專利名稱：抑制變態(tài)反應的脫敏制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抑制變態(tài)反應多肽的制備及其應用。尤其涉及一種采用旦白分解酶分解過敏原，制備抑制變態(tài)反應多肽，作為脫敏制劑的方法及應用。
發(fā)明技術背景過敏癥是一類常見多發(fā)疾病，通常表現(xiàn)為對某些特殊的植物花粉、枯草、粉塵、昆蟲及其分泌液、食品過敏而引發(fā)鼻咽部或呼吸道充血、腫脹等炎癥現(xiàn)象，出現(xiàn)鼻塞、打噴嚏、流鼻涕、咳嗽、哮喘、發(fā)熱、風疹、皮膚發(fā)癢等癥狀，其發(fā)生機理可能與產生過多免疫球旦白E(IgE)有關，IgE可能會刺激局部免疫細胞分泌類似組織胺、五羥色胺等致炎物質，而引發(fā)局部或全身炎癥癥狀。
目前臨床多采用抗組織胺類藥物治療過敏癥，其雖能抑制組織胺釋放量，但作用有限，對許多過敏癥狀不起效用，而且還有副作用。能夠有效改變患者過敏體質的最有效治療方法是系統(tǒng)脫敏療法或稱免疫療法，其特征是，重復注射引發(fā)患者過敏癥發(fā)作的少量過敏原，逐步增加注射過敏原的劑量，通過誘發(fā)患者的免疫耐受而產生更多IgG對抗IgE，并使IgE產生受阻。
但要在許多不同的誘發(fā)因子中準確地找到致病的因子，不是件容易的事情。為檢測一種物質的致敏反應，醫(yī)生需要做各種不同的過敏測試。例如，應用極低劑量的豚草過敏原或蜂毒過敏原進行皮下注射，如果在1小時內局部沒有產生炎癥反應，采用雙倍劑量注射后觀察3～4天，然后逐步增加注射的劑量，直至誘發(fā)患者對過敏原產生免疫耐受。由于注射過敏原可能會引發(fā)極其嚴重的變態(tài)反應，因此，系統(tǒng)脫敏療法需要在急救設備齊全的專業(yè)醫(yī)院，由有經驗的專業(yè)醫(yī)生來施行，費時費事價格昂貴，患者痛苦。
國外學者，L.Berrens et al[Annals of the New York Academy of Sciences，221183-198，1974]，報導，豚草抗原抽提物旦白質中某些氨基酸和糖側鏈被切斷后，其引發(fā)變態(tài)反應的能力明顯減弱。Ishizaka，Ket al[J.Immunol，11370-77，1974]，報導了采用經過修飾的豚草抗原旦白，用于脫敏治療對豚草敏感的患者，這些經過修飾的抗原被分解為多肽，結果不但沒有引起變態(tài)反應，反而通過刺激激活T淋巴細胞和抑制B淋巴細胞誘發(fā)免疫耐受，減少IgE的產生。這些實驗證實，過敏原引發(fā)變態(tài)反應在于其結構特征，當某些結構改變后，尤其某些側鏈被切斷后，其誘發(fā)變態(tài)反應的作用消失，但上述實驗并未深入研究制備活性多肽的方法及應用。
本發(fā)明所要解決的技術問題是，通過分解過敏原，消除其旦白結構上某些連接側鏈，制備具有過敏原特性，不引發(fā)強烈變態(tài)反應，而且還能抑制變態(tài)反應，誘發(fā)產生免疫耐受作用的多肽，應用于脫敏療法中，治療各類過敏癥患者。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案是，選擇多種具有旦白分解作用的酶，在一定的溫度、PH條件下，在不同種類溶液中，分解各類可能引發(fā)人體過敏癥的過敏原，使之分解為多肽，并通過層析、超濾、凝膠分離、樹脂吸附等不同方式，收集分子量＜10,000的多肽碎片，制備具有免疫抑制作用的多肽，并應用于過敏癥患者。
本發(fā)明的技術特征是，用于制備具有免疫抑制作用多肽的物質是能引發(fā)各種人類過敏癥的過敏原，這些植物過敏原包括但不限于普通豚草(Common ragweed)、大豚草(giantragweed)、黑麥(rye)、六月草(June grass)、果草(orchard grass)、甜春草(sweet vernalgrass)、紅頂(red top)、貓尾草(timothy)、黃尾根(yellow dock)、小麥(wheat)、麥殼(corn)、山艾樹(sagebrush)、燕草(blue grass)、加尼福尼亞平草(califonia annualgrass)、藜(Pigweed)、百慕大草(Bermuda grass)、俄羅斯薊(Russian thistle)、山雪松(Mountain cedar)、燕麥(oak)、黃物接木骨(box elder)、洋桐槭(sycamore)、楔樹(maple)、榆樹(elm)等，其中豚草(ragweed)是最常見和危害最大的過敏原，，其主要的致過敏成份是酸性旦白，分子量在20,000～40,000。引起人類過敏癥的動物性過敏原，是各種動物的分泌液及其他成份，包括但不限于蜂毒、蛇毒等(主要含有磷脂酸和玻璃酸酶)，食物性過敏原(主要為卵旦白和卵粘旦白)，其分子量和吸入性過敏原分子量相類似，其結構是屬于球旦白。
本發(fā)明的技術特征是，選用上述過敏原制備具有免疫抑制作用多肽時，首先需制備這些抗原的抽提物，制備這些抽提物的方法可以采用已知的、從植物或動物材料中制備抽提物的方法，用于制備這些多肽的材料，必須是這些過敏原的抽提物形式，最好是水溶性抽提物形式。
本發(fā)明的技術特征是，用來分解上述過敏原變成多肽的生物活性物質是具有分解旦白質作用的酶，這些旦白分解酶包括但不限于羥基多肽酶A(Carboxypeptidase A)、胰旦白酶(Trypsin)、胰凝乳旦白酶(Chymotrypsin)、木瓜旦白酶(Papain)、細菌旦白分解酶(Bacterial protease)、胃旦白酶(nagarase or peps in)。
本發(fā)明的技術特征是，應用上述旦白分解酶在一定溫度、PH環(huán)境下分解過敏原，根據不同的組合、不同的旦白分解酶和不同的過敏原，其要求的溫度、PH和分解時間各不相同，要求形成的多肽分子量小于10,000和大于2000，即形成多肽的分子量最好在2,000～10,000之間，分子半徑不超過15，在動物實驗測試時，這些活性多肽不會刺激致敏個體產生特異性抗體，不會引發(fā)局部皮膚試驗的炎癥表現(xiàn)，不會刺激免疫細胞釋放組織胺等炎癥介質，不會誘發(fā)特異性抗體反應，但是能夠誘發(fā)致敏個體產生免疫耐受。
本發(fā)明的技術特征是，在應用旦白分解酶分解過敏原成為多肽后，必須滅活具有生物活性作用的酶，這可以采用已知滅活酶的方法，包括高溫滅活或調整PH值滅活，同時應該采用各種方法收獲分子量＜10,000的多肽，阻止未分解的過敏原混入活性多肽制劑中，使用的方法包括但不限于采用各種層析柱層析分離法、超微濾膜過濾分離法、特殊樹脂吸附分離法等，目的是收獲分子量＜10,000的活性多肽，阻止分子量＞10,000的過敏原混雜其中。
本發(fā)明的技術特征是，采用本發(fā)明方法制備的具有免疫抑制作用的降解活性多肽，可應用于系統(tǒng)脫敏療法中代替常規(guī)應用的過敏原抽提物，不僅可以避免過敏原引發(fā)的各種嚴重變態(tài)反應及其導致的危險性，還可以增加過敏原的使用劑量，通過激活T淋巴細胞和抑制B淋巴細胞來誘發(fā)免疫耐受，從而抑制由過敏原所導致的過敏癥，應用的劑型通常采用注射劑的形式，以便于嚴格控制劑量。
本發(fā)明的有益效果是，與現(xiàn)有技術相比，制備的免疫抑制多肽能誘發(fā)免疫耐受，降低變態(tài)反應，消除過敏原可能引發(fā)的嚴重過敏反應。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明實例1制備短豚草抽提物稱取10g去脂短豚草花粉，用50ml蒸餾水溶解混勻，在4℃下用搖床孵育48小時，也可以在25℃下孵育2小時，用濾紙過濾，收集上清液，制備完整豚草花粉抽提物，加入固體硫酸銨至90％飽和度，在4℃保持2～3小時后離心沉淀，沉淀物被分離，收集上清液，溶解在3.5ml 0.1 M TRIS緩沖液和0.06M HCL(PH7.9)中，這個緩沖液過層析柱[SephadexG-25 polydextran molecular sieve cluume，高95公分，直徑4公分，已經被0.025M TRIS和0.015M HCL(PH7.9)]所均衡，層析柱第一個尖峰提取液就是純凈提取物，冷凍干燥成干粉備用。
實施例2制備免疫抑制多肽用實施例1制備的冷凍干燥提取物溶解于碳酸氫鈉緩沖液(PH8.0)中，溶解濃度為20mg/ml，胃旦白酶(nagarase)同樣用0.1M碳酸氫鈉緩沖液(PH8.0)溶解，濃度為20mg/ml，胃旦白酶溶液加到過敏原抽提物溶液中，最終比例為100份抽提物∶1份胃旦白酶，室溫下孵育24小時，加PMSF貯藏液[190mg/ml 0.1M碳酸氫鈉(PH8.0)]以仃止酶解過程。增加到克分子價比例PMSF∶胃旦白酶＝1.5∶1，形成含豐富免疫抑制多肽的旦白水解溶液。
實施例3制備免疫抑制多肽溶液取39.8ml 0.1M檸檬酸和10.2ml 0.2M磷酸二鈉，用蒸餾水稀釋至100ml，將實施例1制備的過敏原抽提物溶解在這個緩沖液中，濃度為20mg/ml，用每毫升蒸餾水中含5mg胃旦白酶的濃度，以100∶1＝抽提物∶胃旦白酶的比例配制酶解液，室溫下孵育24小時，用0.1M氫氧化鈉調PH至7.4以終止酶解過程，得到含豐富免疫抑制多肽的旦白水解溶液。
實施例4制備免疫抑制多肽干粉用實施例3制備的旦白水解液，放入美國Pall公司生產的交錯切面流體超濾系統(tǒng)，用分子量為10,000的超微濾膜，以1500ml/分速度分離過濾上述溶液，收集分離液，在冷凍干燥裝置上制備干粉。
權利要求
1.本發(fā)明涉及一種抑制變態(tài)反應多肽的制備及其應用，尤其涉及一種采用旦白分解酶分解過敏原，制備抑制變態(tài)反應多肽，作為脫敏制劑的方法及應用，其特征是，選擇多種具有旦白分解作用的酶，在一定的溫度、PH條件下，在不同種類溶液中，分解各類可能引發(fā)人體過敏癥的過敏原，使之分解為多肽，并通過層析、超濾、凝膠分離、樹脂吸附等不同方式，收集分子量＜10,000的多肽碎片，制備具有免疫抑制作用的多肽，并應用于過敏癥患者。
2.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，用于制備具有免疫抑制作用多肽的物質是能引發(fā)各種人類過敏癥的過敏原，這些植物過敏原包括但不限于普通豚草(Common ragweed)、大豚草(giant ragweed)、黑麥(rye)、六月草(June grass)、果草(orchard grass)、甜春草(sweet vernal grass)、紅頂(red top)、貓尾草(timothy)、黃尾根(yellow dock)、小麥(wheat)、麥殼(corn)、山艾樹(sagebrush)、燕草(bluegrass)、加尼福尼亞平草(califonia annual grass)、藜(Pigweed)、百慕大草(Bermudagrass)、俄羅斯薊(Russian thistle)、山雪松(Mountain cedar)、燕麥(oak)、黃物接木骨(box elder)、洋桐槭(sycamore)、楔樹(maple)、榆樹(elm)等，其中豚草(ragweed)是最常見和危害最大的過敏原，，其主要的致過敏成份是酸性旦白，分子量在20,000～40,000。引起人類過敏癥的動物性過敏原，是各種動物的分泌液及其他成份，包括但不限于蜂毒、蛇毒等(主要含有磷脂酸和玻璃酸酶)，食物性過敏原(主要為卵旦白和卵粘旦白)，其分子量和吸入性過敏原分子量相類似，其結構是屬于球旦白。
3.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，選用上述過敏原制備具有免疫抑制作用多肽時，首先需制備這些抗原的抽提物，制備這些抽提物的方法可以采用已知的、從植物或動物材料中制備抽提物的方法，用于制備這些多肽的材料，必須是這些過敏原的抽提物形式，最好是水溶性抽提物形式。
4.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，用來分解上述過敏原變成多肽的生物活性物質是具有分解旦白質作用的酶，這些旦白分解酶包括但不限于羥基多肽酶A(Carboxypeptidase A)、胰旦白酶(Trypsin)、胰凝乳旦白酶(Chymotrypsin)、木瓜旦白酶(Papain)、細菌旦白分解酶(Bacterial protease)、胃旦白酶(nagarase or pepsin)。
5.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，應用上述旦白分解酶在一定溫度、PH環(huán)境下分解過敏原，根據不同的組合、不同的旦白分解酶和不同的過敏原，其要求的溫度、PH和分解時間各不相同，要求形成的多肽分子量小于10,000和大于2000，即形成多肽的分子量最好在2,000～10,000之間，分子半徑不超過15，在動物實驗測試時，這些活性多肽不會刺激致敏個體產生特異性抗體，不會引發(fā)局部皮膚試驗的炎癥表現(xiàn)，不會刺激免疫細胞釋放組織胺等炎癥介質，不會誘發(fā)特異性抗體反應，但是能夠誘發(fā)致敏個體產生免疫耐受。
6.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，在應用旦白分解酶分解過敏原成為多肽后，必須滅活具有生物活性作用的酶，這可以采用已知滅活酶的方法，包括高溫滅活或調整PH值滅活，同時應該采用各種方法收獲分子量＜10,000的多肽，阻止未分解的過敏原混入活性多肽制劑中，使用的方法包括但不限于采用各種層析柱層析分離法、超微濾膜過濾分離法、特殊樹脂吸附分離法等，目的是收獲分子量＜10,000的活性多肽，阻止分子量＞10,000的過敏原混雜其中。
7.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，采用本發(fā)明方法制備的具有免疫抑制作用的降解活性多肽，可應用于系統(tǒng)脫敏療法中代替常規(guī)應用的過敏原抽提物，不僅可以避免過敏原引發(fā)的各種嚴重變態(tài)反應及其導致的危險性，還可以增加過敏原的使用劑量，通過激活T淋巴細胞和抑制B淋巴細胞來誘發(fā)免疫耐受，從而抑制由過敏原所導致的過敏癥，應用的劑型通常采用注射劑的形式，以便于嚴格控制劑量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制變態(tài)反應多肽的制備及其應用，尤其涉及一種采用蛋白分解酶分解過敏原，制備抑制變態(tài)反應多肽，作為脫敏制劑的方法及應用，其特征是，選擇多種具有蛋白分解作用的酶，在一定的溫度、pH條件下，在不同種類溶液中，分解各類可能引發(fā)人體過敏癥的過敏原，使之分解為多肽，并通過層析、超濾、凝膠分離、樹脂吸附等不同方式，收集分子量＜10,000的多肽碎片，制備具有免疫抑制作用的多肽，并應用于過敏癥患者。
文檔編號A61P37/08GK1557483SQ20041001585
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月15日 優(yōu)先權日2004年1月15日
發(fā)明者高春平 申請人:高春平