專利名稱：奶制品中褪黑素的提純方法和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及奶制品中褪黑素的提純方法和檢測方法。
背景技術(shù)：
褪黑素學(xué)名為N-乙?；?5-甲氧基色胺，是脊椎動物腦中松果腺體合成和分泌的一種吲哚類激素。其純品為淡黃色葉片狀結(jié)晶，分子式為C13H16N2O2，相對分子質(zhì)量232.27，熔點116-118℃。國內(nèi)外對褪黑素的晝夜節(jié)律及其催眠的藥理作用均有綜合報道，結(jié)果表明褪黑素與睡眠及睡眠失調(diào)密切相關(guān)。不同動物、不同劑量、不同指標的實驗都表明，褪黑素與睡眠和睡眠失調(diào)密切相關(guān)，具有明顯的改善睡眠的效果。外源補充褪黑素，能改善睡眠和重建睡眠節(jié)律。褪黑素作為一種新型的催眠藥物或食品，有其獨特的特點1)小劑量就有較為理想的改善睡眠效果。2)褪黑素作為一種內(nèi)源性物質(zhì)，通過對內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)而起作用，對機體來說并非異物。褪黑素在體內(nèi)有自身的代謝途徑，不會造成母藥及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的蓄積。3)褪黑素生物半衰期短，在口服幾小時后即降至正常人的生理水平，不會因蓄積殘留而影響次日的精力。4)毒性極小。動物實驗測不出其半數(shù)致死量，即使大劑量(800mg/kg)時也不引起大鼠死亡。但連續(xù)服用300mg/日褪黑素4個月后，會有抑制排卵的副作用。因此褪黑素的催眠作用具有內(nèi)源性、小劑量、高效、低毒的特點。衛(wèi)生部已批準褪黑素為改善睡眠保健食品的功能因子(Ernest Hartmann M.D.et al.，Sleep Induced by L-Tryptophan.TheJournal of Nervous and Mental Disease，167497-499；Lois A.Steinberg et al.，Tryptophan Intake Influences Infants Sleep Latency.J nutr 1221781-1791；金宗濂，保健食品的功能評價與開發(fā)，中國輕工業(yè)出版社，2001)。但目前褪黑素產(chǎn)品多為片劑或膠囊，故目前褪黑素的檢測都是針對其粉末或膠囊樣品。隨著褪黑素日漸被引入牛奶等奶制品中后，在檢測時，發(fā)現(xiàn)很難將其從奶制品中分離提純，導(dǎo)致常規(guī)的檢測結(jié)果偏低、不準確；從食品的有關(guān)規(guī)定來說，不能準確測定奶制品中的褪黑素含量，從某種程度上制約了褪黑素在奶(乳)制品中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人為解決上述問題，經(jīng)過了諸多的試驗，目的之一即為提供一種奶制品中褪黑素的提純方法。
上述的目的是通過下列技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種奶制品中褪黑素的提純方法，其包括下列步驟1)將奶制品進行脫脂，過濾后得到脫脂奶；2)將該脫脂奶按常規(guī)調(diào)整pH為4.4～4.8；3)將步驟2)得到的產(chǎn)物進行離心后取乳清；4)將該乳清用不少于該奶制品3倍體積的乙酸乙酯分三次萃??；5)萃取液去除乙酸乙酯后即得到褪黑素。
其中，步驟1)中所述的脫脂為離心脫脂。
該步驟2)中調(diào)整的pH最好為4.6。
所述的離心條件最后為8000rpm，20分鐘。
而所述的去除乙酸乙酯最好是經(jīng)過真空蒸發(fā)來實現(xiàn)。
上述的乙酸乙酯最好選用分析純。
本發(fā)明的目的之二則是提供一種利用上述提純方法，而對奶制品中褪黑素的進行檢測的方法。
上述目的是通過下列技術(shù)方案來實現(xiàn)一種奶制品中褪黑素的檢測方法，其包括根據(jù)上述的提純方法分別分離提純需檢測的樣品奶及作為標準的標準奶中的褪黑素，用甲醇溶解，經(jīng)高效液相色譜分離，用外標法定量，根據(jù)峰面積計算出樣品奶中的褪黑素含量。
其中，所述的高效液相色譜分離的條件為色譜柱為Nova-Pak C18柱3.9mm×150mm；流動相為體積比為1∶1的甲醇和水；紫外線波長為260nm；流速為1.0mL/min；進樣量為10ul。
該標準奶是指由褪黑素標準品溶于未含褪黑素的樣品奶中所制得。
而所制得的標準奶中的褪黑素濃度最好分別為1.6、1.2、0.8、0.4mg/kg。
本發(fā)明中的奶制品是指普通牛奶或用奶粉、乳清粉、稀奶油或其他牛奶組分配制成的還原奶或含乳飲料。
本發(fā)明的方法不僅解決了奶制品中褪黑素的分離提純問題，且可以準確定量，有利于褪黑素在奶(乳)制品中的應(yīng)用。


圖1為樣品奶中褪黑素檢測的HPLC曲線圖。
具體實施例方式
為更好地說明、理解本發(fā)明方法的操作步驟及效果，下面用實施例來具體說明之。
實施例1 樣品奶中褪黑素的提純?nèi)?0ml含褪黑素的舒睡奶(市售，光明乳業(yè)股份有限公司生產(chǎn))，經(jīng)離心機8000rpm/20min離心脫脂，玻璃絲過濾后將脫脂奶調(diào)至pH4.6，8000rpm/20min離心后取乳清，用150ml乙酸乙酯分三次萃取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃真空蒸發(fā)乙酸乙酯，得到少量產(chǎn)物。
實施例2 褪黑素標準奶的制備準確稱取褪黑素標準品(純度99.9％以上，Sigma公司產(chǎn)品)制成0.04mg/ml水溶液，移取上述溶液2ml、1.5ml、1.0ml、0.5ml于50ml未含褪黑素、但其余成份與樣品奶一致的舒睡奶(市售，光明乳業(yè)股份有限公司生產(chǎn))中，配置成褪黑素濃度分別為1.6、1.2、0.8、0.4mg/kg的標準奶。
實施例3 標準奶中褪黑素的提純?nèi)嵤├?中褪黑素濃度為1.6mg/kg的標準奶50ml，經(jīng)離心機8000rpm/20min離心脫脂，玻璃絲過濾后將脫脂奶調(diào)至pH4.4，8000rpm/20min離心后取乳清，用300ml乙酸乙酯分三次萃取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃真空蒸發(fā)乙酸乙酯，得到少量產(chǎn)物。
實施例4 標準奶中褪黑素的提純?nèi)嵤├?中褪黑素濃度為1.2mg/kg的標準奶50ml，經(jīng)離心機8000rpm/20min離心脫脂，玻璃絲過濾后將脫脂奶調(diào)至pH4.8，8000rpm/20min離心后取乳清，用200ml乙酸乙酯分三次萃取，在40℃真空蒸發(fā)乙酸乙酯，得到少量產(chǎn)物。
實施例5 標準奶中褪黑素的提純?nèi)嵤├?中褪黑素濃度為0.8mg/kg的標準奶50ml，經(jīng)離心機8000rpm/20min離心脫脂，玻璃絲過濾后將脫脂奶調(diào)至pH4.6，8000rpm/20min離心后取乳清，用150ml乙酸乙酯分三次萃取，在40℃真空蒸發(fā)乙酸乙酯，得到少量產(chǎn)物。
用同樣方法對褪黑素濃度為0.4mg/kg的標準奶中的褪黑素進行提純。
實施例6 提純的褪黑素再處理將實施例1、3、4、5中得到的少量產(chǎn)物分別再用甲醇溶解定容到10ml，用微孔過濾器(Sartorius Minisart TM，0.45um孔徑)0.45um微濾膜加壓過濾，各濾液待上機測定。
實施例7 高效液相色譜分離(HPLC)及外標法測定利用高效液相色譜儀(Waters2690型)帶996型紫外檢測器進行高效液相色譜分離，色譜分離條件為色譜柱為Nova-Pak C18柱3.9mm×150mm；柱溫40℃；流動相為體積比為1∶1的甲醇(色譜純，含量＞99.9％)和水(超純水)；紫外線波長為260nm；流速為1.0mL/min；進樣量為10ul。接下來按照常規(guī)外標法來進行測定，包括標準曲線繪制將上述實施例6中的標準奶的各濾液依次進樣10ul，用HPLC測定各濃度相應(yīng)的峰面積值，繪制標準曲線；樣品測定取實施例6中樣品奶濾液10ul注入高效液相色譜儀分離測定，其曲線如圖1所示，以標準品峰的保留時間定性，并根據(jù)樣品組分的峰面積在標準曲線上查出相應(yīng)組分的含量；結(jié)果計算根據(jù)標準曲線計算。
上述實施例中的離心機為Beckman Coulter公司的Avanti TM J-301型，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為Heidolph公司Laborota 4000型，各試劑均為市售，未特殊說明的甲醇與乙酸乙酯均為分析純。
權(quán)利要求
1.一種奶制品中褪黑素的提純方法，其包括下列步驟1)將奶制品進行脫脂，過濾后得到脫脂奶；2)將該脫脂奶按常規(guī)調(diào)整pH為4.4～4.8；3)將步驟2)得到的產(chǎn)物進行離心后取乳清；4)將該乳清用不少于該奶制品3倍體積的乙酸乙酯分三次萃??；5)萃取液去除乙酸乙酯后即得到褪黑素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提純方法，其特征在于步驟1)中所述的脫脂為離心脫脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提純方法，其特征在于步驟2)中調(diào)整pH為4.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提純方法，其特征在于所述的離心條件為8000rpm，20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提純方法，其特征在于步驟5)中所述的去除乙酸乙酯是經(jīng)過真空蒸發(fā)實現(xiàn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的提純方法，其特征在于該乙酸乙酯為分析純。
7.一種奶制品中褪黑素的檢測方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的提純方法分別分離提純需檢測的樣品奶及作為標準的標準奶中的褪黑素，用甲醇溶解，經(jīng)高效液相色譜分離，用外標法定量，根據(jù)峰面積計算出樣品奶中的褪黑素含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述的高效液相色譜分離的條件為色譜柱為Nova-Pak C18柱3.9mm×150mm；流動相為體積比為1∶1的甲醇和水；紫外線波長為260nm；流速為1.0mL/min；進樣量為10ul。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于該標準奶是指由褪黑素標準品溶于未含褪黑素的樣品奶中所制得。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于所制得的標準奶中的褪黑素濃度分別為1.6、1.2、0.8、0.4mg/kg。
全文摘要
一種奶制品中褪黑素的提純方法，其包括下列步驟1)將奶制品進行脫脂，過濾后得到脫脂奶；2)將該脫脂奶調(diào)整pH為4.4～4.8；3)將步驟2)得到的產(chǎn)物進行離心后取乳清；4)將該乳清用不少于該奶制品3倍體積的乙酸乙酯分三次萃??；5)萃取液去除乙酸乙酯后即得到褪黑素。一種奶制品中褪黑素的檢測方法，其包括根據(jù)上述的提純方法分別分離提純需檢測的樣品奶及作為標準的標準奶中的褪黑素，用甲醇溶解，經(jīng)高效液相色譜分離，用外標法定量，根據(jù)峰面積計算出樣品奶中的褪黑素含量。上述兩種方法不僅解決了奶制品中褪黑素的分離提純問題，且可以準確定量。
文檔編號A61K31/4045GK1742588SQ200410054289
公開日2006年3月8日 申請日期2004年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月3日
發(fā)明者巫慶華, 鄭小平, 吳正鈞, 孫立國, 蘇米亞, 龔廣予, 李存瑞, 王蔭榆, 郭本恒 申請人:光明乳業(yè)股份有限公司