專利名稱：促進神經再生的中藥復方的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及促進神經再生的中藥復方。

背景技術：
在現(xiàn)代創(chuàng)傷外科中，周圍神經損傷因其致殘率高，損傷后修復及再生較為困難。盡管目前周圍神經修復技術已經有了長遠的進步，但即使新鮮，清潔的周圍神經斷裂傷，能及時運用顯微外科技術進行修復，也往往不能完全再生，造成許多神經傷患者的殘廢。因此，如何促進周圍神經損傷后的再生，恢復其功能已日益成為研究的重點。
在促進周圍神經再生因子的研究中，報告最早、唯一闡明分子結構的神經細胞調節(jié)因子是神經生長因子(NGF)。研究證實了其受體及生物效應途徑，觀察到其促進神經軸突再生，髓鞘化及神經元的保護作用。同時，研究較為集中的還有神經節(jié)苷脂，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，分別被證明有不同程度的促神經生長作用。但上述因子療效不確定，且目前以單因子的研究和應用為主，價格昂貴，難以在臨床推廣應用。
周圍神經損傷后的修復與再生是多因子，多因素參與的生理過程(Berger-A，Uierner-R；Rokde-H，shen-EL，Diagnosis and Treatment of Opertpheral Nerve Injury，the integrated therapyconcept.Unfallcaitrurg.1999102(1)59-68)。周圍神經再生所需的微環(huán)境應是一個多因素共同參與的生物網絡，被稱之為多因素共濟環(huán)。因此，補充單一因子對神經再生的作用非常有限。國外目前在臨床上研究與應用的神經生長因子及神經管養(yǎng)因子的替代物與誘生劑等進展緩慢，至今沒有一種可靠的促進神經再生的藥物。
祖國醫(yī)學的中藥復方是多因素復合，相輔相成的藥劑。探求與開發(fā)中草藥中單方與復方制劑，有可能提供更多，比例更接近神經生理需求與生長活性因子的環(huán)境，可能在神經再生的過程中的雪旺氏細胞活化、再生軸索生長、變性物質吸收及促進局部血液循環(huán)、增強免疫力等方面均起到作用。
周圍神經損傷修復的傳統(tǒng)方劑包括 1.補陽還五湯，該方原載于清代王清任的《醫(yī)林改錯》。全方由黃芪，當歸、赤芍、川芎、紅花、桃仁、地龍組成(許濟群主編.方劑學上?？茖W技術出版社，1990150)。具有補氣活血通經的功效。
研究人員對補陽還五湯作用機制和對周圍神經損傷修復與再生進行了大量的的實驗研究和臨床研究。如認為補陽還五湯有在神經損傷后促進軸漿運輸的作用(石關桐等，補陽還五湯對鉗夾大鼠坐骨神經軸漿運輸的影響.中國骨傷.1996.9(1)3-4。并能夠早期改善微循環(huán)，促進局部炎性水腫消退(石關桐等，補陽還五湯對周圍神經損傷后腓腸肌及血粘度影響的實驗研究.中國中醫(yī)骨傷科雜志.1996.4(2)4-7)。證實補陽還五湯對神經纖維再生、雪旺氏細胞活躍增殖，髓鞘形成及結構完整有明顯促進作用，對失神經肌肉萎縮有改善作用(趙翠萍、王健智等加味補陽還五湯對周圍神經再生的形態(tài)學實驗研究.中醫(yī)正骨.1993.5(2)6-8)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，該方具有強心，增加腦血流量，改善循環(huán)的作用，并能促進吞噬細胞的吞噬能力(許青媛，補陽還五湯對動物腦循環(huán)與血流變學影響的實驗研究.中成藥1990，325)，還可以促進再生神經中血管的生長，改善血供，促進神經元修復與再生(劉美玉等補陽還五湯對小鼠額葉皮質后神經元胞體形態(tài)影響的主要研究.昆明醫(yī)學院學報.1995.16(2)43)。
2、黃芪桂枝五物湯，該方系張仲景首創(chuàng)，由黃芪、白芍、桂枝、生姜、大棗組成，該方具有益氣和營，溫陽行痹的功效，是治療氣血阻滯，營衛(wèi)失和，筋脈失養(yǎng)的血痹癥主方。
目前認為神經損傷后，肢體感覺和運動功能障礙以及因神經損傷后造成的神經營養(yǎng)不良性改變多屬外傷后氣血阻滯，營衛(wèi)失和，與血痹的病機十分相似，該方可使血脈通，氣血充，營衛(wèi)和，活血強筋(聶小圃周圍神經損傷從血痹論治湖北中醫(yī)雜志.1997.19(6)37)。以該方治療周圍神經損傷，獲痊愈或功能得到明顯改善(隋秀芝中醫(yī)治愈周圍神經損傷5例.山東醫(yī)藥2001.41(16)72；張?zhí)旖? 加味黃芪桂枝五物湯治療撓神經損傷98例報告中醫(yī)正骨1994 6(2)18)。
盡管有上述促進周圍神經再生的中藥研究，但這些研究及結果總體上有以下幾個特點和缺點 1.各種復方的主要成分均為黃芪，說明比較公認的對周圍神經損傷有肯定療效的中藥是黃芪。
2.按中醫(yī)的理論，促進周圍神經再生主要原理是補血補氣、活血化淤、生肌通絡。并沒有具體描述對周圍神經損傷的治療效果。
3.研究手段尚不夠科學。雖然研究中涉及組織學、電生理學及神經功能學評價方法，但很多是間接的觀察。沒有以確有促進神經再生的物質，如NGF(神經生長因子)等作為對照。因此，較難充分證明各中藥復方的有效性。
4.以口服劑型為主，且配方中藥物種類較多；因為口服劑型是全身用藥，用量大、作用范圍廣，難免有副作用。
紅芪(Radix Hedysari)是豆科巖黃芪屬植物，與黃芪同科不同屬，主產于我國甘肅。目前已知的紅芪藥理作用主要有1)增強機體的免疫功能；2)促進生長抗衰老；3)強心降壓；4)耐缺氧；5)抗菌抗病毒；6)生肌促進傷口愈合。但尚未見到促進周圍神經再生的復方中藥制劑的臨床應用。


發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是開發(fā)一種以中藥為活性成分的促進神經再生的藥物。
本研究與周圍神經研究基礎相結合，從組織學、免疫組織化學及電生理學諸方面考察了紅芪及與其配伍的中藥復方的作用，為進一步的臨床應用及成藥開發(fā)提供科學的實驗依據，并進一步驗證神經再生的多因素共濟環(huán)假說。
本發(fā)明進行了以下研究 1.篩選出對周圍神經修復合理有效的復方； 2.研究復方制劑最優(yōu)的給藥方式或途徑，包括全身給藥，局部給藥； 3.在復方對促進周圍神經再生理論方面進行更深入的研究，闡明復方的免疫調節(jié)機制。
本發(fā)明開發(fā)的促進周圍神經修復的中藥復方由如下重量份的原料藥制成紅芪6-16份、淫羊藿4-10份、地龍2-6份。
上述原料藥的優(yōu)選配比是紅芪8-14份、淫羊藿5-9份、地龍3-5份。
最佳配比是紅芪9-13份、淫羊藿6-8份份、地龍3-4份。
上述復方中君藥不變，還可以加入其它藥物，組合成多種組方，發(fā)揮不同程度的功效。
如上述復方中可另加入當歸1-6份。
在有紅芪、淫羊藿、地龍和當歸的復方中，還可以再加川芎1-6份和/或赤芍1-6份； 或者，有紅芪、淫羊藿、地龍和當歸的復方中，再加紅花1-4份和/或桃仁1-4份。
還可以在紅芪、淫羊藿、地龍三種基本成份的基礎上，不用當歸，另加下列藥物中的一種或幾種川芎1-6份、紅花1-4份、桃仁1-4份、赤芍1-6份。
或者，僅用紅芪一味藥的提取物。
本發(fā)明藥物可以采用中藥制劑的常規(guī)方法制備成任何常規(guī)的制劑，例如將原料藥物進行水煎，或用醇或醇水混合物提取，然后濃縮水煎液或提取液，精制成為中藥提取物。將提取物與藥物可接受的各種載體、輔劑配伍，用本領域技術人員常規(guī)的制藥方法，制備成各種制劑。
本發(fā)明藥物的劑型可以是各種口服劑，如傳統(tǒng)的水煎劑、濃縮口服液、粉劑、顆粒劑、膠囊、片劑、沖劑等，也可以制成注射劑，如用于損傷局部注射或腹腔注射等。
從中醫(yī)理論講，紅芪具有益氣活血、托毒生肌之功；從西醫(yī)理論講，紅芪含紅芪多糖，能顯著促進巨噬細胞活性，提高免疫功能，明顯降低血漿過氧化脂質的含量，提升白球蛋自比值，促進RNA合成，此外，紅芪尚能改善肺的攝氧功能。本發(fā)明人對單藥紅芪的提取物進行了體外細胞培養(yǎng)實驗，證實其對雪旺氏細胞有較好的促生長作用。說明僅用紅芪一味單藥也有周圍神經損傷后的修復與再生作用。
本發(fā)明配方的另幾種藥中，當歸補血活血，赤勺清熱祛瘀，地龍通絡，川芎活血行氣，紅花、桃仁活血祛瘀，淫羊藿補腎壯陽。綜合起來，該復方制劑具有益氣、活血、通絡、補腎的功效。赤勺具有抑制血小板聚集，激活纖溶，抗血栓形成的作用；當歸的有效成分之一阿魏酸能促進吞噬細胞功能，抑制血栓形成，其另一有效成分免疫活性多糖能增強機體造血機能，顯著提高單核巨噬細胞的活性；地龍?zhí)崛∥锝笛獕海佚堖€含血栓溶解素，能直接催化纖溶蛋白酶類，抑制血栓形成；川芎亦含阿魏酸，具有改善微循環(huán)，降壓擴血管，抑制血小板聚集的功能；桃仁和紅花能擴張血管，且能抑制血栓形成；淫羊藿能擴張血管，抑制血小板聚集，促進核酸、蛋白質合成代謝，提高鈉泵活性，改善能量代謝。
在該方劑組成中，紅芪與紅花、桃仁、赤芍、當歸、川芎具有相似的功效，都有補血活血，祛瘀止痛作用。因此，本發(fā)明以紅芪為主幾味藥物的不同組合，如紅芪、淫羊藿、地龍三味藥的組方等，均可以通過擴張損傷神經外周及內部的血管、抑制損傷后的局部血管血栓形成來改善損傷神經的微循環(huán)，提高微動脈的血流量，增加損傷神經血供；同時可以增強免疫功能，提高巨噬細胞活性，加快損傷神經的變性壞死物質的清除；以利于損傷神經再生。
本發(fā)明采用坐骨神經功能指數、神經傳導速度、有髓神經纖維計數作為藥效學實驗觀察指標，神經傳導速度綜合反映神經干內的感覺傳導速度和運動傳導速度的復合動作電位，在檢測神經干外傷性損傷時，簡單快捷可行。有髓神經纖維計數能直觀地反映神經損傷后再生的有髓神經纖維數，準確地反映神經再生情況。坐骨神經功能指數是檢測大鼠坐骨神經損傷后大體功能恢復的指標，它能反映坐骨神經損傷后神經功能恢復的程度，相比前兩項指標，它更具臨床意義。本實驗采用此三項指標，從微觀到宏觀，比較全面地反映了各組大鼠坐骨神經再生情況及其功能恢復程度，且具可比性，能較準確地描述治療組和治療組、治療組和對照組結果之間的差異及其大小。實驗結果顯示，本發(fā)明藥物的各項指標均優(yōu)于空白對照組。且光鏡下觀察組織切片，用藥組大鼠在神經鉗夾后2周、4周和6周時，潰變髓鞘均明顯少于空白對照組。
本發(fā)明對以上所述的各種配方組合還進行了其它藥理實驗，包括細胞毒性試驗、結合神經再生室進行中藥作用機制的研究、誘導人及動物骨髓造血組織干細胞定向分化為神經組織細胞。優(yōu)化已經研制出的海洋生物套管，使之具有良好神經組織相容性，適當的降解吸收周期。將定向誘導分化的神經組織細胞、本發(fā)明的中藥復方的有效組份與海洋生物套管共同構建成神經再生室。通過動物實驗驗證其對周圍神經損傷的修復作用。
以上實驗除包括本發(fā)明的各種配方組、單味紅芪提取液組，還另設有陽性藥物對照NGF組，以及不用藥物的空白對照組。
藥理研究發(fā)現(xiàn) 1.局部給予本發(fā)明的中藥復方和NGF的電生理功能的恢復均明顯好于對照組，且SFI運動功能指數的恢復方面，本發(fā)明的中藥復方組顯示了優(yōu)于NGF組的效果，說明這組復方制劑促進周圍神經再生的作用。
2.本發(fā)明的中藥復方提取液全身給藥對脊髓神經元具有保護作用。
3.本發(fā)明的中藥復方具有促進雪旺氏細胞的增殖、分化的功能，而且證明分化的細胞是藥物作用后新增生的細胞。
因此，可以認為本發(fā)明的中藥復方提取液對周圍神經的修復起著肯定的作用。其作用機制可能為在周圍神經損傷后，充分發(fā)揮其擴張神經外周及內部血管、改善損傷神經的微循環(huán)、提高微動脈的血流量，并能增強免疫功能，提高巨噬細胞的活性，促進核酸、蛋白質合成代謝，加快損傷神經變性壞死物質的清除，增加對神經再生物質的供給，促進軸漿流的恢復，進而防止神經元的變性壞死及促進其早期恢復。
因為紅芪多糖是紅芪的主要成份，本發(fā)明采用改進的苯酚-濃硫酸法測定了本發(fā)明藥物提取液中紅芪多糖的含量。

具體實施例方式 實施例1 多組復方的配比 用紅芪單味藥，或以紅芪、淫羊藿、地龍作為復方中的君藥，另加入當歸、川芎、紅花、桃仁、赤芍中的一種或幾種，組方見表1。
表1 各組復方原料藥成份配比配方原料藥名稱及用量(重量份)紅芪 淫羊藿地龍當歸桃仁赤芍川芎紅花11 -------26 42-----39 23-----412 64-----516 86-----612 641----713 1044--1-811 6363---98 644-4-- 108443---3112724-66-121444-4--1131265-11-4141152--44- 實施例2 原料藥水煎提取 設備旋轉蒸發(fā)儀(含真空泵)，電熱煎藥器，冷凝管，茄形瓶等玻璃儀器。
紅芪購自原產地甘肅，其余藥材購于北京同仁堂藥店。
步驟 1.按配方稱取每種藥物，其中，將紅芪切鍘成約2cm的小段，碾壓后稱量。
2.將各配方組藥物置于圓底燒瓶內，每組藥物各煎三遍，各以藥量的10倍，8倍，6倍水加入，第一遍煎煮兩小時，后兩遍各煎一小時，每遍煎出液過濾至容器內，將煎出液通過旋蒸儀除水，然后以蒸餾水融為含生藥量2g/ml的液體，轉至無菌瓶內冷凍保存。
實施例3 原料藥的乙醇提取 將各藥材用75％乙醇提取三次，然后通過旋蒸回收醇，所得液體以多糖為主，濃縮。
實施例4 中藥復方提取細胞毒性試驗 將提純的本發(fā)明的中藥復方提取液0.22μm濾網過濾，用含15％胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)(Gibco BRL，美國)倍比稀釋，分置24孔板中。對數生長期的SP2/0細胞，調整細胞濃度為106/ml，在含倍比稀釋的紅芪培養(yǎng)液的24孔板中分別加入10ul，37℃培養(yǎng)。每天觀察細胞生長狀況。
觀察3天后結果顯示復方紅芪提取液在1∶16000，1∶32000時(即NGF有效地作用劑量)均對雪旺氏細胞有促進增生及分化的作用。說明可促進雪旺氏細胞的增生。用藥安全。
實施例5 各組藥物提取液和NGF對SD大鼠坐骨神經培養(yǎng)對比 各組配方提取液NGF按1∶16000稀釋，作為陽性參照，正常培養(yǎng)液作陰性對照。分別放入新鮮切取的SD大鼠坐骨神經。37℃培養(yǎng)。平行樣3個。分別于培養(yǎng)后第48h、72h和96h取出坐骨神經，-20℃冰箱保存。酪氨酸蛋白激酶測試系統(tǒng)美國Gibco公司產品(NO13154-018)。含底物液和不含RR-SRC的對照液。用前按100uCi/ml加[γ-32P]ATP(＞5000Ci/mmol)(北京亞輝生物醫(yī)學工程公司)、按試劑系統(tǒng)推薦配方配制抽提液。檢測前樣品制備參照試劑盒說明，每根神經加抽提液200ul，玻璃勻漿品勻漿，冰上放置20min，12000g離心2min，考馬斯亮蘭法測蛋白濃度[7]。按蛋白濃度取樣，用抽提液稀釋至0.5mg/ml。分別加入底物液或對照液10ul，冰上孵育10min后12000g離心10min(4℃)。吸取反應液上清20ul，滴于已標記的磷酸纖維素紙上，1％(v/v)乙酸與自來水各洗兩次，每次5min。加入液閃杯中檢測。樣本檢測采用Wallac 1410液體閃爍計數器(芬蘭)計數，每樣計數1min。
結果分析①每pmol磷的cpm按下公式計算10ul含32p底物(a)及對照(b)的cpm值/1200；②參入磷的肽pmol數按下公式計算樣品cpm值×2/①a-對照cpm值×2/①b；③激酶活性按下公式計算②/30。不同濃度及不同時間的樣品結果用多樣本比較的秩和檢驗進行統(tǒng)計學處理。方差分析第48h各組方劑、NGF及對照間均值的差異。
實施例6 動物體內藥效學實驗 模型及分組取SD雄性大鼠隨機分為兩組，一組以鉗夾法造成雙側坐骨神經損傷，隨機分為服藥組與對照組，將體外篩選后的療效較好的方劑已低，中，高三種劑量隨機擇鼠灌服，對照組采用生理鹽水，另一組將大鼠雙側坐骨神經切斷后斷端留取兩毫米間隙，采用我們自制的海洋生物套管套接縫合，用藥組局部給予方劑，對照組局部應用NGF+神經節(jié)苷脂。
觀察時間3d，1W，2w，3w，6w，9w。
早期觀察項目 1.SC增值形態(tài)，數量 2.再生新芽發(fā)出時間，走行 3.纖維通過套管的時間 4.髓鞘形成時間及層數(光鏡與電鏡) 5.各組神經損傷處巨噬細胞聚集數量的變化 6.細胞內亞微結構的變化(DIC)。
晚期觀察項目 1.觀察神經纖維再生數量 2.神經傳導速度和活動電位 3.測量肌張力和肌肉干濕重量。
組織學染色方法固蘭髓鞘染色和HE染；SY-38生長圓錐染色；S-100雪旺氏細胞染色；SMI-31軸索染。
實施例7 復方藥物作用機制的研究 在進行大鼠體內實驗過程中，分別在局部或全身給藥前和給藥一段時間之后，取材或取血，檢測巨噬細胞數量和功能的變化，體內MHC抗原的變化，來檢測中藥紅芪對大鼠免疫狀態(tài)的影響。
實施例8 對藥物誘導人及鼠造血組織干細胞向神經組織細胞定向分化的觀察實驗 1.實驗目的 研究本發(fā)明復方對神經干細胞生長的影響，為開展人工神經的研究作基礎。
2.方法 用不同方法分離及純化造血組織干細胞將不同方法分選的造血組織干細胞及骨髓基質細胞進行定向誘導分化在促神經生長因子(EGF、FGF-2、PDGF)作用下，將以上細胞誘導分化成神經組織細胞；利用單克隆抗體進行鑒定，所用抗體包括抗神經上皮干細胞蛋白(nestin)鑒別神經干細胞，抗神經元特異性烯醇化酶鑒別神經元細胞，抗S100鑒別雪旺氏細胞；對誘導出的神經組織細胞進行神經電位測定。
3.結果 證明該復方可有效促進神經干細胞的增殖與分化，將有利于人工神經的研究與應用。
實施例9 中藥復方的有效成份與海洋生物套管共同構建成神經再生室研究 1.人工海洋生物管橋制備和性能優(yōu)化 材料的生物性能(動物體內吸收時相及組織相容性)研究；材料與雪旺氏細胞相容性及抑制成纖維細胞生長特性的研究具體如下，無菌手術取出坐骨神經，剪碎，用培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中進行體外雪旺氏細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中墊放生物材料膜，并設置對照，分不同時期以倒置顯微鏡、光鏡切片、組織學及免疫組織化學染色、掃描電鏡等手段觀察雪旺氏細胞及成纖維細胞的形態(tài)、活性和密度，進行單位面積計數，并觀察雪旺氏細胞的內部結構及功能活性。
2.將誘導分化出的神經組織細胞懸液或干細胞和本發(fā)明的中藥復方有效成分接種在本課題研制出的海洋生物材料支架上，然后將二者一同加入轉壁式生物反應器中，使細胞與材料均勻的結合，構建神經再生室，進行大鼠坐骨神經修復試驗。
①實驗動物隨機分成兩大組，第一組進一步分為A組取大鼠左腿坐骨神經行外膜原位縫合；B組取大鼠右腿坐骨神經行套管小間隙原位套接。第二組進一步分為C組取大鼠左腿坐骨神經行外膜旋轉180度縫合；D組取大鼠右腿坐骨神經行套管小間隙遠側斷端旋轉180度套接。另取一小組大鼠作為正常神經對照。②實驗方法SD大鼠用2.5％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，由股外側肌間隙進入暴露雙側坐骨神經，在坐骨結節(jié)下方1.0cm處銳性切斷坐骨神經，然后依據各組進行相應處理。③實驗各組動物預先行骨髓穿刺，分離骨髓基質細胞及造血組織干細胞并定向培養(yǎng)成神經組織細胞，實驗組個體的神經組織細胞用于生物組織管橋制備，其余各組神經組織細胞用于體外活性實驗觀察；④分別在術后第一、二、三、四周，每次從第一組和第二組隨機取大鼠，取材后行手術顯微鏡下觀察，光鏡下有髓神經纖維計數，鋨酸染色組織學切片觀察，電生理學檢查及功能檢查(坐骨神經功能指數)。
以上實施例1～9的實驗結果顯示 1.局部給予本發(fā)明的中藥復方和NGF的電生理功能的恢復均明顯好于對照組，且SFI運動功能指數的恢復方面，本發(fā)明的中藥復方組顯示了優(yōu)于NGF組的效果，充分說明了這組復方制劑促進周圍神經再生的作用。
2.本發(fā)明的中藥復方提取液全身給藥對脊髓神經元具有保護作用。在該制劑作用機制的研究方面證實其具有促進神經再生過程中發(fā)揮重要作用的雪旺氏細胞的增殖、分化的功能。同時證明分化的細胞是藥物作用后新增生的細胞。因此，可以認為本發(fā)明的中藥復方提取液對周圍神經的修復起著肯定的作用。其作用機制可能為在周圍神經損傷后，充分發(fā)揮其擴張神經外周及內部血管、改善損傷神經的微循環(huán)、提高微動脈的血流量，并能增強免疫功能，提高巨噬細胞的活性，促進核酸、蛋白質合成代謝，加快損傷神經變性壞死物質的清除，增加對神經再生物質的供給，促進軸漿流的恢復，進而防止神經元的變性壞死及促進其早期恢復。
實施例10 本發(fā)明的中藥復方提取液對周圍神經再生促進作用觀察(一) 本實驗用鉗夾大鼠的坐骨神經的方法作成周圍神經損傷的模型，以本發(fā)明的中藥復方提取液作為治療藥物與神經生長因子及空白組作為對照，通過對坐骨神經功能指數(SFI)，神經傳導速度，再生髓鞘計數的測量來探明本發(fā)明的中藥復方提取液是否對周圍神經再生有促進作用。
1.實驗方法 實驗動物與分組實驗采用40只成年健康的SD雄性大鼠，由北京醫(yī)科大學動物實驗部提供，體重250g左右，隨機分成4組，每組10只大鼠。各組編號為N、Q、S、B。
2.實驗藥物 1)含紅芪50份、當歸10份、赤芍8份、地龍5份、川芎5份、紅花5份、桃仁5份、淫羊藿15份，濃縮為1.125g/ml。
2)含紅芪、淫羊藿、地龍，濃縮為0.774g/ml。
3)補陽還五湯成分含黃芪、當歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍，濃縮為2.6g/ml。
3.實驗方法及觀察指標 SD大鼠用2.5％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，由股外側肌間隙進入暴露雙側坐骨神經，在坐骨結節(jié)下方1.0cm處以無齒鉗鉗夾坐骨神經(3齒30秒種)造成寬2mm損傷區(qū)，此種方法經組織學證實能夠使神經外膜完整情況下，軸索全部斷裂。然后關閉切口。Q組實驗藥物1)提取液灌藥劑量為2ml/只/天，S組實驗藥物2)灌藥劑量2ml/只/天；B組實驗藥物3)補陽還五湯，灌藥劑量2ml/只/天；N組生理鹽水灌藥劑量2ml/只/天；每天一次。術中麻醉死亡3只(S組1只，Q組2只)。每組中，5只于2周時(灌藥為每天一次，共14天)，5只于4周時(每天灌藥一次，共28天)，取出雙側坐骨神經行組織學觀察，每組大鼠術前與2、4周取材前行坐骨神經功能指數測定，每組大鼠2周與4周取材前取雙側坐骨神經行神經傳導速度測定。
觀察指標坐骨神經功能指數(SFI)、神經傳導速度、組織形態(tài)學及有髓神經纖維計數。
SFI測定自制大鼠足印行走箱，高15cm，寬15cm，長50cm，通道遠端放置一長20cm，寬15cm，高15cm單側開門的鼠箱。行走箱底放置與行走箱等長、等寬的白紙。在培養(yǎng)皿內放入少許棉花，倒入適量碳素墨水使棉花浸濕，將大鼠后足在培養(yǎng)皿內蘸一下，放入行走箱的一端，其自行走向箱的另一端，在此過程中，標記紙上留下大鼠雙側后足印各4-5個。各組10只大鼠鉗夾術前于標記紙上留下后足印，鉗夾術后2、4周再于標記紙上留下后足印，均取雙側足印，前者為正常組(N)，后者為實驗組(E)。各測量3個變量，測量精確到毫米。
足印長度(print length factor，PLF)足印的最長距離，即從足跟到足尖，每次選用最長的PLF值。
足距寬度(toe spread factor，TSF)第1-5趾連線距離，每次選用最長的TSF值。
中間足趾距離(intermediary toe spread，ITF)第2-4趾連線距離，每次選用最長的TSF值。
將上述3個變量代入Bain公式便可計算出SFI. SFI＝-38.3(EPL-NPL/NPL)+109.5(ETS-NTS/NTS)+13.3(EIT-NIT/NIT)-8.8 EPL實驗組足印長度；NPL正常組足印長度；ETS實驗組足距寬度；NTS正常組足距寬度；EIT實驗組中間足趾距離；NIT正常組中間足趾距離。
SFI以±10為正常值，-100為神經完全離斷的指標。
神經傳導速度(NCV)行SFI檢測后，按原徑路暴露雙側坐骨神經，在鉗夾損傷處兩側約1.5cm處放置電極，中樞端為刺激電極，外周端為引導電極，用Oxford肌電圖儀測量神經傳導速度。公式速度＝兩電極間距離/動作電位潛時的差值 組織學檢查 取材及染色各組大鼠分別于鉗夾術2周，4周后原手術徑路暴露坐骨神經，取出鉗夾處以遠0.5cm的神經節(jié)段，置入10％福爾馬林，固定24小時后，行鋨酸染色。
鋨酸染色 1％鋨酸后固定及染色72小時 流水沖洗10分鐘后，蒸餾水浸泡10分鐘共3次 脫水酒精50％→70％→75％→80％→85％→90％→95％→100％(1次)，→100％(2次)各15分鐘→二甲苯(1次)→二甲苯(2次)各15分鐘 浸蠟60分鐘→30分鐘→30分鐘→15分鐘 包埋 切片3-5微米的神經橫斷切片 烤片38℃12-24小時 二甲苯5分鐘2次 封片 鏡檢每個標本選1-2張切片，鋨酸染色的切片在觀察各組切片髓鞘的染色及形態(tài)數量差異的基礎上，作腓總神經有髓神經纖維計數研究。
有髓神經纖維計數實驗各組及對照組共75張切片，在光學顯微鏡放大400倍(10*40)的視野下，每張切片測量腓總神經各個視區(qū)的有髓神經纖維數，取均值。行統(tǒng)計學分析。
4.實驗結果 1)坐骨神經功能指數(SFI)X+SD 組別術后2周 術后4周 空白對照組 -50.3405±20.5918-22.1106±10.3532 S組 -32.9944±20.0971-11.9985±5.4533 Q組 -27.4385±13.5411-16.8660±8.6201 B組 -58.3396±12.3949-21.1303±7.0933 其中2周時N組3只5側，Q組3只5側，B組2只3側因不同程度的足趾潰瘍及攣縮未測出。補陽還五湯組和實驗藥物2)組與對照組無顯著差異(分別為P＝0.086＞0.05；P＝0.530＞0.05)；但補陽還五湯組和實驗藥物2)組有顯著差異，且實驗藥物2)組優(yōu)于補陽還五湯組，(P＝0.01＜0.05)，實驗藥物1)組與對照組比差異有顯著性意義，且優(yōu)于對照組(P＝0.046＞0.05)，實驗藥物1)組也優(yōu)于補陽還五湯組，且差異有顯著性(P＝0.002＜0.010)。4周時N組1只1側，S組2只2側，B組1只2側因不同程度的足趾潰瘍及攣縮未測出，實驗藥物1)組和補陽還五湯組與對照組差別無意義(分別為P＝0.827＞0.05，P＝0.246＞0.05)，實驗藥物2)組與對照組差別有顯著意義，且優(yōu)于對照組(P＝0.048＜0.05)，同時優(yōu)于實驗藥物1)組，且差別有意義(P＝0.023＜0.05)，但與補陽還五湯組差別無意義。
2)神經傳導速度(NCV)(m/s)X+SD 術后時間 組別 2周 4周 N組17.0000±14.485526.2900±11.3439 S組20.5100±8.1175 40.7857±14.4462 B組22.5700±16.203739.1516±10.1192 Q組27.7540±3.9825 40.4375±13.9800 2周時Q組有四只四側，B組有2只2側，N組3只5側，未能測出，實驗藥物1)組、實驗藥物2)組、補陽還五湯組與對照組比均優(yōu)于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。4周時S組1只1側，B組1只1側，Q組1只2側未能測出，其中實驗藥物1)組、實驗藥物2)組、補陽還五湯組與對照組比均優(yōu)于對照組，且差異具有顯著意義(分別為P＝0.005＜0.01，P＝0.02＜0.05，P＝0.003＜0.05)，而三組用藥組間差別無顯著意義。
組織學觀察 光鏡下形態(tài)學觀察鋨酸染色切片，2周時，已開始出現(xiàn)再生有髓神經纖維，較細，壁薄，用藥各組再生有髓神經纖維明顯多于對照組，且部分變性髓鞘已崩解吸收，空白組仍有較多變性髓鞘，再生有髓神經纖維較少。4周時，再生有髓神經纖維明顯增多，用藥各組再生有髓神經纖維明顯多于空白組，且變性髓鞘已基本崩解消失，而空白組仍有較多變性髓鞘。
3)單位視野有髓神經纖維計數(條)X+SD 組別 術后2周 術后4周 N組11.3±1.0619.0±2.50 S組17.3±1.9929.0±3.67 B組17.6±2.8523.5±2.31 Q組17.6±3.8722.9±2.94 2周時用藥各組均明顯好于對照組，(p＝0.001＜0.01)，但各用藥組間差異無意義，4周時用藥各組均明顯好于對照組(p＜0.05)，且實驗藥物2)組明顯好于全方組及補陽還五湯組(p＝0.002＜0.01，p＝0.004＜0.01)。而全方組與補陽還五湯組間差異無意義。
實施例11本發(fā)明的中藥復方提取液對周圍神經再生促進作用觀察(二) 1.實驗動物與分組實驗采用30只成年健康的SD雄性大鼠，由北京醫(yī)科大學動物實驗部提供，體重250g左右，隨機分成3組，每組10只大鼠。
2.實驗藥物 1)實施例1中配方紅芪60份、淫羊藿20份、地龍6份，當歸15份，赤芍10份，每劑提取液濃縮為0.963g/mL。(請改寫) 2)含紅芪70份、淫羊藿25份、地龍5份(寫出配比關系)。每劑濃縮為濃縮為0.774g/mL。
3.實驗方法及觀察指標 SD大鼠用2.5％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，由股外側肌間隙進入暴露雙側坐骨神經，于雙側股后作小切口暴露坐骨神經直至遠端脛神經和腓總神經分叉上5mm處，用頭部為2mm寬的無齒鉗子鉗夾神經，鉗夾強度統(tǒng)一咬合3齒，持續(xù)時間為1分鐘。術后第二日起S組與Q組分別按每次5ml/kg每日灌藥一次，對照組每日灌服生理鹽水5ml/kg。術后3組在同一條件下分籠飼養(yǎng)6周。
全部于6周時(每天灌藥一次，共灌藥42天)取出雙側坐骨神經行組織學觀察，每組大鼠術前與6周取材前行坐骨神經功能指數測定。
觀察指標坐骨神經功能指數(SFI)、組織形態(tài)學及有髓神經纖維計數。
一般狀態(tài)包括食欲、精神狀態(tài)、攻擊性、局部感染率及死亡率。
SFI測定自制大鼠足印行走箱，高15cm，寬15cm，長50cm，通道遠端放置一長20cm，寬15cm，高15cm單側開門的鼠箱。行走箱底放置與行走箱等長、等寬的白紙。在培養(yǎng)皿內放入少許棉花，倒入適量碳素墨水使棉花浸濕，將大鼠后足在培養(yǎng)皿內蘸一下，放入行走箱的一端，其自行走向箱的另一端，在此過程中，標記紙上留下大鼠雙側后足印各4-5個。各組10只大鼠鉗夾術前于標記紙上留下后足印，鉗夾術后6周再于標記紙上留下后足印，均取雙側足印，前者為正常組(N)，后者為實驗組(E)。各測量3個變量，測量精確到毫米。
足印長度(print length factor，PLF)足印的最長距離，即從足跟到足尖，每次選用最長的PLF值。
足距寬度(toe spread factor，TSF)第1-5趾連線距離，每次選用最長的TSF值。
中間足趾距離(intermediary toe spread，ITF)第2-4趾連線距離，每次選用最長的TSF值。將上述3個變量代入Bain公式便可計算出SFI。
SFI＝-38.3(EPL-NPL/NPL)+109.5(ETS-NTS/NTS)+13.3(EIT-NIT/NIT)-8.8 EPL實驗組足印長度；NPL正常組足印長度；ETS實驗組足距寬度；NTS正常組足距寬度；EIT實驗組中間足趾距離；NIT正常組中間足趾距離。
SFI以±10為正常值，-100為神經完全離斷的指標。
組織學檢查 取材及染色各組大鼠分別于鉗夾術6周后原手術徑路暴露坐骨神經，取出鉗夾處以遠0.5cm的神經節(jié)段，置入10％福爾馬林，固定24小時后，行鋨酸染色。
鋨酸染色 1％鋨酸后固定及染色72小時 流水沖洗10分鐘后，蒸餾水浸泡10分鐘共3次 脫水酒精50％→70％→75％→80％→85％→90％→95％→100％(1次)，→100％(2次)各15分鐘→二甲苯(1次)→二甲苯(2次)各15分鐘 浸蠟60分鐘→30分鐘→30分鐘→15分鐘 包埋 切片3-5微米的神經橫斷切片 烤片38℃12-24小時 二甲苯5分鐘2次 封片 鏡檢每個標本選1-2張切片，鋨酸染色的切片在觀察各組切片髓鞘的染色及形態(tài)數量差異的基礎上，作腓總神經有髓神經纖維計數研究。
有髓神經纖維計數實驗各組及對照組共75張切片，在光學顯微鏡放大400倍(10*40)的視野下，如圖所示，每張切片測量腓總神經各個視區(qū)的有髓神經纖維數，取均值。行統(tǒng)計學分析。
4.實驗結果 1)一般狀態(tài)除術中麻醉死亡6只(Q組3只，S組2只，N組1只)外，術后各組大鼠均無明顯異常行為。術后24 h起睡眠及食欲無明顯變化，無1例出現(xiàn)傷口感染或死亡。給藥組大鼠的雙側坐骨神經表面普遍比對照組光滑，容易從組織中分離和顯露，外膜血管豐富。
2)坐骨神經功能指數(SFI)+SD組別術后時間(6周)N-25.1729±15.3830Q-30.2700±10.8001S-19.1105±9.1048 結果顯示實驗藥物1)組和實驗藥物2)組與對照組無顯著差異(分別為P＝0.262，＞0.05；P＝0.479＞0.05)。而實驗藥物1)組與實驗藥物2)組比差異有顯著性意義，且實驗藥物2)組優(yōu)于實驗藥物1)組(P＝0.03，＜0.05)。
3)組織學觀察 光鏡下形態(tài)學觀察 鋨酸染色切片，6周時，再生有髓神經纖維明顯增多，中藥組及NGF組再生有髓神經纖維多于空白組，中藥組變性髓鞘已基本崩解消失，空白組仍有較多變性髓鞘。提示，本發(fā)明的中藥復方提取液能夠促進有髓神經纖維的再生和變性髓鞘的分解吸收。
4)單位視野有髓神經纖維計數(條)+SD組別術后時間(6周)N75.77±14.36Q112.33±17.99S109.26±15.73 本發(fā)明的中藥復方組平均單位視野有髓神經纖維數為112.33±17.99優(yōu)于對照組75.77±14.36且統(tǒng)計學有明顯差異(P＝0.000，＜0.01)。實驗藥物2)組109.26±15.73明顯優(yōu)于對照組(P＝000，＜0.01)，而實驗藥物1)組與實驗藥物2)組間無顯著性差異。
實施例10～11結果 (1)坐骨神經功能指數(SFI)2周時，補陽還五湯組和實驗藥物2)組與對照組無顯著差異，但補陽還五湯組和實驗藥物2)組有顯著差異，且實驗藥物2)組優(yōu)于補陽還五湯組，實驗藥物1)組與對照組比差異有顯著性意義，且優(yōu)于對照組，實驗藥物1)組也優(yōu)于補陽還五湯組，且差異有顯著性。4周時實驗藥物1)組和補陽還五湯組與對照組差別無意義，實驗藥物2)組與對照組差別有顯著意義，且優(yōu)于對照組，同時優(yōu)于實驗藥物1)組，且差別有意義，但與補陽還五湯組差別無意義。6周時實驗藥物1)組和實驗藥物2)組與對照組無顯著差異；而實驗藥物1)組與實驗藥物2)組比差異有顯著性意義，且實驗藥物2)組優(yōu)于實驗藥物1)組。
(2)神經傳導速度(NCV)2周時實驗藥物1)組、實驗藥物2)組、補陽還五湯組與對照組比均優(yōu)于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。4周時其中實驗藥物1)組、實驗藥物2)組、補陽還五湯組與對照組比均優(yōu)于對照組，且差異具有顯著意義，而三組用藥組間差別無顯著意義。
(3)組織學觀察2周時用藥各組均明顯好于對照組，但各用藥組間差異無意義，4周時用藥各組均明顯好于對照組，且實驗藥物2)組明顯好于全方組及補陽還五湯組，而全方組與補陽還五湯組間差異無意義。6周時本發(fā)明的中藥復方組優(yōu)于對照組且統(tǒng)計學有明顯差異。實驗藥物2)組明顯優(yōu)于對照組而實驗藥物1)組與實驗藥物2)組間無顯著性差異。
實施例12本發(fā)明的中藥復方提取液中紅芪多糖含量測定 在含紅芪70份、淫羊藿25份、地龍5份的提取液配方可以有效促進大鼠損傷坐骨神經再生的基礎上，對該方中主要物質成分紅芪多糖采用苯酚-濃硫酸法作含量測定。
材料和方法 1.1材料苯酚(分析純)，重蒸后配成50g/l水溶液；濃硫酸(分析純，d＝1.84g/cm-3)；吸光度用721型分光光度計測定，使用光徑10mm石英比色皿，用Optifix定量加液器吸加50g/l苯酚及濃硫酸。葡萄糖純品。已提純本發(fā)明的中藥復方減方提取液(濃度86mg/ml) 1.2方法標準溶液的配制精確稱取已經干燥的葡萄糖純品10mg，溶于100ml水中，然后分別稀釋為濃度為2，4，8，10，20ug/ml，本發(fā)明的中藥復方減方提取液稀釋為4.3ug/ml.。先取已稀釋各標準葡萄糖溶液各0.4ml，置于10ml試管中，加入50g/l苯酚溶液0.8ml混合后，迅速加入4ml濃硫酸，混合均勻后，室溫放置30min，在波長490nm測定吸光度，空白對照以蒸餾水代替糖溶液。待測出標準曲線后，取已稀釋的本發(fā)明的中藥復方減方提取液0.4ml，置于10ml試管中，加入50g/l苯酚溶液0.8ml混合后，迅速加入4ml濃硫酸，混合均勻后，室溫放置30min，在波長490nm測定吸光度，將此吸光度代入標準曲線方程求出含有的紅芪多糖量，從而得出方劑中紅芪多糖含量。
2.結果與討論 2.1由下表所示的樣品吸光值得到標準曲線，求得直線方程為Y＝14.73X-0.0343Chi-Square0.00091 其中Y為所含糖量，X為490nm處吸光度 稀釋的本發(fā)明的中藥復方減方提取液測得吸光度為0.076，代入方程求得所含糖量為1.0908ug，稀釋液含方劑1.72ug，從而求得方劑中所含紅芪多糖占總量的63.41％。
樣本編號所含標準葡萄糖量(ug)490nm吸光值10.80.05121.60.11033.20.22544.00.28058.00.541 在減方方劑中，因為方中淫羊藿與地龍幾乎不含糖類，所以測得的糖可以認為即是紅芪多糖。測得結果為方劑總量的63.41％ 實施例13單藥紅芪的藥效學實驗 1.實驗目的觀察紅芪單藥對促進周圍神經損傷后的再生作用 2.實驗方法 紅芪單藥提取液與NGF按1∶16000稀釋，作為陽性參照，正常培養(yǎng)液作陰性對照。分別放入新鮮切取的SD大鼠坐骨神經。37℃培養(yǎng)。平行樣3個。分別于培養(yǎng)后第48h、72h和96h取出坐骨神經，-20℃冰箱保存。酪氨酸蛋白激酶測試系統(tǒng)美國Gibco公司產品(NO13154-018)。含底物液和不含RR-SRC的對照液。用前按100uCi/ml加[γ-32P]ATP(＞5000Ci/mmol)(北京亞輝生物醫(yī)學工程公司)、按試劑系統(tǒng)推薦配方配制抽提液。檢測前樣品制備參照試劑盒說明，每根神經加抽提液200ul，玻璃勻漿品勻漿，冰上放置20min，12000g離心2min，考馬斯亮蘭法測蛋白濃度[7]。按蛋白濃度取樣，用抽提液稀釋至0.5mg/ml。分別加入底物液或對照液10ul，冰上孵育10min后12000g離心10min(4℃)。吸取反應液上清20ul，滴于已標記的磷酸纖維素紙上，1％(v/v)乙酸與自來水各洗兩次，每次5min。加入液閃杯中檢測。樣本檢測采用Wallac 1410液體閃爍計數器(芬蘭)計數，每樣計數1min。
3.結果分析 ①每pmol磷的cpm按下公式計算10ul含32P底物(a)及對照(b)的cpm值/1200；②參入磷的肽pmol數按下公式計算樣品cpm值×2/①a-對照cpm值×2/①b；③激酶活性按下公式計算②/30。不同濃度及不同時間的樣品結果用多樣本比較的秩和檢驗進行統(tǒng)計學處理。方差分析第48h紅芪單藥、NGF及對照間均值的差異。
4.結論紅芪單藥有促進雪旺氏細胞增殖及分化的作用，效果與NGF相似。說明單味紅芪也有促進周圍神經損傷后的再生的作用。
實施例14注射劑的制備 制備注射劑將方劑的水煎劑先用旋蒸儀提純，然后在真空機中將含有的水分提出，再通過水浴鍋將其干燥為粉狀，使用時按所需用量精確稱量，用注射用水稀釋后對大鼠局部注射應用。
實施例15口服劑的制備 將方劑的水煎劑先用旋蒸儀提純，濃縮為所需用量，對大鼠進行灌服實驗。
權利要求
1.一種促進周圍神經修復的藥物，其特征在于由如下重量份的原料藥制成紅芪6-16份、淫羊藿4-10份、地龍2-6份。
2.權利要求1所述的藥物，所述原料藥的重量份是紅芪8-14份、淫羊藿5-9份、地龍3-5份。
3.權利要求1所述的藥物，所述原料藥的重量份是紅芪9-13份、淫羊藿6-8份份、地龍3-4份。
4.權利要求1所述的藥物，所述原料藥還有當歸1-6份。
5.權利要求4所述的藥物，其中原料藥還有川芎1-6份和/或赤芍1-6份。
6.權利要求4所述的藥物，其中原料藥還有紅花1-4份和/或桃仁1-4份。
7.權利要求1所述的藥物，所述原料藥還包括下列藥物中的一種或幾種川芎1-6份、紅花1-4份、桃仁1-4份、赤芍1-6份。
8.一種促進周圍神經修復的藥物，其特征在于藥物的活性成分由紅芪一種原料制成。
9.權利要求1-8所述的藥物，劑型是口服劑。
10.權利要求1-8所述的藥物，劑型是注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進神經再生的中藥復方。該復方用紅芪、淫羊藿、地龍等中藥為主要原料制成。藥理研究證實，本發(fā)明的中藥復方各個組方的局部與全身給藥均可促進周圍神經再生；全身給藥對脊髓神經元具有保護作用。本發(fā)明的中藥復方還具有促進雪旺氏細胞的增殖、分化的功能。
文檔編號A61P25/00GK1615935SQ20041000961
公開日2005年5月18日 申請日期2004年9月28日 優(yōu)先權日2004年9月28日
發(fā)明者姜保國, 張殿英, 魏光如, 黨育, 徐海林, 張培訓, 趙富強, 張宏波, 傅中國, 任俠飛 申請人:北京大學人民醫(yī)院