專(zhuān)利名稱(chēng)：一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，更具體地說(shuō)是一種黃酮單體在制備抗小核糖核酸病毒如柯薩奇病毒的藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鑒于近年來(lái)病毒性疾病如SARS、禽流感、瘋牛病等的全球性流行，開(kāi)發(fā)抗病毒藥物成為了人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，國(guó)際上抗病毒藥物研究的主要策略包括阻斷病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合、抑制逆轉(zhuǎn)錄酶、抑制病毒蛋白翻譯、抑制蛋白質(zhì)修飾或病毒顆粒的出芽釋出、以及切斷病毒基因組等。通過(guò)對(duì)已知療效化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造、計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)先導(dǎo)分子、反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)改造和組合化學(xué)合成、免疫功能調(diào)節(jié)劑的研制、以及從植物和微生物中篩選天然抗病毒先導(dǎo)化合物等，研究開(kāi)發(fā)新的抗病毒藥物。
在眾多的病毒性疾病中，病毒性心肌炎是心血管系統(tǒng)的常見(jiàn)病與多發(fā)病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。目前，無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是在發(fā)展中國(guó)家，心肌炎的發(fā)病率較10年前均有顯著增多，其主要原因是感染性心肌炎中病毒性心肌炎的發(fā)病率增高所致。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)全球病毒監(jiān)測(cè)研究報(bào)導(dǎo)顯示在新生兒、兒童突發(fā)死亡病例中，20％為病毒性心肌炎所致；病毒性心肌炎在新生兒、兒童中的發(fā)病率為360/10萬(wàn)，死亡率為8％；病毒性心肌炎的發(fā)病率為同期心血管疾病住院病人的8.69～20.8％；病毒感染侵入心肌以后，會(huì)引起局灶性或彌漫性心肌間質(zhì)性滲出和心肌纖維變性、壞死。重癥彌漫性心肌炎可出現(xiàn)嚴(yán)重心律不齊、心力衰竭、心源性休克、甚至猝死；也可遷延不愈，導(dǎo)致心臟肥大，并逐漸發(fā)展成擴(kuò)張型心肌病。
國(guó)內(nèi)外針對(duì)病毒性心肌炎的藥物研究主要集中在下列幾個(gè)方面柯薩奇病毒減毒活疫苗的開(kāi)發(fā)、免疫調(diào)節(jié)劑的研制以及抗病毒藥物的探索，而且針對(duì)病毒性心肌炎的基因治療方興未艾；但是在抗柯薩奇病毒藥物的研發(fā)方面，一直沒(méi)有重大進(jìn)展，這就導(dǎo)致所有的治療措施均難以將病毒性心肌炎控制在潛伏期和急性期。鑒于以上情況，進(jìn)行針對(duì)病毒性心肌炎的新藥開(kāi)發(fā)研究對(duì)臨床治療意義重大。
準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆(Eremosparton.songoricum(Litv)Vass.)產(chǎn)于新疆準(zhǔn)噶爾盆地，生于流動(dòng)或半固定的沙地，根莖延沙地淺層伸長(zhǎng)，達(dá)20米；在根莖上萌發(fā)新株，為優(yōu)良先鋒固沙植物?？乱晾?Chrysoeriol)，為準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆中提取得到的一種黃酮類(lèi)單體化合物，該化合物目前在國(guó)內(nèi)外的研究方向主要集中在植物化學(xué)方面，在醫(yī)學(xué)方面，還沒(méi)有相關(guān)的論述。但是因?yàn)槠鋵儆邳S酮類(lèi)化合物，所以在一些文獻(xiàn)中，認(rèn)為其可能參與如下生理調(diào)節(jié)作用抗氧化、抗自由基、抗菌、降血壓等作用，但是，還沒(méi)有文獻(xiàn)提到其與抗病毒藥物之間存在任何關(guān)系。在非醫(yī)藥用途方面，目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，該黃酮單體具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式 所述病毒為小核糖核酸病毒科病毒，包括柯薩奇病毒、腸道病毒、鼻病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和甲型肝炎病毒。
所述柯薩奇病毒為CVB病毒3型Nancy株。
本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)多種天然植物單體篩選發(fā)現(xiàn)，上述單體對(duì)病毒引起的凋亡以及病毒翻譯過(guò)程中的病毒蛋白酶具有抑制作用。因?yàn)椴《驹谕瓿蓮?fù)制和翻譯過(guò)程之后，必然要進(jìn)行包裝，病毒才能夠成為完整的病毒顆粒，而病毒翻譯產(chǎn)生的蛋白酶在小核糖核酸病毒科(包括柯薩奇病毒、腸道病毒、鼻病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒)中具有極高的同源性，并與真核細(xì)胞的蛋白酶差異明顯。所以可以斷定該單體對(duì)小核糖核酸病毒科在侵入細(xì)胞以后，均具有抑制病毒成熟的作用，從而發(fā)揮抑制病毒性疾病進(jìn)展的作用。
本實(shí)驗(yàn)室目前成功建立了柯薩奇病毒感染的細(xì)胞及動(dòng)物模型，通過(guò)一系列細(xì)胞學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確知，上述單體成分能夠明顯抑制柯薩奇病毒造成的病變。
本發(fā)明證實(shí)，該單體可用于制備抗病毒尤其是小核糖核酸類(lèi)病毒的藥物，即以該單體作為藥物的有效成分，單獨(dú)制成原料藥、或者輔以藥劑學(xué)可接受的輔料或載體制成可施用于生物體的制劑。其制劑可以是消化道給藥制劑如片劑、丸劑、膠囊等；也可以是注射劑，如注射液、粉針等；還可以是透皮吸收給藥制劑、粘膜給藥制劑和呼吸道給藥制劑，如鼻噴劑等。這里的生物體并不局限于人，也包括禽類(lèi)和其他哺乳類(lèi)動(dòng)物等凡是能夠被病毒尤其是小核糖核酸類(lèi)病毒感染的生物。由于對(duì)藥物劑型的選擇屬于本領(lǐng)域公知技術(shù)，因此任何依照本發(fā)明的指導(dǎo)對(duì)該單體的該藥物用途所進(jìn)行的劑型選擇都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種抗病毒單體化合物，經(jīng)過(guò)一系列的抗病毒實(shí)驗(yàn)，證明這種單體對(duì)病毒引起的凋亡以及病毒翻譯過(guò)程中的病毒蛋白酶具有抑制作用，提示該單體為一廣譜抗病毒藥物；該單體對(duì)柯薩奇病毒為代表的小核糖核酸病毒具有明顯的抗病毒作用，為人們治愈病毒性心肌炎提供了新的選擇方案。


圖1為SGL-1的藥物毒性測(cè)定結(jié)果圖。
圖2為CPE抑制實(shí)驗(yàn)的MTT染色結(jié)果圖。
圖3為CPE抑制實(shí)驗(yàn)的倒置顯微鏡下逐時(shí)觀察結(jié)果圖。
圖4為病毒繁殖抑制試驗(yàn)的結(jié)果圖。
圖5為光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)生深染的凋亡細(xì)胞圖。
圖6為流式細(xì)胞觀察SGL-1對(duì)凋亡的抑制作用圖。
圖7為感染CVB3的Hela細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC/PI染色后可觀察到早期凋亡及晚期凋亡現(xiàn)象圖。
圖8為RT-PCR法驗(yàn)證SGL-1下調(diào)柯薩奇病毒在心肌細(xì)胞的主要表面受體CAR表達(dá)的作用圖。
圖9為用Western blot方法檢測(cè)心肌細(xì)胞dystrophin的斷裂及合成情況結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、藥物單體的獲得1、儀器和材料熔點(diǎn)用Boetius顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定；IR利用KBr壓片法在IFS-120H型紅外光譜儀(德國(guó))上測(cè)試；FABMS在Autospec 3000質(zhì)譜儀上測(cè)試；核磁共振用INOVA-400型(Varian公司)，TMS為內(nèi)標(biāo)；柱層析硅膠(200-300目)，薄層層析硅膠H均為青島海洋化工廠生產(chǎn)。
準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆(Eremosparton.songoricum(Litv)Vass.)于2002年9月采自新疆維吾爾自治區(qū)阜新縣，由中國(guó)科學(xué)院新疆沙漠土壤研究所張立運(yùn)研究員鑒定為準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆(Eremosparton.Songoricum(Litv)Vass.)。
2、提取和分離準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆(Eremosparton.songoricum(Litv)Vass.)全草干粉7.0kg，工業(yè)乙醇冷浸三次，每次7天。冷浸液經(jīng)減壓濃縮得浸膏555g，將浸膏分散于適量水中，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，得乙酸乙酯部分120g，拌以160-200目硅膠，自然涼干，研細(xì)。用200-300目(1500g)硅膠濕法上柱，用氯仿-丙酮(100∶1～1∶1)為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫。TLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)，相同組分合并，得柯伊利素500mg。
3、結(jié)構(gòu)鑒定柯伊利素C16H12O6；黃色粉末(甲醇)；m.p.320℃-322℃；FAB-MS m/z301(M+)；IRvmar cm-13420，3164，2996，2972，2843，1624，1572，1509，1471，1380，1314，1283，1243，1132，1099，1024，952，854；1H-NMR(DMSO-d6)δ12.98(1H，s，5-OH)，10.8(1H，s，7-OH)，9.98(1H，s，4′-OH)，7.56(2H，d，J＝8.8Hz，H-2′，H-6′)，6.92(2H，m，H-5′，H-3)，6.51(1H，d，J＝2.4Hz，H-8)，6.36(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，3.89(3H，s，1×CH3)；13C-NMR(DMSO-d6)δ164.13(C-2)，103.21(C-3)，181.82(C-4)，161.44(C-5)，98.84(C-6)，163.67(C-7)，94.07(C-8)，157.33(C-9)，103.71(C-10)，120.36(C-1′)，110.16(C-2′)，150.772(C-3′)，148.03(C-4′)，115.74(C-5′)，121.50(C-6′)，56.03(1×OMe)。并與文獻(xiàn)對(duì)照，化合物鑒定為5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮(柯伊利素，Chrysoeriol)。
在以下實(shí)施例中以該化合物單體在本實(shí)驗(yàn)室的編號(hào)SGL-1代替其名稱(chēng)，純度＞99.99％。
實(shí)施例2、藥物毒性測(cè)定(一)、SGL-1的藥物毒性測(cè)定結(jié)果1、實(shí)驗(yàn)方法在96孔培養(yǎng)板中接種心肌細(xì)胞；用DMEM倍比稀釋藥物，形成6-10個(gè)梯度；每孔加入DMEM倍比稀釋藥物0.1mL，每個(gè)稀釋度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；對(duì)照組細(xì)胞包括病毒感染細(xì)胞對(duì)照和空白處理對(duì)照(如有溶媒，則需僅加入溶媒作為對(duì)照)；置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)；結(jié)合MTT染色計(jì)算半數(shù)中毒劑量(TD50)，統(tǒng)計(jì)方法采用Bliss統(tǒng)計(jì)軟件分析。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)以后，應(yīng)用Bliss統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)算得出SGL-1的藥物毒性結(jié)果如下TD50＝1.35mg/ml。
(二)、利巴韋林的藥物毒性測(cè)定結(jié)果實(shí)驗(yàn)方法同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為T(mén)D50＝2.34μg/ml。
通過(guò)對(duì)比SGL-1與利巴韋林的藥物毒性，發(fā)現(xiàn)SGL-1的半數(shù)毒性劑量是利巴韋林的577倍，說(shuō)明SGL-1的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于利巴韋林。
實(shí)施例3、細(xì)胞病變(CPE)抑制實(shí)驗(yàn)(一)SGL-1的CPE抑制實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)方法將2×105/ml濃度的Vero細(xì)胞接種于96孔板，0.1ml/孔；培養(yǎng)1-2天形成單層細(xì)胞后，感染柯薩奇病毒(該病毒由武漢醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)院病毒室提供，為CVB病毒3型Nancy株)10-100TCID50；將待測(cè)藥物自最大無(wú)毒濃度開(kāi)始稀釋8個(gè)稀釋度；感染后不同時(shí)間，將藥物加入細(xì)胞；每天于顯微鏡下觀察CPE進(jìn)展情況，并記錄結(jié)果；當(dāng)病毒對(duì)照組的細(xì)胞接近于全部破壞時(shí)，停止細(xì)胞培養(yǎng)；此實(shí)驗(yàn)分組和在96孔板中的安排如表。
表2在96孔板進(jìn)行的CPE抑制實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2、結(jié)果分析及統(tǒng)計(jì)處理連續(xù)觀察96孔板中各組細(xì)胞CPE出現(xiàn)情況，在病變最嚴(yán)重的實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战MCPE不再進(jìn)展時(shí)，開(kāi)始做MTT染色；用無(wú)血清培養(yǎng)基將MTT稀釋為10％濃度；吸去原培養(yǎng)基，并在每孔中加入100ul 10％MTT染液；37℃孵育4小時(shí)；吸去MTT染液，用PBS洗1-2遍，然后加入DMSO以終止顯色反應(yīng)；酶標(biāo)儀測(cè)定OD值；數(shù)據(jù)分析采用Reed-Muench法。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)、按Reed-Muench法計(jì)算藥物SGL-1對(duì)CVB3致CPE產(chǎn)生50％抑制的濃度，以下為倒置顯微鏡下檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)字(表3)表3倒置顯微鏡下檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)CPE發(fā)生情況

根據(jù)計(jì)算公式(僅高于50％的感染百分率-50)/(僅高于50％的感染百分率-僅低于50％的感染百分率)＝(71.4-50)/(71.4-12.5)＝0.66；將0.66加到僅高于50％感染率的藥物濃度稀釋指數(shù)(本實(shí)驗(yàn)中為1ug/ml)；最后，得出該病毒的IC50為1.66μg/ml。
(2)MTT染色結(jié)果，見(jiàn)圖2。
(3)倒置顯微鏡下逐時(shí)觀察結(jié)果，見(jiàn)圖3。
(二)、利巴韋林CPE抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)方法同上，IC50為0.24μg/ml。
(三)、SGL-1與利巴韋林藥物治療指數(shù)(TI)的比較1、按TI＝TD50/IC50進(jìn)行計(jì)算得出，SGL-1的TI值為1350/1.66＝813.252、同樣，利巴韋林的TI值為2.34/0.24＝9.75通過(guò)以上比較，能夠明確SGL-1半數(shù)有效量要低于利巴韋林，但是SGL-1的安全性要明顯高于利巴韋林。
實(shí)施例4、病毒繁殖抑制實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)的前提是CPE抑制實(shí)驗(yàn)顯示藥物具有抑制CVB3增殖的作用；收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞及培養(yǎng)液；經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融，使細(xì)胞充分裂解，釋放出胞漿內(nèi)的病毒顆粒；離心后取上清，作系列10倍稀釋?zhuān)苍O(shè)8個(gè)梯度；將稀釋后的病毒液接種于已培養(yǎng)好Vero細(xì)胞96孔板上；對(duì)比病毒感染組與病毒+藥物組TCID50的差別。
2、結(jié)果分析以Reed-Muench法計(jì)算病毒感染組培養(yǎng)液上清接種后TCID50；以Reed-Muench法計(jì)算病毒+藥物組組培養(yǎng)液上清接種后TCID50；以加藥組比病毒對(duì)照組TCID50降低1個(gè)對(duì)數(shù)以上判定為有效。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Reed-Muench法計(jì)算各組TCID50值，結(jié)果如圖4所示，可以看出兩組的TCID50下降值均大于1。說(shuō)明SGL-1的病毒繁殖抑制作用明顯。
實(shí)施例5、在體動(dòng)物模型死亡率比較1、實(shí)驗(yàn)分組及劑量確定(1)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用Balb/C四周齡雄性小鼠，動(dòng)物為清潔級(jí)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所。
(2)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)化分組原則進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)本發(fā)明藥物實(shí)驗(yàn)組，另外設(shè)三個(gè)對(duì)照組，分別是空白對(duì)照組、假處理對(duì)照組和利巴韋林對(duì)照組，其中假處理對(duì)照組為腹腔注射同等量的病毒液，口服本發(fā)明藥物溶酶。每組動(dòng)物數(shù)安排依照預(yù)試驗(yàn)后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果而定(按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每組動(dòng)物數(shù)確定為18只)。
(2)、劑量確定本發(fā)明藥物高劑量組給藥量為1250mg/kg；中劑量組按照380mg/kg給藥。低劑量組為126mg/kg，利巴韋林對(duì)照組為75mg/kg。假處理對(duì)照組腹腔注射同等濃度的病毒懸液，灌胃生理鹽水。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
表4不同分組動(dòng)物死亡率統(tǒng)計(jì)表

實(shí)施例6、不同時(shí)間各個(gè)分組取血后分離血清檢測(cè)指標(biāo)1、病毒在Vero細(xì)胞水平的TCID50值(1)、實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定TCID50值的方法與病毒繁殖抑制實(shí)驗(yàn)相同。
(2)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組TCID50值的測(cè)定結(jié)果如表5表5各組TCID50值的測(cè)定結(jié)果

在這項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)中，如果TCID50值能夠在使用藥物以后下降1個(gè)對(duì)數(shù)值以上，即可以認(rèn)為有效。從上表的結(jié)果能夠判定SGL-1具有抗病毒的作用。
2、血清中心肌酶含量測(cè)定(1)試驗(yàn)材料儀器為SABA18型生化分析儀，試劑購(gòu)買(mǎi)自首都醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)科技中心；
(2)試驗(yàn)方法按照生化分析儀及試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)。
(3)試驗(yàn)結(jié)果心肌酶CK-MB和LDH含量在3～7天均有增加，但是增幅不同，具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下表(表6和表7)表6CK-MB統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

表7LDH統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)CK-MB和LDH在血清中的含量隨著感染天數(shù)的增加，平均值也逐漸上升，但是其增長(zhǎng)幅度均小于假處理組，而且3--7天之間均存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)施例7、SGL-1對(duì)病毒導(dǎo)致的凋亡存在抑制作用(一)、原位末端標(biāo)記法(Tunnel)檢測(cè)凋亡的發(fā)生情況1、實(shí)驗(yàn)方法取出六孔板于鏡下觀察，各組間形態(tài)出現(xiàn)明顯差異；PBS洗三次，以去除死細(xì)胞及培養(yǎng)基血清；以冰冷新配制的4％多聚甲醛固定細(xì)胞30min；PBS洗三次；(可以用70、75、80、90、95、100％梯度酒精脫水，存于-20℃)；加入0.3％H2O甲醇溶液，室溫放置30min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS洗三次，加入0.1％TRITON x-100，冰浴2min；PBS洗三次，加入40ul TUNNEL反應(yīng)混合液于每個(gè)蓋玻片上；37℃孵浴60min；加入50ul試劑3(轉(zhuǎn)化型POD)，37℃孵浴30min；PBS洗三次加入50-100ul DAB顯影液，室溫放置＜30min；PBS洗三次，空干，封片。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)生深染的凋亡細(xì)胞A(4×10)、B(10×10)；CSGL-1干預(yù)以后，凋亡發(fā)生情況明顯減少；D正常細(xì)胞對(duì)照。圖中箭頭所示為明顯的凋亡細(xì)胞。
從Tunnel結(jié)果，能夠明顯觀察到SGL-1對(duì)CVB引起凋亡有明顯抑制作用。
(二)、流式細(xì)胞觀察SGL-1對(duì)凋亡的抑制作用(圖6，表8)如圖6所示，A100TCID50病毒感染細(xì)胞對(duì)照；B100 TCID50病毒+SGL-1；CSGL-1藥物對(duì)照；D正常細(xì)胞對(duì)照。
表8不同濃度病毒對(duì)細(xì)胞周期的影響及凋亡發(fā)生的比率

(三)、通過(guò)Annexin V-FITC/PI染色觀察SGL-1對(duì)凋亡的抑制作用1、實(shí)驗(yàn)方法將Hela細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整蓋玻片上的細(xì)胞數(shù)為5×105。24小時(shí)后分組為病毒感染對(duì)照組和藥物+病毒實(shí)驗(yàn)組；12-18小時(shí)后，棄上清，用冷PBS洗三次；分別加Binding Buffer 200μl；加10μl異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的Annexin-V(Annexin-V-FITC)，輕輕混勻后，避光室溫反應(yīng)15分鐘；再加入BindingBuffer 300ul，在1小時(shí)內(nèi)應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測(cè)；檢測(cè)前5分鐘加入2.5μlPI染料；檢測(cè)時(shí)將蓋玻片取出，細(xì)胞向下置于載玻片上，檢測(cè)時(shí)完成一個(gè)樣本再制作下一個(gè)，以免涂片變干燥影響觀察。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，感染CVB3的Hela細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC/PI染色后可觀察到早期凋亡及晚期凋亡現(xiàn)象。圖中細(xì)胞膜熒光綠染以及細(xì)胞核熒光紅染的細(xì)胞為發(fā)生凋亡的細(xì)胞，正常細(xì)胞沒(méi)有任何熒光。圖F即為受SGL-1保護(hù)而沒(méi)有發(fā)生凋亡的細(xì)胞。
實(shí)施例8、SGL-1對(duì)心肌細(xì)胞表面受體表達(dá)的影響1、實(shí)驗(yàn)方法(1)、用TRIZOL提取細(xì)胞總RNA傾去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中上清，并盡量吸除干凈；加入TRIZOL1.5ml，吹吸使細(xì)胞溶于TRIZOL中；取0.5ml上述液體于1.5ml離心管中；加0.125ml氯仿，震蕩混勻15min，室溫放置3min；離心4℃，12000rpm，15min；取上清，并轉(zhuǎn)移入另一只離心管；加入0.25ml異丙醇，室溫放置10min；離心4℃，12000rpm，5min；去上清，加入1ml75％乙醇；離心4℃，7500rpm，5min。棄上清，室溫干燥10min。加DEPC水溶解RNA。電泳鑒定RNA條帶。
(2)、 表9、反應(yīng)體系

(3) 表10、循環(huán)參數(shù)

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。
柯薩奇病毒在心肌細(xì)胞的表面受體主要是CAR，這種受體在正常情況下表達(dá)水平非常低。當(dāng)CVB3病毒感染心肌細(xì)胞以后，CAR的表達(dá)水平明顯上升，促進(jìn)了病毒與心肌細(xì)胞之間的黏附。如果藥物能夠下調(diào)CAR的表達(dá)，將減少病毒的入侵。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR方法充分說(shuō)明SGL-1具有下調(diào)CAR表達(dá)的作用，進(jìn)而證明SGL-1能夠在病毒的穿入階段發(fā)揮作用。
實(shí)施例9、SGL-1對(duì)病毒蛋白酶活性的影響1、實(shí)驗(yàn)方法(1)、采用Western blot方法檢測(cè)心肌細(xì)胞dystrophin的斷裂及合成情況，從而確定病毒protease 2A以及protease 3C的活性。
Western blot方法采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作方法心肌細(xì)胞裂解→蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移→封閉→靶蛋白與第一抗體反應(yīng)→與第二抗體反應(yīng)→顯色。
(2)、直接檢測(cè)病毒蛋白酶protease 2A活性培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞，分組為病毒感染對(duì)照組、正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒+藥物實(shí)驗(yàn)組。當(dāng)觀察到病毒對(duì)照組與正常細(xì)胞對(duì)照組之間出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變時(shí)，終止細(xì)胞培養(yǎng)，取感染對(duì)照組細(xì)胞和病毒+藥物實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，進(jìn)行病毒蛋白酶protease 2A活性檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)方法及操作步驟由合作實(shí)驗(yàn)室完成。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)圖9。
心肌細(xì)胞的dystrophin蛋白具有一個(gè)與病毒衣殼蛋白相似的蛋白酶切割位點(diǎn)，當(dāng)病毒感染進(jìn)入心肌細(xì)胞以后，能夠?qū)ystrophin蛋白切割為220kDa的蛋白片段。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入藥物以后，dystrophin沒(méi)有發(fā)現(xiàn)被切割的現(xiàn)象，從而證實(shí)SGL-1對(duì)病毒的蛋白酶具有抑制作用。
(2)、病毒蛋白酶protease 2A活性分析
表11蛋白酶活性分析

通過(guò)酶活性分析，能夠明顯觀察到當(dāng)SGL-1干預(yù)以后，病毒的蛋白酶KCAT/Km指數(shù)明顯降低，說(shuō)明SGL-1對(duì)病毒的蛋白酶具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)選用的CVB3Nancy株具有普遍性，而且是病毒性心肌炎的主要致病毒株。其翻譯產(chǎn)生的蛋白酶在小核糖核酸病毒科中具有很高的同源性，故而在本研究中以柯薩奇病毒作為代表進(jìn)行研究。
本發(fā)明提供了一種抗病毒單體化合物，其來(lái)源充足，提取工藝簡(jiǎn)單。經(jīng)一系列的抗病毒實(shí)驗(yàn)，證明這種單體對(duì)CVB3病毒具有明顯的抗病毒作用。病毒在完成復(fù)制和翻譯過(guò)程之后，必須要進(jìn)行包裝，才能夠成為完整的病毒顆粒，而病毒翻譯產(chǎn)生的蛋白酶在小核糖核酸病毒科(包括腸道病毒、鼻病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒)中具有極高的同源性，并與真核細(xì)胞的蛋白酶差異明顯。所以本發(fā)明單體對(duì)小核糖核酸病毒科在侵入細(xì)胞以后，均具有抑制病毒成熟的作用，從而發(fā)揮抑制病毒性疾病進(jìn)展的作用。
權(quán)利要求
1.一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于該黃酮單體具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是指該黃酮單體用于制備抗病毒的原料藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是指該黃酮單體添加藥劑學(xué)可接受的輔料或載體，用于制備抗病毒的制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述制劑包括消化道給藥制劑、注射劑、透皮吸收給藥制劑、粘膜給藥制劑和呼吸道給藥制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述病毒為小核糖核酸病毒科病毒，包括柯薩奇病毒、腸道病毒、鼻病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和甲型肝炎病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述病毒為柯薩奇病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述柯薩奇病毒為CVB病毒3型Nancy株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種黃酮單體在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，該黃酮單體具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種抗病毒單體化合物，經(jīng)過(guò)一系列的抗病毒實(shí)驗(yàn)，證明這種單體對(duì)病毒引起的凋亡以及病毒翻譯過(guò)程中的病毒蛋白酶具有抑制作用，提示該單體為一廣譜抗病毒藥物；該單體對(duì)以柯薩奇病毒為代表的小核糖核酸病毒具有明顯的抗病毒作用，為人們治愈病毒性心肌炎提供了新的選擇方案。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1663562SQ20041000476
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2004年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月5日
發(fā)明者惠汝太, 宋曉東, 汪漢卿, 陳敬洲, 甄一松, 馬平 申請(qǐng)人:惠汝太