36是Arg或Lys；Xaa37是Gly、Ala、Glu、或Lys；Xaa38是Lys、酰胺或是不存在。
在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽選自GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)或其類似物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽是選自下組的肽的片段GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、和GLP-1(7-41)或其類似物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽是包含一個(gè)經(jīng)由親水性間隔物附著在C末端氨基酸殘基上的清蛋白結(jié)合殘基和任選的附著在一個(gè)其它氨基酸殘基上的第二個(gè)清蛋白結(jié)合殘基的GLP-1(A-B)或其類似物，其中A是1-7的整數(shù)而B是38-45的整數(shù)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽與GLP-1(7-37)(SEQ ID NO1)相比包含不超過15個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了替代、添加、或刪除，或者與GLP-1(7-37)(SEQ ID NO1)相比包含不超過10個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了替代、添加、或刪除。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽與GLP-1(7-37)(SEQ ID NO1)相比包含不超過6個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了替代、添加、或刪除。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1包含不超過4個(gè)不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽是DPPIV保護(hù)的GLP-1肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的化合物是DPPIV穩(wěn)定化的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽在第8位包含Aib殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述GLP-1肽第7位氨基酸殘基選自下組D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、同組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、和4-吡啶基丙氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽選自下組Arg34GLP-1(7-37)、Lys38Arg26，34LP-1(7-38)、Lys38Arg26，34GLP-1(7-38)-OH、Lys36Arg26，34GLP-1(7-36)、Aib8，22，35GLP-1(7-37)、Aib8，35GLP-1(7-37)、Aib8，22GLP-1(7-37)、Aib8，22，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35UArg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Lys37GLP-1(7-37)、Aib8，35Lys37GLP-1(7-37)、和Aib8，22Lys37GLP-1(7-38)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽經(jīng)由相應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO1的第23、26、34、36、或38位的氨基酸殘基附著在所述親水性間隔物上。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽是exendin-4(SEQ ID NO4)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽是ZP-10，即HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-酰胺(SEQ ID NO5)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽是HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGX或其片段或類似物，其中X＝P或Y。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1肽是Arg18，Leu20，Gln34，Lys33(Nε-(γ-氨基丁?；?Nα-十六?；?))Exendin-4(7-45)-酰胺或Arg33，Leu20，Gln34，Lys18(Nε-(γ-氨基丁?；?Nα-十六?；?))Exendin-4(7-45)-酰胺。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)清蛋白結(jié)合殘基經(jīng)由親水性間隔物附著在GLP-1肽的C末端氨基酸殘基上。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第二個(gè)清蛋白結(jié)合殘基附著在GLP-1肽中C末端氨基酸殘基以外的氨基酸殘基上。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，親脂性取代基通過親水性間隔物以這樣的方式附著到GLP-1肽上，即間隔物的羧基與GLP-1肽的氨基形成酰胺鍵。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物選自下組Nε37-(2-(2-(2-(十二基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(17-磺基十六?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 Nε37-{2-[2-(2-(15-羧基十五酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙酰基}-[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺
Nε37-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(19-羧基十九酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 [Aib8，22，35，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；?-OH [Aib8，22，35，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(十六?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH
Nε37-(2-[2-(2，6-(S)-二-{2-[2-(2-(十二?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀己?；被?乙氧基]乙氧基})乙?；?[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺 Nε37-(2-[2-(2，6-(S)-二-{2-[2-(2-(十四?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀己酰基氨基)乙氧基]乙氧基})乙?；?[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺 [Aib8，22，35，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH [Aib8，22，35]GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[4-[4-(4-氨基-9，10-二氧-3-磺基-9，10-二氫-蒽-1-基氨基)-2-磺基-苯基氨基]-6-(2-磺基-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基))酰胺 [Aib8，22，35]GLP-1(7-37)Lys(({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(15-羧基十五?；被?-乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；被?乙氧基]乙氧基}乙?；?)酰胺 Nε37-([2-(2-{3-[2，5-二氧-3-(15-羧基十五基硫烷基)-吡咯烷-1-基]-丙?；被鶀乙氧基)乙氧基)乙?；鵠-[D-Ala8，Lys37]-GLP-1(7-37)酰胺 -GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(11-(草?；被?十一酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?)))酰胺 [Aib8，22，35，Ala37]-GLP-1(7-37)Lys({2-[2-(2-{2-[2-(2-(15-羧基-十五?；被?-乙氧基]乙氧基}乙?；被?乙氧基]乙氧基}乙?；鵠酰胺 [Aib8，22，35，Ala37]-GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[11-(5-二甲基氨基萘-1-磺?；被?十一?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙?；?酰胺 [Aib8，22，35，Ala37]-GLP-1(7-37)Lys(([2-(2-{2-[1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-基]乙?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙?；?)酰胺
[Aib8，Arg26，34，Glu22，23，30]-GLP-1H(7-37)Lys(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?酰胺 [Aib8，Arg26，34，Glu22，23，30]-GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(二十?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)酰胺 [Gly8，Arg26，34]-GLP-1H-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八?；被?-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH [Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH [Aib8]-GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(十六?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH [Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH [Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基庚?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH [Aib8]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十六?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH Nε37-(2-(2-(2-(十二酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1H(7-37)-酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(十四?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1H(7-37)-酰胺
Nε37-(2-(2-(2-(十六?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)-酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)-酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(二十?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)-酰胺 Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?)-[Aib8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH
Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?)[Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH Nε36-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[Gly8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH Nε37-(2-(2-(2-(4-4(4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，9-十三氟壬?；被酋；?丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基))[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)-OH
Nε37-(2-(2-(2-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，10，10，11，11，12，12，12-二十一氟十二基氧基乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)-OH Nε37-(2-(2-(2-(4-(十六?；被酋；?丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)-OH [Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys({2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)})-OH [Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十八?；被?-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH
Nε20-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六?；被?-4-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-exendin(1-39) [Ala8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-草?；被?3-羧基-2-4，5，6，7-四氫-苯并[b]噻吩-6-基-乙?；被?)乙氧基]乙氧基乙酰基)酰胺 [Aib8，22，35]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-草?；被?3-羧基-2-4，5，6，7-四氫-苯并[b]噻吩-6-基-乙?；被?)乙氧基]乙氧基乙?；?酰胺
Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八?；被?-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Gly8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH Nε37-2-(2-(2-(4-(4-(十七?；被?-4-(S)-羧基丁?；被?-4-(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基-[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)-NH2
Nε37-2-(2-[2-(2-[2-(4-[4-(十七酰基氨基)-4-(S)羧基丁?；被鵠-4-(S)-羧基丁?；被?乙氧基]乙氧基)乙?；被?乙氧基]乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)-NH2 Nε26-(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)-OH Nε26-2-(2-2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)-OH
[Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(19-(羧基)十九酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH [Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(17-(羧基)十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基))-OH [Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(19-(羧基)十九酰基氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH [Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十六?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)-乙?；?-OH GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)-乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?NH2 Nε20(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(17-(羧基)十七酰基氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Lys20]exendin-4(1-39)-NH2 Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37) Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37) Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Gly8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37) Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)-乙氧基)乙?；?[Lys20]Exendin-4(1-39)-酰胺 Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37) Nε26-(2-[2-(2-[2-(2-[2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙?；?[Arg34]GLP-1(7-37)-OH Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七?；被?-4(S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；鵠[Arg34]GLP-1(7-37)-OH Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[Lys20]Exendin-4(1-39)-酰胺
[Gly8，Glu22，23，30，Arg18，26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基))乙氧基)乙?；?-NH2 [咪唑基丙酸7，Asp16，Aib22，35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17-羧基十七?；被?丁基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基)) GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17-羧基十七?；被?丁基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基)) 和[3-(5-咪唑基)丙酰基7，Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基庚酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH 在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽是GLP-2肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-2肽是DPPIV保護(hù)的GLP-2肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-2肽是Gly2-GLP-2(1-33)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-2肽是Lys17Arg30-GLP-2(1-33)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽是人胰島素或其類似物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽選自下組AspB28-人胰島素、LysB28，ProB29-人胰島素、LysB3，GluB29-人胰島素、GlyA21，ArgB31，ArgB32人胰島素、和des(B30)人胰島素。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽是人生長(zhǎng)激素或其類似物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽是甲狀旁腺激素或其類似物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽是人促卵泡激素或其類似物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽的摩爾量小于100kDa、小于50kDa、或小于10kDa。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽選自下組生長(zhǎng)因子，諸如血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，諸如胰島素生長(zhǎng)因子I(IGF-I)、胰島素生長(zhǎng)因子II(IFG-II)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、或血管生成素；干擾素，尿激酶原，尿激酶，組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，纖溶酶原激活劑抑制劑1，纖溶酶原激活劑抑制劑2，血管假性血發(fā)病因子；細(xì)胞因子，例如白介素(IL)諸如IL-1、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-20、或IL-21，集落刺激因子(CFS)諸如GM-CSF，干細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子諸如TNF-α，淋巴毒素-α，淋巴毒素-β，CD40L，或CD30L；蛋白酶抑制劑，例如抑酶肽；酶，諸如超氧化物歧化酶、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、核糖核酸酶、過氧化氫酶、尿酸酶、膽紅素氧化酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性磷酸酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、或巴曲酶；阿片樣物質(zhì)，例如內(nèi)啡肽、腦啡肽、或非天然阿片樣物質(zhì)；激素或神經(jīng)肽，例如降鈣素、胰高血糖素、促胃液素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、縮膽囊素、促黃體素、促性腺激素釋放激素、絨毛膜促性腺激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、加壓素、催產(chǎn)素、抗利尿激素、促甲狀腺激素、促甲狀腺素釋放激素、松弛素、催乳素、YY肽、Y神經(jīng)肽、胰多肽、瘦素、CART(受可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本)、CART相關(guān)肽、脂滴相關(guān)蛋白、黑皮質(zhì)素(促黑激素)諸如MC-4、黑色素濃集激素、鈉尿肽、腎上腺髓質(zhì)素、內(nèi)皮素、胰泌素、糊精、血管活性腸肽(VIP)、可激活垂體腺苷酸環(huán)化酶的多肽(PACAP)、鈴蟾肽、鈴蟾肽樣肽、胸腺素、肝素結(jié)合蛋白、可溶性CD4、下丘腦釋放因子(hypothalmicreleasing factor)、褪黑素(melanotonin)及其類似物。
另一方面，本發(fā)明涉及包含依照本發(fā)明的化合物以及制藥學(xué)可接受賦形劑的藥物組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物適于腸胃外施用。
另一方面，本發(fā)明涉及依照本發(fā)明的化合物用于制備藥物的用途。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將依照本發(fā)明的化合物(其中治療性多肽是GLP-1肽)用于制備治療或預(yù)防高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、肥胖、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管病、中風(fēng)、炎性腸綜合征(infammatory bowel syndrome)、消化不良、和胃潰瘍的藥物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將依照本發(fā)明的化合物(其中治療性多肽是GLP-1肽)用于制備延遲或預(yù)防2型糖尿病疾病發(fā)展的藥物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將依照本發(fā)明的化合物(其中治療性多肽是GLP-1肽)用于制備減少食物攝入、降低β-細(xì)胞凋亡、提高β-細(xì)胞功能和β-細(xì)胞質(zhì)量、和/或恢復(fù)β-細(xì)胞葡萄糖敏感性的藥物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將依照本發(fā)明的化合物(其中治療性多肽是GLP-2肽)用于制備治療小腸綜合征(small bowelsyndrome)、炎性腸綜合征、或克羅恩病的藥物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將依照本發(fā)明的化合物(其中治療性多肽是胰島素肽)用于制備治療或預(yù)防高血糖癥、1型糖尿病、2型糖尿病、或β-細(xì)胞缺乏的藥物。
可以通過包括以下步驟的方法來生產(chǎn)治療性多肽在合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中在容許肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含編碼多肽的DNA序列且能夠表達(dá)該多肽的宿主細(xì)胞，然后由培養(yǎng)液回收由此產(chǎn)生的肽。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基，諸如含有適當(dāng)補(bǔ)充物的基本或復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可以由供應(yīng)商處購買，或者可以依照發(fā)表的處方自行配制(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心的目錄)。然后可以通過常規(guī)流程由培養(yǎng)液回收由細(xì)胞生成的肽，包括通過離心或過濾將細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，借助鹽(例如硫酸銨)沉淀上清液或?yàn)V出液中的蛋白質(zhì)性質(zhì)成分，根據(jù)目的肽的類型，通過多種層析流程進(jìn)行純化，例如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等等。
適宜的是，編碼治療性多肽的DNA序列可以是源自基因組或cDNA，例如如下得到的DNA序列，即依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建基因組或cDNA文庫，并使用合成寡核苷酸探針通過雜交篩選編碼整個(gè)或部分多肽的DNA序列(見例如Sambrook，J.、Fritsch，E.F.、和Maniatis，T.，MolecularCloningA Laboratory Manual，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，1989)。還可以使用已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)方法通過人工合成制備編碼多肽的DNA序列，例如Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters221859-1869，1981描述的磷亞酰胺法或Matthes等，EMBO Journal 3801-805，1984描述的方法。還可以使用特異引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來制備DNA序列，例如如US 4,683,202或Saiki等，Science 239487-491，1988中所述。
可以將DNA序列插入可以方便進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇常常取決于它將導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。由此，載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，它的復(fù)制不依賴染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。或者，載體可以是在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞基因組中并與它所整合的染色體一起復(fù)制的載體。
載體優(yōu)選其中編碼肽的DNA序列與DNA轉(zhuǎn)錄所必需的額外區(qū)段(諸如啟動(dòng)子)可操作相連的表達(dá)載體。啟動(dòng)子可以是在選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，而且可以衍生自編碼對(duì)于宿主細(xì)胞而言的同源或異源蛋白質(zhì)的基因。適于在多種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼本發(fā)明肽的DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的實(shí)例在本領(lǐng)域是眾所周知的，見例如Sambrook等，同上。
如果需要，編碼肽的DNA序列還可以可操作連接合適的終止子、多聚腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列、和翻譯增強(qiáng)子序列。本發(fā)明的重組載體還可以包含使得載體能夠在所研究的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
載體還可以包含選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物補(bǔ)足宿主細(xì)胞缺陷的基因，或者賦予藥物抗性的基因，例如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素、或甲氨蝶呤。
為了引導(dǎo)本發(fā)明的親本肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號(hào)序列(也稱為前導(dǎo)序列、前原序列(preprosequence)、或前序列(pre sequence))。將分泌信號(hào)序列與編碼肽的DNA序列以正確讀碼框相連接。分泌信號(hào)序列通常位于編碼肽的DNA序列的5′端。分泌信號(hào)序列可以是通常就與肽相連的，或者可以是來自編碼另一種分泌性蛋白質(zhì)的基因。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于分別連接編碼本發(fā)明肽的DNA序列、啟動(dòng)子、和任選的終止子和/或分泌信號(hào)序列以及將它們插入包含復(fù)制所必需的信息的合適載體的程序(見例如Sambrook等，同上)。
將要導(dǎo)入DNA序列或重組載體的宿主細(xì)胞可以是能夠生成本發(fā)明肽的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌、和高等真核細(xì)胞。本領(lǐng)域熟知且使用的合適宿主細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于大腸桿菌、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、或哺乳動(dòng)物的BHK或CHO細(xì)胞系。
可用作依照本發(fā)明的GLP-1部分(moiety)的化合物的實(shí)例見國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 87/06941(The General Hospital Corporation)，它涉及包含GLP-1(7-37)及其功能衍生物的肽片段，而且涉及它作為促胰島素劑的用途。
其它GLP-1類似物見國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 90/11296(The GeneralHospital Corporation)，它涉及包含GLP-1(7-36)及其功能衍生物且所具有的促胰島素活性超越GLP-1(1-36)或GLP-1(1-37)的促胰島素活性的肽片段，而且涉及它作為促胰島素劑的用途。
國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 91/11457(Buckley等)公布了也可用作依照本發(fā)明的GLP-1部分(moiety)的活性GLP-1肽7-34、7-35、7-36、和7-37的類似物。
藥物組合物可以通過常規(guī)技術(shù)來制備含有依照本發(fā)明的化合物的藥物組合物，例如如Remington′s Pharmaceutical Sciences，1985或RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995所述。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包含以約0.1至25mg/ml濃度存在的依照本發(fā)明的化合物的藥物制劑，且其中所述制劑的pH是2.0至10.0。藥物制劑可以包含以約0.1至50mg/ml濃度存在的依照本發(fā)明的化合物，且其中所述制劑的pH是2.0至10.0。制劑還可以包含緩沖系統(tǒng)、防腐劑、等滲劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、和表面活性劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是水性制劑，即含有水的制劑。這種制劑典型的是溶液或懸浮液。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑是水性溶液。術(shù)語“水性制劑”定義為至少含有50％w/w水的制劑。同樣，術(shù)語“水性溶液”定義為至少含有50％w/w水的溶液，而術(shù)語“水性懸浮液”定義為至少含有50％w/w水的懸浮液。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑是使用前需要醫(yī)師或患者向其中加入溶劑和/或稀釋劑的凍干制劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑是無需預(yù)先溶解即可使用的干制劑(例如凍干或噴霧干燥)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含依照本發(fā)明的化合物的水性溶液以及緩沖劑的藥物制劑，其中所述化合物以0.1mg/ml或更高的濃度存在，且所述制劑的pH是約2.0至約10.0。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含依照本發(fā)明的化合物的水性溶液和緩沖劑的藥物制劑，其中所述化合物以0.1mg/ml或更高的濃度存在，且其中所述制劑的pH是約7.0至約8.5。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑的pH選自下組2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、和10.0。優(yōu)選的是，制劑的pH與依照本發(fā)明的化合物的等電點(diǎn)相差至少一個(gè)pH單位，甚至更優(yōu)選相差至少兩個(gè)pH單位。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑選自下組乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、三(羥甲基)-氨基甲烷、hepes、N-二(羥乙基)甘氨酸、N(羥甲基)甲基甘氨酸、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸、或其混合物。這些具體緩沖劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)替換實(shí)施方案。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含制藥學(xué)可接受防腐劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑選自下組苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、芐醇、乙醇、氯丁醇、硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定(chlorohexidine)、脫氫乙酸鈉、氯甲酚、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、芐索氯銨、chlorphenesine(3-對(duì)氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)、或其混合物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑的濃度是0.1mg/ml至30mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑的濃度是0.1mg/ml至20mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑的濃度是0.1mg/ml至5mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑的濃度是5mg/ml至10mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑的濃度是10mg/ml至20mg/ml。這些具體防腐劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)替換實(shí)施方案。技術(shù)人員熟知防腐劑在藥物組合物中的用途。有用的參考書是RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，第19版，1995。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含等滲劑(isotonicagent)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，等滲劑選自下組鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、醛醇(例如甘油、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)、或其混合物?？梢允褂萌魏翁?，諸如單糖、二糖、或多糖，或者是水溶性聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支鏈淀粉、糊精、環(huán)糊精、可溶淀粉、羥乙基淀粉、和羧甲基纖維素鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖添加劑是蔗糖。糖醇定義為具有至少一個(gè)-OH基團(tuán)的C4-C8烴，包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇、和阿拉伯糖醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖醇添加劑是甘露醇?？梢詥为?dú)或聯(lián)合使用上文所述糖或糖醇。對(duì)于用量沒有固定的限制，只要糖或糖醇在液體制劑中可溶解，而且對(duì)使用本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)的穩(wěn)定作用沒有不利影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖或糖醇的濃度是約1mg/ml至約150mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，等滲劑的濃度是1mg/ml至50mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，等滲劑的濃度是1mg/ml至7mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，等滲劑的濃度是8mg/ml至24mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，等滲劑的濃度是25mg/ml至50mg/ml。這些具體等滲劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)替換實(shí)施方案。技術(shù)人員熟知等滲劑在藥物組合物中的用途。有用的參考書是RemingtonThe Scienceand Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含螯合劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、和天冬氨酸的鹽及其混合物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑的濃度是0.1mg/ml至5mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑的濃度是0.1mg/ml至2mg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑的濃度是2mg/ml至5mg/ml。這些具體螯合劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)替換實(shí)施方案。技術(shù)人員熟知螯合劑在藥物組合物中的用途。有用的參考書是RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含穩(wěn)定劑。技術(shù)人員熟知穩(wěn)定劑在藥物組合物中的用途。有用的參考書是RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
更具體的說，本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定的液體藥物組合物，其治療活性成分包括在以液體藥物制劑的形式貯藏的過程中可能形成聚集體的多肽?！靶纬删奂w”意指多肽分子之間導(dǎo)致寡聚體(可能保持可溶性)或大型可見聚集體(由溶液中沉淀出來)形成的物理相互作用。“貯藏過程中”意指液體藥物組合物或制劑在配制后沒有立即施用于受試者。相反，配制后，將其包裝以便貯藏，采取液體形式、凍結(jié)狀態(tài)、或干燥形式(稍后重構(gòu)成液體形式或適于施用于受試者的其它形式)。“干燥形式”意指通過冷凍干燥(即凍干法見例如Williams和Polli，J.Prenteral Sci.Technol.3848-59，1984)、噴霧干燥(見Masters，1991，在Spray-Drying Handbook一書中，第5版，Longman Scientfic and Technical，Essez，英國(guó)，第491-676頁；Broadhead等，Drug Devel.Ind.Pharm.181169-1206，1992；以及Mumenthaler等，Pham. Res.1112-20，1994)、或空氣干燥(Carpenter和Crowe，Cryobiology 25459-470，1988；以及Roser，Biopharm.447-53，1991)將液體藥物組合物或制劑干燥。在液體藥物組合物的貯藏過程中由多肽形成聚集體可能對(duì)該多肽的生物學(xué)活性產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致藥物組合物的治療功效損失。另外，聚集體的形成可能引起其它問題，諸如在使用輸注系統(tǒng)施用含有多肽的藥物組合物時(shí)阻塞管道、膜、或泵。
本發(fā)明的藥物組合物還可以包含其數(shù)量足以減少組合物的貯藏過程中由多肽形成聚集體的氨基酸堿?！鞍被釅A”意指氨基酸或其組合，其中任何指定氨基酸以其游離堿的形式或以其鹽的形式存在。在使用氨基酸組合時(shí)，可以是所有氨基酸都以它們游離堿的形式存在，可以是所有氨基酸都以它們鹽的形式存在，或者一些以它們游離堿的形式存在而另一些以它們鹽的形式存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，制備本發(fā)明組合物時(shí)使用的氨基酸是攜帶帶電荷側(cè)鏈的氨基酸，諸如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、和谷氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明組合物的氨基酸是甘氨酸。本發(fā)明的藥物組合物中可以存在特定氨基酸(例如甲硫氨酸、組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸、及其混合物)的任何立體異構(gòu)體(即L或D)或其組合，只要特定氨基酸以其游離堿的形式或其鹽的形式存在。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用L-立體異構(gòu)體。還可以用這些氨基酸的類似物來配制本發(fā)明的組合物?！鞍被犷愃莆铩币庵柑烊淮嬖诎被岬难苌铮鼛砹藴p少本發(fā)明液體藥物組合物的貯藏過程中由多肽形成聚集體的期望效果。合適的精氨酸類似物包括例如氨基胍、鳥氨酸、和N-單乙基L-精氨酸，合適的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸，而合適的半胱氨酸類似物包括S-甲基L-半胱氨酸。對(duì)于其它氨基酸，以其游離堿的形式或其鹽的形式將氨基酸類似物摻入組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，以足以預(yù)防或延遲蛋白質(zhì)聚集的濃度使用氨基酸或其類似物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)擔(dān)當(dāng)治療劑的多肽是包含至少一個(gè)甲硫氨酸殘基而易受下述氧化影響的多肽時(shí)，可以添加甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或其類似物)來抑制甲硫氨酸殘基氧化變成甲硫氨酸亞砜。“抑制”意指甲硫氨酸氧化產(chǎn)物隨時(shí)間的最小積累。抑制甲硫氨酸氧化導(dǎo)致多肽更持久的保持其正確的分子形式。可以使用甲硫氨酸的任何立體異構(gòu)體(L、D、或其混合物)。添加的數(shù)量應(yīng)當(dāng)足以抑制甲硫氨酸殘基的氧化，使得甲硫氨酸亞砜的數(shù)量是管理機(jī)構(gòu)可以接受的。通常，這意味著組合物包含不超過約10％至約30％的甲硫氨酸亞砜。通常，這可以通過以約1∶1至約1000∶1諸如約10∶1至約100∶1的外加甲硫氨酸對(duì)甲硫氨酸殘基的比率添加甲硫氨酸來實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含選自下組的穩(wěn)定劑高分子量聚合物或低分子化合物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L、和HPMC)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)(如單硫甘油、硫代乙醇酸、和2-甲基硫代乙醇)、和不同的鹽(例如氯化鈉)。這些具體穩(wěn)定劑的每-種構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)替換實(shí)施方案。
藥物組合物還可以包含進(jìn)一步增強(qiáng)其中治療活性多肽的穩(wěn)定性的額外穩(wěn)定劑。本發(fā)明特別感興趣的穩(wěn)定劑包括但不限于保護(hù)多肽免于甲硫氨酸氧化的甲硫氨酸和EDTA，以及保護(hù)多肽免于凍融或機(jī)械剪切相關(guān)聚集的非離子表面活性劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑還包含表面活性劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，表面活性劑選自去污劑、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化(polyglycolyzed)甘油酯、乙?；视蛦熙?、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆，諸如Pluronic_F68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、星形PEO、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物諸如烷基化和烷氧基化衍生物(吐溫，例如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80、和Brij-35)、聚氧乙烯羥基硬脂酸酯、甘油單酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、凝集素、磷脂(例如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、和鞘磷脂)、磷脂的衍生物(例如二棕櫚酰磷脂酸)和溶血磷脂的衍生物(例如棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸和乙醇胺、膽堿、絲氨酸、或蘇氨酸的1-?；?sn-甘油-3-磷酸酯)、溶血磷脂酰和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷酯)、烷氧(烷醚)衍生物(例如溶血磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物)、極性首基(即膽堿、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘油、肌醇)和帶正電荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP的修飾、溶血磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰蘇氨酸、甘油磷脂(例如腦磷脂)、甘油糖脂(例如吡喃型半乳糖苷脂)、鞘糖脂(例如神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂)、十二基磷酸膽堿、雞卵溶血卵磷脂、梭鏈孢酸衍生物(例如?；?二氫梭鏈孢酸鈉等)、C6-C12的長(zhǎng)鏈脂肪酸及其鹽(例如油酸和辛酸)、酰基肉堿及其衍生物、賴氨酸、精氨酸、或組氨酸的Nα-?；苌铩①嚢彼峄蚓彼岬膫?cè)鏈?；苌铩嚢彼?、精氨酸、或組氨酸與中性或酸性氨基酸的任意組合的二肽的Nα-?；苌铩行园被崤c兩個(gè)帶電荷氨基酸的任意組合的三肽的Nα-?；苌?、DSS(多庫酯鈉，CAS注冊(cè)號(hào)[577-11-7]；多庫酯鈣，CAS注冊(cè)號(hào)[128-49-4]；多庫酯鉀，CAS注冊(cè)號(hào)[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸及其鹽、甘氨酸或?；撬峋Y合物、熊去氧膽酸、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘膽酸鈉、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-銨-1-丙烷磺酸鹽、陰離子單價(jià)表面活性劑(烷基-?；?磺酸鹽)、兩性離子表面活性劑(例如N-烷基-N，N-二甲基銨-1-丙烷磺酸鹽、3-膽胺基-1-丙基二甲基銨-1-丙烷磺酸鹽)、陽離子表面活性劑(季銨堿)(例如鯨蠟基-三甲基溴化銨、鯨蠟基吡啶_氯化物)、非離子表面活性劑(例如十二烷基β-D-吡喃型葡萄糖苷)、poloxamine(即通過向乙二胺連續(xù)添加氧化丙烯和氧化乙烯衍生的四功能嵌段共聚物)(例如Tetronic)、咪唑啉衍生物、或其化合物。這些具體表面活性劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)替換實(shí)施方案。
技術(shù)人員熟知表面活性劑在藥物組合物中的用途。有用的參考書是RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
可以如例如WO 03/002136中所述制備用于腸胃外施用GLP-1化合物的組合物。
可能的是，本發(fā)明的肽藥物制劑中還存在其它成分。這些額外成分可以包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、螯合劑、金屬離子、油質(zhì)媒介、蛋白質(zhì)(例如人血清清蛋白、明膠、或蛋白質(zhì))、和兩性離子(例如氨基酸，諸如甜菜堿、?；撬?、精氨酸、甘氨酸、賴氨酸、和組氨酸)。這些額外成分當(dāng)然不應(yīng)當(dāng)對(duì)本發(fā)明藥物制劑的總體穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。
可以在數(shù)個(gè)部位對(duì)需要這種治療的患者施用含有依照本發(fā)明的化合物的藥物組合物，例如局部部位(例如皮膚和粘膜部位)、繞過吸收的部位(例如在動(dòng)脈、靜脈、心臟中施用)、和牽涉吸收的部位(例如在皮膚中、在皮膚下面、在肌肉中、或在腹部施用)。
可以通過數(shù)種施用路徑對(duì)需要這種治療的患者施用依照本發(fā)明的藥物組合物，例如舌、舌下、口腔、口中、口服、胃和腸中、鼻、肺(例如通過細(xì)支氣管和肺泡或其聯(lián)合)、表皮、真皮、透皮、陰道、直腸、眼(例如通過結(jié)膜)、輸尿管、和腸胃外。
可以以數(shù)種劑型來施用本發(fā)明的組合物，例如溶液、懸浮液、乳液、微乳液、復(fù)合乳液、泡沫、軟膏、糊劑、膏藥、藥膏、片劑、包衣片、洗液、膠囊(例如硬明膠膠囊和軟明膠膠囊)、栓劑、直腸膠囊、滴劑、凝膠、噴霧劑、粉劑、氣霧劑、吸入劑、滴眼液、眼膏、洗眼液、陰道栓、陰道環(huán)、陰道藥膏、注射液、原位轉(zhuǎn)變液(例如原位膠凝、原位安裝、原位沉淀、原位結(jié)晶)、輸液、和植入物。
還可以將本發(fā)明的組合物復(fù)合或附著(例如通過共價(jià)、疏水、和靜電相互作用)藥物載體、藥物投遞系統(tǒng)、和高級(jí)藥物投遞系統(tǒng)，從而進(jìn)一步提高化合物的穩(wěn)定性、提高生物利用度、提高溶解度、降低不利作用、完成本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的計(jì)時(shí)療法、和提高患者依從性或其任何組合。載體、藥物投遞系統(tǒng)、和高級(jí)藥物投遞系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于聚合物(例如纖維素及其衍生物)、多糖(例如葡聚糖及其衍生物、淀粉及其衍生物)、聚乙烯醇、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白(例如清蛋白)、凝膠(例如熱膠凝系統(tǒng)，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的嵌段共聚合系統(tǒng))、膠束、脂質(zhì)體、微球體、納米顆粒、液晶及其分散體、L2相及其分散體(本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知它在脂-水體系中的相特性)、聚合膠束、復(fù)合乳液、自身乳化、自身微乳化、環(huán)糊精及其衍生物、以及樹狀分子(dendrimer)。
本發(fā)明的組合物可用于配制用于肺部施用化合物的固體、半固體、粉末、和溶液，例如使用計(jì)量藥劑吸入器、地粉吸入器、和噴霧器，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的裝置。
本發(fā)明的組合物具體可用于配制受控、持續(xù)、延長(zhǎng)、延遲、和緩慢藥物投遞系統(tǒng)。更具體的說，而非限制，組合物可用于配制本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的腸胃外受控釋放和持續(xù)釋放系統(tǒng)(這兩種系統(tǒng)都導(dǎo)致施用次數(shù)減少許多倍)。甚至更優(yōu)選的是皮下施用的受控釋放和持續(xù)釋放系統(tǒng)。并非限制本發(fā)明的范圍，有用的受控釋放系統(tǒng)和組合物的實(shí)例是水凝膠、油質(zhì)凝膠、液晶、聚合膠束、微球體、納米顆粒。
用于生產(chǎn)對(duì)本發(fā)明組合物有用的受控釋放系統(tǒng)的方法包括但不限于結(jié)晶、濃縮、共結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓勻漿、封裝、噴霧干燥、微囊化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以生成微球體、擠壓、和超臨界流體過程。一般參考書有Handbook of PharmaceuticalControlled Release，Wise，D.L.編，Marcel Dekker，紐約，2000；以及Drug and the Pharmaceutical Sciences，第99卷，ProteinFormulation and Delivery，MacNally，E.J.編，Marcel Dekker，紐約，2000。
可以借助注射器(任選筆樣注射器)的手段通過皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行腸胃外施用?；蛘?，可以借助輸液泵的手段進(jìn)行腸胃外施用。另一種選擇是這樣的組合物，它可以是以鼻或肺噴霧的形式施用依照本發(fā)明的化合物的溶液或懸浮液。還有一種選擇是，還可以使含有本發(fā)明化合物的藥物組合物適用于經(jīng)皮施用(例如通過無針注射或貼劑，任選離子電滲貼劑)或經(jīng)粘膜施用(例如口腔)。
術(shù)語“穩(wěn)定的制劑”指物理穩(wěn)定性提高、化學(xué)穩(wěn)定性提高、或物理和化學(xué)穩(wěn)定性提高的制劑。
術(shù)語“物理穩(wěn)定性”在本文中用于蛋白質(zhì)制劑時(shí)指作為蛋白質(zhì)暴露于熱-機(jī)械壓力和/或與去穩(wěn)定的界面和表面(諸如疏水表面和界面)相互作用的結(jié)果，蛋白質(zhì)形成生物學(xué)無活性和/或不溶性的蛋白質(zhì)聚集體的趨勢(shì)?？梢酝ㄟ^如下手段評(píng)估水性蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性將裝入合適的容器(例如藥筒或藥瓶)的制劑在不同溫度下暴露于機(jī)械/物理壓力(例如搖動(dòng))達(dá)不同時(shí)間后進(jìn)行視覺檢查和/或混濁度測(cè)量。對(duì)制劑的視覺檢查是在黑暗背景下在強(qiáng)烈聚焦燈光下進(jìn)行的。制劑的混濁度表現(xiàn)為將混濁程度分級(jí)的視覺評(píng)分，例如由0至3的等級(jí)(不顯示混濁的制劑對(duì)應(yīng)于視覺評(píng)分0，而在日光中顯示可見混濁的制劑對(duì)應(yīng)于視覺評(píng)分3)。當(dāng)制劑在日光下顯示可見混濁時(shí)，將其歸類為在蛋白質(zhì)聚集方面是物理不穩(wěn)定的?；蛘?，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的簡(jiǎn)單的混濁度測(cè)量方法來評(píng)估制劑的混濁度。還可以使用蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)的光譜試劑或探針來評(píng)估水性蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性。探針優(yōu)選優(yōu)先與蛋白質(zhì)的非天然異構(gòu)體結(jié)合的小分子。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針的一個(gè)實(shí)例是硫黃素(Thioflavin)T。硫黃素T是廣泛用于檢測(cè)淀粉樣纖絲的熒光染料。在存在纖絲以及可能有其它蛋白質(zhì)構(gòu)型時(shí)，硫黃素T在與纖絲蛋白質(zhì)形式結(jié)合后在約450nm處產(chǎn)生新的最大激發(fā)并在約482nm處產(chǎn)生增強(qiáng)的發(fā)射。未結(jié)合的硫黃素T本質(zhì)上在這些波長(zhǎng)沒有熒光。
其它小分子可以用作由天然狀態(tài)變成非天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的探針，例如優(yōu)先與蛋白質(zhì)暴露的疏水斑結(jié)合的“疏水斑”探針。疏水斑通常埋藏在處于其天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)之中，但是在蛋白質(zhì)開始去折疊或變性時(shí)成為暴露的。這些小分子光譜探針的實(shí)例是芳香族、疏水性染料，諸如antrhacene、吖啶、菲咯啉、諸如此類。其它光譜探針有金屬-氨基酸復(fù)合物，諸如疏水氨基酸(諸如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、和纈氨酸等等)的鈷金屬復(fù)合物。
術(shù)語“化學(xué)穩(wěn)定性”在本文中用于蛋白質(zhì)制劑時(shí)指蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中導(dǎo)致化學(xué)降解產(chǎn)物形成的化學(xué)共價(jià)變化，與天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相比所述化學(xué)降解產(chǎn)物的生物學(xué)效力可能降低和/或免疫原性可能升高。根據(jù)天然蛋白質(zhì)的類型和本質(zhì)以及蛋白質(zhì)所暴露的環(huán)境，可能形成多種化學(xué)降解產(chǎn)物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，幾乎不可能完全避免或消除化學(xué)降解，而且在蛋白質(zhì)制劑的貯藏和使用過程中常?？吹交瘜W(xué)降解產(chǎn)物的數(shù)量增加。大多數(shù)蛋白質(zhì)傾向于脫酰胺，在這個(gè)過程中谷氨酰胺?；蛱於０孵埢膫?cè)鏈酰胺基團(tuán)水解而形成游離的羧酸。其它降解途徑涉及高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成，其中兩個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)分子通過轉(zhuǎn)酰胺基作用和/或二硫鍵作用彼此共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致共價(jià)結(jié)合二聚體、寡聚體、和多聚體降解產(chǎn)物的形成(Stability of ProteinPharmaceuticals，Ahern T.J.和Manning M.C.，Plenum出版社，紐約，1992)。(例如甲硫氨酸殘基的)氧化是化學(xué)降解的另一種變型?？梢酝ㄟ^在暴露于不同環(huán)境條件后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量化學(xué)降解產(chǎn)物的數(shù)量來評(píng)估蛋白質(zhì)制劑的化學(xué)穩(wěn)定性(常?？梢酝ㄟ^例如提高溫度來加速降解產(chǎn)物的形成)。常常通過根據(jù)分子量和/或電荷使用多種層析技術(shù)(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分離降解產(chǎn)物來測(cè)定每一種降解產(chǎn)物的數(shù)量。
因此，如上所述，“穩(wěn)定的制劑”指物理穩(wěn)定性提高、化學(xué)穩(wěn)定性提高、或物理和化學(xué)穩(wěn)定性提高的制劑。一般而言，制劑在使用和貯藏過程中必需是穩(wěn)定的(依照推薦的使用和貯藏條件)，直至有效期滿。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含依照本發(fā)明的化合物的藥物制劑對(duì)于超過6周的使用和超過3年的貯藏是穩(wěn)定的。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含依照本發(fā)明的化合物的藥物制劑對(duì)于超過4周的使用和超過3年的貯藏是穩(wěn)定的。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含依照本發(fā)明的化合物的藥物制劑對(duì)于超過4周的使用和超過2年的貯藏是穩(wěn)定的。
在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施方案中，包含依照本發(fā)明的化合物的藥物制劑對(duì)于超過2周的使用和超過2年的貯藏是穩(wěn)定的。
可以對(duì)需要這種治療的患者腸胃外施用包含依照本發(fā)明的GLP-1衍生物的藥物組合物?？梢越柚⑸淦?任選筆樣注射器)的手段通過皮下、肌肉內(nèi)、或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行腸胃外施用?；蛘撸梢越柚斠罕玫氖侄芜M(jìn)行腸胃外施用。另一種選擇是這樣的組合物，它可以是以鼻或肺噴霧的形式施用GLP-1衍生物的粉末或懸浮液。還有一種選擇是，還可以經(jīng)皮(例如貼劑，任選離子電滲貼劑)或經(jīng)粘膜(例如口腔)施用本發(fā)明的GLP-1衍生物。
由此，可以使用制藥工業(yè)的常規(guī)技術(shù)來制備本發(fā)明的GLP-1衍生物的可注射組合物，它涉及將適合的成分溶解和混合以產(chǎn)生期望的最終產(chǎn)品。
依照一種程序，將GLP-1衍生物溶于數(shù)量小于待制備組合物最終體積的水。根據(jù)需要添加等滲劑、防腐劑、和緩沖劑。如果需要，根據(jù)需要用酸(例如鹽酸)或堿(例如氫氧化鈉水溶液)調(diào)節(jié)溶液的pH。最后，用水調(diào)整溶液的體積，達(dá)到成分的期望濃度。
除了上述成分以外，含有依照本發(fā)明的GLP-1衍生物的溶液還可以含有表面活性劑以提高GLP-1衍生物的溶解度和/或穩(wěn)定性。
例如，可以如歐洲專利號(hào)272097(授予Novo Nordisk A/S)或WO 93/18785中所述制備用于鼻內(nèi)施用某些肽的組合物。
依照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，以適于通過注射進(jìn)行施用的組合物的形式提供GLP-1衍生物。這種組合物可以是即用型注射液，或者可以是必需在注射前溶于溶劑的一定量固體組合物(例如凍干產(chǎn)品)。優(yōu)選的是，注射液所含有的GLP-1衍生物不少于約2mg/ml、優(yōu)選不少于約5mg/ml、更優(yōu)選不少于約10mg/ml，而且優(yōu)選的是，不超過約100mg/ml。
本發(fā)明的GLP-1衍生物可用于治療多種疾病。將使用的具體GLP-1衍生物和用于任何患者的最佳劑量水平將取決于待治療的疾病和多種因素，包括所采用具體肽衍生物的功效、患者的年齡、體重、身體活性、和飲食、與其它藥物的可能組合、以及病例的嚴(yán)重程度。推薦的是，由本領(lǐng)域技術(shù)人員為每位患者個(gè)體確定本發(fā)明GLP-1衍生物的劑量。
具體而言，設(shè)想GLP-1衍生物將可用于制備具有延長(zhǎng)作用特性的藥物，用于治療非胰島素依賴性糖尿病和/或用于治療肥胖。
另一方面，本發(fā)明涉及依照本發(fā)明的化合物用于制備藥物的用途。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及依照本發(fā)明的化合物用于制備治療高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、肥胖、高血壓、X綜合征、血脂異常、β-細(xì)胞凋亡、β-細(xì)胞缺乏、心肌梗塞、炎性腸綜合征、消化不良、認(rèn)知障礙(例如認(rèn)知增強(qiáng))、神經(jīng)保護(hù)、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和其它心血管病的藥物的用途。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及依照本發(fā)明的化合物用于制備治療小腸綜合征、炎性腸綜合征、或克羅恩病的藥物的用途。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及依照本發(fā)明的化合物用于制備治療高血糖癥、1型糖尿病、2型糖尿病、或β-細(xì)胞缺乏的藥物的用途。
使用依照本發(fā)明的化合物進(jìn)行的治療還可以聯(lián)合第二種或多種制藥學(xué)活性物質(zhì)，例如選自抗糖尿病藥、減肥藥、食欲調(diào)節(jié)藥、抗高血壓藥、用于治療和/或預(yù)防由糖尿病引起的或與其有關(guān)的并發(fā)癥的藥物、以及用于治療和/或預(yù)防由肥胖引起的或與其有關(guān)的并發(fā)癥和紊亂的藥物。在本文中，表述“抗糖尿病藥”包括用于治療和/或預(yù)防胰島素耐受和其中胰島素耐受作為病理生理學(xué)機(jī)制的疾病的化合物。
這些制藥學(xué)活性物質(zhì)的實(shí)例有胰島素、GLP-1拮抗劑、磺酰脲(例如甲苯磺丁脲、格列本脲、格列吡嗪、和格列奇特)、雙胍(例如二甲雙胍)、氯茴苯酸、葡糖苷酶抑制劑(例如acorbose)、胰高血糖素拮抗劑、DPP-IV(二肽酰肽酶-IV)抑制劑、參與刺激葡糖異生和/或糖原分解的肝酶的抑制劑、葡萄糖攝取調(diào)控物、噻唑烷二酮(諸如曲格列酮和環(huán)格列酮)、改變脂質(zhì)代謝的化合物(諸如抗高脂血癥藥，像HMG CoA抑制劑(他汀))、減少食物攝入的化合物、RXR激動(dòng)劑、以及作用于β-細(xì)胞ATP依賴性鉀通道的藥物(例如格列本脲、格列吡嗪、格列奇特、和瑞格列奈)；考來烯胺、考來替泊、氯貝丁酯、吉非貝齊、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普羅布考、右旋甲狀腺素、neteglinide、瑞格列奈；β-阻斷藥(諸如阿普洛爾、阿替洛爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、普萘洛爾、和美托洛爾)、ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)變酶)抑制劑(諸如貝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、alatriopril、喹那普利、和雷米普利)、鈣通道阻斷藥(諸如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、依拉地平、尼莫地平、地爾硫卓、和維拉帕米)、以及α-阻斷藥(諸如多沙唑嗪、烏拉地爾、哌唑嗪、和特拉唑嗪)；CART(受可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本)激動(dòng)劑、NPY(神經(jīng)肽Y)拮抗劑、MC4(黑皮質(zhì)素4)激動(dòng)劑、阿立新拮抗劑、TNF(腫瘤壞死因子)激動(dòng)劑、CRF(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)激動(dòng)劑、CRF BP(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、尿皮質(zhì)醇激動(dòng)劑、β3激動(dòng)劑、MSH(促黑激素)激動(dòng)劑、MCH(黑色素細(xì)胞濃集激素)拮抗劑、CCK(縮膽囊素)激動(dòng)劑、血清素再攝取抑制劑、血清素和去甲腎上腺素再攝取抑制劑、混合血清素和去甲腎上腺素能化合物、5HT(血清素)激動(dòng)劑、鈴蟾肽激動(dòng)劑、神經(jīng)節(jié)肽拮抗劑、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素釋放化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動(dòng)劑、UCP 2或3(解偶聯(lián)蛋白2或3)調(diào)控劑、瘦素激動(dòng)劑、DA激動(dòng)劑(溴隱亭、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制劑、RXR(類維生素AX受體)調(diào)控劑、TRβ激動(dòng)劑；組胺H3拮抗劑。
應(yīng)當(dāng)理解，依照本發(fā)明的化合物與一種或多種上文所述化合物以及任選的一種或多種其它制藥學(xué)活性物質(zhì)的任何合適組合認(rèn)為是屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
下面的實(shí)施例將進(jìn)一步例示本發(fā)明，但是不應(yīng)將其解釋為對(duì)保護(hù)范圍的限制。上面的描述和下面的實(shí)施例中公布的特色(無論是分開的，或者是以其任何組合)對(duì)于認(rèn)識(shí)本發(fā)明的不同形式都是重要的。
實(shí)施例對(duì)商業(yè)性化學(xué)試劑使用下列首字母縮寫DMFN，N-二甲基甲酰胺
DCCN，N-二環(huán)己基碳二亞胺NMPN-甲基-2-吡咯烷酮TFA三氟乙酸THF四氫呋喃DIEA異丙基乙胺H2O水CH3CN乙腈HBTU2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽Fmoc9H-芴-9-基甲氧基羰基Boc叔丁氧基羰基OtBu叔丁酯tBu叔丁基Trt三苯基甲基Pmc2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氫吡喃-6-磺?；鵇de1-(4，4-二甲基-2，6-二氧環(huán)亞己基)乙基DCM二氯甲烷TIS三異丙基硅烷Et2O二乙醚H-Glu(OH)-OButL-谷氨酸α-叔丁酯HOOC-(CH2)12-COONSuω-羧基十三酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯HOOC-(CH2)14-COONSuω-羧基十五酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯HOOC-(CH2)16-COONSuω-羧基十七酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯HOOC-(CH2)18-COONSuω-羧基十九酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯縮寫r.t.室溫PDMS等離子解吸質(zhì)譜
MALDI-MS基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜HPLC高效液相層析amu原子質(zhì)量單位分析通過如下降解測(cè)定法來測(cè)定肽對(duì)二肽酰氨肽酶IV的降解的抵抗力將幾份肽與一份純化的二肽酰氨肽酶IV在pH7-8的合適緩沖液(緩沖劑不是清蛋白)中于37℃保溫4-22小時(shí)。添加三氟乙酸終止酶促反應(yīng)，并通過HPLC或LC-MS分析將肽降解產(chǎn)物分離和量化。用于進(jìn)行這種分析的一種方法是將混合液施加到Zorbax 300SB-C18(30nm孔徑，5μm顆粒)150×2.1mm柱上，并用乙腈在0.1％三氟乙酸中的線性梯度(0％-100％乙腈，30分鐘)以流速0.5ml/min進(jìn)行洗脫?？梢酝ㄟ^它們?cè)?14nm(肽鍵)或280nm(芳香族氨基酸)的吸光率來監(jiān)測(cè)肽及其降解產(chǎn)物，并通過將它們的峰面積積分而量化。可以使用LC-MS來測(cè)定降解模式，其中可以測(cè)定各個(gè)峰的MS譜。根據(jù)在指定時(shí)間的完整/降解化合物百分率，評(píng)估肽的DPPIV穩(wěn)定性。
當(dāng)根據(jù)完整化合物在指定時(shí)間的百分率，肽比天然肽穩(wěn)定10倍時(shí)，將它定義為DPPIV穩(wěn)定化的。由此，DPPIV穩(wěn)定化的GLP-1化合物至少比GLP-1(7-37)穩(wěn)定10倍。
一般合成方法可以在Fmoc保護(hù)的Rink酰胺樹脂(Novabiochem)或氯三苯甲基樹脂或適于固相肽合成的類似樹脂上合成肽?？梢允褂肂oc化學(xué)，但是更方便的是使用Fmoc策略，最終在Applied Biosystems 433A肽合成儀上以0.25mmol規(guī)模使用FastMoc UV方案，采用溶于N-甲基吡咯烷酮的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽)來介導(dǎo)偶聯(lián)(HATU更適于受阻偶聯(lián))，并UV監(jiān)測(cè)Fmoc保護(hù)基團(tuán)的脫保護(hù)。也可以使用HBTU和HATU以外的偶聯(lián)劑，例如CurrentOpinion in Chemical Biology 8211-2210，2004中所述。所使用的受保護(hù)氨基酸衍生物可以是適于ABI433A合成儀的在預(yù)稱重藥筒中供應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-氨基酸(Applied Biosystems)，除了非天然氨基酸，諸如購自諸如Bachem等供應(yīng)商并轉(zhuǎn)移到空藥筒中的Fmoc-Aib-OH(Fmoc-氨基異丁酸)。最后偶聯(lián)的氨基酸可以是Boc保護(hù)的。
可以通過在自動(dòng)化合成過程中摻入Fmoc-Lys(Dde)-OH，隨后用肼選擇性脫保護(hù)，最終在特定位置導(dǎo)入側(cè)鏈和接頭，對(duì)與樹脂結(jié)合的粗制受保護(hù)肽上特定賴氨酸殘基進(jìn)行附著。對(duì)賴氨酸可以使用其它正交保護(hù)基團(tuán)。
用于清除Dde保護(hù)的程序可以將樹脂(0.25mmol)置于手工搖動(dòng)器/過濾裝置中，并用溶于N-甲基吡咯烷酮的2％肼進(jìn)行處理(20ml，2×12min)，以除去DDE基團(tuán)，隨后用N-甲基吡咯烷酮進(jìn)行清洗(4×20ml)。
用于將側(cè)鏈附著到賴氨酸殘基上的程序可以將氨基酸(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)溶于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，10ml)。添加羥基苯并三唑(HOBt)(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)和二異丙基碳二亞胺(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)，并將溶液攪動(dòng)15分鐘。將溶液加到樹脂中，并添加二異丙基乙胺(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)。將樹脂于室溫?fù)u動(dòng)24小時(shí)。用N-甲基吡咯烷酮(2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，2×20ml)、和二氯甲烷(2×20ml)清洗樹脂。
用于清除Fmoc保護(hù)的程序?qū)渲?0.25mmol)置于手工搖動(dòng)裝置中的濾瓶中，并用N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮(1×20ml)、和哌啶溶于N-甲基吡咯烷酮的20％溶液(3×20ml)進(jìn)行處理，每次10分鐘。用N-甲基吡咯烷酮(2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，2×20ml)、和二氯甲烷(2×20ml)清洗樹脂。
用于由樹脂上切下肽的程序?yàn)榱擞蓸渲锨邢码?，將樹脂在三氟乙酸、水、和三異丙基硅烷混合?95∶2.5∶2.5)中于室溫?cái)噭?dòng)180分鐘。將切割混合液過濾，并通過氮?dú)饬鲗V出液濃縮成油。用45ml二乙醚由此油中沉淀出粗制肽，并用45ml二乙醚清洗3次。
純化可以在填充7μC-18二氧化硅的20mm×250mm柱上通過半制備性HPLC純化粗制肽。根據(jù)肽，可以使用一種或兩種純化系統(tǒng)硫酸銨將柱用溶于0.05M(NH4)2SO4并用濃H2SO4調(diào)至pH2.5的40％CH3CN進(jìn)行平衡。干燥后，將粗制肽溶于5ml 50％乙酸/H2O，用H2O稀釋至20ml，并注射到柱上。然后用CH3CN在0.05M(NH4)2SO4pH2.5中的40％-60％梯度以10ml/分鐘流速用50分鐘于40℃進(jìn)行洗脫。收集含肽級(jí)分，用3倍體積的H2O稀釋，并流過用0.1％TFA平衡的Sep-Pak_C18藥筒(Waters part.#51910)。然后用溶于0.1％TFA的70％CH3CN進(jìn)行洗脫，用水稀釋洗脫液后通過凍干法分離純化的肽。
TFA干燥后，將粗制肽溶于5ml 50％乙酸/H2O，用H2O稀釋至20ml，并注射到柱上。然后用CH3CN在0.1％TFA中的40％-60％梯度以10ml/分鐘流速用50分鐘于40℃進(jìn)行洗脫。收集含肽級(jí)分。用水稀釋洗脫液后將純化的肽凍干。
可以通過分析性RP-HPLC(保留時(shí)間)和LCMS鑒定得到的終產(chǎn)物。
在實(shí)驗(yàn)部分中進(jìn)行的RP-HPLC分析是使用214nmUV檢測(cè)和Vydac218TP54 4.6mm×250mm 5μC-18二氧化硅柱(The Separations Group，Hesperia，美國(guó))進(jìn)行的，洗脫以1ml/分鐘流速于42℃進(jìn)行。不同的洗脫條件是A1將柱用含0.1M(NH4)2SO4并用濃H2SO4調(diào)至pH2.5的緩沖液進(jìn)行平衡，并且用CH3CN在相同緩沖液中的0％-60％梯度用50分鐘進(jìn)行洗脫。
B1將柱用0.1％TFA/H2O進(jìn)行平衡，并且用0％CH3CN/0.1％TFA/H2O至60％CH3CN/0.1％TFA/H2O梯度在50分鐘內(nèi)進(jìn)行洗脫。
B6將柱用0.1％TFA/H2O進(jìn)行平衡，并且用0％CH3CN/0.1％TFA/H2O至90％CH3CN/0.1％TFA/H2O梯度用50分鐘進(jìn)行洗脫。候選系統(tǒng)是
B4使用配備了Waters 2487雙波段檢測(cè)儀的Alliance Waters 2695系統(tǒng)進(jìn)行RP分析。使用Symmetry 300 C18，5μm，3.9mm×150mm柱于42℃收集214nm和254nm的UV檢測(cè)峰。用5-95％乙腈、90-0％水、和5％三氟乙酸(1.0％)在水中的線性梯度用15分鐘以1.0ml/分鐘流速進(jìn)行洗脫。
LCMS是在由受HP Chemstation軟件控制的Hewlett Packard系列1100 G1312A Bin泵、Hewlett Packard系列1100柱隔間、HewlettPackard系列1100 G1315A DAD二極管陣列檢測(cè)儀、Hewlett Packard系列1100MSD、和Sedere 75蒸發(fā)光散射檢測(cè)儀組成的裝置上進(jìn)行的。
HPLC泵與裝有下列洗脫液的兩個(gè)洗脫液儲(chǔ)液器相連A0.05％TFA/水B0.05％TFA/乙腈或者，兩個(gè)系統(tǒng)是A10mM NH4OH/水B10mM NH4OH/90％乙腈為了進(jìn)行分析，于23℃將適當(dāng)體積的樣品(優(yōu)選20μl)注射到柱上，并用A和B的梯度進(jìn)行洗脫。
下表給出了所使用的HPLC條件、檢測(cè)儀設(shè)置、和質(zhì)譜設(shè)置。柱Waters Xterra MS C-18(50×3mm id 5μm)梯度5％-100％乙腈線性梯度，用時(shí)6.5分，流速1.5ml/分鐘檢測(cè)210nm(模擬輸出來自DAD)ELS(模擬輸出來自ELS)MS電離模式API-ES；掃描550-1500amu，步長(zhǎng)0.1amu或者，LC-MS分析可以在配備了兩個(gè)Perkin Elmer系列200微型泵、一個(gè)Perkin Elmer系列200自動(dòng)加樣器、一個(gè)Applied Biosystems785A UV檢測(cè)儀、和一個(gè)Sedex 75蒸發(fā)光散射檢測(cè)儀的PE-Sciex API100質(zhì)譜儀上進(jìn)行。將Waters Xterra 3.0mm×50mm 5μC-18二氧化硅柱以1.5ml/分鐘流速于室溫進(jìn)行洗脫。用5％CH3CN/0.05％TFA/H2O進(jìn)行平衡，并用5％CH3CN/0.05％TFA/H2O洗脫1分鐘，然后用至90％CH3CN/0.05％TFA/H2O的線性梯度洗脫7分鐘。檢測(cè)是214nm的UV檢測(cè)和蒸發(fā)光散射。將柱洗脫液的一個(gè)級(jí)分導(dǎo)入PE-Sciex API 100質(zhì)譜儀的離子噴射界面。在運(yùn)行過程中每2秒掃描質(zhì)量范圍300-2000amu。
MALDI-TOF MS分析是使用配備了延遲提取且以線性模式運(yùn)轉(zhuǎn)的Voyager RP設(shè)備(PerSeptive Biosystems公司，弗雷明漢，馬薩諸塞)進(jìn)行的。使用α-氰-4-羥-肉桂酸作為基質(zhì)，而且質(zhì)量賦值以外部校準(zhǔn)為基礎(chǔ)。
實(shí)施例1Nε37-(2-(2-(2-(十二基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 使用樹脂(Rink酰胺，0.68mmol/g，Novabiochem，0.25mmole)在ABI433A機(jī)器上依照制造商的指示生成最初的序列。所有保護(hù)基團(tuán)都是酸不穩(wěn)定的，只有第37位使用的殘基是例外(Fmoc-Lys(ivDde)-OH，Novabiochem)，從而容許對(duì)此賴氨酸而非任何其它賴氨酸進(jìn)行特異脫保護(hù)。
流程將上述制備的含GLP-1類似物氨基酸序列的樹脂(0.25mmole)置于手工搖動(dòng)器/過濾裝置中，并用溶于N-甲基吡咯烷酮的2％肼進(jìn)行處理(2×20ml，2×12min)，以除去DDE基團(tuán)，隨后用N-甲基吡咯烷酮進(jìn)行清洗(4×20ml)。將Fmoc-8-氨基-3，6-二氧辛酸(NeosystemFA03202)(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)溶于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，20ml)。添加羥基苯并三唑(HOBt)(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)和二異丙基碳二亞胺(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)，并將溶液攪動(dòng)15分鐘。將溶液加到樹脂中，并添加二異丙基乙胺(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)。將樹脂于室溫?fù)u動(dòng)24小時(shí)。用N-甲基吡咯烷酮清洗樹脂(4×20ml)。一邊搖動(dòng)一邊向樹脂中加入哌啶溶于N-甲基吡咯烷酮的20％溶液(3×20ml，3×10min)。用N-甲基吡咯烷酮清洗樹脂(4×20ml)。將十二酸(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)溶于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，20ml)。添加羥基苯并三唑水合物(HOBt；H2O)(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)和二異丙基碳二亞胺(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)，并將溶液攪動(dòng)15分鐘。將溶液加到樹脂中，并添加二異丙基乙胺(相對(duì)于樹脂為4個(gè)摩爾當(dāng)量)。將樹脂于室溫?fù)u動(dòng)24小時(shí)。用N-甲基吡咯烷酮(2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，2×20ml)、和二氯甲烷(2×20ml)清洗樹脂。為了由樹脂上切下肽，將樹脂在三氟乙酸、水、和三異丙基硅烷混合液(95∶2.5∶2.5，15ml)中于室溫?cái)噭?dòng)180分鐘。將切割混合液過濾，并將濾出液真空濃縮成油。用45ml二乙醚由此油中沉淀出粗制肽，并用45ml二乙醚清洗3次。在填充7μC-18二氧化硅的20mm×250mm柱上通過制備級(jí)HPLC純化粗制肽。將粗制肽溶于5ml 50％乙酸/H2O，用H2O稀釋至20ml，并注射到柱上。然后用CH3CN在0.1％TFA和水中的40％-60％梯度以10ml/分鐘流速用50分鐘于40℃進(jìn)行洗脫。收集含肽級(jí)分。用水稀釋洗脫液后將純化的肽凍干。
HPLC(方法B6)RT＝32.8minHPLC(方法A1)RT＝43.6minLCMSm/z＝765.0(M+5H)5+，957.0(M+4H)4+，1275.0(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3825.0實(shí)施例2Nε37-(2-(2-(2-(17-磺基十六酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法A1)RT＝45.5minLCMSm/z＝792.9(M+5H)5+，990.9(M+4H)4+，1320.9(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3959.9實(shí)施例3Nε37-{2-[2-(2-(15-羧基十五?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；鶀-[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B1)RT＝43.8minHPLC(方法A1)RT＝42.0minLCMSm/z＝978.3(M+4H)4+，1303.8(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3909.6實(shí)施例4Nε37-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B1)RT＝46.4minHPLC(方法A1)RT＝44.4minLCMSm/z＝985.5(M+4H)4+，1313.4(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3937.6實(shí)施例5Nε37-(2-(2-(2-(19-羧基十九?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B1)RT＝49.5minHPLC(方法A1)RT＝47.1minLCMSm/z＝992.5(M+4H)4+，1322.6(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3965.7實(shí)施例6[Aib8，22，35，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；?-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝36.28min
LCMSm/z＝995(M+4H)4+，1326(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3977.6實(shí)施例7[Aib8，22，35，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(十六?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝37.1minLCMSm/z＝999(M+4H)4+，1332(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3993.7實(shí)施例8Nε37-(2-[2-(2，6-(S)-二-{2-[2-(2-(十二?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基}己?；被?乙氧基]乙氧基})乙酰基-[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝38.2minLCMSm/z＝1106.7(M+4H)4+，1475.3(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4433.0
實(shí)施例9Nε37-(2-[2-(2，6-(S)-二-{2-[2-(2-(十四?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀己?；被?乙氧基]乙氧基})乙?；?[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝42.9minLCMSm/z＝1120.9(M+4H)4+，1494.2(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4480.4實(shí)施例10[Aib8，22，35，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(十六?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝36.0minLCMSm/z＝1032.0(M+4H)4+，1374.0(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4122.8
實(shí)施例11[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[4-[4-(4-氨基-9，10-二氧-3-磺基-9，10-二氫-蒽-1-基氨基)-2-磺基-苯基氨基]-6-(2-磺基-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基))酰胺 為了制備化合物，將DdeLys(Fmoc)-OH加載到Rink樹脂上。然后如“合成方法”中所述用哌啶處理樹脂，從而選擇性清除Fmoc。將2-(2-(2-(Fmoc-氨基)乙氧基)乙氧基)乙酸偶聯(lián)到賴氨酸的ε-氨基上，并除去Fmoc。添加DMSO和Cibacron Blue 3GA(17個(gè)當(dāng)量)(SigmaC-9534)，并將混合液于60℃加熱15小時(shí)，用水(3次)、甲醇(2次)、THF(2次)、和二乙醚(2次)進(jìn)行清洗。如“合成方法”中所述清除Dde保護(hù)基團(tuán)并添加剩余氨基酸。
HPLC(方法A1)RT＝38.1minLCMSm/z＝1110.4(M+4H)4+，1436.4(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4435.9實(shí)施例12[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)Lys(({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(15-羧基十五?；被?-乙氧基]乙氧基}乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；被?乙氧基]乙氧基}乙?；?)酰胺
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法A1)RT＝41.2minHPLC(方法B6)RT＝30.7minLCMSm/z＝1069.1(M+4H)4+，1424.6(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4271實(shí)施例13Nε37-([2-(2-{3-[2，5-二氧-3-(15-羧基十五基硫烷基)-吡咯烷-1-基]-丙?；被鶀乙氧基)乙氧基)乙?；鵠-[D-Ala8，Lys37]-GLP-1(7-37)酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法A1)RT＝45.2minLCMSm/z＝1004.0(M+4H)4+，1338.2(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4010.7實(shí)施例14[Aib8，22，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(11-(草酰基氨基)十一?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基-)))酰胺
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法A1)RT＝37.9minHPLC(方法B1)RT＝39.5minLCMSm/z＝993.3(M+4H)4+，1323.9(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3967.6實(shí)施例15[Aib8，22，35，Ala37]-GLP-1(7-37)Lys({2-[2-(2-{2-[2-(2-(15-羧基-十五?；被?-乙氧基]乙氧基}乙?；被?乙氧基]乙氧基}乙?；鵠酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝31.1minHPLC(方法A1)RT＝41.9minLCMSm/z＝1376.3(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4125.8實(shí)施例16[Aib8，22，35，Ala37]-GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[11-(5-二甲基氨基萘-1-磺?；被?十一?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙?；?酰胺
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法A1)RT＝42.6minHPLC(方法B6)RT＝30.4minLCMSm/z＝1377.3(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4128.8實(shí)施例17[Aib8，22，35，Ala37]-GLP-1(7-37)Lys(([2-(2-{2-[1-(4-氯苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-基]乙?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙酰基))酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法A1)RT＝41.1minHPLC(方法B6)RT＝31.1minLCMSm/z＝1351.8(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4052.0實(shí)施例18[Aib8，Arg26，34，Glu22，23，30]GLP-1H(7-37)Lys(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?酰胺
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝39.3minLCMSm/z＝1366.6(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4095.6實(shí)施例19[Aib8，Arg26，34，Glu22，23，30]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(二十?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝42.6minLCMSm/z＝1375.7(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4123.7實(shí)施例20[Gly8，Arg26，34]GLP-1H-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝38.0min(99.9％)HPLC(方法A1)RT＝49.0minLCMSm/z＝1054.6(M+4H)4+，1405.3(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4211.8實(shí)施例21[Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝38.7minLCMSm/z＝1029.2(M+4H)4+，1371.4(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4110.8實(shí)施例22[Aib8]-GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(十六?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝34.7minLCMSm/z＝1000.3(M+4H)4+，1337.4(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4110.8
實(shí)施例23[Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝37.5minLCMSm/z＝1414.9(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4239.8實(shí)施例24[Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基庚?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝32.4minHPLC(方法A1)RT＝43.8minLCMSm/z＝1381.3(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4140.0實(shí)施例25GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法A1)RT＝42.3minLCMSm/z＝1372.3(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4112.7實(shí)施例26[Aib8]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十六?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝33.5minLCMSm/z＝1040.3(M+4H)4+，1386.6(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4155.8實(shí)施例27Nε37-(2-(2-(2-(十二?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1H(7-37)-酰胺
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝32.8minLC-MSm/z＝765.7(M+H)5+，957.0(M+H)4+，1275.7(M+H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3822.9實(shí)施例28Nε37-(2-(2-(2-(十四?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1H(7-37)-酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝34,6minLC-MSm/z＝771,4(M+5H)5+，964,1(M+4H)4+，1284,9(M+H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3851,5實(shí)施例29Nε37-(2-(2-(2-(十六?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)-酰胺
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝36,8minLC-MSm/z＝970.7(M+4H)4+，1294.3(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3879,6實(shí)施例30Nε37-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)-酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝39,4minLC-MSm/z＝977,9(M+4H)4+，1303,7(M+H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3907,6實(shí)施例31Nε37-(2-(2-(2-(二十?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)-酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝42.7min
LC-MSm/z＝984.8(M+4H)4+，1312.8(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3935.7實(shí)施例32Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?)-[Aib8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝40.7minLC-MSm/z＝792.3(M+5H)5+，989.8(M+4H)4+，1319.2(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3955.5實(shí)施例33Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?)[Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝40.5minLC-MSm/z＝789.5(M+5H)5+，986.3(M+4H)4+，1314.8(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3941.5
實(shí)施例34Nε36-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[Gly8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝38,3minLC-MSm/z＝786.8(M+5H)5+，982.8(M+4H)4+，1310.1(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3927,5實(shí)施例35Nε37-(2-(2-(2-(4-4(4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，9-十三氟壬酰基氨磺酰基-丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?)[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝32.4minLC-MSm/z＝1042.7(M+4H)4+，1389.9(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4166.4實(shí)施例36Nε37-(2-(2-(2-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，10，10，11，11，12，12，12-二十一氟十二基氧基乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝36.7minLC-MSm/z＝1062.8(M+4H)4+，1416.9(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4247.3實(shí)施例37Nε37-(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨磺酰基)丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝37.4minLC-MSm/z＝1008.8(M+4H)4+，1344.3(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4030.7實(shí)施例38[Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys({2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?})-OH
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝38.5minLCMSm/z＝(M+4H)4+1025.1，(M+3H)3+1366.7，計(jì)算的(M+H)+＝4096.0實(shí)施例39[Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十八?；被?-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝37.7minLCMSm/z＝(M+4H)4+1057.8，(M+3H)3+1410.2，計(jì)算的(M+H)+＝4235.9實(shí)施例40Nε20-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六?；被?-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-exendin(1-39)
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝33.6mimLCMSm/z＝(M+4H)4+1205.3，(M+3H)3+1606.9，計(jì)算的(M+H)+＝4816.5實(shí)施例41[Ala8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-草?；被?3-羧基-2-4，5，6，7-四氫-苯并[b]噻吩-6-基-乙酰基氨基))乙氧基]乙氧基乙?；?酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝32.1minHPLC(方法A1)RT＝42.2minLCMSm/z＝1033.3(M+4H)4+，1376.6(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4126.7實(shí)施例42[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-草酰基氨基-3-羧基-2-4，5，6，7-四氫-苯并[b]噻吩-6-基-乙?；被?)乙氧基]乙氧基乙?；?酰胺
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B1)RT＝37.4minHPLC(方法A1)RT＝35.5minLCMSm/z＝1002.5(M+4H)4+，1336.7(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4007.5實(shí)施例43Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝39.0minLC-MSm/z＝1022.3(M+4H)4+，1362.3(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4084.6實(shí)施例44Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Gly8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝38,6minLC-MSm/z＝1015.2(M+4H)4+，1353.4(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4056.6實(shí)施例45Nε37-2-(2-(2-(4-(4-(十七?；被?-4-(S)-羧基丁?；被?-4-(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基-[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)-NH2 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B4)RT＝10.72minLCMSm/z＝1039.0(M+4H)4+，1385.0(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4152.0實(shí)施例46Nε37-2-(2-[2-(2-[2-(4-[4-(十七?；被?-4-(S)羧基丁?；被鵠-4-(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；被?乙氧基]乙氧基)乙酰基-[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)-NH2 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B4)RT＝10.74minLCMSm/z＝1074(M+4H)4+，1433(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4297實(shí)施例47Nε26-(2-(2-(2-(4-(十六?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B4)RT＝10.71minLCMSm/z＝979.0(M+4H)4+，1304.0(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3910.0實(shí)施例48Nε26-2-(2-2-(2-(2-(2-(4-(十八?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，Arg34]GLP-1(7-37)-OH
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B4)RT＝11.32minLCMSm/z＝1021(M+4H)4+，1362(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4084使用Fmoc策略在Advanced Chemtech 348肽合成儀上在氯三苯甲基樹脂(Novabiochem)上合成肽(0.5mmol/g，100mg樹脂/孔，使用10個(gè)孔)。用溶于1-甲基-吡咯烷-2-酮(NMP)的二異丙基碳二亞胺(DIC)(Fluka)和1-羥基苯并三唑(HOBt)/1-羥基-7-氮雜-苯并三唑(HOAt)(2∶1)(Senn Chemicals)介導(dǎo)偶聯(lián)，使用10個(gè)摩爾當(dāng)量的氨基酸和偶聯(lián)劑。所使用的受保護(hù)氨基酸衍生物是標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc-氨基酸(Advanced Chemtech)，除了氨基酸Fmoc-Lys(ivDde)(Novabiochem)和Fmoc-Glu-OtBu(Bachem)。然后將樹脂分成5份(0.1mmol)，并用溶于NMP的(Boc)2O和DIEA(5個(gè)摩爾當(dāng)量)處理N末端。
通過在自動(dòng)化合成過程中摻入Fmoc-Lys(ivDde)-OH，隨后用肼選擇性脫保護(hù)，從而在特定位置導(dǎo)入側(cè)鏈和接頭，對(duì)與樹脂結(jié)合的粗制受保護(hù)肽上特定賴氨酸殘基進(jìn)行附著。
用于清除Dde保護(hù)的程序?qū)渲?0.1mmol)置于注射器中，并用溶于NMP的3％肼和3％哌啶于室溫進(jìn)行處理(50min)，以除去Dde基團(tuán)，隨后用NMP進(jìn)行清洗(4×5ml)。
用于將側(cè)鏈附著到賴氨酸殘基上的程序?qū)EG或氨基酸(相對(duì)于樹脂為7個(gè)摩爾當(dāng)量)溶于NMP。添加HOAt(相對(duì)于樹脂為7個(gè)摩爾當(dāng)量)和二異丙基碳二亞胺(相對(duì)于樹脂為7個(gè)摩爾當(dāng)量)，并將溶液攪動(dòng)15分鐘。然后，將溶液加到樹脂中。將樹脂于室溫?fù)u動(dòng)過夜。用NMP清洗樹脂(3×5ml)。
用于清除Fmoc保護(hù)的程序?qū)渲?0.1mmol)置于注射器中，并用哌啶溶于NMP的30％溶液進(jìn)行處理(5ml，20min)。用NMP(2×5ml)和二氯甲烷(2×5ml)清洗樹脂。
用于由樹脂上切下肽的程序?yàn)榱擞蓸渲锨邢码?，將樹脂在三氟乙酸、水、和三異丙基硅烷混合?94∶3∶3)中于室溫?cái)噭?dòng)120分鐘。將切割混合液過濾，并通過氮?dú)饬鲗V出液濃縮成油。用10ml二乙醚由此油中沉淀出粗制肽，并用10ml二乙醚清洗2次。
實(shí)施例49[Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(19-(羧基)十九?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH 使用氯三苯甲基樹脂(0.5mmol/g，Novabiochem，0.1mmole)在Advanced Chemtech 348機(jī)器上生成最初的序列。所有保護(hù)基團(tuán)都是酸不穩(wěn)定的，只有第37位使用的殘基是例外(FmocLys(ivDde)-OH，Novabiochem)，從而容許對(duì)此賴氨酸而非任何其它賴氨酸進(jìn)行特異脫保護(hù)。
流程將上述制備的含GLP-1類似物氨基酸序列的樹脂(0.1mmole)置于注射器中，并用溶于N-甲基吡咯烷酮的3％肼和3％哌啶進(jìn)行處理(50ml)，以除去DDE基團(tuán)，隨后用NMP進(jìn)行清洗(4×5ml)。將Fmoc-8-氨基-3，6-二氧辛酸(Neosystem FA03202)(相對(duì)于樹脂為7個(gè)摩爾當(dāng)量)溶于NMP。添加HOAt(相對(duì)于樹脂為7個(gè)摩爾當(dāng)量)和二異丙基碳二亞胺(相對(duì)于樹脂為7個(gè)摩爾當(dāng)量)，并將溶液攪動(dòng)15分鐘。然后，將溶液加到樹脂中。將樹脂于室溫?fù)u動(dòng)過夜。用NMP清洗樹脂(4×5ml)。向樹脂中加入哌啶溶于NMP的30％溶液(5ml，20min)。用NMP(4×5ml)清洗樹脂。將C20的N-羥基琥珀酰亞胺酯(相對(duì)于樹脂為6個(gè)摩爾當(dāng)量，KJ.Ross-PetersenA/S)和DIEA溶于NMP，并添加到樹脂中。將樹脂于室溫?fù)u動(dòng)過夜。用NMP(3×5ml)和二氯甲烷(2×5ml)清洗樹脂。為了由樹脂上切下肽，將樹脂在三氟乙酸、水、和三異丙基硅烷混合液(94∶3∶3，3ml)中于室溫?cái)噭?dòng)120分鐘。將切割混合液過濾，并將濾出液真空濃縮成油。用10ml二乙醚由此油中沉淀出粗制肽，并用10ml二乙醚清洗2次。
純化于室溫將粗制肽以5-10mg/200μl的濃度溶于DMSO，并施加到于40℃運(yùn)行的7.8×300mm X-Terra Prep MS C18 10μm柱上。用30％CH3CN、0.08％TFA以4ml/分鐘洗脫5分鐘后，用30-65％CH3CN線性梯度用35分鐘對(duì)柱進(jìn)行洗脫。手動(dòng)收集UV主峰，并通過MALDI-MS鑒定期望峰。
通過測(cè)量280nm的UV吸收來測(cè)定肽在洗脫液中的濃度，假設(shè)酪氨酸和色氨酸的摩爾消光系數(shù)分別是1280和3690。
測(cè)定濃度后，將洗脫液等分成含期望數(shù)量的小瓶，并通過真空離心進(jìn)行干燥。
HPLC洗脫于27.9min＝52.9％CH3CNMALDI-MS3996(MH+)實(shí)施例50[Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(17-(羧基)十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?)-OH 依照上面的實(shí)施例和“一般合成方法”中的方法制備化合物，只是將十八二酸C18作為單保護(hù)叔丁酯(相對(duì)于樹脂為3個(gè)摩爾當(dāng)量)進(jìn)行附著，而且用HOAt和DIC(也是相對(duì)于樹脂為3個(gè)摩爾當(dāng)量)在NMP中介導(dǎo)偶聯(lián)。將粗制肽溶于22.5％CH3CN、0.1N NaOH用于純化。
HPLC洗脫于25.4min＝50.4％CH3CNMALDI-MS3969(MH+)實(shí)施例51[Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(19-(羧基)十九?；被?-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH 依照上面的兩個(gè)實(shí)施例和“一般合成方法”中的方法制備化合物。用HOAt和DIC(相對(duì)于樹脂為6個(gè)摩爾當(dāng)量)將氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)(相對(duì)于樹脂為6個(gè)摩爾當(dāng)量)偶聯(lián)到樹脂上。將粗制肽溶于22.5％CH3CN、0.1N NaOH用于純化。
HPLC洗脫于27.2min＝52.2％CH3CNMALDI-MS4124(MH+)實(shí)施例52[Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十六?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)-乙?；?-OH 依照上面的三個(gè)實(shí)施例和“一般合成方法”中的方法制備化合物，所不同的是將另外兩個(gè)OEG偶聯(lián)到Lys的側(cè)鏈上。
HPLC洗脫于25.0min＝50.0％CH3CN
MALDI-MS4259(MH+)實(shí)施例53[Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)-乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?NH2 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝38.8minLCMSm/z＝1022.3(M+4H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4081.7實(shí)施例54Nε20(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(17-(羧基)十七?；被?-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Lys20]exendin-4(1-39)-NH2 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法A1)RT＝41.9minHPLC(方法B6)RT＝31.3min
LCMSm/z＝1722.7(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝5164.9實(shí)施例55Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37) 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝34,2minLC-MSm/z＝997,2(M+4H)4+，1329,4(M+3H)3+，1993,2(M+2H)2+，計(jì)算的(M+H)+＝3985,5實(shí)施例56Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37) 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝34,2minLC-MSm/z＝993.8(M+4H)4+，1324.6(M+3H)3+，1987.2(M+2H)2+，計(jì)算的(M+H)+＝3971.5實(shí)施例57Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Gly8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37) 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝34,2minLC-MSm/z＝990.3(M+4H)4+，1320.3(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3957.4實(shí)施例58Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)-乙氧基)乙酰基)[Lys20]Exendin-4(1-39)-酰胺
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝37.7minLC-MSm/z＝1216.6(M+4H)4+，1621.4(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4861.5實(shí)施例59Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37) 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝39.1minLC-MSm/z＝1018.8(M+4H)4+，1357.6(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4070.6實(shí)施例60Nε26-(2-[2-(2-[2-(2-[2-(17-羧基十七?；被?乙氧基]乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙?；?[Arg34]GLP-1(7-37)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B4)RT＝12.1minLCMSm/z＝993.0(M+4H)4+，1325.0(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝3970.0實(shí)施例61Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七?；被?-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基]乙氧基)乙酰基][Arg34]GLP-1(7-37)-OH 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B4)RT＝11.8minLCMSm/z＝1026(M+4H)4+，1368(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4100實(shí)施例62Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Lys20]Exendin-4(1-39)-酰胺 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝32,3min
LC-MSm/z＝1223.9(M+4H)4+，1630.8(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4891.5實(shí)施例63[Gly8，Glu22，23，30，Arg18，26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基))乙氧基)乙?；?-NH2 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝32.0minHPLC(方法A1)RT＝43.4minLCMSm/z＝1438.7(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4311.8實(shí)施例64[咪唑基丙酸7，Asp16，Aib22，35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17-羧基十七酰基氨基)丁基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基)) 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B1)RT＝32.5minHPLC(方法A1)RT＝43.5minLCMSm/z＝1028.8(M+4H)4+，計(jì)算的(M+H)+＝4108.7實(shí)施例65[咪唑基丙酸7，Aib22，35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17-羧基十七酰基氨基)丁基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基)) 依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
HPLC(方法B6)RT＝33.7minHPLC(方法A1)RT＝44.8minLCMSm/z＝1024.8(M+4H)4+，1365.4(M+3H)3+，計(jì)算的(M+H)+＝4092.8實(shí)施例66[3-(5-咪唑基)丙?；?，Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基庚酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH
依照實(shí)施例1和“一般合成方法”中的方法制備化合物。
MALDI-MS4127(MH+)HPLC洗脫于25.5min＝50.6％CH3CN生物學(xué)發(fā)現(xiàn)GLP-1衍生物在靜脈內(nèi)或皮下施用后的延長(zhǎng)效果通過使用下文所述方法監(jiān)測(cè)它們?cè)谄は率┯糜诮】地i后在血漿中的濃度來測(cè)量本發(fā)明的多種GLP-1衍生物的延長(zhǎng)效果。為了進(jìn)行比較，還跟蹤GLP-1(7-37)在皮下施用后在血漿中的濃度?？梢砸韵嗤绞綔y(cè)定本發(fā)明其它GLP-1衍生物的延長(zhǎng)效果。
GLP-1類似物在小種豬中的藥動(dòng)學(xué)測(cè)試將測(cè)試物溶于適于皮下或靜脈內(nèi)施用的媒介物。調(diào)整濃度，使得服藥體積是約1ml。
研究在12只雄性G_ttingen小種豬(Ellegaard G_ttingenMinipigs ApS)中進(jìn)行。在動(dòng)物加入研究前容許約10天的適應(yīng)期。在適應(yīng)期開始時(shí)，小種豬約5月齡，體重范圍8-10kg。
研究在合適的動(dòng)物房中進(jìn)行，室溫設(shè)為21-23℃，相對(duì)濕度≥50％。照明循環(huán)為12小時(shí)明亮和12小時(shí)黑暗。照明時(shí)間是06:00至18:00。
將動(dòng)物收容在以草為墊的欄中，每欄六只。
在研究過程中，動(dòng)物可以自由獲取家用品質(zhì)的飲用水，但是由服藥前一天約16時(shí)開始禁食，直至服藥后約12小時(shí)。
在動(dòng)物到達(dá)時(shí)和服藥日稱重。
動(dòng)物接受一次靜脈內(nèi)或皮下注射。皮下注射在頸右側(cè)進(jìn)行，距離耳朵大約5-7cm而距離頸中部7-9cm。注射器的針帶有阻止器，容許0.5cm的針插入皮膚。
每種測(cè)試物注射三只動(dòng)物。每只動(dòng)物接受的劑量是2nmol/kg體重。
每周給六只動(dòng)物服藥，而其余六只動(dòng)物休息。
由每只動(dòng)物獲得完整血漿濃度-時(shí)間曲線。依照如下方案采集血樣靜脈內(nèi)施用后服藥前(0)、注射后0.17(10分鐘)、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、和120小時(shí)。
皮下施用后服藥前(0)、注射后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、和120小時(shí)。
每次取樣時(shí)，由每只動(dòng)物采集2ml血液。血樣是由頸靜脈采集的。
將血樣收集到裝有用于穩(wěn)定的緩沖液的試管中，以預(yù)防對(duì)GLP-1類似物的酶促降解。
立即將血漿轉(zhuǎn)移到Micronic管中，每個(gè)管轉(zhuǎn)移約200μl血漿。將血漿保存于-20℃直至測(cè)定。通過免疫測(cè)定法對(duì)血漿樣品測(cè)定GLP-1類似物的含量。
對(duì)血漿濃度-時(shí)間曲線進(jìn)行非房室藥動(dòng)學(xué)分析。對(duì)每種情況計(jì)算下列藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC、AUC/劑量、AUC％Extrap、Cmax、tmax、λz、t1/2、CL、CL/f、Vz、Vz/f、和MRT。
對(duì)選擇的本發(fā)明化合物在丹麥蘭德瑞斯(Landrace)豬中進(jìn)行測(cè)試。
GLP-1類似物在豬中的藥動(dòng)學(xué)測(cè)試自實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將豬(50％杜洛克豬，25％約克夏豬，25％丹麥蘭德瑞斯豬，約40kg)禁食。在50μM等滲液(5mM磷酸鹽pH7.4、0.02％吐溫_-20(Merck)、45mg/ml甘露醇(不含熱原，Novo Nordisk)中對(duì)每頭豬施用0.5nmol測(cè)試化合物/kg體重。由頸靜脈中的導(dǎo)管采集血樣。將5ml血樣倒入裝有175μl如下溶液的冷玻璃杯中0.18MEDTA、15000KIE/ml抑酶肽(Novo Nordisk)、和0.30mM纈氨酸-Pyrrolidide(Novo Nordisk)pH7.4。在30分鐘內(nèi)，將樣品以5-6000*g離心10分鐘。將溫度保持于4℃。將上清液轉(zhuǎn)移到另其它玻璃杯中，并保存于-20℃直至使用。
在三明治ELISA或RIA中使用不同的單克隆或多克隆抗體測(cè)定肽的血漿濃度?？贵w的選擇取決于GLP-1衍生物。根據(jù)選擇的具體GLP-1衍生物，達(dá)到血漿峰值濃度的時(shí)間在較廣范圍內(nèi)變化。
在96孔微量滴定板中進(jìn)行三明治ELISA的一般測(cè)定方案包被緩沖液(PBS)磷酸鹽緩沖鹽水pH7.2清洗緩沖液(PBS清洗液)磷酸鹽緩沖鹽水、0.05％v/v吐溫20pH7.2測(cè)定緩沖液(BSA緩沖液)磷酸鹽緩沖鹽水、10g/L牛血清清蛋白(F1uka 05477)、0.05％v/v吐溫20 pH7.2鏈霉親和素緩沖液磷酸鹽緩沖鹽水、0.5M NaCl、0.05％v/v吐溫20pH7.2標(biāo)準(zhǔn)物血漿基質(zhì)中的各種化合物A-TNPNonsens抗體AMDEX鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(Amersham RPN4401V)TMB底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(＜0.02％)、過氧化氫如下進(jìn)行測(cè)定(體積/孔)1)用100μl溶于PBS緩沖液的5μg/ml捕捉抗體進(jìn)行包被→于4℃保溫o/n→用PBS清洗液清洗5次→用最后一次清洗液封閉至少30分鐘
→然后將板倒空2)加入20μl樣品和100μl溶于BSA緩沖液的生物素化檢測(cè)抗體以及10μg/mlA-TNP→在搖床上于室溫保溫2小時(shí)→用PBS清洗液清洗5次→然后將板倒空3)加入100μl在鏈霉親和素緩沖液中1∶8000稀釋的AMDEX→在搖床上于室溫保溫45-60分鐘→用PBS清洗液清洗5次→然后將板倒空4)加入100μl TMB底物→在搖床上于室溫保溫x分鐘→加入100μl 4M H3PO4終止反應(yīng)讀取450nm的吸光度，以620nm作為參照。
由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的濃度。
RIA的一般測(cè)定方案DB緩沖液80mM磷酸鹽緩沖液、0.1％人血清清蛋白、10mM EDTA、0.6mM硫柳汞pH7.5FAM緩沖液40mM磷酸鹽緩沖液、0.1％人血清清蛋白、0.6mM硫柳汞pH7.5木炭40mM磷酸鹽緩沖液、0.6mM硫柳汞、16.7％牛血漿、15g/L活性炭pH7.5(使用前將懸浮液于4℃混合至少1小時(shí))標(biāo)準(zhǔn)物血漿基質(zhì)中的各種化合物如下在minisorp管12×75mm中進(jìn)行測(cè)定(體積/管)
混勻；于4℃保溫30分鐘；以3000rpm離心30分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移到新管中后，立即用塞子封上，并在伽馬計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)1分鐘。
由各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的濃度。
GLP-1放射受體測(cè)定法(RRA)該方法是使用LEADseeker成像顆粒的放射配體結(jié)合測(cè)定法。測(cè)定體系由包含GLP-1受體的膜碎片、未標(biāo)記GLP-1類似物、用125I標(biāo)記的人GLP-1、和用小麥胚芽凝集素(WGA)包被的PS LEADseeker顆粒組成。冷的且125I標(biāo)記的GLP-1將競(jìng)爭(zhēng)與受體的結(jié)合。在添加LEADseeker顆粒后，它們將經(jīng)由WGA殘基結(jié)合膜碎片上的碳水化合物殘基。125I分子與LEADseeker顆粒之間的接近引起顆粒發(fā)光。
LEADseeker將發(fā)出的光成像，而且它與樣品中存在的GLP-1類似物的數(shù)量成反比。
試劑和材料動(dòng)物血漿的預(yù)處理將動(dòng)物血漿于56℃熱處理4小時(shí)，并以10,000rpm離心10分鐘。然后，添加Val-Pyr(10μM)和aprotenin(500KIE/ml)，并保存于＜-18℃直至使用。
GLP-1類似物校準(zhǔn)物將GLP-1類似物摻入經(jīng)過熱處理的血漿以產(chǎn)生范圍約1μM至1pM的稀釋系列。
GLP-1RRA測(cè)定緩沖液25mM Na-HEPES(pH＝7.5)、2.5mM CaCl2、1mMMgCl2、50mM NaCl、0.1％卵清蛋白、0.003％吐溫20、0.005％桿菌肽、0.05％NaN3。
GLP-1受體懸浮液由表達(dá)人胰GLP-1受體的倉鼠幼鼠腎(BHK)細(xì)胞純化GLP-1受體膜碎片。保存于＜-80℃直至使用。
偶聯(lián)了WGA的聚苯乙烯LEADseeker成像珠(RPNQ0260，Amersham)將珠用GLP-1RRA測(cè)定緩沖液重構(gòu)至13.3mg/ml的濃度。然后添加GLP-1受體膜懸浮液，并在使用前末端對(duì)末端(end-over-end)倒置于低溫(2-8℃)保溫至少1小時(shí)。-GLP-1(7-36)酰胺(Novo Nordisk A/S)保存于＜-18℃直至使用。
99.9％(體積)乙醇(De Dansk Spritfabrikker A/S)保存于＜-18℃直至使用。
MultiScreen_Solvinert 0.45μm疏水性PTFE板(MSRPN0450，Millipore公司)聚丙烯板(產(chǎn)品目錄編號(hào)650201，Greiner Bio-One)白色聚苯乙烯384孔板(產(chǎn)品目錄編號(hào)781075，Greiner Bio-One)儀器水平板混合儀裝配了標(biāo)準(zhǔn)翻斗微量滴定板轉(zhuǎn)子的離心機(jī)UltraVap-Drydown Sample Concentrator(Porvair)LEADseekerTMMultimodality Imaging System(Amersham)檢驗(yàn)流程樣品制備將MultiScreen_Solvinert濾板安裝在化學(xué)相容的接收板(即聚丙烯板)上以收集濾出液。
向MultiScreen_Solviner t濾板的空孔中加入150μl冰冷的99.9％乙醇，隨后是50μl校準(zhǔn)物或血漿樣品。將貯藏蓋蓋到濾板上。
在水平板混合儀上于18-22℃保溫15分鐘。
將裝配好的濾板和接收板連同蓋子放到標(biāo)準(zhǔn)翻斗微量滴定板轉(zhuǎn)子中。然后以1500rpm離心2分鐘，將濾出液收集在接收板的空孔中。
使用UltraVap用熱(40℃)N2將濾出液干燥15分鐘。向每個(gè)孔中加入100μl GLP-1 RRA測(cè)定緩沖液，使干物質(zhì)重構(gòu)。在水平混合儀上保溫5分鐘。
GLP-1放射受體測(cè)定法使用如下移液方案和白色聚苯乙烯384孔板●35μl GLP-1 RRA測(cè)定緩沖液●5μl重構(gòu)的濾出液●10μl[125I]-GLP-1(7-36)酰胺。使用前將儲(chǔ)液在GLP-1RRA測(cè)定緩沖液中稀釋至20,000cpm/孔。
●15μl預(yù)包被到WGA-聚苯乙烯LEADseeker成像珠(0.2mg/孔)上的GLP-1受體膜碎片(≈0.5μg/孔)將板密封并于18-22℃保溫過夜。
使用LEADseekerTMMultimodality Imaging System檢測(cè)每個(gè)孔的發(fā)光，持續(xù)10分鐘。
在表達(dá)克隆人GLP-1受體的細(xì)胞系中刺激cAMP形成用GLP-1和肽類似物刺激來自表達(dá)人GLP-1受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系BHK467-12A(tk-ts13)的純化細(xì)胞膜，并使用AlphaScreenTMcAMP測(cè)定試劑盒(Perkin Elmer Life Sciences)測(cè)量生成cAMP的效力。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是在NN制備的，并選擇高表達(dá)克隆用于篩選。在含5％FCS、1％青霉素/鏈霉素、和0.5mg/ml G418的DMEM中于5％CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
用PBS將大約80％匯合的細(xì)胞清洗2次，并用Versene收獲細(xì)胞，以1000rpm離心5分鐘，并除去上清液。其它步驟都是在冰上進(jìn)行的。將細(xì)胞沉淀在10ml緩沖液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA，pH＝7.4)用Ultrathurax勻漿20-30秒，以20,000rpm離心15分鐘，并將沉淀重懸于10ml緩沖液2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA，pH＝7.4)。
將懸浮液勻漿20-30秒，并以20,000rpm離心15分鐘。將懸于緩沖液2、勻漿、和離心重復(fù)一次，并將膜重懸于緩沖液2，用于進(jìn)一步分析或保存于-80℃。
功能受體測(cè)定法是通過使用AlphaScreen技術(shù)測(cè)量由肽誘導(dǎo)的cAMP產(chǎn)量來進(jìn)行的。AlphaScreen技術(shù)的基本原理是內(nèi)源cAMP與外源添加生物素-cAMP之間的競(jìng)爭(zhēng)。對(duì)cAMP的捕捉是使用綴合在受體珠上的特異抗體來完成的。在AlphaFusion Microplate Analyzer上對(duì)形成的cAMP進(jìn)行計(jì)數(shù)和測(cè)量。使用Graph-Pad Prisme軟件計(jì)算EC50值。
序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>治療肽的清蛋白結(jié)合型衍生物<130>6692-WO<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>31<212>PRT<213>智人<400>1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30
<210>2<211>40<212>PRT<213>合成的構(gòu)建體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>位置1的Xaa是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、α-羥基-組氨酸、同組氨酸、N-α-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>位置2的Xaa是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>位置10的Xaa是Val或Leu.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>位置12的Xaa是Ser，Lys或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>位置13的Xaa是Tyr或Gln.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>位置14的Xaa是Leu或Met.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>位置16的Xaa是Gly，Glu或Aib.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)<223>位置17的Xaa是Gln，Glu，Lys或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>位置19的Xaa是Ala或Val.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>位置20的Xaa是Lys，Glu或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>位置21的Xaa是Glu或Leu.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>位置24的Xaa是Ala，Glu或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>位置27的Xaa是Val或Lys.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>位置28的Xaa是Lys，Glu，Asn或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>位置29的Xaa是Gly或Aib.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>位置30的Xaa是Arg，Gly或Lys.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>位置31的Xaa是Gly，Ala，Glu，Pro，Lys，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>位置32的Xaa是Lys，Ser，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>位置33的Xaa是Ser，Lys，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>位置34的Xaa是Gly，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)
<223>位置35的Xaa是Ala，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>位置36的Xaa是Pro，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>位置37的Xaa是Pro，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)<223>位置38的Xaa是Pro，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>位置39的Xaa是Ser，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>位置40的Xaa是酰胺或不存在.
<400>2Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa1 5 10 15Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40<210>3<211>32<212>PRT<213>合成的構(gòu)建體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>位置1的Xaa是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、α-羥基-組氨酸、同組氨酸、N-α-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>位置2的Xaa是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸。
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>位置12的Xaa是Ser，Lys或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>位置16的Xaa是Gly，Glu或Aib.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>位置17的Xaa是Gln，Gly，Lys或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>位置20的Xaa是Lys，Glu或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>位置24的Xaa是Ala，Glu或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>位置28的Xaa是Lys，Glu或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>位置29的Xaa是Gly或Aib.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)<223>位置30的Xaa是Arg或Lys..
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>位置31的Xaa是Gly，Ala，Glu或Lys.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>位置32的Xaa是Lys，酰胺或不存在.
<400>3Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30<210>4<211>39<212>PRT<213>Gila monster
<220>
<221>MISC FEATURE<222>(39)..(39)<223>羧基基團(tuán)酰胺化.
<400>4His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>5<211>44<212>PRT<213>合成的構(gòu)建體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(44)..(44)<223>羧基基團(tuán)酰胺化.
<400>5His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu PheIle Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys35 40
權(quán)利要求
1.包含治療性多肽的化合物，其中所述治療性多肽通過親水性間隔物與清蛋白結(jié)合殘基相連。
2.包含治療性多肽的化合物，其中所述治療性多肽通過親水性間隔物-(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)pQq-與清蛋白結(jié)合殘基相連，其中l(wèi)、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，或其制藥學(xué)可接受鹽或前藥。
3.依照權(quán)利要求2的化合物，其具有通式(I)A-W-B-Y-治療性多肽(I)，其中A是清蛋白結(jié)合殘基，B是親水性間隔物-(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)pQq-，其中l(wèi)、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，Y是連接B與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，且W是連接A與B的化學(xué)基團(tuán)。
4.依照權(quán)利要求2的化合物，其具有通式(II)A-W-B-Y-治療性多肽-Y′-B′-W′-A′ (II)，其中A和A′是清蛋白結(jié)合殘基，B和B′是獨(dú)立選自-(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-的親水性間隔物，其中l(wèi)、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，Y是連接B與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，而Y′是連接B′與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，且W是連接A與B的化學(xué)基團(tuán)，而W′是連接A′與B′的化學(xué)基團(tuán)。
5.依照權(quán)利要求4的化合物，其中Y′選自下組-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)NHCH2-、CH2NHC(O)-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。
6.依照權(quán)利要求4-5任一項(xiàng)的化合物，其中W′選自下組-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。
7.依照權(quán)利要求2的化合物，其具有通式(III) 其中A和A′是清蛋白結(jié)合殘基，B是選自-(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-的親水性間隔物，其中l(wèi)、m、和n獨(dú)立的是1-20且p是0-10，Q是-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-，q是0-5的整數(shù)，D、E、和G各自獨(dú)立的選自-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、和-P(OR6)(O)-，其中R3、R4、R5、和R6獨(dú)立的代表氫或C1-6烷基，Z選自-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH-、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH＝CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、或-NHC(O)-，其中s是0或1，Y是連接B與治療劑的化學(xué)基團(tuán)，且W″是連接B與A和A′的化學(xué)基團(tuán)。
8.依照權(quán)利要求7的化合物，其中W″選自下組 and 其中s是0、1、或2。
9.依照權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的化合物，其中Y選自下組-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)NHCH2-、CH2NHC(O)-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。
10.依照權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)的化合物，其中W選自下組-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、和-C(O)NH-，其中s是0或1。
11.依照權(quán)利要求2-10任一項(xiàng)的化合物，其中l(wèi)是1或2，n和m獨(dú)立的是1-10，且p是0-10。
12.依照權(quán)利要求2-11任一項(xiàng)的化合物，其中D是-O-。
13.依照權(quán)利要求2-12任一項(xiàng)的化合物，其中E是-O-。
14.依照權(quán)利要求2-10任一項(xiàng)的化合物，其中親水性間隔物是-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)pQq-，其中m是1-10，p是1-3，且Q是-Z-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)p-。
15.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中q是0或1。
16.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中q是1。
17.依照權(quán)利要求2-10和12-15任一項(xiàng)的化合物，其中G是-O-。
18.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中Z選自下組-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、和-OC(O)NH-。
19.依照權(quán)利要求2-15任一項(xiàng)的化合物，其中q是0。
20.依照權(quán)利要求2-13任一項(xiàng)的化合物，其中l(wèi)是2。
21.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中n是2。
22.依照權(quán)利要求2-15任一項(xiàng)的化合物，其中親水性間隔物B是-[CH2CH2O]m+1(CH2)pQq-。
23.依照權(quán)利要求2-15任一項(xiàng)的化合物，其中親水性間隔物B是-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p-[C(O)NH-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p]q-，其中l(wèi)、m、n、和p獨(dú)立的是1-5，且q是0-5。
24.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中-W-B-Y-選自下組 和
25.依照權(quán)利要求7的化合物，其中＞W(wǎng)″-B-Y-是
26.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中A選自下組 其中手性碳原子是R或是S， 其中手性碳原子是R或是S， 其中手性碳原子是R或是S， 其中兩個(gè)手性碳原子獨(dú)立的是R或是S， 其中兩個(gè)手性碳原子獨(dú)立的是R或是S， 其中兩個(gè)手性碳原子獨(dú)立的是L或是D， 其中手性碳原子是R或是S， 其中手性碳原子是R或是S， 其中兩個(gè)手性碳原子獨(dú)立的是R或是S， 其中兩個(gè)手性碳原子獨(dú)立的是R或是S， 和
27.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述親水性間隔物的摩爾量在80-1000D范圍內(nèi)，或在80-300D范圍內(nèi)。
28.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述清蛋白結(jié)合殘基是親脂性殘基。
29.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述清蛋白結(jié)合殘基與清蛋白非共價(jià)結(jié)合。
30.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述清蛋白結(jié)合殘基在生理pH帶負(fù)電荷。
31.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述清蛋白結(jié)合殘基所具有的針對(duì)人血清清蛋白的結(jié)合親和力低于約10μM或低于約1μM。
32.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述清蛋白結(jié)合殘基選自直鏈烷基、分支烷基、具有ω-羧酸基團(tuán)的基團(tuán)、部分或完全氫化的環(huán)戊烷并菲環(huán)骨架。
33.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述清蛋白結(jié)合殘基是cibacronyl殘基。
34.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述清蛋白結(jié)合殘基具有6-40個(gè)碳原子、8-26個(gè)碳原子、或8-20個(gè)碳原子。
35.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述清蛋白結(jié)合殘基是肽，諸如包含少于40個(gè)氨基酸殘基的肽。
36.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述清蛋白結(jié)合殘基經(jīng)由間隔物和接頭附著在所述治療性多肽中賴氨酸殘基的ε-氨基上。
37.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述清蛋白結(jié)合殘基經(jīng)由間隔物和接頭附著在所述治療性多肽中選自半胱氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸的氨基酸殘基的接頭上。
38.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述治療性多肽是GLP-1肽。
39.依照權(quán)利要求34的化合物，其中所述多肽是包含氨基酸序列通式(IV)的GLP-1肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46通式(IV)(SEQ ID NO2)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、同組氨酸、Nα-乙酰基-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸、或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；Xaa16是Val或Leu；Xaa18是Ser、Lys、或Arg；Xaa19是Tyr或Gln；Xaa20是Leu或Met；Xaa22是Gly、Glu、或Aib；Xaa23是Gln、Glu、Lys、或Arg；Xaa25是Ala或Val；Xaa26是Lys、Glu、或Arg；Xaa27是Glu或Leu；Xaa30是Ala、Glu、或Arg；Xaa33是Val或Lys；Xaa34是Lys、Glu、Asn、或Arg；Xaa35是Gly或Aib；Xaa36是Arg、Gly、或Lys；Xaa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或是不存在；Xaa38是Lys、Ser、酰胺或是不存在；Xaa39是Ser、Lys、酰胺或是不存在；Xaa40是Gly、酰胺或是不存在；Xaa41是Ala、酰胺或是不存在；Xaa42是Pro、酰胺或是不存在；Xaa43是Pro、酰胺或是不存在；Xaa44是Pro、酰胺或是不存在；Xaa45是Ser、酰胺或是不存在；Xaa46是酰胺或是不存在；倘若Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45、或Xaa46不存在的話，那么下游的每一個(gè)氨基酸殘基也不存在。
40.依照權(quán)利要求39的化合物，其中所述多肽是包含氨基酸序列通式(V)的GLP-1肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38通式(V)(SEQ ID NO3)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、同組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸、或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；Xaa18是Ser、Lys、或Arg；Xaa22是Gly、Glu、或Aib；Xaa23是Gln、Glu、Lys、或Arg；Xaa26是Lys、Glu、或Arg；Xaa30是Ala、Glu、或Arg；Xaa34是Lys、Glu、或Arg；Xaa35是Gly或Aib；Xaa36是Arg或Lys；Xaa37是Gly、Ala、Glu、或Lys；Xaa38是Lys、酰胺或是不存在。
41.依照權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)的化合物，其中所述GLP-1肽選自GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)或類似物。
42.依照權(quán)利要求38-41任一項(xiàng)的化合物，其中所述GLP-1肽與GLP-1(7-37)(SEQ ID NO1)相比包含不超過15個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了替代、添加、或刪除，或者與GLP-1(7-37)(SEQ ID NO1)相比包含不超過10個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了替代、添加、或刪除。
43.依照權(quán)利要求42的化合物，其中所述GLP-1肽與GLP-1(7-37)(SEQ ID NO1)相比包含不超過6個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了替代、添加、或刪除。
44.依照權(quán)利要求42-43任一項(xiàng)的化合物，其中所述GLP-1包含不超過4個(gè)不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。
45.依照權(quán)利要求38的化合物，其中所述GLP-1肽是DPPIV保護(hù)的GLP-1肽。
46.依照權(quán)利要求38的化合物，其中所述化合物是DPPIV穩(wěn)定化的。
47.依照權(quán)利要求38-46任一項(xiàng)的化合物，其中所述GLP-1肽在第8位包含Aib殘基。
48.依照權(quán)利要求38-47任一項(xiàng)的化合物，其中所述GLP-1肽第7位氨基酸殘基選自下組D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、同組氨酸、Nα-乙酰基-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、和4-吡啶基丙氨酸。
49.依照權(quán)利要求38-48任一項(xiàng)的化合物，其中所述GLP-1肽選自下組Arg34GLP-1(7-37)、Lys38Arg26，34GLP-1(7-38)、Lys38Arg26，34GLP-1(7-38)-OH、Lys36Arg26，34GLP-1(7-36)、Aib8，22，35GLP-1(7-37)、Aib8，35GLP-1(7-37)、Aib8，22GLP-1(7-37)、Aib8，22，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，35Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8，22，35Lys37GLP-1(7-37)、Aib8，35Lys37GLP-1(7-37)、和Aib8，22Lys37GLP-1(7-38)。
50.依照權(quán)利要求38-49任一項(xiàng)的化合物，其中所述GLP-1肽經(jīng)由相對(duì)于氨基酸序列SEQ ID NO1的第23、26、34、36、或38位的氨基酸殘基附著在所述親水性間隔物上。
51.依照權(quán)利要求38-41任一項(xiàng)的化合物，其中所述GLP-1肽是exendin-4。
52.依照權(quán)利要求38-41任一項(xiàng)的化合物，其中所述GLP-1肽是ZP-10，即HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-酰胺。
53.依照權(quán)利要求38-52任一項(xiàng)的化合物，其中一個(gè)清蛋白結(jié)合殘基經(jīng)由所述親水性間隔物附著到所述GLP-1肽的C末端氨基酸殘基上。
54.依照權(quán)利要求53的化合物，其中另一個(gè)清蛋白結(jié)合殘基附著到并非C末端氨基酸殘基的氨基酸殘基上。
55.依照任一上述權(quán)利要求的化合物，其中所述化合物選自下組Nε37-(2-(2-(2-(十二烷基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(17-磺基十六?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 Nε37-{2-[2-(2-(15-羧基十五?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；鶀-[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(19-羧基十九酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺 [Aib8，22，35，Arg26，34]GLP-1-(7-37)Lys(4-(十六?；被?-4(S)-羧基丁?；?-OH [Aib8，22，35，Arg26，34]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(十六?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH Nε37-(2-[2-(2，6-(S)-二-{2-[2-(2-(十二?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀己酰基氨基)乙氧基]乙氧基})乙?；?[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺 Nε37-(2-[2-(2，6-(S)-二-{2-[2-(2-(十四?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被鶀己?；被?乙氧基]乙氧基})乙?；?[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺 [Aib8，22，35，Arg26，34]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(十六?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH [Aib8，22，35]GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[4-[4-(4-氨基-9，10-二氧-3-磺基-9，10-二氫-蒽-1-基氨基)-2-磺基-苯基氨基]-6-(2-磺基-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙?；?)酰胺 [Aib8，22，35]GLP-1(7-37)Lys(({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(15-羧基十五?；被?-乙氧基]乙氧基}乙?；被?乙氧基]乙氧基}乙?；被?乙氧基]乙氧基}乙?；?)酰胺 Nε37-([2-(2-{3-[2，5-二氧-3-(15-羧基十五基硫烷基)-吡咯烷-1-基]-丙?；被鶀乙氧基)乙氧基)乙?；鵠-[D-Ala8，Lys37]-GLP-1-[7-37]酰胺 [Aib8，22，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(11-(草?；被?十一?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?)))酰胺 [Aib8，22，35，Ala37]-GLP-1(7-37)Lys({2-[2-(2-{2-[2-(2-(15-羧基-十五?；被?-乙氧基]乙氧基}乙?；被?乙氧基]乙氧基}乙?；?酰胺 [Aib8，22，35，Ala37]-GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[11-(5-二甲基氨基萘-1-磺?；被?十一?；被鵠乙氧基}乙氧基)乙?；?酰胺 [Aib8，22，35，Ala37]-GLP-1(7-37)Lys(([2-(2-{2-[1-(4-氯苯甲?；?-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-基]乙?；被鶀乙氧基)乙氧基]乙?；?)酰胺 [Aib8，Arg26，34，Glu22，23，30]GLP-1H(7-37)Lys(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?酰胺 [Aib8，Arg26，34，Glu22，23，30]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(二十?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)酰胺 [Gly8，Arg26，34]GLP-1H-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH [Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH [Aib8]-GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(十六?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH [Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十八?；被?-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰基)乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH [Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基庚?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH [Gly8，Arg26，34]GLP1-(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH [Aib8]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十六?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH Nε37-(2-(2-(2-(十二酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1H(7-37)-酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(十四?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1H(7-37)-酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(十六?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)-酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)-酰胺 Nε37-(2-(2-(2-(二十?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)-酰胺 Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?)-[Aib8，Arg26，34，Lys36]GLP-1-(7-37)-OH Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?)[Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37)-OH Nε36-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰基)}-[Gly8，Arg26，34，Lys36]GLP-1-(7-37)-OH Nε37-(2-(2-(2-(4-4(4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，9-十三氟壬?；被酋；?丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基))[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1-(7-37)-OH Nε37-(2-(2-(2-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，10，10，11，11，12，12，12-二十一氟十二基氧基乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys27]GLP-1-(7-37)-OH Nε37-(2-(2-(2-(4-(十六?；被酋；?丁酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1-(7-37)-OH [Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys({2-(2-(2-(2-[2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)})-OH [Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH Nε20-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-exendin(1-39) [Ala8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-草?；被?3-羧基-2-4，5，6，7-四氫-苯并[b]噻吩-6-基-乙?；被?)乙氧基]乙氧基乙?；?酰胺 [Aib8，22，35]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-草?；被?3-羧基-2-4，5，6，7-四氫-苯并[b]噻吩-6-基-乙?；被?)乙氧基]乙氧基乙酰基)酰胺 Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Aib8，Arg26，34，Lys36]GLP-1-(7-37)-OH Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Gly8，Arg26，34，Lys36]GLP-1-(7-37)-OH Nε37-2-(2-(2-(4-(4-(十七酰基氨基)-4-(S)-羧基丁?；被?-4-(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1-(7-37)-NH2 Nε37-2-(2-[2-(2-[2-(4-[4-(十七?；被?-4-(S)羧基丁?；被鵠-4-(S)-羧基丁?；被?乙氧基]乙氧基)乙?；被?乙氧基]乙氧基)乙?；?[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1-(7-37)-NH2 Nε26-(2-(2-(2-(4-(十六酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)-[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)-OH Nε26-2-(2-2-(2-(2-(2-(4-(十八?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)-OH [Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(19-(羧基)十九?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)-OH [Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(17-(羧基)十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?)-OH [Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(19-(羧基)十九酰基氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?-OH [Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十六酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)-乙?；?-OH [Gly8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八?；被?乙氧基)乙氧基)-乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)NH2 Nε20(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(17-(羧基)十七酰基氨基)-4-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[Lys20]exendin-4(1-39)-NH2 Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?[Aib8，Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37) Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[Arg26，34，Lys36]GLP-1(7-37) Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基)[Gly8，Arg26，34，Lys36]GLP-1-(7-37) Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(十八酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)-乙氧基)乙?；?[Lys20]Exendin-4(1-39)-酰胺 Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(十八?；被?-4(S)-羧基丁?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?-[Arg26，34，Lys36]GLP-1-(7-37) Nε26-(2-[2-(2-[2-(2-[2-(17-羧基十七?；被?乙氧基]乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙?；?[Arg34]GLP-1-(7-37)-OH Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七酰基氨基)-4(S)-羧基丁?；被鵠乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基]乙氧基)乙酰基][Arg34]GLP-1-(7-37)-OH Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七?；被?乙氧基)乙氧基)乙酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[Lys20]Exendin-4(1-39)酰胺 [Gly8，Glu22，23，30，Arg18，26，34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-羧基十七酰基氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；被?乙氧基))乙氧基)乙?；?-NH2 [咪唑基丙酸7，Asp16，Aib22，35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17-羧基十七酰基氨基)丁基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基)) [咪唑基丙酸7，Aib22，35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17-羧基十七酰基氨基)丁基氨基甲?；鵠甲氧基}乙氧基)乙氧基)) 和[3-(5-咪唑基)丙?；?，Aib8，Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-羧基庚?；被?乙氧基)乙氧基]乙?；被?乙氧基)乙氧基)乙?；?}-OH
56.依照權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)的化合物，其中所述治療性多肽是GLP-2肽。
57.依照權(quán)利要求56的化合物，其中所述GLP-2肽是DPPIV保護(hù)的GLP-2肽。
58.依照權(quán)利要求56的化合物，其中所述GLP-2肽是Gly2-GLP-2(1-33)。
59.依照權(quán)利要求56的化合物，其中所述GLP-2肽是Lys17Arg30-GLP-2(1-33)。
60.依照權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)的化合物，其中所述治療性多肽是人胰島素或其類似物。
61.依照權(quán)利要求60的化合物，其中所述治療性多肽選自下組AspB28-人胰島素、LysB28，ProB29-人胰島素、LysB3，GluB29-人胰島素、GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰島素、和des(B30)人胰島素。
62.依照權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)的化合物，其中所述治療性多肽是人生長(zhǎng)激素或其類似物。
63.依照權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)的化合物，其中所述所述治療性多肽是甲狀旁腺激素或其類似物。
64.依照權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)的化合物，其中所述治療性多肽是人促卵泡激素或其類似物。
65.依照權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)的化合物，其中所述治療性多肽的摩爾量小于100kDa、小于50kDa、或小于10kDa。
66.依照權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)的化合物，其中所述治療性多肽選自下組生長(zhǎng)因子，諸如血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，諸如胰島素生長(zhǎng)因子I(IGF-I)、胰島素生長(zhǎng)因子II(IFG-II)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、或血管生成素；干擾素，尿激酶原，尿激酶，組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，纖溶酶原激活劑抑制劑1，纖溶酶原激活劑抑制劑2，血管假性血發(fā)病因子；細(xì)胞因子，例如白介素(IL)諸如IL-1、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-20、或IL-21，集落刺激因子(CFS)諸如GM-CSF，干細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子諸如TNF-α，淋巴毒素-α，淋巴毒素-β，CD40L，或CD30L；蛋白酶抑制劑，例如抑酶肽；酶，諸如超氧化物歧化酶、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、核糖核酸酶、過氧化氫酶、尿酸酶、膽紅素氧化酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性磷酸酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、或巴曲酶；阿片樣物質(zhì)，例如內(nèi)啡肽、腦啡肽、或非天然阿片樣物質(zhì)；激素或神經(jīng)肽，例如降鈣素、胰高血糖素、促胃液素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、縮膽囊素、促黃體素、促性腺激素釋放激素、絨毛膜促性腺激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、加壓素、催產(chǎn)素、抗利尿激素、促甲狀腺激素、促甲狀腺素釋放激素、松弛素、催乳素、YY肽、Y神經(jīng)肽、胰多肽、瘦素、CART(受可卡因和苯丙胺調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本)、CART相關(guān)肽、脂滴相關(guān)蛋白、黑皮質(zhì)素(促黑激素)諸如MC-4、黑色素濃集激素、鈉尿肽、腎上腺髓質(zhì)素、內(nèi)皮素、胰泌素、糊精、血管活性腸肽(VIP)、可激活垂體腺苷酸環(huán)化酶的多肽(PACAP)、鈴蟾肽、鈴蟾肽樣肽、胸腺素、肝素結(jié)合蛋白、可溶性CD4、下丘腦釋放因子、褪黑素及其類似物。
67.包含依照權(quán)利要求1-66任一項(xiàng)的化合物以及制藥學(xué)可接受賦形劑的藥物組合物。
68.依照權(quán)利要求67的藥物組合物，其適于腸胃外施用。
69.依照權(quán)利要求1-66任一項(xiàng)的化合物用于制備藥物的用途。
70.依照權(quán)利要求38-55任一項(xiàng)的化合物用于制備治療或預(yù)防高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、肥胖、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管病、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良、和胃潰瘍的藥物的用途。
71.依照權(quán)利要求38-55任一項(xiàng)的化合物用于制備延遲或預(yù)防2型糖尿病疾病發(fā)展的藥物的用途。
72.依照權(quán)利要求38-55任一項(xiàng)的化合物用于制備減少食物攝入、降低β-細(xì)胞凋亡、提高β-細(xì)胞功能和β-細(xì)胞質(zhì)量、和/或恢復(fù)β-細(xì)胞葡萄糖敏感性的藥物的用途。
73.依照權(quán)利要求56-59任一項(xiàng)的化合物用于制備治療小腸綜合征、炎性腸綜合征、或克羅恩病的藥物的用途。
74.依照權(quán)利要求60-61任一項(xiàng)的化合物用于制備治療或預(yù)防高血糖癥、1型糖尿病、2型糖尿病、或β-細(xì)胞缺乏的藥物的用途。
全文摘要
具有延長(zhǎng)的作用特性的新型多肽衍生物。本發(fā)明涉及一種化合物，其包含通過親水性間隔物與清蛋白結(jié)合殘基連接的治療性多肽。本發(fā)明也涉及一種化合物，其包含通過親水性間隔物與清蛋白結(jié)合殘基連接的治療性多肽，所述親水性間隔物通過化學(xué)部分(moiety)將所述多肽和清蛋白結(jié)合殘基分隔開，所述化學(xué)部分(moiety)含有至少5個(gè)非氫原子，其中30－50％的這些原子是N或O。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，間隔物定義為－(CH
文檔編號(hào)A61K47/48GK1867360SQ200480030018
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月19日
發(fā)明者J·勞, T·K·漢森, K·馬德森, P·布羅奇, F·Z·迪爾沃德, N·L·喬安森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司