專利名稱：骨誘導(dǎo)性生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨誘導(dǎo)性生物材料(osteoinductive biomaterial)。尤其，本發(fā)明涉及一種成骨組合物，及該成骨組合物在治療中的應(yīng)用背景技術(shù)本發(fā)明的成骨組合物尤其被用于人或哺乳動(dòng)物的組織再生，并且被用于促進(jìn)或誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)。出于本說(shuō)明的目的，術(shù)語(yǔ)“成骨蛋白”指通過(guò)分離哺乳動(dòng)物的總骨骼蛋白而獲得的，并且能夠誘導(dǎo)骨形成的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“成骨的”和“骨誘導(dǎo)的”被認(rèn)為是同義詞。骨發(fā)生是被用于描述成年哺乳動(dòng)物中的骨骼重新形成的術(shù)語(yǔ)，并且在成年個(gè)體的骨折的再生過(guò)程中被證實(shí)。該過(guò)程通過(guò)與胚胎時(shí)期的骨生成極其類似過(guò)程而進(jìn)行。在其它未鑒定的蛋白中的成骨蛋白含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic protein BMPs)。此類蛋白為被分類為形態(tài)發(fā)生蛋白中較大的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族(transforming growthfactor-beta superfamily)中的一部分的特征蛋白家族。BMP家族包括多于12種的已知能夠在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)骨骼形成的個(gè)體成員。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了對(duì)從骨骼中分離成骨蛋白的方法的改進(jìn)，在該方法中含有片斷的成骨蛋白從骨骼中被提取，并且通過(guò)選自超濾和層析的富集步驟的順序被富集，所述改進(jìn)在于在富集步驟之前從含有片斷的成骨蛋白中去除較高分子量組分。
所述較高分子量組分可以具有約100～300kDa的分子量。所述較高分子量組分典型地包括膠原、膠原片斷、膠原聚集體及其混合物。
該方法可以包括通過(guò)超濾去除所述較高分子量的組分。例如，可通過(guò)經(jīng)過(guò)100～300kDa標(biāo)準(zhǔn)分子量膜(nominal molecular weightmembrane)，如100～300kDa標(biāo)準(zhǔn)分子量的聚砜薄膜的超濾而去除所述組分。
可以使用離液序列高的溶液(chaotropic solution)從骨骼中提取含有片斷的成骨蛋白。所述離液序列高的溶液可以含有脲、氯化胍或其組合。
所述富集步驟可以包括通過(guò)逐漸減小的標(biāo)準(zhǔn)分子量膜的含有片斷的成骨蛋白的連續(xù)超濾，隨后或交替進(jìn)行層析富集步驟。因此富集步驟可以包括一步或多步層析步驟。
含有片斷的成骨蛋白可以通過(guò)連續(xù)的超濾步驟而被濃縮并被去鹽。所述片斷可以通過(guò)10kDA和5kDA的超濾步驟而被濃縮和去鹽。
所述層析富集步驟可以選自一種或多種肝磷脂-瓊脂糖凝膠層析(heparin-sepharose chromatography)、羥磷灰石層析(hydroxyapatitechromatography)、反向硅膠層析和其中任意兩種或多種的組合。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了包括成骨蛋白、不溶性骨基質(zhì)(ICBM)和明膠的誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)的組合物。
所述組合物可以為水合性粉末形式。
所述不溶性骨基質(zhì)可以通過(guò)以下步驟制備用酸去除全骨粉末中的礦質(zhì)以產(chǎn)生酸性去礦質(zhì)的全骨粉末或基質(zhì)，用如尿素水溶液或胍鹽溶液的離液劑(chaotropic agent)從去礦質(zhì)的骨粉或基質(zhì)中提取可溶性組分，水洗殘留物，然后干燥該殘留物從而制備不溶性骨基質(zhì)。
可以通過(guò)提取不溶性骨基質(zhì)以制備富含可溶性I型膠原的片斷、沉淀該可溶性I型膠原并真空干燥該沉淀物，從而獲得明膠。
可以用純的沸水進(jìn)行提取，并且可以用乙醇進(jìn)行沉淀。
所述不溶性膠原骨基質(zhì)可以為哺乳動(dòng)物的。也可以為非人體的或人體的不溶性膠原骨基質(zhì)。優(yōu)選為人的不溶性膠原骨基質(zhì)，或hICBM。相應(yīng)地，明膠可以為人的明膠。
可以通過(guò)上述方法制備成骨蛋白。
成骨蛋白、hICBM和人明膠之間的質(zhì)量比約為0.4～0.6∶800～1200∶100～1000。
因此，誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)的組合物中成骨蛋白的含量可以約為400～600μg，hICBM的含量約為800～1200mg，人明膠的含量約為100～1000mg。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)的組合物中成骨蛋白的含量約為500μg，hICBM的含量約為1000mg，人明膠的含量約為200mg。
本發(fā)明延及如上所述的誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)的組合物，其中通過(guò)上述改進(jìn)方法制備成骨蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了制備誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)的組合物的方法，該方法包括混合成骨蛋白、不溶性骨基質(zhì)和明膠的步驟。
所述不溶性膠原骨基質(zhì)可以為哺乳動(dòng)物的，并且可以選自非人體的或人體的不溶性膠原骨基質(zhì)。優(yōu)選為人體的不溶性膠原骨基質(zhì)或hICBM。明膠可以為人的明膠。
可以通過(guò)上述方法制備成骨蛋白。
成骨蛋白、hICBM和人的明膠之間的質(zhì)量比可以為0.4～0.6∶800～1200∶100～1000。
因此，該方法可以包含混合約400～600μg的成骨蛋白、約800～1200mg的hICBM、約100～1000mg的人明膠。在優(yōu)選實(shí)施例中，該方法可以包含混合約500μg的成骨蛋白、約1000mg的hICBM、約200mg的人明膠。
該方法可以包括將成骨蛋白與hICBM在稀酸性水溶液中混合、凍干所得混合物，以制備干粉末，并將該粉末與人的明膠混合，以制備水合材料。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物骨骼生長(zhǎng)的設(shè)備，該設(shè)備包括含有成骨蛋白、不溶性骨基質(zhì)和明膠的誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物，和用于向治療部位輸送所述組合物的輸送裝置。
所述成骨蛋白、不溶性骨基質(zhì)和明膠可以為上述類型。所述輸送裝置可以為注射器。
尤其，該組合物可以為上述的可以被容納在注射器中的水合性的干粉。因此，通過(guò)向注射器中注入鹽水溶液，所述材料可以被水合，以注入到輸送部位內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種在具有骨骼缺陷的哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)骨骼形成的方法，該方法包括向哺乳動(dòng)物的骨骼缺陷處注入上述誘導(dǎo)骨骼的組合物的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中異位骨生長(zhǎng)的方法，該方法包括向哺乳動(dòng)物的非骨質(zhì)部位注入上述誘導(dǎo)骨骼的組合物的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種加速哺乳動(dòng)物中異源骨愈合的方法，該方法包括將異源骨物質(zhì)與上述誘導(dǎo)骨骼的組合物一起注入哺乳動(dòng)物中需要異源骨愈合的位置的步驟。
該異源骨材料可以為組織庫(kù)的骨，包括人的皮層骨片、松質(zhì)骨塊、松質(zhì)骨粉、全骨或脫礦骨基質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于加速哺乳動(dòng)物中自體骨移植愈合的方法，該方法包括將自體骨材料與上述誘導(dǎo)骨的組合物一起注入哺乳動(dòng)物中需要自體骨移植愈合的位置。
所述自體骨材料可以為髂嵴自體骨。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于誘導(dǎo)具有骨骼缺陷的哺乳動(dòng)物中骨骼形成的方法中的物質(zhì)或組合物，所述物質(zhì)或組合物包括上述誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物，并且該方法包括將所述組合物注入哺乳動(dòng)物的骨骼缺陷處。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中異位骨生長(zhǎng)的方法中的物質(zhì)或組合物，該物質(zhì)或組合物包括上述誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物，并且所述方法包括將所述組合物注入哺乳動(dòng)物的非骨質(zhì)部位的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于加速哺乳動(dòng)物中異源骨愈合的物質(zhì)或組合物，該物質(zhì)或組合物包括上述誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物，并且所述方法包括將異源骨材料與所述組合物一起注入到哺乳動(dòng)物中需要異源骨愈合的位置的步驟。
所述異源骨材料可以為選自人的皮層骨片、松質(zhì)骨塊、松質(zhì)骨粉、全顆粒骨或脫礦質(zhì)骨基質(zhì)的組織庫(kù)的骨骼。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于加速哺乳動(dòng)物中自體骨移植愈合的物質(zhì)或組合物，該物質(zhì)或組合物包括上述誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物，并且所述方法包括將自體骨材料與所述組合物一起注入到哺乳動(dòng)物中需要自體骨移植愈合的位置的步驟。
所述自體骨材料可以為碎的髂嵴自體骨。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了物質(zhì)或組合物在制備用于誘導(dǎo)具有骨骼缺陷的哺乳動(dòng)物中骨骼形成的方法的藥物的應(yīng)用，所述物質(zhì)或組合物包括上述誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了物質(zhì)或組合物在制備用于誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中異位骨生長(zhǎng)的方法的藥物的應(yīng)用，所述物質(zhì)或組合物包括上述誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了物質(zhì)或組合物在制備用于加速哺乳動(dòng)物中異源骨愈合的藥物中的應(yīng)用，所述物質(zhì)或組合物包括上述誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物和異源骨材料。
所述異源骨材料可以為選自人的皮層骨片、松質(zhì)骨塊、松質(zhì)骨粉、全骨或脫礦質(zhì)骨基質(zhì)的組織庫(kù)的骨骼。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了物質(zhì)或組合物在制備用于加速哺乳動(dòng)物中自體骨移植愈合的藥物中的應(yīng)用，所述物質(zhì)或組合物包括上述誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物和自體骨材料。
所述自體骨材料可以為碎髂嵴自體骨。
本發(fā)明相應(yīng)地涉及由哺乳動(dòng)物的骨制備成骨蛋白，及其在骨修復(fù)中與基質(zhì)相結(jié)合的應(yīng)用。
討論哺乳動(dòng)物的骨組織為被稱作骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的蛋白生長(zhǎng)和分化因子的家族的宿主。當(dāng)這些蛋白被注射到青年或成年哺乳動(dòng)物中時(shí)，其能夠誘導(dǎo)新骨形成。
BMPs在成年個(gè)體中被調(diào)遣以通過(guò)與胚胎分化極其類似的機(jī)制產(chǎn)生骨的再生。骨分化的發(fā)育過(guò)程包括間質(zhì)細(xì)胞的趨化作用、祖細(xì)胞的繁殖、軟骨的分化、血管侵入、骨形成、重新成型和最終的骨髓分化(Reddi，(1981)Collagen Rel.Res，1209-226)。已發(fā)現(xiàn)骨基質(zhì)的天然軟骨內(nèi)骨分化活性可以分離地被獲取，并且可以用無(wú)活性的殘余基質(zhì)再構(gòu)建，從而恢復(fù)全骨誘導(dǎo)活性(Sampath and Reddi，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 787599-7603)。Sampath等(1987)公開(kāi)了成骨素，即來(lái)自哺乳動(dòng)物骨骼的成骨蛋白的純化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7109-7113)。Urist等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81371-375)公開(kāi)了具有酸性多肽的特性、并具有約18kD分子量的牛的骨形態(tài)發(fā)生蛋白提取物。該作者報(bào)道了該蛋白存在于通過(guò)羥磷灰石層析分離的片斷，并且該蛋白誘導(dǎo)小鼠后腿肌肉中的骨骼形成，及在大鼠和狗的頭骨內(nèi)的環(huán)鉆損傷處的骨再生。
1985年10月7日出版的歐洲專利申請(qǐng)No.148,155公開(kāi)了源自牛、豬和人的成骨蛋白。其中一種被發(fā)明人命名為P3蛋白，并具有22～24kD分子量的蛋白質(zhì)，被報(bào)道已經(jīng)被純化至基本均質(zhì)態(tài)。據(jù)報(bào)道，當(dāng)該材料被注入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，能夠誘導(dǎo)骨形成。
本發(fā)明的目的是提供一種以高產(chǎn)率由哺乳動(dòng)物骨組織制備成骨蛋白的方法。另一目的是提供一種含有被吸附到基質(zhì)上的成骨蛋白的骨骼誘導(dǎo)的設(shè)備作為所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白的輸送系統(tǒng)。
本發(fā)明提供了成骨設(shè)備，當(dāng)在哺乳動(dòng)物的骨骼缺陷處植入時(shí)，它能夠在植入處誘導(dǎo)骨骼的完全再生，和隨后的缺陷愈合。該設(shè)備包括下述基質(zhì)載體材料，和成骨蛋白，即含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的總提取骨蛋白的一部分。
成骨蛋白需要適當(dāng)?shù)妮斔筒牧系拇嬖冢詫?shí)現(xiàn)其骨再生作用。從去礦質(zhì)骨基質(zhì)中純化的基質(zhì)為這種適合的材料，并在以下進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
用于分離成骨蛋白的方法部分采用了Sampath等(1987)公開(kāi)的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7109-7113)。該方法利用了BMP’s對(duì)被固定在層析載體顆粒上的羥磷灰石和肝磷脂的親和性，以實(shí)現(xiàn)富BMP片斷的分離。該方法使用了在肝磷脂層析柱上的去礦質(zhì)骨的尿素提取物的層析，隨后使用羥磷灰石柱，最后使用凝膠排阻層析，以去除重分子量污染物。盡管該方法取得了對(duì)具有成骨能力的片斷的有效分離，但是使用本發(fā)明的方法成骨蛋白的產(chǎn)量、產(chǎn)率和純化速度都極大地被提高。
本發(fā)明的成骨蛋白的制備是基于Sampath等的方法(1987)，但是包括了新穎的和創(chuàng)造性的改進(jìn)。關(guān)鍵的改進(jìn)涉及在層析之前，在純化過(guò)程開(kāi)始時(shí)，將總骨蛋白提取物分為高、低的分子量部分。骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有約30kDa的分子量，并且出于本說(shuō)明的目的，被分類為低分子量的多肽。對(duì)本說(shuō)明來(lái)說(shuō)，高分子量的多肽包括分子量大于100kDa并且尤其大于300kDa的多肽。所述高分子量片斷包括膠原和膠原片斷(約100kDa)，以及膠原聚集物(200kDa，或更高)，和其它的未識(shí)別的多肽，其中一些被認(rèn)為是形態(tài)發(fā)生素誘導(dǎo)的成骨作用的抑制劑。對(duì)本說(shuō)明來(lái)說(shuō)，注意到在肝磷脂親和層析步驟之前，在此方法的開(kāi)始時(shí)，從低分子量片斷中分離膠原是很重要的。
出于以下原因，膠原的分離是重要的。首先，I型膠原被認(rèn)為具有BMPs親和性(Reddi AH(1995)Cartilage morphogenesisrole of boneand cartilage morphogenetic proteins，homeobox genes andextracellular matrix.Matrix Biol.Oct 14(8)599-606.；Winn SR，Uludag H，Hollinger JO.(1999) Carrier systems for bonemorphogenetic proteins.Clin Orthop 1999 Oct(367Suppl)S95-106)。其次，肽為經(jīng)常阻塞柱子、并且以阻礙結(jié)合的方式來(lái)改變BMP與肝磷脂分子上的結(jié)合位點(diǎn)的交換動(dòng)力學(xué)的大MW肽。此外，似乎可能存在在總提取骨蛋白的高分子量片斷中殘留骨形態(tài)發(fā)生蛋白，即成骨蛋白的活性組分，的抑制因子。這表明在I型膠原和肝磷脂之間存在對(duì)BMPs的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。這種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的阻擾看來(lái)導(dǎo)致BMPs在肝磷脂柱上的層析純化過(guò)程中的產(chǎn)率損失。本發(fā)明的方法在總成骨活性的回收方面取得了超過(guò)現(xiàn)有技術(shù)方法的顯著進(jìn)步。
現(xiàn)在，通過(guò)參考以下實(shí)施例和附圖的方式描述本發(fā)明。


圖1表示不同時(shí)間的被治療的骨折不愈合(non-union)的X射線測(cè)定值；圖2表示常規(guī)方法治療后的患者的骨骼中的骨折不愈合。
圖3表示經(jīng)過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法的治療后，圖2中的患者的骨骼的完全愈合。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白的人成骨蛋白的純化1.去礦質(zhì)骨的制備無(wú)軟組織粘附的人長(zhǎng)骨骨干被去骨髓，然后切成1～4cm的片。該材料在含有體積比為50∶50的甲醇和氯仿的溶劑體系中，在4～8℃下被脫脂16～24小時(shí)。然后，在4～8℃下此骨在純乙醇中被脫水48小時(shí)。倒出乙醇，并且該骨在通風(fēng)櫥中被空氣干燥48～96小時(shí)。然后，用錘式粉碎機(jī)磨碎骨頭，以使顆粒直徑范圍為10～425微米。
在室溫下通過(guò)連續(xù)加入4～5體積的0.5M HCl，直至通過(guò)一段時(shí)間內(nèi)的pH變化的減緩而判斷骨骼中的羥磷灰石和鹽酸之間的酸堿反應(yīng)已經(jīng)接近完成，從而去除該微粒材料的礦質(zhì)。用稀釋的碳酸氫鈉溶液中和該去礦質(zhì)骨，然后用純化的水清洗，以制備去礦質(zhì)的骨基質(zhì)。
2.去除礦質(zhì)的骨基質(zhì)的不連續(xù)提取由以上步驟制備的去礦質(zhì)骨基質(zhì)(DBM)用3～4體積的8M尿素，pH7.4，含有蛋白酶抑制劑(5mM鹽酸苯甲脒，0.1M 6-氨基己酸，5mMN-乙基馬來(lái)酰亞胺和0.5mM苯基甲磺酰氟)的50mM Tris-HCl在4～8℃下24小時(shí)提取2次。通過(guò)經(jīng)過(guò)多孔聚丙稀玻璃料的過(guò)濾收集上清，然后通過(guò)3微米標(biāo)準(zhǔn)尺寸的筒式過(guò)濾器(Polygard，MilliporeCorporation，美國(guó))過(guò)濾。
3.高分子量組分的超濾分離通過(guò)將步驟2中的上清液通過(guò)300kDa標(biāo)準(zhǔn)分子量膜(Millipore，Cat.No.CDUF006TM)進(jìn)行超濾從而去除重分子量蛋白和膠原?？梢匀芜x使用具有稍低的總BMP活性的產(chǎn)率、但具有較高特異活性的100kDa標(biāo)準(zhǔn)分子量膜。該方法去除去除在較低離子強(qiáng)度的條件下結(jié)合BMPs的膠原，尤其I型膠原。滲余物用6M尿素緩沖液、pH7.4的50mMTris-HCL(緩沖液A)液清洗幾次，然后收集含有成骨活性的滲濾物。
4.通過(guò)超濾緩沖液交換的濃縮和去鹽步驟3中的含有成骨蛋白(分子量約為30kDa)的滲濾物通過(guò)在10kDa PLGC膜(Millipore，Cat.No.SK1P003W4)上的超濾被去鹽并濃縮。該步驟有效地去除了鹽和其它的低分子量組分，從達(dá)到以下層析步驟所需的條件。濃縮后，相繼量的含有上述濃度的酶抑制劑、但是除了n-乙基馬來(lái)酰亞胺外的緩沖液A被加入到滲余物中，直至該滲余物的傳導(dǎo)率達(dá)到5.0～6.0毫西門(mén)子。
5.肝磷脂-瓊脂糖層析步驟4中的滲余物在已用含0.15M NaCl的緩沖液A平衡的肝磷脂-瓊脂糖CL6b(Pharmacia-Amersham)上被層析。該柱子用3柱體積的含有0.15M NaCl的緩沖液A清洗，然后用含有0.5M NaCl的緩沖液A洗脫。收集在280nm處具有吸收的洗脫峰，并在4℃保存。
6.肝磷脂-瓊脂糖親和性片斷的超濾交換步驟5中的肝磷脂-瓊脂糖親和性片斷通過(guò)在PLCC 5kDa膜(Millipore，Cat.No.CDUF001LC)上的超濾被去鹽并被濃縮。該步驟有效地去除鹽和其它的低分子量組分，以達(dá)到下一層析步驟所需的條件。濃縮后，相繼量的含有10mM磷酸鈉的緩沖液A被加到滲余物中，直至該滲余物的傳導(dǎo)率達(dá)到5.0～6.0毫西門(mén)子。
7.羥磷灰石(HA)層析步驟6中得到的滲余物在已被含10mM磷酸鈉的緩沖液A平衡的羥磷灰石柱(Hydroxyapatite Ultrogel，Biosepra，法國(guó))上被層析。該柱子用3柱體積的含有10mM磷酸鈉的緩沖液A清洗。用含有150mM磷酸鈉的緩沖液A洗脫富含成骨蛋白的片斷。收集在280nm處具有吸收的洗脫峰，并在4℃保存。
8.將HA親和性片斷交換到10mMHCl中使用負(fù)載有3kDa截留值的纖維素膜(YM3，76mm再生纖維素，Millipore Corporation，美國(guó))的Amicon攪拌式超濾器(MilliporeCorporation，美國(guó))將步驟7中的HA親和性的片斷交換到10mM HCl溶液中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，HA親和性片斷被改為負(fù)載到C-18Vydac硅基HPLC柱(顆粒直徑為5μm，孔尺寸為300)上。用10柱體積的0.1％的三氟乙酸、10％乙腈洗柱子，并用70％乙腈、0.1％三氟乙酸逐步洗脫結(jié)合蛋白。凍干該材料，并在10mM HCl中被重組。
在表1中列出具有蛋白值的方法流程圖。
表1

被加載在1.2g基質(zhì)上的500μg的實(shí)施例1中步驟8的材料，誘導(dǎo)人的頑固性長(zhǎng)骨不結(jié)合處的新骨形成。通過(guò)S-200凝膠過(guò)濾層析(Pharmacia)分析步驟8中的材料，并發(fā)現(xiàn)含有20％質(zhì)量的高分子量組分。這些組分可以通過(guò)使用S-200基質(zhì)(Pharmacia)上的凝膠排阻層析和用8M脲，1M NaCl，50mM pH7.4的Tris-HCl洗脫的“純化”步驟被任選地去除。最終的產(chǎn)率范圍為30mg～50mg的成骨蛋白。這些產(chǎn)率比那些已報(bào)道的使用相當(dāng)?shù)钠鹗脊遣牧虾突诹u磷灰石親和性、肝磷脂親和性和在S-200基質(zhì)(Pharmacia)上的凝膠排阻層析的方法的狒狒骨提取(Ripamonti U，Ma SS，Cunningham NS，Yeates L，Reddi AH(1993)Reconstruction of the bone-bone marrow organ by osteogenin，abone morphogenetic protein，and demineralised bone matrix in calvarialdefects of adult primates(Plastic and Reconstructive Surgery 91(1)27-36))的產(chǎn)率高4倍。在人和狒狒的髂嵴骨活組織切片檢查之間的對(duì)比組織形態(tài)研究已經(jīng)表明在兩個(gè)物種之間具有顯著程度的相似性(SchnitzlerCM，Ripamonti U，and Mesquita JM(1993)Histomorphometry of iliaccrest trabecular bone in adult male baboons in captivity，Calcif，Tiss.Int.，52，447-454)。
實(shí)施例2成骨蛋白的成骨活性的測(cè)定大鼠的生物鑒定成骨活性的生物試驗(yàn)如Sampath和Reddi(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)806591-6595)所述。該試驗(yàn)包括在被醚麻醉的受體鼠的皮下植入含有不溶性骨基質(zhì)和人成骨蛋白的測(cè)試樣品。在無(wú)菌條件下在胸部區(qū)域的皮膚上切開(kāi)垂直的切口(1cm)，并且通過(guò)鈍器解剖制成對(duì)稱的小袋。植入物包括25mg的大鼠ICBM，50mg溶于0.5M乙酸中的鼠尾I型膠原，和可變量的成骨蛋白。測(cè)試樣品被對(duì)稱植入到各小袋中，并且縫合切口。異向的位點(diǎn)使能夠進(jìn)行骨誘導(dǎo)的研究，而無(wú)由于使用骨質(zhì)位點(diǎn)而導(dǎo)致的可能的混淆。
在植入后的第12天取出再生組織，并且如所述的(Reddi andSullivan 1980 Endocrinology 1071291-1299)進(jìn)行骨形成標(biāo)記的堿性磷酸酶活性的試驗(yàn)。結(jié)果和數(shù)據(jù)如表2所示。
表2

*hICBM-人不溶性骨基質(zhì)大鼠植入模型顯示了通過(guò)成骨蛋白誘導(dǎo)的軟骨內(nèi)骨發(fā)育的階段的可控制的進(jìn)展。該后胚胎骨生成可以被認(rèn)為概要重現(xiàn)了正常的胚胎骨發(fā)育過(guò)程中的活動(dòng)。新骨的形成經(jīng)過(guò)局部間葉細(xì)胞濃縮、軟骨階段和細(xì)胞外基質(zhì)形成、血管侵入和礦質(zhì)化，以及最后經(jīng)由骨原細(xì)胞系分化的新骨的形成。
使用甲苯胺藍(lán)或蘇木精/伊紅(hemotoxylin/eosin)染色的組織學(xué)分析清晰地表明軟骨的發(fā)育。十二天的植入通常足以確定是否該植入物具有骨誘導(dǎo)活性。
堿性磷酸酶活性可以作為骨生成的標(biāo)記。在植入物均質(zhì)化和在堿性條件下以p-磷酸硝基苯做底物進(jìn)行酶活性試驗(yàn)后，可以通過(guò)分光光度測(cè)定酶活性。在組織學(xué)上不顯示骨發(fā)育的植入物在這些試驗(yàn)條件下應(yīng)該不具有堿性磷酸酶活性(Reddi AH and Sullivan NE(1980)Endocrinology 107，1291-1299)。該試驗(yàn)對(duì)于堿性磷酸酶的特異的和總活性的定量是有用的，并且這可能與所述被制備的成骨蛋白的骨誘導(dǎo)能力相關(guān)。
根據(jù)Reddi和Sullivan(1980，Endocrinology 107，1291-1299)的方法測(cè)定堿性磷酸酶活性。鼠植入物誘導(dǎo)的1單位或更多的堿性磷酸酶說(shuō)明了有效的性生成。
實(shí)施例3人明膠的制備在硼硅酸鹽玻璃瓶中混合一定量的ICBM和5～10體積的水，并在高壓鍋中加熱1小時(shí)。用Whatman No.1濾紙或20微米的不銹鋼篩過(guò)濾上清。將明膠溶液冷卻到25℃，并向膠原沉淀物中加入5體積冷乙醇(-20℃)。在真空中干燥沉淀物，并且被研磨至75～425微米的尺寸范圍。
實(shí)施例4
成骨設(shè)備的制造人ICBM被用作制備骨誘導(dǎo)性的組合生物材料的可吸附性的載體基質(zhì)。當(dāng)足夠量的成骨蛋白與ICBM混合時(shí)，無(wú)活性的ICBM被恢復(fù)生物活性。ICBM的顆粒尺寸影響新骨的量反應(yīng)。75～420μm的顆粒引起最大反應(yīng)。一定量的ICBM與成骨蛋白在10mM HCl中混合，并且用無(wú)菌調(diào)藥刀徹底混合。所得材料被凍干干燥。
然后，將該材料與人ICBM源的明膠混合。將各組分充分干燥混合到一起，以獲得均質(zhì)分布的混合物。人明膠發(fā)揮使生物材料可被擠壓的易水合性材料的作用。該組合物被裝載到注射器中。當(dāng)使用時(shí)，該骨誘導(dǎo)性組合物被再水合。當(dāng)將一定量的無(wú)菌鹽水或水吸入到注射器中時(shí)，再水合作用被實(shí)現(xiàn)，并且需要約10分鐘以使再水合作用發(fā)生。然后，可以通過(guò)推動(dòng)活塞而容易地將所述物質(zhì)排出注射器。這使在手術(shù)時(shí)能夠?qū)⒕_量的植入物置入缺陷部位。植入物可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的明膠海綿如Spongostan(Johnson and Johnson Medical Limited，U.K.)而進(jìn)一步在原位被施用。
載體可以被可生物降解的合成物或合成的無(wú)機(jī)基質(zhì)(如，HAP、膠原、磷酸三鈣、或聚乳酸、聚乙醇酸及其各種共聚物)替代。
表3中列出成骨組合物的典型配方。
表3


周的平均術(shù)后階段內(nèi)達(dá)到高于2的分值。由受過(guò)訓(xùn)練的臨床醫(yī)生根據(jù)1～5的標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)放射線照相來(lái)估測(cè)橋變(bridging)，其中1＝骨未連合/無(wú)骨痂，2＝無(wú)橋變的骨痂，3＝中等橋變，4＝良好的橋變，5＝完全結(jié)合。與1.44的治療前值相比，治療組在20周的術(shù)后階段時(shí)的平均值為2.80。該結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明的成骨組合植入物對(duì)難治性骨不連具有有效治療作用。圖1中列出了在不同術(shù)后階段所測(cè)定的值。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由本發(fā)明的成骨生物材料組合物誘導(dǎo)的骨骼的多步發(fā)育階段包括纖維蛋白和纖維結(jié)合蛋白與生物材料的結(jié)合、細(xì)胞的趨化現(xiàn)象、纖維原細(xì)胞的繁殖、間葉細(xì)胞的濃縮、分化為成軟骨細(xì)胞、軟骨發(fā)生、血管侵入、骨骼形成、再成型和骨髓分化。
本發(fā)明的可注射的生物材料具有很多優(yōu)點(diǎn)。它可以在室溫下被儲(chǔ)存很長(zhǎng)時(shí)間，而沒(méi)有明顯的生物活性下降。當(dāng)手術(shù)時(shí)，本發(fā)明的可注射的生物材料可以容易地被再水合，并且易于操作，僅需要推動(dòng)注射器的活塞以推出所需量的成骨物質(zhì)。
由臨床觀察來(lái)看，該成骨生物材料組合物具有以下優(yōu)點(diǎn)。它具有在植入位點(diǎn)誘導(dǎo)骨骼的成骨性。它避免了在患者的髖部進(jìn)行再次手術(shù)以獲得自體骨的需要，并且避免使用組織庫(kù)的骨的需要。這樣降低了傳染疾病的危險(xiǎn)。
ICBM結(jié)合成骨蛋白，并且起到緩慢釋放運(yùn)送系統(tǒng)的作用，以活化植入位點(diǎn)處的祖細(xì)胞。本發(fā)明的復(fù)合生物材料適應(yīng)骨骼發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞應(yīng)答的各步驟。該組合生物材料是可生物相容的，并且在成骨過(guò)程中可以被再吸收，并被宿主自身的骨骼替代。
由其顆粒尺寸所測(cè)定的所述生物材料幾何形狀對(duì)于進(jìn)行細(xì)胞滲透和分化是最優(yōu)的。
權(quán)利要求
1.對(duì)從骨骼中分離成骨蛋白的方法的改進(jìn)，在該方法中，含有片斷的成骨蛋白從骨骼中被提取，并且通過(guò)選自超濾和層析的富集步驟的順序被富集，所述改進(jìn)在于在富集步驟之前去除含有片斷的成骨蛋白中的較高分子量組分。
2.如權(quán)利要求1所述的改進(jìn)，其中該較高分子量組分具有約100～300kDa的分子量。
3.如權(quán)利要求1或2所述的改進(jìn)，其中該較高分子量組分選自膠原、膠原片斷、膠原聚集體及其混合物。
4.如權(quán)利要求1或2所述的改進(jìn)，其中通過(guò)超濾去除較高分子量組分。
5.如權(quán)利要求3所述的改進(jìn)，其中通過(guò)經(jīng)100～300kDa標(biāo)準(zhǔn)分子量的聚砜薄膜的超濾而去除所述較高分子量組分。
6.如權(quán)利要求8～10中任意一項(xiàng)所述的改進(jìn)，其中含有片斷的成骨蛋白通過(guò)連續(xù)的超濾步驟被濃縮并被去鹽。
7.一種包括成骨蛋白、不溶性骨基質(zhì)(ICBM)和明膠的誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物，其中通過(guò)如權(quán)利要求1～6中任意一項(xiàng)所述的改進(jìn)方法制備成骨蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物，該誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物為水合性粉末形式。
10.如權(quán)利要求7～9中任意一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物，其中成骨蛋白、hICBM和明膠之間的質(zhì)量比為0.4～0.6∶800～1200∶100～1000。
11.一種制備誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物的方法，該方法包括混合成骨蛋白、不溶性骨基質(zhì)和明膠的步驟。
12.如權(quán)利要求11所述的步驟，其中通過(guò)如權(quán)利要求1～6中任意一項(xiàng)所述的改進(jìn)方法制備成骨蛋白。
13.一種用于誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物骨骼生長(zhǎng)的設(shè)備，該設(shè)備包括含有成骨蛋白、不溶性骨基質(zhì)和明膠的誘導(dǎo)骨骼生長(zhǎng)的組合物，和用于向治療部位輸送所述組合物的輸送裝置。
14.如權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其中通過(guò)如權(quán)利要求1～6中任意一項(xiàng)所述的改進(jìn)方法獲得成骨蛋白。
15.如權(quán)利要求13或14所述的設(shè)備，其中該輸送裝置為注射器。
16.如權(quán)利要求13～15中任意一項(xiàng)所述的設(shè)備，其中所述組合物為水合性粉末。
全文摘要
在從骨骼中分離成骨蛋白的方法中，含有片斷的成骨蛋白從骨骼中被提取，并且通過(guò)選自超濾和層析的富集步驟的順序被富集。本發(fā)明的改進(jìn)在于在富集步驟之前從含有片斷的成骨蛋白中去除較高的分子量組分。該較高分子量組分具有約100～300kDa的分子量，并且選自膠原、膠原片斷、膠原聚集體及其混合物。
文檔編號(hào)A61K38/39GK1678631SQ03814401
公開(kāi)日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
發(fā)明者尼古拉斯·杜內(nèi)斯 申請(qǐng)人:尼古拉斯·杜內(nèi)斯