專利名稱：多孔骨修復(fù)材料及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療領(lǐng)域中用于修復(fù)骨缺損部的多孔骨修復(fù)材料及其制造方法。
背景技術(shù)：
作為針對腫瘤或壞死等骨病變的骨組織切除手術(shù)、或針對外傷引起的骨組織缺損部位的治療方法，近年來使用再生醫(yī)療的手法。迄今為止，針對骨的缺損部位，填充金屬等非生物體吸收性材料，只是單純修復(fù)缺損部的形態(tài)，沒有考慮骨組織本身的再生。再生醫(yī)療的手法根據(jù)組織學(xué)的概念、結(jié)合構(gòu)成生物體組織的細胞和固定材料以及誘導(dǎo)細胞分化的因子(信號物質(zhì)等)而使失去的生物體組織(此處是指骨組織)再生的醫(yī)療手法。
作為腳手架材料，要求具有對生物體的危害性低且在一定時間內(nèi)可被代謝吸收的特性，在有機材料中，正在嘗試使用膠原、明膠、殼聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸等。另外，特別是在骨組織或牙齒再生中，正在應(yīng)用無機材料如磷酸三鈣等磷酸鈣類材料。
羧甲基殼多糖(下面稱為CM殼多糖)與殼聚糖一樣，是構(gòu)成螃蟹等甲殼類的外骨骼的甲殼質(zhì)的衍生物，通過適當(dāng)?shù)慕宦?lián)處理而具有腳手架材料的特性。
例如，對混入了磷酸鈣類化合物粉末的殼多糖(含有殼多糖、殼聚糖以及它們的衍生物)溶液實施真空熱干燥等，交聯(lián)狀態(tài)的殼多糖形成承載有磷酸鈣類化合物粒子的復(fù)合體，進而通過未交聯(lián)的殼多糖使該復(fù)合體表面形成被膜，該生物體移植材料和生理鹽水等液體進行捏煉而具有適當(dāng)?shù)恼澈闲?參照專利文獻1)。
根據(jù)專利文獻1，通過該手法，由未交聯(lián)的殼多糖構(gòu)成的被膜具有水溶性，所以和生理鹽水等液體進行捏煉而具有適當(dāng)?shù)恼扯龋M而因為殼多糖進行交聯(lián)形成的承載磷酸鈣類化+物粒子的復(fù)合體不溶于水，所以在復(fù)合體內(nèi)牢固地承載上述粒子并填充在骨的缺損部，且沒有出現(xiàn)移動、脫落，骨骼在骨缺損部早期出現(xiàn)再生增殖，從而能夠提供具有很大治療效果的生物體移植材料。
另外，也公開了由熱交聯(lián)后的殼多糖或其衍生物構(gòu)成的吸收性生物體材料、以及以實施真空熱交聯(lián)處理為主要特征的吸收性生物體材料的制造方法(參照專利文獻2)。
根據(jù)專利文獻2，相對容易地提供作為生物體內(nèi)的安全的吸收性材料的生物體材料，同時能夠通過使用該材料而提供促進骨生成的環(huán)境。
另外，為了改善在吸收性生物體材料中修正(trimming)時的強度以及生物體內(nèi)環(huán)境下的強度，充分減緩在生物體內(nèi)的吸收速度，也有由通過環(huán)氧化合物交聯(lián)的衍生物構(gòu)成的、且含鈣的吸收性生物體材料(參照專利文獻3)。
另外，作為促進生物體骨形成的材料，示出由包括下述工序的方法形成的骨形成材料，即，通過有機酸溶解殼多糖·殼聚糖以成為殼多糖·殼聚糖溶膠的工序、在該殼多糖·殼聚糖溶膠中混合骨形成用蛋白質(zhì)制作含有該骨形成用蛋白質(zhì)的殼多糖·殼聚糖溶膠的工序、把混合了上述骨形成用蛋白質(zhì)的上述殼多糖·殼聚糖溶膠與羥基磷灰石、α-TCP、β-TCP、CaCO3、CaO、ZnO、CaSiO3、MgO等的粉末進行捏煉而得到捏煉物的工序(參照專利文獻4)。
專利文獻1特開平6-105901號公報，專利文獻2特開平7-116241號公報，專利文獻32002-11090號公報，專利文獻4特開平11-347112號公報。
如前所述，再生醫(yī)療的手法是根據(jù)組織學(xué)的概念，組合構(gòu)成生物體組織的細胞和成為腳手架的材料以及誘導(dǎo)細胞分化的因子(信號物質(zhì)等)而使失去的生物體組織(此處是指骨組織)再生的醫(yī)療手法。當(dāng)在生物體內(nèi)只埋置材料時，生物體內(nèi)預(yù)先存在的細胞以及因子進入到材料內(nèi)部，由此在該處(in situ)期望出現(xiàn)組織的再生。從這種觀點出發(fā)，如果研究現(xiàn)有技術(shù)需要考慮下述問題。
首先，專利文獻1所述的生物體移植材料，是用生物體吸收性較慢的殼多糖或其衍生物覆蓋磷酸鈣類化合物顆粒，從而減慢成骨細胞與磷酸鈣類顆粒的接觸。
另外，對于專利文獻2，3所述的材料，由于通過溶液的凍結(jié)干燥形成多孔體，因此得到的成形體的微細結(jié)構(gòu)，成為用溶質(zhì)凝聚形成的(此時是指殼多糖衍生物)的隔膜遮蔽冰的晶體升華而殘留的空洞的形狀(所謂蜂窩狀結(jié)構(gòu))。當(dāng)為這種結(jié)構(gòu)時，因為各氣孔沒有形成完全的連續(xù)氣孔，所以減慢再生骨組織的成骨細胞等細胞群進入到材料內(nèi)部。當(dāng)為專利文獻3所述的材料時，由于進一步地用環(huán)氧化合物交聯(lián)殼多糖衍生物，所以也擔(dān)心有交聯(lián)劑殘留。
此外，專利文獻4中所述的骨形成促進材料，采用在生物體內(nèi)或生物體外固化捏煉物的方法。在該手法中，固化物只含有數(shù)微米以下的氣孔，實質(zhì)上阻斷了再生骨組織的細胞。為此，骨組織只在材料被生物體吸收之后才出現(xiàn)再生。
綜上所述，現(xiàn)有手法的缺點都在于，減慢磷酸鈣類粒子與對成骨細胞等骨進行再構(gòu)建的細胞群之間的接觸。
另外，從殼多糖和磷酸鈣顆粒的復(fù)合體形成方法的觀點來看，存在下述的課題。
上述的現(xiàn)有技術(shù)都使用在殼多糖溶液中混合磷酸鈣顆粒的手法。通常情況下，殼多糖溶液的密度稍超過1，磷酸鈣顆粒的密度約為3。為此，密度差在成形過程中引起顆粒的沉淀，制作的復(fù)合體成為磷酸鈣下部的配合比較高的不均勻物質(zhì)。為了避免這種問題，必須采用在溶液冰點以下的溫度下進行顆粒的攪拌混合以及成形等繁瑣的手法。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的這種問題，本發(fā)明的目的在于，通過防止磷酸鈣顆粒分布的偏差而使骨均勻進入其內(nèi)部，通過使骨修復(fù)材料內(nèi)部的氣孔處于基本連通狀態(tài)而使骨大量進入其內(nèi)部，增大磷酸鈣顆粒在骨修復(fù)材料內(nèi)部的氣孔內(nèi)的露出面積，從而促進骨進入其內(nèi)部。
為了解決上述課題，本發(fā)明者進行了潛心研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用由殼多糖或其衍生物構(gòu)成的纖維形成集合體時，能夠構(gòu)成基本上完全連續(xù)的氣泡，其實質(zhì)上能在集合體纖維之間均勻地承載磷酸鈣顆粒，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供一種多孔骨修復(fù)材料，在含有由殼多糖或其衍生物構(gòu)成的腳手架材料和由磷酸鈣構(gòu)成的細胞分化誘導(dǎo)材料的骨修復(fù)材料中，上述殼多糖或其衍生物形成纖維狀并成為多孔集合體，同時磷酸鈣成為顆粒狀并在上述集合體的纖維間被承載。
另外，本發(fā)明在制造由殼多糖或其衍生物的纖維集合體和其纖維間所承載的磷酸鈣顆粒構(gòu)成的多孔骨修復(fù)材料時，提供一種多孔骨修復(fù)材料的制造方法，包括殼多糖或其衍生物形成纖維的工序、在減壓條件下交聯(lián)該纖維的工序、把該交聯(lián)纖維與磷酸鈣顆粒以及該交聯(lián)纖維的保水量以下的水相混合而形成大致均勻的混合物的工序、凍結(jié)干燥該混合物而成為多孔性材料的工序。
在本發(fā)明的多孔骨修復(fù)材料中，殼多糖或其衍生物在再生醫(yī)療手法中是作為腳手架的材料，磷酸鈣顆粒是誘導(dǎo)細胞分化的材料。
在本發(fā)明中，使殼多糖或其衍生物成為纖維的集合體有下述理由。
即，通過形成在纖維集合體的纖維之間承載磷酸鈣顆粒的結(jié)構(gòu)，能夠防止在制造骨修復(fù)材料時出現(xiàn)顆粒沉淀且顆粒分布出現(xiàn)偏差。另外，纖維集合體具有基本上完全連續(xù)的氣孔，所以骨細胞能夠大量進入到其內(nèi)部。而且，能夠成為磷酸鈣顆粒在連續(xù)氣孔內(nèi)露出的狀態(tài)，所以能夠很好地誘導(dǎo)細胞分化。
作為殼多糖或其衍生物，在制造工序上優(yōu)選可以溶解于中性水的羧甲基殼多糖(鈉鹽)或水溶性殼聚糖。另外，也可以使用羥乙基殼多糖(乙二醇殼多糖)或乙二醇殼聚糖等水溶性殼多糖衍生物。
這里，衍生物是指對天然存在的殼多糖進行了化學(xué)修飾后的物質(zhì)。
作為磷酸鈣，也可能是磷灰石、磷酸三鈣、磷酸八鈣等各種材料。
作為磷酸鈣顆粒的尺寸，只要為2000微米以下就能夠使用，根據(jù)應(yīng)用部位的骨種類(皮質(zhì)骨、海綿骨)或基于部位不同而產(chǎn)生的骨反應(yīng)性的變化，可以選擇最佳尺寸。
在本發(fā)明的制造方法中，作為形成殼多糖或其衍生物的纖維的方法，當(dāng)為水溶性殼多糖衍生物時，把該材料的水溶液與乙醇或丙酮等水溶性有機溶劑相混合，通過快速攪拌而析出短纖維狀的沉淀物，收集、清洗該沉淀物之后，干燥并除去溶劑，由此能夠得到纖維。另外，用下述的方法也能夠得到纖維。即，使用堿性溶劑使殼多糖溶液化并將其從細孔(數(shù)十微米)的噴嘴中高壓擠出到熱水中，由此使其凝固而成為纖維狀。
另外，關(guān)于上述水溶性殼多糖衍生物，進行交聯(lián)處理以使纖維在體內(nèi)不容易被溶出。
交聯(lián)處理是通過在2kPa左右的減壓情況下120℃至180℃的加熱情況下進行熱交聯(lián)而實現(xiàn)的。與上述的磷酸鈣顆粒相同，能夠根據(jù)應(yīng)用部位選擇最佳溫度。
另外，當(dāng)混合交聯(lián)纖維和磷酸鈣顆粒時，添加交聯(lián)纖維的保水量以下的水。這里，交聯(lián)纖維的保水量是指當(dāng)纖維集合體浸漬于大量水中后取出來時，纖維集合體攝入至纖維間以及纖維內(nèi)并保持的水量。這是因為當(dāng)添加保水量以上的水時，在和磷酸鈣顆粒進行混合時，由于剩余的水具有過度的流動性，所以出現(xiàn)因重力造成的顆粒沉淀或凝聚，造成其分散不均勻。當(dāng)為保水量以下時，纖維集合體所保持的水分難以流動，抑制磷酸鈣顆粒的凝聚或沉淀，其結(jié)果是形成均勻的復(fù)合體。
交聯(lián)纖維和磷酸鈣顆粒的混合比(重量)在1∶0.1至1∶10之間是可以制作的。
為了使該混合物能夠成可使用狀態(tài)，進行混合物的凍結(jié)干燥。凍結(jié)干燥是在醫(yī)藥品、干燥食品的制造中等通常進行的工序，通過使凍結(jié)干燥機內(nèi)部的溫度保持在混合物中所含的水分的凝固點以下(0℃以下)，使用真空泵等進行減壓而使水分升華蒸發(fā)而實現(xiàn)的。作為凍結(jié)干燥的條件，對溫度、減壓程度、干燥時間等沒有特別限制。
根據(jù)本發(fā)明的多孔骨修復(fù)材料，通過形成纖維集合體的纖維間承載磷酸鈣顆粒的結(jié)構(gòu)，能夠防止在制造骨修復(fù)材料時出現(xiàn)顆粒沉淀以及顆粒分布出現(xiàn)偏差。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)骨細胞沒有偏差地進入內(nèi)部。另外，因為纖維集合體具備基本上完全連續(xù)的氣孔，所以骨細胞能夠大量進入內(nèi)部。而且，成為磷酸鈣顆粒在連續(xù)氣孔內(nèi)露出的狀態(tài)，所以能夠大量誘導(dǎo)細胞分化。
另外，根據(jù)本發(fā)明的制造方法，通過下述工序能夠制造上述多孔骨修復(fù)材料，即，殼多糖或其衍生物形成纖維的工序、在真空中交聯(lián)該纖維的工序、把該交聯(lián)纖維與磷酸鈣顆粒以及該交聯(lián)纖維的保水量以下的水相混合而形成大致均勻的混合物的工序、凍結(jié)干燥該混合物而成為多孔性材料的工序。


圖1是表示實施例的多孔骨修復(fù)材料表面的SEM圖像。
圖2是表示實施例的多孔骨修復(fù)材料斷面的SEM圖像(反射電子圖像)。
具體實施例方式
下面，表示上述發(fā)明的優(yōu)選實施例，不過本發(fā)明如上所述，交聯(lián)處理能夠在2kPa左右的減壓情況下120℃至180℃的加熱情況下進行熱交聯(lián)，與上述的磷酸鈣顆粒相同，能夠根據(jù)應(yīng)用部位選擇最佳溫度。
另外，當(dāng)混合交聯(lián)纖維和磷酸鈣顆粒時，添加交聯(lián)纖維保水量以下的水而可以實現(xiàn)。另外，交聯(lián)纖維和磷酸鈣顆粒的混合比(重量)在1∶0.1至1∶10之間是可以制作的。因此，本發(fā)明并不限于下面的實施例。
(優(yōu)選的制造方法)精密稱取CM殼多糖原料3g，連同純水(mil Q水)72g一起添加到玻璃制容器中，使用電磁式攪拌器進行攪拌、溶解，制成4wt％的CM殼多糖水溶液。為了加快CM殼多糖的溶解，水浴中加熱容器至30～50℃，攪拌3～5小時，得到目視情況下均質(zhì)的溶液。
把溶液倒入內(nèi)裝150ml乙醇的燒杯中并用玻璃棒快速攪拌。通過這一操作，析出短纖維狀的CM殼多糖沉淀物。把沉淀物轉(zhuǎn)移到其他容器中，接著使用乙醇100ml清洗數(shù)次。在盡可能除去乙醇之后，把該沉淀物放置在40℃的干燥器中12小時以上，使乙醇以及殘留的水分蒸發(fā)。然后，在真空熱處理裝置在140℃減壓條件下(約2kPa以下)處理12小時。
以重量比1∶5∶32的比例稱量上述的CM殼多糖以及βTCP顆粒(粒徑50～150微米)以及純水放在容器中，用刮勺攪拌混合。把該混合物填充到尺寸適于以后的試驗的聚苯乙烯制圓筒中，用PET薄膜封閉圓筒的兩端，然后迅速放置到-80℃的冷凍庫中。經(jīng)過1小時以上且混合物完全凍結(jié)之后，去除兩端的PET薄膜并移至凍結(jié)干燥器中，在凍結(jié)狀態(tài)下直接蒸發(fā)水分。然后，從聚苯乙烯制圓筒中取出試驗體，供于下述試驗。
使用掃描型電子顯微鏡[SEM]實施。對試樣進行汽化鍍金之后，使用35倍的倍率、以2維電子圖像進行觀察(參照圖1)。觀察到纖維狀的CM殼多糖(纖維集合體)中的纖維間承載有TCP顆粒的狀態(tài)。氣孔的尺寸為數(shù)十～數(shù)百μm。
為了觀察TCP顆粒的分散狀態(tài)，把試驗體包埋于環(huán)氧樹脂中之后，切斷并研磨切斷面，平整化之后實施相同的SEM觀察。此時，為了只清楚地看到TCP顆粒，采用反射電子圖像進行觀察(參照圖2)。在所觀察的整個斷面(約4×8mm)上，觀察到大致均勻分散有TCP顆粒，沒有觀察到顆粒因沉淀造成的偏載。
將本材料埋置到形成在家兔下頜骨上的直徑為4mm的骨缺損處，術(shù)后4、8周后與周圍組織一起回收，調(diào)查骨組織的再生狀況。針對在規(guī)定時間后回收的組織，按照一般方法制作非脫灰樹脂包埋組織標(biāo)本，計算各標(biāo)本中再生骨組織占骨缺損部位的面積比。作為比較，只形成骨缺損且不埋置任何材料的例子(空白例)、埋置有通過現(xiàn)有技術(shù)即上述專利文獻2(特開平7-116241號公報)中所述的手法制造的試驗體的例子，以供于相同的試驗。把空白例的骨修復(fù)面積作為1，比較研究各種材料埋置例子的面積比的值。
該現(xiàn)有技術(shù)樣本的制作如下所示。在冷卻浴(-10℃)中攪拌CM殼多糖4.24wt％的CM殼多糖水溶液，同時使其凍結(jié)，制成微細的晶體冰和溶液混合的狀態(tài)(frozen)。添加規(guī)定量的TCP顆粒(粒徑50～150μm)并攪拌，使其均勻分散。在尺寸適于以后的試驗的聚苯乙烯制圓筒中填充該凍結(jié)物，用PET薄膜封閉圓筒兩端之后，迅速放到-80℃的冷凍庫中，然后使其凍結(jié)干燥。除掉圓筒，使用真空熱處理裝置在140℃或160℃的減壓條件下(2kPa以下)加熱處理24小時，得到海綿狀體。常溫冷卻后，用體積是成形體表觀體積20倍以上的純水清洗3小時，把液體部分置換成乙醇，在80℃的干燥器中干燥。制作的試驗體經(jīng)由25kGy的伽馬射線進行滅菌處理，供于試驗。
其中，只使用通過現(xiàn)有技術(shù)的手法，則出現(xiàn)TCP顆粒的偏載，但是，通過與如上所述在溶液冰點以下的溫度下對顆粒進行攪拌混合以及成形等的手法并用，制作顆粒大致均質(zhì)分散的試驗體以用于試驗。
其試驗結(jié)果匯總?cè)绫?所示。
表1

由表1可知，和空白例相比，當(dāng)埋置本發(fā)明制成的材料時，在4周后、8周后的任何時點都有很好的骨修復(fù)。通過現(xiàn)有技術(shù)制造的材料，其在4周后骨修復(fù)稍微差于空白例，在8周后則相同。
權(quán)利要求
1.一種多孔骨修復(fù)材料，含有由殼多糖或其衍生物構(gòu)成的腳手架材料和由磷酸鈣構(gòu)成的細胞分化誘導(dǎo)材料，其特征在于，所述殼多糖或其衍生物形成為纖維狀并構(gòu)成為多孔集合體，同時磷酸鈣形成為顆粒狀并被承載在所述集合體的纖維間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔骨修復(fù)材料，其特征在于，多孔集合體具有大致完全連續(xù)的氣泡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔骨修復(fù)材料，其特征在于，磷酸鈣顆粒在所述纖維間大致均勻分散。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔骨修復(fù)材料，其特征在于，所述殼多糖或其衍生物是水溶性羧甲基殼多糖或殼聚糖并被交聯(lián)。
5.一種多孔骨修復(fù)材料的制造方法，所述多孔骨修復(fù)材料由殼多糖或其衍生物的纖維集合體和承載在其纖維間的磷酸鈣顆粒構(gòu)成，其特征在于，具有殼多糖或其衍生物形成纖維的工序、在減壓條件下交聯(lián)該纖維的工序、把該交聯(lián)纖維與磷酸鈣顆粒以及該交聯(lián)纖維的保水量以下的水相混合而形成大致均勻的混合物的工序、凍結(jié)干燥該混合物而成為多孔性材料的工序。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制造方法，其特征在于，交聯(lián)工序是通過在120～180℃、2kPa減壓條件下加熱而進行的，
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制造方法，其特征在于，所述交聯(lián)纖維和磷酸鈣顆粒的混合比(重量)為1∶0.1～1∶10。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔骨修復(fù)材料，其特征在于，磷酸鈣顆粒在2000μm以下。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多孔骨修復(fù)材料，其特征在于，由殼多糖或其衍生物形成的纖維集合體構(gòu)成，且所述集合體的纖維間承載有磷酸鈣顆粒。本發(fā)明還提供一種多孔骨修復(fù)材料的制造方法，其特征在于，具有殼多糖或其衍生物形成纖維的工序、在真空中交聯(lián)該纖維的工序、把該交聯(lián)纖維與磷酸鈣顆粒以及該交聯(lián)纖維的保水量以下的水相混合而形成大致均勻的混合物的工序、凍結(jié)干燥該混合物而成為多孔性材料的工序。根據(jù)本發(fā)明，通過防止磷酸鈣顆粒分布的偏差而使骨均勻進入其內(nèi)部，通過使骨修復(fù)材料內(nèi)部的氣孔處于基本連通狀態(tài)而使骨大量進入其內(nèi)部，增大磷酸鈣顆粒在骨修復(fù)材料內(nèi)部的氣孔內(nèi)的露出面積，從而促進骨進入其內(nèi)部。
文檔編號A61L27/00GK1621097SQ20041009550
公開日2005年6月1日 申請日期2004年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者增田真吾, 吉原雄祐 申請人:京瓷株式會社