專利名稱：去唾液酸干擾素和肝癌的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝癌的治療。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌發(fā)生于當(dāng)異常的肝細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)時(shí)。與許多其他類型的癌癥相比較，患上肝癌并因此死亡的人數(shù)在增加。許多患有慢性肝臟疾病，包括肝硬化和肝炎的病人，更有可能發(fā)展成肝癌。1975-1995年之間，美國原發(fā)性肝癌的發(fā)生率增加了75％，診斷患有肝癌的患者人數(shù)每年持續(xù)增長(zhǎng)。在2002年，美國癌癥學(xué)會(huì)估計(jì)美國將確診16,600例原發(fā)性肝癌和膽管癌的新增病例，并且14,100美國人將因此死亡。
兒童和成年人中最普遍的原發(fā)性肝癌的形式是肝細(xì)胞癌，占全部肝癌的80-90％。肝細(xì)胞癌有幾種不同的臨床類型，包括彌散型肝細(xì)胞癌，發(fā)熱型肝細(xì)胞癌和膽汁阻塞型肝細(xì)胞癌。肝母細(xì)胞瘤是另一種形式的肝癌，它相對(duì)罕見并通常影響幼兒。
大多數(shù)肝癌病例預(yù)后很差。目前的療法對(duì)于治療肝癌療效有限。雖然干擾素已被成功的用于治療其他類型的癌癥，例如毛細(xì)胞性白血病，慢性髓細(xì)胞性白血病和黑色素瘤，但是肝臟實(shí)體瘤對(duì)于干擾素的治療較不敏感，這可能是由于干擾素從血液中的快速清除。另外，在癌癥治療所需的劑量水平上，干擾素療法常常導(dǎo)致不良副作用和毒性；因此，需要研制預(yù)防或治療肝癌的治療試劑。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明描述了一種治療肝癌病人的方法，該方法是通過給予有效量的含有哺乳動(dòng)物去唾液酸干擾素(asialo-interferon)的藥物組合物。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，肝癌表達(dá)無唾液酸-糖蛋白受體(asialo-glycoproteinreceptor)。一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施例中，肝臟過度表達(dá)無唾液酸-糖蛋白受體。
另一方面，本發(fā)明描述了一種治療表達(dá)無唾液酸-糖蛋白受體的肝癌病人的方法，該方法通過(a)檢測(cè)肝癌中無唾液酸-糖蛋白受體的表達(dá)，和(b)給予病人有效量的含有哺乳動(dòng)物去唾液酸干擾素的組合物。一個(gè)實(shí)施例中，通過活組織檢查，對(duì)從患者獲得的組織樣本進(jìn)行肝癌的檢測(cè)。另一個(gè)實(shí)施例中，無唾液酸-糖蛋白受體過度表達(dá)，肝癌的檢測(cè)采用非侵入性顯像技術(shù)。
可以用前述任意一種方法治療的肝癌包括，例如彌散型肝細(xì)胞癌，發(fā)熱型肝細(xì)胞癌和膽汁阻塞型肝細(xì)胞癌，肝母細(xì)胞瘤，肝樣腺癌和灶性結(jié)節(jié)性增生。這些方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，去唾液酸干擾素是人去唾液酸干擾素。適用的去唾液酸干擾素包括去唾液酸干擾素-α，-β和-γ。
另一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括第二種抗腫瘤治療(anti-neoplastic therapy)。適用的抗腫瘤治療包括，例如，外科手術(shù)(即，腫瘤切除)，化療和放療。
本發(fā)明的治療方法也可用于治療轉(zhuǎn)移性肝癌。適用于該治療方法的轉(zhuǎn)移性肝癌包括，例如轉(zhuǎn)移性前列腺癌，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌，轉(zhuǎn)移性乳腺癌，轉(zhuǎn)移性肺癌，轉(zhuǎn)移性胰腺癌，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性白血病和淋巴瘤。
“干擾素”是指具有高度同源種屬特異性的干擾素蛋白家族，它抑制病毒復(fù)制和細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，與干擾素-α，-β或-γ或其生物活性片段基本相同。評(píng)價(jià)干擾素生物活性的方法是公知的(例如，Monkarsh et al.，Anal.Biochem.247434-440，1997；Grace et al.，Bioconj.Chem.12195-202，2001；Pepinsky et al.，J.Pharmacol.Exp.Therap.2971059-66，2001)。人干擾素根據(jù)它們的細(xì)胞來源和分子結(jié)構(gòu)分為三類干擾素-α(白細(xì)胞)，干擾素-β(成纖維細(xì)胞)和干擾素-γ(淋巴細(xì)胞)。
“干擾素-α”是指含有與干擾素-α2的成熟多肽(登錄號(hào)P01563的24-188位氨基酸；SEQ ID NO1)或其生物活性片段基本相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。因此，干擾素-α包括干擾素-α2前體多肽(登錄號(hào)P01563；SEQ ID NO1)和保留了成熟干擾素-α生物活性(例如，抗增殖活性)的片段。該定義還包括干擾素-α2的變體，包括例如，干擾素-α2b(SEQ ID NO1的R46K突變)和干擾素-α2c(SEQ ID NO1的R57H突變)。干擾素-α2b是一個(gè)O-連接糖蛋白。干擾素-α14c是一個(gè)N-連接糖蛋白，在72位Asn處糖基化。天然干擾素可由商業(yè)途徑獲得，商品名是Wellferon(Glaxo-SmithKline)，Alferon(Interferon)，Sumiferon(Sumitomo)和Multiferon(Viragen)。非糖基化干擾素-α也可從商業(yè)途徑獲得，包括例如，重組干擾素-α2a，商品名Roferon-A(Roche)，重組干擾素-α2b，商品名Intron-A(Schering Plough)，和重組干擾素-α2c，商品名Berofor α2(Boehringer Ingelheim)。重組共有干擾素-con1可以以Infergen(Amgen)的商品名獲得。當(dāng)然，在用于本發(fā)明的組合物和方法之前，任何非糖基化的干擾素必需用帶有末端半乳糖殘基的寡糖糖基化。
“干擾素-β”是指含有與成熟干擾素-β多肽(登錄號(hào)P01574的22-187位氨基酸；SEQ ID NO2)或其生物活性片段基本相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。因此，除了不含信號(hào)肽的成熟干擾素-β蛋白之外，干擾素-β還包括，包含信號(hào)肽的干擾素-β前體多肽(登錄號(hào)P01574；SEQ ID NO2)及具有干擾素-β生物活性(例如，抗增殖活性)的片段。干擾素-β是糖蛋白，在成熟干擾素-β蛋白的80位Asn處糖基化。已經(jīng)研制了重組形式的干擾素-β，并且可從商業(yè)途徑獲得。干擾素-β1a可以以Avonex(Biogen)和Rebif(Serono)的商品名獲得。干擾素-β1b可以以Betaseron(Berlex)的商品名獲得。
“干擾素-γ”是指含有與成熟干擾素-γ多肽(登錄號(hào)P01579的21-166位氨基酸；SEQ ID NO3)或其生物活性片段基本相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。因此，除了不含信號(hào)肽的成熟干擾素-γ多肽之外，干擾素-γ蛋白還包括，含有信號(hào)肽的干擾素-γ前體蛋白(登錄號(hào)P01579；SEQ ID NO3)及具有干擾素-γ生物活性(例如，抗增殖活性)的片段。干擾素-γ在48位Asn處糖基化，二聚體中，還在120位Asn處糖基化。干擾素-γ可以以Actimmune(InterMune)的商品名獲得。
“去唾液酸干擾素”是指存在于天然糖基化干擾素中的、缺少末端唾液酸基團(tuán)的糖基化干擾素。除去末端唾液酸殘基暴露出下面的半乳糖部分。這個(gè)末端半乳糖被無唾液酸糖蛋白受體識(shí)別。優(yōu)選，去唾液酸干擾素包含天然干擾素的碳水化合物部分的至少50％，70％，80％，90％，或甚至95％。更優(yōu)選，去唾液酸干擾素只缺失末端唾液酸殘基。通過從糖基化干擾素，例如干擾素-α，-β和-γ，除去一個(gè)或多個(gè)唾液酸基團(tuán)，制備去唾液酸干擾素?？赏ㄟ^下述方法除去唾液酸，例如溫和的酸水解，或用純化的神經(jīng)氨酸酶處理天然的糖基化干擾素，例如干擾素-α，-β或-γ。對(duì)于含有一條以上糖鏈的干擾素，可利用特異性神經(jīng)氨酸酶(唾液酸酶)實(shí)現(xiàn)選擇性去唾液酸化。該定義特別排除了完全去糖基化干擾素，包括典型的原核細(xì)胞制備的干擾素以及真核細(xì)胞制備并經(jīng)酶法或化學(xué)法去糖基化的干擾素。當(dāng)然，因?yàn)槌ネ僖核釟埢哪康氖且a(chǎn)生在其寡糖鏈上帶有至少一個(gè)末端半乳糖殘基的糖基化干擾素，末端半乳糖殘基可通過任何其它適宜的方式進(jìn)行改造，包括例如寡糖與去糖基化干擾素共價(jià)聯(lián)接。
“抗腫瘤治療”是指任何用于部分或完全地抑制腫瘤(neoplasm)增殖的醫(yī)學(xué)過程或治療。典型的，抗腫瘤治療包括消除病人的一些或全部腫瘤細(xì)胞的外科操作(例如，肝切除術(shù))，放療和化療?？膳c本發(fā)明去唾液酸干擾素聯(lián)合施用的特別有效的抗腫瘤化療劑的種類包括，例如烷化劑，抗代謝劑，亞硝基脲和植物堿。
“肝癌(liver cancer)”是指肝臟組織或細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞)發(fā)生異常的失控增殖的任意疾病。肝癌包括，但不限于，肝細(xì)胞性癌癥(heaptocellularcarcinoma)，例如彌散型肝細(xì)胞癌(diffuse-type hepatocellular carcinoma)，發(fā)熱型肝細(xì)胞癌(febrile-type hepatocellular)和膽汁阻塞型肝細(xì)胞癌(cholestatichepatocellular carcinoma)，肝母細(xì)胞瘤(hepatoblastoma)，肝樣腺癌(hepatoidadenocarcinoma)和灶性結(jié)節(jié)性增生(focal nodular hyperplasia)。
患有表達(dá)無唾液酸糖蛋白受體的肝癌的病人適宜用去唾液酸干擾素治療；這些病人可用現(xiàn)有技術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法確定(例如，Burgess et al.，Hepatology 15702-706，1992；Hirose et al.，Biochem.and Biophys.ResearchComm.287675-681，2001；Hyodo et al.，Liver 1380-5，1993；Trere et al.，Br.J.Cancer 81404-8，1999)。
“表達(dá)無唾液酸糖蛋白受體的肝癌”是指任何包含表達(dá)可檢測(cè)水平的無唾液酸糖蛋白受體(登錄號(hào)NP_001662或P07307)或其功能等價(jià)蛋白的腫瘤細(xì)胞的肝癌?？捎萌我庖环N合適的體內(nèi)(in vivo)，回體(ex vivo)或體外(invitro)技術(shù)評(píng)價(jià)腫瘤肝臟細(xì)胞的無唾液酸-糖蛋白受體的表達(dá)。例如，對(duì)于在活組織檢查或外科切除過程中從病人獲得的細(xì)胞，可采用標(biāo)準(zhǔn)化免疫組織化學(xué)技術(shù)，Northern或Western印跡技術(shù)，或ELISA確定其無唾液酸糖蛋白受體表達(dá)的特性。無唾液酸糖蛋白受體對(duì)普通技術(shù)人員是已知的(例如，Spiess et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.826465-6469，1985；Spiess et al.，J.Biol.Chem.2601979-1982，1985；Trere et al.，Br.J.Cancer，81404-8，1999)。
“基本純”是指從其天然伴隨成分中分離出來的核酸，多肽，或其它分子。典型的，當(dāng)多肽的至少60％，70％，80％，90％，95％甚至99％(重量比)不含有與其天然伴隨的蛋白質(zhì)和自然存在的有機(jī)分子時(shí)，該多肽是基本純的。例如，基本純的多肽可以從天然來源提取獲得，通過在正常情況下不表達(dá)該蛋白的細(xì)胞中表達(dá)重組核酸獲得，或通過化學(xué)合成獲得。
“基本相同(substantially identical)”是指多肽或核酸與參照氨基酸或核酸序列有至少75％，優(yōu)選85％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％，或甚至99％的同一性(identity)。在多肽的情況下，對(duì)照序列(comparison sequence)的長(zhǎng)度通常為至少20個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少40個(gè)氨基酸，最優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸。在核酸的情況下，對(duì)照序列的長(zhǎng)度通常為至少60個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少90個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少120個(gè)核苷酸。
序列同一性通常用序列分析軟件測(cè)定(例如，Genetics Computer Group的Sequence Analysis Software Package，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710 University Avenue，Madison，WI53705，BLAST，BESTFIT，GAP，或PILEUP/PRETTYBOX程序)。這些軟件通過對(duì)各種取代，缺失和/或其它修飾分配(assign)同源性程度，來配對(duì)(match)相同或相似的序列。
“有效量”是指根據(jù)本發(fā)明單獨(dú)或聯(lián)合使用的、在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)所需的化合物的量。用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的腫瘤(例如，癌)治療方法的活性化合物的有效量根據(jù)給藥方式，個(gè)體的年齡，體重和一般健康狀況而不同。主治醫(yī)師或獸醫(yī)將最終決定適宜的量和劑量方案。用于治療肝癌的去唾液酸干擾素的有效量少至0.005，0.01，0.02，0.025，0.05，0.075，0.1，0.133mg/劑，或多至0.15，0.399，0.5，0.57，0.6，0.7，0.8，1.0，1.25，1.5，2.0或2.5mg/劑?？梢悦刻旖o予一次，每2天，3天，4天，7天，14天或21天給予一次。治療肝癌所給予的去唾液酸干擾素的量根據(jù)去唾液酸干擾素的活性而定。該劑量足以有效減少細(xì)胞增殖或腫瘤的大小。
“片段”是指蛋白質(zhì)或核酸的一部分，它與參照蛋白質(zhì)或核酸基本相同并且保留參照蛋白質(zhì)或核酸至少50％，75％，80％，90％，或95％或甚至99％的生物活性(例如，抗腫瘤活性)。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)從發(fā)明的詳細(xì)描述和權(quán)利要求中體現(xiàn)。


圖1是天然人干擾素-β的結(jié)構(gòu)示意圖。還標(biāo)示出了神經(jīng)氨酸酶在天然人干擾素-β的典型雙觸角復(fù)合型糖鏈中的切割位點(diǎn)?？s寫Fuc，巖藻糖；GlcNAc，N-乙酰葡萄糖胺；Man，甘露糖；Gal，半乳糖；NeuAc，N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)。
圖2A是人干擾素-α-2前體多肽的氨基酸序列(登錄號(hào)P01563)(SEQID NO1)，包括信號(hào)肽(1-23位氨基酸，粗體字符)。成熟干擾素-α-2多肽(普通字符)是24-188位氨基酸。標(biāo)有下劃線的129位氨基酸蘇氨酸是O-連接糖基化位點(diǎn)。
圖2B是編碼人干擾素-α-2前體多肽的mRNA的核酸序列(登錄號(hào)NM_000605)(SEQ ID NO4)。編碼序列是69-635位核酸。起始密碼子和終止密碼子都標(biāo)有下劃線。該核酸序列存在幾種變體，包括下列核酸變化205位A→G；667位A→G；909位C→T；和/或949位A→G。
圖3A是人干擾素-β前體多肽的氨基酸序列(登錄號(hào)P01574)(SEQ IDNO2)，包括信號(hào)肽(1-21位氨基酸，粗體字符)。成熟人干擾素-β多肽(普通字符)是22-187位氨基酸。標(biāo)有下劃線的101位氨基酸天冬酰胺是N-連接糖基化位點(diǎn)。人干擾素-β多肽變體包含162位酪氨酸(C→Y)。
圖3B是編碼人干擾素-β前體多肽的mRNA的核酸序列(登錄號(hào)NM_002176)(SEQ ID NO5)。編碼序列是1-564位核酸。起始密碼子和終止密碼子都標(biāo)有下劃線。該核酸序列存在幾種變體，包括下列核酸變化153位C→T和228位C→T。
圖4A是人干擾素-γ前體蛋白的氨基酸序列(登錄號(hào)P01579)(SEQ IDNO3)，包括信號(hào)肽(1-20位氨基酸，粗體字符)。成熟人干擾素-γ多肽(普通字符)是21-166位氨基酸。干擾素-γ前體蛋白中標(biāo)有下劃線的48位和120位天冬酰胺是N-連接糖基化位點(diǎn)(而二聚體中只有120位Asn糖基化)。
圖4B是編碼人干擾素-γ前體蛋白的mRNA的核酸序列(登錄號(hào)NM_000619)(SEQ ID NO6)。編碼序列是109-609位核酸。起始密碼子和終止密碼子都標(biāo)有下劃線。該核酸序列存在幾種變體，包括下列核酸變化624位A→G；705位A→G；732位A→T；789位C→T；986位C→T和/或1148位A→G。
發(fā)明詳述腫瘤性肝細(xì)胞常常表達(dá)無唾液酸糖蛋白受體以及一或多種干擾素受體。去唾液酸干擾素-α，-β或-γ可有效治療肝癌，其使用劑量與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所用的天然形式的人干擾素的劑量相似或更低。腫瘤性肝細(xì)胞包含去唾液酸干擾素的兩種結(jié)合位點(diǎn)，即無唾液酸糖蛋白受體和干擾素受體。與天然干擾素相比，同等或較低劑量的去唾液酸干擾素能達(dá)到相同或更好的功效；相應(yīng)的，毒性和不良副作用將減少。
無唾液酸糖蛋白受體無唾液酸糖蛋白受體是跨膜蛋白，它以高密度幾乎獨(dú)占了肝細(xì)胞表面(50,000-500,000位點(diǎn)/細(xì)胞)，它介導(dǎo)缺少末端唾液酸殘基的胞外糖蛋白的結(jié)合和細(xì)胞內(nèi)攝作用。無唾液酸糖蛋白受體是一種低親和力受體，它與配體的親和力根據(jù)配體上存在的半乳糖簇的數(shù)目而不同(Lee et al.，J.Biol.Chem.258199-202，1983)。該受體對(duì)帶有成簇的雙半乳糖殘基、雙觸角的配體的親和力(KD～10-6)低于對(duì)帶有成簇的三半乳糖殘基、三觸角的配體的親和力(KD～10-8至10-9)。
很多肝細(xì)胞性癌癥中無唾液酸-糖蛋白受體的表達(dá)增加。Eisenberg etal.(J.Hepatol.，13305-309，1991)指出，健康肝臟每個(gè)細(xì)胞有140,000+/-65,000無唾液酸-糖蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而在纖維化，硬化或肝細(xì)胞癌(hepatocarcinoma)的病態(tài)肝臟中，結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量增加到300,000+/-125,000/細(xì)胞(即，受體“過度表達(dá)”)。Trere et al.指出80％良好分化的肝細(xì)胞性癌癥(癌癥I級(jí)和II級(jí))和20％不良分化的肝細(xì)胞性癌癥(癌癥III級(jí)和IV級(jí))，其原生質(zhì)膜上表達(dá)無唾液酸-糖蛋白受體。確定癌細(xì)胞上是否存在無唾液酸-糖蛋白受體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如，Hyodo et al.，Liver1380-5，1993；Trere et al.，Br.J.Cancer 81404-8，1999)。Shuke et al.，J.Nucl.Med.44475-82，2003描述了一種通過單光子發(fā)射同軸斷層攝影術(shù)(singlephoto emission coaxial tomography)對(duì)局部肝臟無唾液酸糖蛋白受體量進(jìn)行非侵入性功能性作圖的方法。
干擾素的肝臟傳遞從任意天然干擾素除去唾液酸基團(tuán)，將暴露出末端半乳糖殘基(圖1)，產(chǎn)生無唾液酸-糖蛋白受體識(shí)別位點(diǎn)，使得去唾液酸干擾素選擇性靶向肝細(xì)胞。這是特別有益的，因?yàn)椴B(tài)肝臟中的無唾液酸-糖蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量增加。除去唾液酸基團(tuán)賦予去唾液酸干擾素幾個(gè)重要的治療有利性，使其優(yōu)于天然干擾素。首先，去唾液酸干擾素選擇性靶向肝臟。第二，去唾液酸干擾素小于天然干擾素或偶聯(lián)型干擾素，因此能更有效穿透肝窗(liver fenestrae)。第三，與無唾液酸-糖蛋白受體的結(jié)合以及受體復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)攝作用有可能增加去唾液酸干擾素激活細(xì)胞內(nèi)干擾素受體庫(pool)的能力。最后，去唾液酸干擾素靶向到無唾液酸-糖蛋白受體上有可能增加去唾液酸干擾素在細(xì)胞表面的局部濃度，因此增加了去唾液酸干擾素與干擾素受體結(jié)合的可能性。
細(xì)胞表面干擾素受體結(jié)合通過與無唾液酸-糖蛋白受體結(jié)合，增加肝細(xì)胞表面去唾液酸干擾素的局部濃度，使肝部滯留時(shí)間增長(zhǎng)，去唾液酸干擾素-α，-β或-γ與干擾素受體α/β或干擾素γ受體相互作用的可能性增大。高親和力干擾素-α/β受體(KD～10-12至10-31)以低密度存在于肝細(xì)胞上(100-5,000位點(diǎn)/細(xì)胞)。因?yàn)闊o唾液酸-糖蛋白受體對(duì)去唾液酸干擾素的親和力低于干擾素受體對(duì)其的親和力，所以去唾液酸干擾素可以有效的從大量的無唾液酸-糖蛋白受體轉(zhuǎn)移到較少量的干擾素受體上。無唾液酸-糖蛋白受體對(duì)配體的親和力根據(jù)配體上半乳糖簇的數(shù)量而不同(Lee et al.，J.Biol.Chem.258199-202，1983)。
無唾液酸-糖蛋白受體對(duì)雙觸角配體的親和力(KD～10-6)低于對(duì)三觸角配體的親和力(KD～10-8至10-9)。例如，干擾素-β的碳水化合物鏈的伸展構(gòu)象(Karpusas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci 9411813-11818，1997)有可能使其與無唾液酸-糖蛋白受體和干擾素-α/β受體同時(shí)發(fā)生相互作用。因此，大量的無唾液酸-糖蛋白受體可以將去唾液酸干擾素-β集中到細(xì)胞表面，而在此細(xì)胞表面去唾液酸干擾素-β有可能同時(shí)與較少量的干擾素-α/β受體相互作用。
細(xì)胞內(nèi)干擾素受體結(jié)合干擾素-α，-β或-γ與細(xì)胞內(nèi)干擾素受體的結(jié)合可能觸發(fā)干擾素信號(hào)傳遞。摻入到脂質(zhì)體中的干擾素-α能產(chǎn)生比游離的干擾素-α顯著增強(qiáng)的活性，這支持了下述假設(shè)干擾素不需要到達(dá)細(xì)胞表面就能顯示活性。而且，配體與無唾液酸-糖蛋白受體的結(jié)合觸發(fā)了受體-配體復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)攝作用，使得去唾液酸干擾素與細(xì)胞內(nèi)干擾素受體接近。
干擾素的制備通常，本發(fā)明的多肽，例如干擾素-α(圖2A)，-β(圖3A)或-γ(圖4A)可通過以下方式制備用包含在合適表達(dá)載體中的全長(zhǎng)或部分編碼多肽的核酸分子，如圖2B所示的干擾素-α編碼核酸，圖3B所示的干擾素-β編碼核酸，圖4B所示的干擾素-γ編碼核酸或其片段，轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，例如真核細(xì)胞。
分子生物學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道廣泛多種表達(dá)系統(tǒng)中任意一種都可用于制備重組蛋白質(zhì)。將干擾素肽基因序列引入質(zhì)粒或其它載體，隨后轉(zhuǎn)化活細(xì)胞，可以產(chǎn)生干擾素肽的真核表達(dá)系統(tǒng)。包含全部開放閱讀框的干擾素肽cDNA以正確的方向插入到表達(dá)質(zhì)粒中，這種構(gòu)建體可用于蛋白質(zhì)的表達(dá)。真核表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)干擾素肽融合蛋白的表達(dá)和表達(dá)回收，在該融合蛋白中，干擾素肽與有利于識(shí)別和/或純化的標(biāo)記分子(tag)共價(jià)連接?？梢栽诟蓴_素肽和標(biāo)記分子之間構(gòu)建酶或化學(xué)切割位點(diǎn)，以便可以在純化后除去標(biāo)記分子。
典型的表達(dá)載體包含啟動(dòng)子，它指導(dǎo)合成大量與含質(zhì)粒的細(xì)胞中插入的干擾素肽核酸相應(yīng)的mRNA。表達(dá)載體還可包含復(fù)制起始序列，其使載體在宿主生物中能自主復(fù)制；編碼遺傳性狀的序列，其使得存在其它毒性去唾液酸干擾素時(shí)能篩選出含載體的細(xì)胞；增加合成mRNA的翻譯效率的序列。利用調(diào)節(jié)元件，例如病毒的調(diào)節(jié)元件(例如，Epstein Barr病毒基因組的OriP序列)，可使穩(wěn)定的長(zhǎng)期載體以游離的復(fù)制性實(shí)體形式維持。還可以制備將載體整合到基因組DNA中的細(xì)胞系，并以這種方式連續(xù)獲得基因產(chǎn)物。
具體使用哪種宿主細(xì)胞對(duì)本發(fā)明并不重要。本發(fā)明的多肽可從任意真核宿主制備獲得(例如，啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，昆蟲細(xì)胞如Sf21細(xì)胞，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞如NIH，3T3，Hela，COS細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)?？蓮膹V泛多種來源獲得這些細(xì)胞(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockland，MD；或參見，例如Ausubel et al.，Current Protocols in MoleularBiology，Wiley Interscience，New York，2001)。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法以及表達(dá)載體的選擇依賴于所選擇的宿主系統(tǒng)。例如，Ausubel et al.(出處同上)中描述了轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的方法；表達(dá)載體可以從Cloning VectorsA LaboratoryManual(P.H.Pouwels et al.，1985，Supp.1987)所提供的表達(dá)載體中選擇。
天然的糖基化干擾素可從天然產(chǎn)生它的人細(xì)胞中分離，或者從被構(gòu)建成表達(dá)重組干擾素基因的轉(zhuǎn)基因真核細(xì)胞中分離。美國專利4,758,510，4,124,702，5,827,694，4,680,261，5,795,779，5,376,567和4,130,641概括描述了干擾素的天然或重組制備方法。
適宜的表達(dá)載體一經(jīng)構(gòu)建，即可通過轉(zhuǎn)化技術(shù)將其引入合適的宿主細(xì)胞，所述技術(shù)例如，但不限于，磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染，電穿孔，顯微注射，原生質(zhì)體融合或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明的重組多肽一經(jīng)表達(dá)，即可用例如親和層析方法分離。一個(gè)實(shí)施例中，抗本發(fā)明多肽的抗體(如本文所述制備)連接到層析柱上用于分離重組多肽。親和層析之前，可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法將包含多肽的細(xì)胞裂解并分級(jí)分離(參見，例如Ausubel et al.，出處同上)。重組蛋白的純化可采用任意合適的技術(shù)，包括，例如，高效液相色譜法或其它色譜法(參見，例如Fisher，Laboratory Techniques In Biochemistry And Moleular Biology，eds.，Work andBurdon，Elsevier，1980)。
本發(fā)明的多肽，特別是短肽片段，也可通過化學(xué)合成制備(例如，通過Solid Phase Peptide Synthesis，2nd ed.，1984 The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL描述的方法)。
這些常規(guī)的多肽表達(dá)和純化技術(shù)也可用于制備和分離有用的肽片段或類似物(本文所述)。或者，分離和純化的人干擾素可由商業(yè)途徑獲得(例如，Sigma Chemical Co.目錄號(hào)I2396，I2271，I1640，和I6507)。
去唾液酸干擾素的制備已知很多方法能產(chǎn)生具有不同比例雙觸角復(fù)合物的干擾素。例如，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素的雙觸角復(fù)合物比例高于中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)產(chǎn)生的干擾素。具體的說，人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的人去唾液酸干擾素-β包含約82％的雙觸角半乳糖-末端寡糖和約18％的三觸角半乳糖-末端寡糖。
去唾液酸干擾素可通過除去真核細(xì)胞生產(chǎn)的糖基化干擾素的末端唾液酸殘基而制備(參見，例如美國專利4,184,917及其引用的參考文獻(xiàn)，和Kasama et al.，J.Interfer.Cyto.Res.15407-415，1995)。末端唾液酸殘基可用下述方法除去例如溫和的酸水解，或用如Drzenieck et al.，Microbiol.Immunol.5935，1972所述的分離純化的細(xì)菌或病毒神經(jīng)氨酸酶處理天然的糖基化干擾素。神經(jīng)氨酸酶可從Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)輕易獲得(目錄號(hào)N3642，N5146，N7771，N5271，N6514，N7885，N2876，N2904，N3001，N5631，N2133，N6021，N5254和N4883)。制備去唾液酸干擾素的其它方法在美國專利6,296,844中有概括描述(結(jié)合在此作為參考)。
例如，為制備人去唾液酸干擾素-β，將20mg附著在珠狀瓊脂糖上(約0.22單位)的不溶性神經(jīng)氨酸酶懸浮于微量離心管中的1ml蒸餾水中，進(jìn)行短暫的水化。離心沉淀瓊脂糖，用1ml含154mM NaCl和9mM氯化鈣的醋酸鈉緩沖液(pH5.5)洗滌3次，凝膠(約72μl)重懸于150μl醋酸鈉緩沖液中。例如，人糖基化干擾素-β(3×106IU/瓶，約0.15mg)懸浮于150μl醋酸鈉緩沖液中。然后，凝膠和干擾素-β混合，在旋轉(zhuǎn)臺(tái)上37℃溫育3小時(shí)。用0.2μm過濾器離心過濾，使混合物與神經(jīng)氨酸酶分離。去唾液酸干擾素可在-80℃保存一段時(shí)間。
制備去唾液酸干擾素的另一個(gè)方法包括，用1ml 5mM甲酸(pH3.5)中的1單位產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)神經(jīng)氨酸酶消化天然人干擾素-β，在37℃消化3小時(shí)。隨后水解，去唾液酸化的干擾素-β用C-18反相柱(例如，ZorbaxPR-10)和0.1％三氟乙酸中線性梯度的乙腈分離。制備去唾液酸干擾素的其它方法在美國專利6,296,844中有概括描述(結(jié)合在此作為參考)。
藥物組合物的配制可用任意合適的方式給予去唾液酸干擾素化合物，該方式是導(dǎo)致與其它成分聯(lián)合施用的干擾素的濃度達(dá)到靶區(qū)域時(shí)有抗腫瘤活性的方式?；衔镆匀我夂线m的劑量包含在任意適宜的載體基質(zhì)中，通常占組合物總重的1-95％。所述組合物采用適合于非胃腸道給藥途徑的劑量形式(例如，皮下，靜脈，肌內(nèi)或腹膜內(nèi))?？梢园凑粘Ｒ?guī)的制藥操作配制藥物組合物(參見，例如RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy(20th ed.)，ed.A.R.Gennaro，Lippincott Williams & Wilkins，2000 and Encyclopedia ofPharmaceutical Technology，eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan，1988-1999，MARCEL Dekker，New York)。
本發(fā)明的藥物組合物可以配制成給藥后立即釋放活性成分，或者在給藥后的任意預(yù)設(shè)時(shí)間或時(shí)間段內(nèi)釋放活性成分。后一種類型的組合物通常稱為控釋制劑，包括(i)在一段持續(xù)的時(shí)間內(nèi)，在體內(nèi)產(chǎn)生基本恒定濃度的去唾液酸干擾素的配制劑；(ii)在預(yù)設(shè)的滯后時(shí)間之后，在一段持續(xù)的時(shí)間內(nèi)，在體內(nèi)產(chǎn)生恒定濃度的去唾液酸干擾素的配制劑；(iii)在預(yù)設(shè)的時(shí)間段內(nèi)維持去唾液酸干擾素作用的配制劑，它能在體內(nèi)保持相對(duì)、恒定、有效的去唾液酸干擾素水平，同時(shí)使伴隨活性去唾液酸干擾素物質(zhì)在血漿水平的波動(dòng)(sawtooth動(dòng)力學(xué)模式)而產(chǎn)生的不期望的副作用最小化；(iv)通過將控釋組合物放置在患病組織或器官的空間上鄰近位置或內(nèi)部位置，而使去唾液酸干擾素局部發(fā)揮作用的配制劑；(v)允許方便定量的配制劑，致使例如可以每一周或兩周一次給藥；和(vi)利用載體或化學(xué)衍生物定向去唾液酸干擾素作用，而將去唾液酸干擾素傳遞到具體類型的靶細(xì)胞的配制劑。特別推薦以控釋配制劑的形式給予去唾液酸干擾素化合物，因?yàn)槿ネ僖核岣蓴_素在胃腸道的吸收窗(adsorption window)很狹窄或者其生物半衰期非常短。在這些實(shí)例中，控釋配制劑避免了為維持血漿治療水平而在一天內(nèi)頻繁給藥的需要。
可采用任意策略以獲得控釋配制劑，其中配制劑的釋放率高于目標(biāo)化合物的代謝率。一個(gè)實(shí)施例中，通過適當(dāng)選擇各種配制參數(shù)和成分，包括，例如控釋組合物和包衣的各種類型，來實(shí)現(xiàn)控釋。為此，將去唾液酸干擾素與合適的賦形劑配制成藥物組合物，其在給藥后，以控釋的方式釋放去唾液酸干擾素。配制劑的實(shí)例包括單一單位或多單位片劑或膠囊劑組合物，油溶液，懸液，乳劑，微膠囊，微球，分子復(fù)合物，極微粒子(nanoparticle)，敷劑(patch)和脂質(zhì)體。
非胃腸道給藥的組合物藥物組合物可以進(jìn)行非胃腸道給藥，方式是以分劑量形式(dosageform)、配制劑形式通過注射、輸注或植入(皮下，靜脈，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)或其它方式)進(jìn)行非胃腸道給藥，或通過含有常規(guī)無毒性藥用可接受載體和輔劑的合適傳遞裝置或植入體進(jìn)行非胃腸道給藥。這種組合物的配方和制備是藥物配制領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。配方可以參見RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，出處同上。
非胃腸道給藥的組合物以單位劑量形式提供(例如，單劑量安瓿)或以包含多個(gè)劑量的藥瓶(vial)形式提供，其中添加合適的防腐劑(參見下文)。組合物可以是溶液，懸液，乳液，輸注裝置或植入傳遞裝置，也可以是干粉，所述干粉在使用前用水或另一種適合的媒介(vehicle)重建。除了活性去唾液酸干擾素，組合物中還可以包括合適的胃腸道外可接受的載體和/或賦形劑?；钚匀ネ僖核岣蓴_素可以摻入微球，微膠囊，極微粒子，脂質(zhì)體或其它類似物以進(jìn)行控制釋放。另外，組合物還包括助懸劑，增溶劑，穩(wěn)定劑，pH調(diào)節(jié)劑，等滲調(diào)節(jié)劑和/或分散劑。
如上所述，本發(fā)明的藥物組合物可以是適合無菌注射的形式。為了制備這樣的組合物，合適的活性去唾液酸干擾素溶解于或懸浮于胃腸道外可接受的液體媒介中?？梢允褂玫目山邮苊浇楹腿軇┯兴ㄟ^添加合適量的鹽酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)到合適的pH值的水或適合的緩沖液，1，3-丁二醇，Ringer′s溶液和等滲氯化鈉溶液和葡萄糖溶液。含水配制劑還可以包括一種或多種防腐劑(例如，甲基，乙基或n-丙基-p-羥基苯甲酸)。當(dāng)其中一種成分僅僅是少量的或稍微的溶于水的情況下，可以加入促溶劑或增溶劑，或者溶劑中可含有10-60％w/w的丙二醇或類似物。
控釋非胃腸道給藥的組合物控釋非胃腸道給藥的組合物可以是含水懸浮液，微球，微膠囊，磁性微球，油溶液，油懸液或乳液?；蛘撸梢詫⒒钚匀ネ僖核岣蓴_素?fù)饺肷锵嗳菪暂d體，脂質(zhì)體，極微粒子，植入體或輸注裝置。
制備微球和/或微膠囊所用的材料有，例如，生物可降解/生物可消耗(bioerodible)的聚合物，如聚泌乳素，聚(異丁基腈基丙烯酸酯)，聚(2-羥乙基-L-谷氨酰胺)和聚(乳酸)。配制控釋非胃腸道給藥的配制劑時(shí)，可使用的生物相容性載體有碳水化合物(例如，葡聚糖)，蛋白質(zhì)(例如，清蛋白)，脂蛋白或抗體。植入體所用的材料可以為非生物可降解的(例如，聚二甲基硅氧烷)或生物可降解的(例如，聚(己內(nèi)酯)，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)或聚(原酸酯)或其混合物)。
口服固體劑量形式干擾素的口服配制劑包括片劑，其含有與無毒的藥用可接受賦形劑混合的活性成分。這種配制劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的(例如，5,824,300，5,817,307，5,830,456，5,846,526，5,882,640，5,910,304，6,036,949，6,372,218結(jié)合在此作為參考)。賦形劑可以是，例如惰性稀釋劑或填充劑(如，蔗糖，山梨醇，糖，甘露醇，微晶纖維素，淀粉包括馬鈴薯淀粉，碳酸鈣，氯化鈉，乳糖，磷酸鈣，硫酸鈣或磷酸鈉)；制粒劑和崩解劑(如，纖維素衍生物包括微晶纖維素，淀粉包括馬鈴薯淀粉，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，藻酸鹽或藻酸)；粘合劑(如，蔗糖，葡萄糖，山梨醇，阿拉伯膠，藻酸，藻酸鈉，明膠，淀粉，預(yù)膠凝淀粉，微晶纖維素，硅酸鎂鋁，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，乙基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；和潤(rùn)滑劑，助流劑(glidant)和抗粘著劑(如，硬脂酸鎂，硬脂酸鋅，硬脂酸，硅石(silica)，氫化植物油，或滑石(talc))。其它藥用可接受賦形劑有著色劑，芳香劑，增塑劑，保濕劑，緩沖劑及類似物。
片劑可以不包衣或用已知的技術(shù)進(jìn)行包衣，以延遲在胃腸道的崩解和吸收，因此可以在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持活性。包衣適于以預(yù)設(shè)的模式釋放活性去唾液酸干擾素(例如，為獲得控釋配制劑)，或者包衣適于直至通過胃之后才釋放活性去唾液酸干擾素(腸溶衣)。包衣可以是糖衣，薄膜衣(如，基于羥丙基甲基纖維素，甲基纖維素，甲基羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，羧甲基纖維素，丙烯酸共聚物，聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)，或腸溶衣(如，基于甲基丙烯酸共聚物，醋酸苯二甲酸纖維素，苯二甲酸羥丙基甲基纖維素，醋酸琥珀酸羥丙基甲基纖維素，聚乙烯乙酸苯二甲酸酯，蟲膠(shellac)和/或乙基纖維素)。此外，可采用延時(shí)材料，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
固體片劑組合物可以包衣以防止組合物發(fā)生不需要的化學(xué)變化(例如，在釋放活性去唾液酸干擾素之前化學(xué)降解)?？梢圆捎妙愃朴贓ncyclopediaof Pharmaceutical Technology，出處同上描述的方式對(duì)固體劑型進(jìn)行包衣。
可以將兩種去唾液酸干擾素混合在片劑中，也可以分隔開。一個(gè)實(shí)施例中，第一種去唾液酸干擾素包含在片劑的內(nèi)側(cè)，第二種去唾液酸干擾素在外側(cè)，因此，第二種去唾液酸干擾素的實(shí)質(zhì)性部分在第一種去唾液酸干擾素釋放之前釋放。
口服配制劑也可以是咀嚼片或是硬明膠膠囊(hard gelatin capsule)，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，馬鈴薯淀粉，乳糖，微晶纖維素，碳酸鈣，磷酸鈣或高嶺土(kaolin))混合?？诜苿┗蛘呤擒浢髂z膠囊，其中活性成分與水或油狀介質(zhì)(例如花生油，液體石蠟或橄欖油)混合在一起。可以使用上面提到的片劑和膠囊中的成分采用常規(guī)方式制備粉末和顆粒，所述方式例如混合器，流化床(fluid bed apparatuss)或噴霧干燥設(shè)備。
口服控釋分劑量形式可以將口服控釋組合物制成通過控制活性去唾液酸干擾素物質(zhì)的溶解和/或擴(kuò)散來釋放活性去唾液酸干擾素。
通過對(duì)化合物的片劑，膠囊，丸劑或顆粒劑進(jìn)行適合的包衣，或?qū)⒒衔飺饺牒线m的基質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)溶解或擴(kuò)散控制釋放。控釋包衣可以包含一種或多種上面提到的包衣材料和/或例如，蟲膠，蜂蠟，糖蠟，蓖麻蠟，巴西棕櫚蠟，硬脂醇，單硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯，棕櫚硬脂酸甘油酯，乙基纖維素，丙烯酸樹脂，dl-聚乳酸，醋酸丁酸纖維素，聚氯乙烯，聚乙酸乙烯，乙烯吡咯烷酮，聚乙烯，聚甲基丙烯酸酯，異丁烯酸甲酯，2-羥基異丁烯酸酯，異丁烯酸水凝膠，1，3丁二醇，乙二醇異丁烯酸酯和/或聚乙二醇。在一個(gè)含基質(zhì)的控釋配制劑中，基質(zhì)物質(zhì)可以包括，例如，水合甲基纖維素，棕櫚蠟和硬脂醇，Carbopol 934，硅，三硬脂酸甘油酯，甲基丙烯酸-異丁烯酸甲酯，聚氯乙稀，聚乙烯和/或鹵代碳氟化合物。
含有一種或多種以所述組合物形式組合的化合物的控釋組合物也可以是浮體型(buoyant)片劑或膠囊(即，口服給藥時(shí)，在一段時(shí)間內(nèi)，浮在胃的上部的片劑或膠囊)?；衔锏母◇w型片劑配制劑可如下制備，將去唾液酸干擾素，賦形劑以及20-75％w/w水性膠體(hydrocolloid)的混合物制成顆粒，水性膠體如羥乙基纖維素，羥丙基纖維素或羥丙基甲基纖維素。制得的顆粒隨后壓成片劑。與胃液一接觸，片劑表面形成一個(gè)基本不透水的凝膠屏障。這個(gè)凝膠屏障參與維持小于1的密度，因此使片劑能夠在胃液中維持浮體狀態(tài)。
聯(lián)合治療去唾液酸干擾素可與其它任何標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療方法聯(lián)合使用；這些方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的(例如，Wadler et al.，Cancer Res.503473-86，1990)，包括，但不限于，化療，放療，以及其它任何用于治療癌癥的治療方法。
實(shí)施例1為制備人去唾液酸干擾素-β，將20mg不溶且附著在珠狀瓊脂糖上的神經(jīng)氨酸酶(約0.22單位)，懸浮于微量離心管中的1ml蒸餾水中，以便進(jìn)行短暫的水化。離心沉淀瓊脂糖，用1ml含154mM NaCl和9mM氯化鈣的醋酸鈉緩沖液(pH5.5)洗滌3次，凝膠(約72μl)重懸于150μl醋酸鈉緩沖液中。人糖基化干擾素-β(3×106IU/瓶，約0.15mg)懸浮于150μl醋酸鈉緩沖液中。然后，凝膠和干擾素-β混合，在旋轉(zhuǎn)臺(tái)上37℃溫育3小時(shí)。用0.2μm過濾器離心過濾，混合物與神經(jīng)氨酸酶分離。去唾液酸干擾素可在-80℃保存一段時(shí)間。
上述方法也可用于制備干擾素-α和干擾素-γ的去唾液酸形式。制備去唾液酸糖蛋白的其它方法也是已知的，例如酸水解(Duk et al.，Glycoconj J.9148-53，1992)。
其它實(shí)施例本說明書引用的全部出版物和專利申請(qǐng)都引入本文作為參考，就象每個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)也分別具體引入作為參考一樣。雖然上述發(fā)明通過圖解和實(shí)例(為了清楚的理解發(fā)明)描述了一些細(xì)節(jié)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該知道，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，不背離本發(fā)明的精神和所附的權(quán)利要求的范圍，可進(jìn)行一些改變和修飾。
序列表<110>通用醫(yī)療公司(The General Hospital Corporation)<120>去唾液酸干擾素和肝癌的治療<130>50206/014WO2<150>US 60/408,265<151>2002-09-05<160>6<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>188<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu20 25 30Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser35 40 45Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu50 55 60Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His65 70 75 80Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser85 90 95Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr100 105 110Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val115 120 125Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys130 135 140Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro145 150 155 160Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu165 170 175Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu180 185<210>2<211>187<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg20 25 30Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg35 40 45Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu50 55 60Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile65 70 75 80Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser85 90 95Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val100 105 110Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu115 120 125Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys130 135 140Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser145 150 155 160His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr165 170 175Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn180 185<210>3<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu1 5 10 15Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu20 25 30Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn35 40 45Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp50 55 60Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe65 70 75 80Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile85 90 95Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg100 105 110Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val115 120 125Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser130 135 140Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg145 150 155 160Gly Arg Arg Ala Ser Gln165<210>4<211>1142<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)<400>4gagaacctgg agcctaaggt ttaggctcac ccatttcaac cagtctagca gcatctgcaa 60catctacaat ggccttgacc tttgctttac tggtggccct cctggtgctc agctgcaagt 120caagctgctc tgtgggctgt gatctgcctc aaacccacag cctgggtagc aggaggacct 180tgatgctcct ggcacagatg aggagaatct ctcttttctc ctgcttgaag gacagacatg 240actttggatt tccccaggag gagtttggca accagttcca aaaggctgaa accatccctg 300tcctccatga gatgatccag cagatcttca atctcttcag cacaaaggac tcatctgctg 360cttgggatga gaccctccta gacaaattct acactgaact ctaccagcag ctgaatgacc 420tggaagcctg tgtgatacag ggggtggggg tgacagagac tcccctgatg aaggaggact 480ccattctggc tgtgaggaaa tacttccaaa gaatcactct ctatctgaaa gagaagaaat 540acagcccttg tgcctgggag gttgtcagag cagaaatcat gagatctttt tctttgtcaa 600caaacttgca agaaagttta agaagtaagg aatgaaaact ggttcaacat ggaaatgatt 660ttcattgatt cgtatgccag ctcacctttt tatgatctgc catttcaaag actcatgttt 720ctgctatgac catgacacga tttaaatctt ttcaaatgtt tttaggagta ttaatcaaca 780ttgtattcag ctcttaaggc actagtccct tacagaggac catgctgact gatccattat 840ctatttaaat atttttaaaa tattatttat ttaactattt ataaaacaac ttatttttgt 900tcatattatg tcatgtgcac ctttgcacag tggttaatgt aataaaatgt gttctttgta 960tttggtaaat ttattttgtg ttgttcattg aacttttgct atggaacttt tgtacttgtt 1020tattctttaa aattaaattc caagcctaat tgtgcaacct gattacagaa taactggtac 1080acttcatttg tccatcaata ttatattcaa gatataagta aaaataaact ttctgtaaac 1140ca1142<210>5<211>757<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>5atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 60tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag 120ctcctgtggc aattgaatgg gaggcttgaa tattgcctca aggacaggat gaactttgac 180atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc 240tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg 300aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag 360acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gattttacca ggggaaaact catgagcagt 420ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt 480cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga 540cttacaggtt acctccgaaa ctgaagatct cctagcctgt ccctctggga ctggacaatt 600gcttcaagca ttcttcaacc agcagatgct gtttaagtga ctgatggcta atgtactgca 660aatgaaagga cactagaaga ttttgaaatt tttattaaat tatgagttat ttttatttat 720ttaaatttta ttttggaaaa taaattattt ttggtgc 757<210>6<211>1193<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>6tgaagatcag ctattagaag agaaagatca gttaagtcct ttggacctga tcagcttgat 60acaagaacta ctgatttcaa cttctttggc ttaattctct cggaaacgat gaaatataca 120agttatatct tggcttttca gctctgcatc gttttgggtt ctcttggctg ttactgccag 180gacccatatg taaaagaagc agaaaacctt aagaaatatt ttaatgcagg tcattcagat 240gtagcggata atggaactct tttcttaggc attttgaaga attggaaaga ggagagtgac 300agaaaaataa tgcagagcca aattgtctcc ttttacttca aactttttaa aaactttaaa 360gatgaccaga gcatccaaaa gagtgtggag accatcaagg aagacatgaa tgtcaagttt 420ttcaatagca acaaaaagaa acgagatgac ttcgaaaagc tgactaatta ttcggtaact 480
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1.一種治療肝癌病人的方法，所述方法包括給予所述病人有效量的含有哺乳動(dòng)物去唾液酸干擾素的藥物組合物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肝癌表達(dá)無唾液酸-糖蛋白受體。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述肝癌過度表達(dá)無唾液酸-糖蛋白受體。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肝癌選自由以下癌癥組成的組彌散型肝細(xì)胞癌，發(fā)熱型肝細(xì)胞癌，膽汁阻塞型肝細(xì)胞癌，肝母細(xì)胞瘤，肝樣腺癌和灶性結(jié)節(jié)性增生。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述去唾液酸干擾素是人去唾液酸干擾素。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述人去唾液酸干擾素是去唾液酸干擾素-α。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述人去唾液酸干擾素是去唾液酸干擾素-β或去唾液酸干擾素-γ。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有效量是0.05-1.5mg/周。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括第二種抗腫瘤治療。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述第二種抗腫瘤治療是化療或放療。
11.一種治療肝癌病人的方法，所述方法包括以下步驟(a)檢測(cè)所述肝癌的無唾液酸-糖蛋白受體的表達(dá)；和(b)當(dāng)所述檢測(cè)步驟(a)指示所述肝癌表達(dá)無唾液酸-糖蛋白受體時(shí)，給予所述病人有效量的含有哺乳動(dòng)物去唾液酸干擾素的組合物。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(a)所述的檢測(cè)包括進(jìn)行肝臟活組織檢查。
13.權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述肝癌過度表達(dá)無唾液酸-糖蛋白受體。
14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)所述的檢測(cè)包括對(duì)所述病人肝臟進(jìn)行非侵入性顯像。
15.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肝癌選自由以下癌癥組成的組彌散型肝細(xì)胞癌，發(fā)熱型肝細(xì)胞癌，膽汁阻塞型肝細(xì)胞癌，肝母細(xì)胞瘤，肝樣腺癌和灶性結(jié)節(jié)性增生。
16.權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)所述的方法，其中所述去唾液酸干擾素是人去唾液酸干擾素。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述人去唾液酸干擾素是去唾液酸干擾素-α。
18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述人去唾液酸干擾素是去唾液酸干擾素-β或去唾液酸干擾素-γ。
19.權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有效量是0.05-1.5mg/周。
20.權(quán)利要求11-19任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括第二種抗腫瘤治療。
21.一種治療轉(zhuǎn)移性肝癌的方法，所述方法包括對(duì)所述病人給予有效量的含有哺乳動(dòng)物去唾液酸干擾素的藥物組合物。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)移性癌癥選自由以下癌癥組成的組轉(zhuǎn)移性前列腺癌，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌，轉(zhuǎn)移性乳腺癌，轉(zhuǎn)移性肺癌，轉(zhuǎn)移性胰腺癌，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，轉(zhuǎn)移性白血病和轉(zhuǎn)移性淋巴瘤。
23.權(quán)利要求21或22所述的方法，其中所述人去唾液酸干擾素是去唾液酸干擾素-α，去唾液酸干擾素-β或去唾液酸干擾素-γ。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備和利用去唾液酸干擾素，包括去唾液酸干擾素－α，去唾液酸干擾素－α2a，去唾液酸干擾素－α2b，去唾液酸干擾素－β，去唾液酸干擾素－β1a，去唾液酸基干擾素－β1b和去唾液酸干擾素－γ治療肝癌的方法。去唾液酸干擾素治療可以單獨(dú)進(jìn)行或與其它抗腫瘤治療聯(lián)合進(jìn)行。
文檔編號(hào)A61K38/21GK1691956SQ03824453
公開日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2003年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月5日
發(fā)明者尼古拉斯·P·巴克, 丹尼爾·K·波多爾斯基 申請(qǐng)人:通用醫(yī)療公司, Gi公司