專利名稱：內毒素結合的配體及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及親和配體和它們從各種流體如水、水溶液、血液、血漿、藥物產品、抗生素、疫苗、蛋白質、核酸和其它生物產品中除去內毒素的用途。
背景技術：
內毒素是在革蘭氏陰性菌如大腸桿菌的外膜中發(fā)現(xiàn)的脂多糖(LPS)(Raetz，Ann.Rev.Biochem.，1990，p.129，Vol.59)。LPS分子含有三個不同的化學區(qū)域，脂質A區(qū)，中心多糖區(qū)和O-抗原區(qū)。脂質A區(qū)由含磷酸基的葡糖胺二糖組成且被長鏈脂肪酸高度取代和認為決定了內毒素的毒性效果(Rietschel等，Cellular and Molecular Aspects ofEndotoxin Reaction，Ed.Nowotny，A.，Spitzner，J.J.and Ziegler，E.J.，1990，p15)。
由內毒素誘導的生物效果來自于免疫系統(tǒng)的激活，特別地單核細胞和巨噬細胞的激活，且極其多樣，其中包括發(fā)燒、代謝破壞和毒膿性休克(Martich等，Immunobiology，1993，p.403，Vol.187)。由于內毒素潛在有害的效果，因此在生物衍生的產品和用于治療用途的藥物產品中內毒素的存在是主要關心的區(qū)域。盡管保持無菌過程可確保生物產品不含內毒素，但這通常不可能，特別地當生物產品在革蘭氏陰性菌源如大腸桿菌中表達時。使內毒素失活的典型方法包括暴露于濃氫氧化鈉(1M NaOH)和/或長期熱處理(250℃)。然而，這種處理方法不可用于大多數(shù)生物產品。
已使用許多技術從生物產品中除去內毒素和包括超濾(Sweadner等，Appl.Environ.Microbiol.，1977，p.382，Vol.34；Li等，Biotechnol.Tech.，1998，p.119，Vol.12)、炭吸附(Nagaki等，Int.J.Artif.Organs.，1991，p.43，Vol.14)、尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法(Hou等，J.Parenter.Sci.Technol.，1990，Vol.44；Hou等，Biotechnol.Bioeng.，1990，p.315，Vol.12；Neidhardt等，J.Chromatogr.，1992，p.255，Vol.590)和親和色譜法。所有這些技術顯示出明顯的缺點，特別是當應用到從治療蛋白質和其它生物產品中除去內毒素上時。炭吸附和離子交換色譜降低蛋白質溶液中的內毒素含量，但它們還傾向于結合生物組分。
已使用親和色譜法在固定的多粘菌素B上實現(xiàn)了內毒素的有效去除(Talmadge等，Chromatogr.，1989，p.175，Vol.476；Anspach等，J.Chromatogr.A，1995，p.81，Vol.711)。然而，對多粘菌素B瀝濾液的潛在毒性的擔心限制了它的應用?；谶B接到固相基體上的二氨基烷烴和單氨基烷烴化合物的合成配體已用于從水溶液中除去內毒素，但僅顯示出有限的能力結合內毒素(Hou等，Biochim.Biophys.Acta，1991，p.149，Vol.1073)。
J.Chromatography，248，401-408(1982)和262，193-198(1983)以及US-A-4381239公開了共價連接到固體基體上的組胺和其它芳族氮雜環(huán)。
US-A-5358933公開了細菌內毒素解毒和防止與治療毒膿性休克用的合成肽。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一類新的合成親和配體結構，其用于從含生物治療產品的溶液中選擇性捕獲和除去內毒素。可通過下述通用結構(結構1和2)描述本發(fā)明的合成親和配體-基體共軛物結構1
結構2 其中A表示任選取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀飽和烴鏈，和在各重復單元內的各A可以相同或不同；X1、X2和X3各自獨立地表示氫原子或烷基取代基；n為2或更大；m為1或更大；和配體通過任選的間隔基臂連接到支持基體Z上。
特別地，結構2的共軛物可能是新的。
優(yōu)選實施方案的說明具有結構1或2的多胺配體具有至少3個基本氮原子，和這些氮原子優(yōu)選通過至少兩個碳原子彼此隔開。氮原子可以是伯、仲、叔或季胺基，和在一對氮原子之間的插入碳原子可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀烴鏈。
作為實例，A可具有式-(CH2)x-CHR-(CH2)y-結構，其中x和y獨立地為0、1或2，和R為H或C1-4烷基，例如氫、甲基、乙基、丙基或丁基。特別地，A可以是二價C1-4烷基，即甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，或1，4-環(huán)亞己基，例如衍生于反式-1，4-二氨基環(huán)己烷的1，4-環(huán)亞己基。更一般地，A可具有最多6-10個碳原子。
m和n各自優(yōu)選為1、2、3或4。X可具有最多6或10個碳原子。
支持基體Z可以是粒狀或非粒狀、可溶或不可溶、多孔或非多孔的任何化合物或材料，其可用于固定內毒素親和配體，形成內毒素配體-基體共軛物，從而提供從接觸溶液中除去內毒素的方便方式。粒狀支持基體的實例包括天然聚合物，如瓊脂糖、糊精、纖維素或淀粉，合成聚合物和共聚物如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、全氟碳和聚甲基丙烯酸甲酯，和無機化合物如二氧化硅、玻璃、氧化鋁和金屬氧化物?？扇茌d體的實例包括糊精的聚合物、聚乙烯醇、聚乙二醇和水解淀粉。支持基體也可以是含上述聚合物和其它聚合物如硝基纖維素、聚醚砜和尼龍的膜或片材形式。
可通過使用各種活化劑，其中包括，但不限于溴化氰、表氯醇、1，4-丁二醇二縮水甘油醚、1，2，7，8-二環(huán)氧基辛烷、甲苯磺酰氯、tresylchloride、二乙烯基砜和氰尿酰氯，實現(xiàn)配體共價連接到支持基體Z上。
間隔基臂可以不存在。若存在的話，它可作為部分活化步驟引入，和優(yōu)選由以下結構來表示-T-L-其中T表示氧原子、硫原子或基團N-R2，其中R2表示氫原子或含有1-6個碳原子的烷基；和L是含有2-20個碳原子的任選取代的烷基、烷基醚、烷基硫醚、烷基酯或酰胺鍵。
本發(fā)明特別優(yōu)選的共軛物包括Z-(間隔基)-NH(CH2)2N[(CH2)2NH2]2(A)Z-(間隔基)-NH(CH2)2NH(CH2)2NH2(B)Z-(間隔基)-NH(CH2)2NH(CH2)2NH(CH2)2NH2(C)Z-(間隔基)-NH(CH2)2NH(CH2)3NH2(D)Z-(間隔基)-NH(CH2)3NH(CH2)3NH(CH2)3NH2(E)Z-(間隔基)-NH(CH2)3NH(CH2)2NH(CH2)3NH2(F)Z-(間隔基)-NH(CH2)2N[(CH2)3NH2]2(G)其中Z和(間隔基)具有與此前所述相同的含義。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可通過將合適的多胺共價偶聯(lián)到預活化的水不溶基體上，從而方便地制備本發(fā)明的親和共軛物。例如，可根據(jù)以下所示的反應過程(過程1)，實現(xiàn)將多胺配體(A)偶聯(lián)到表氯醇活化的瓊脂糖基體上過程1 在Z和多胺配體之間的插入基團形成間隔基臂。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，從含內毒素的溶液中捕獲和除去內毒素的方法包括優(yōu)選在1.0-13.0的pH范圍內，使如上所述的親和共軛物與該溶液接觸。這種溶液的實例包括流體如水、水溶液、血液、血漿、藥物產品、抗生素、蛋白質、核酸和其它生物產品。本發(fā)明的內毒素結合的配體-基體共軛物的另一用途是用于從全血或血漿中體外除去內毒素?？赏ㄟ^使用重力或其它機械方式，在柱內填充共軛物，并使內毒素污染的溶液流過該柱，方便地使用內毒素結合的配體-基體共軛物?；蛘?，可將該共軛物與含內毒素的溶液混合并以分批的方式使用。
在本發(fā)明另一實施方案中，可將該共軛物連接到多孔膜上并用作一次使用的可棄置過濾設備，供從溶液中選擇除去內毒素。
在本發(fā)明另一實施方案中，本發(fā)明的內毒素結合配體可被連接到可溶聚合物或非聚合物載體如葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙二醇或水解淀粉上，例如用于內毒素的體內捕獲和解毒。
已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的共軛物高度有效，和在從抗菌素與蛋白質的緩沖和非緩沖溶液中除去內毒素方面具有選擇性，同時證明對生物組分具有低的選擇性。
下述實施例闡述本發(fā)明。實施例1-3示出了共軛物的制備，和實施例4-6示出了它們在內毒素去除上的用途。
實施例1第1階段-表氯醇活化的PuraBead6XL的制備不含防腐劑的PuraBead6XL(200g沉降重量)、RO水(128ml)和10M氫氧化鈉(3.2ml)的漿料與表氯醇(14.4ml)在40℃下反應1小時。用RO水(10×200ml等份)徹底洗滌環(huán)氧活化的PuraBead6XL，除去過量反應物，并立即在第2階段中使用。
第2階段-三(2-氨基乙基)胺-PuraBead6XL的制備將來自第1階段的環(huán)氧活化的PuraBead6XL(200g沉降重量)等份地添加到三(2-氨基乙基)胺(15.97g，在80ml RO水中)的水溶液中，并在40℃下攪拌反應混合物16小時。用RO水(10×200ml等份)洗滌所得胺化吸收劑，并在20％(v/v)的含水乙醇中儲存直到進一步使用。
實施例2第1階段-表氯醇活化的PuraBead6XL的制備不含防腐劑的PuraBead6XL(200g沉降重量)、RO水(128ml)和10M氫氧化鈉(3.2ml)的漿料與表氯醇(14.4ml)在40℃下反應1小時。用RO水(10×200ml等份)徹底洗滌環(huán)氧活化的PuraBead6XL，并立即在第2階段中使用。
第2階段-三亞乙基四胺-PuraBead6XL的制備將來自第1階段的環(huán)氧活化的PuraBead6XL(200g沉降重量)等份地添加到三亞乙基四胺(8.04g，在60ml RO水中)的水溶液中，并在40℃下攪拌所得漿料16小時。用大量RO水(10×200ml部分)洗滌所得胺化吸收劑，以除去過量多胺。
實施例3
用10床體積的RO水洗滌PuraBead 6XL，并用192ml RO水使300g排出的凝膠變成漿料。添加10M氫氧化鈉(4.8ml)，和溫熱混合物到36℃，隨后添加21.6ml表氯醇。反應溫度增加到40℃，并在該溫度下維持1小時，之后用10床體積的RO水洗滌活化的PuraBead并允許在重力下排出。添加在60ml水中的N，N’-雙(3-氨基丙基)亞乙基二胺(9.586g)，和加熱向其中在30分鐘的時間段內分批添加100g環(huán)氧活化的瓊脂糖的混合物到40℃。在40℃下攪拌反應漿料，并用10床體積的水洗滌，以除去過量胺。
實施例4將根據(jù)實施例1-3制備的脫熱原(depyrogennated)的共軛物(1ml)(共軛物A、C和G)添加到含有大腸桿菌#0113:H10:K陰性內毒素(1.0×103EU)的慶大霉素(2ml，9mg/ml)水溶液中，和在25℃下攪拌所得漿料1小時。使用Limulus Amoebocyte Lysate Turbidimetric測定法，分析上清液中內毒素的存在(參見表1)。
表1
結果表明，從硫酸慶大霉素水溶液中極其有效和選擇地除去內毒素且慶大霉素的回收率為100％。
實施例5將脫熱原的共軛物(共軛物A，1ml)添加到含有大腸桿菌#0113:H10:K陰性內毒素(3.0×102EU)的人類血清白蛋白(2ml，27mg/ml)的緩沖(150mM磷酸鹽緩沖的鹽水，pH7.4)溶液中并在25℃下攪拌1小時。使用被校正的Limulus Amoebocyte LysateTurbidimetric測定法，分析上清液中未結合的內毒素，以檢測在合適濃度的人類血清白蛋白中的內毒素。結果見表2。
表2
結果證明，除去大于99％存在于人類血清白蛋白內的內毒素，同時維持所采用的蛋白質100％的回收率。
實施例6將根據(jù)實施例1和2制備的脫熱原共軛物(共軛物A和C，1ml)分別填充在玻璃柱(10mm內徑×30mm高度)內并用20ml不含內毒素的水平衡。將含有大腸桿菌#0113:H10:K陰性內毒素(7.5×103EU)的慶大霉素(1ml，3mg/ml)水溶液以61cm/hr的線性流速裝載到柱上。然后用不含內毒素的水(9ml)洗滌該柱，除去任何未結合的內毒素。使用Limulus Amoebocyte Lysate Turbidimetric測定法，分析流過的合并溶液的內毒素含量。結果見表3。
表權利要求
1.下述結構的親和配體-基體共軛物用于含水體系中內毒素的離析、分離、純化、表征、鑒定或定量化的用途Z-間隔基-[NX-A]m-NY-A-NX2其中m是至少為1的整數(shù)；各A獨立地表示含1-6個碳原子的任選取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀飽和烴鏈；各X獨立地表示氫或烷基；Y為X或A-NX2；和Z是通過任選的間隔基臂(間隔基)連接到配體上的支持基體。
2.權利要求1的用途，其中含水體系選自緩沖液、蛋白質、疫苗、抗生素、血液、血漿、血清、核酸、藥物產品和其它生物化合物。
3.權利要求1或2的用途，其中各A獨立地表示二價C1-4烷基。
4.前述任何一項權利要求的用途，其中存在間隔基且其具有如下結構-T-L-其中T表示O、S或N-R2，其中R2表示氫原子或含有1-6個碳原子的烷基；和L是含有2-20個原子的任選取代的烷基、烷基醚、烷基硫醚、烷基酯或酰胺鍵。
5.權利要求1-3任何一項的用途，其中間隔基不存在。
6.前述任何一項權利要求的用途，其中Z選自多孔瓊脂糖珠粒、全氟碳顆粒和功能膜。
7.前述任何一項權利要求的用途，其中配體選自二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、N，N-雙(3-氨基丙基)亞乙基二胺和N-(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺。
8.權利要求1-6任何一項的用途，其中配體是三(2-氨基乙基)胺。
9.前述任何一項權利要求的用途，其中含水體系具有在3-10范圍內的pH。
10.前述任何一項權利要求的用途，其中含水體系與共軛物的懸浮液或填充床接觸。
11.前述任何一項權利要求的用途，用于在體外設備中從全血或血漿中除去內毒素。
12.前述任何一項權利要求的用途，其中配體連接到可溶聚合物或非聚合物載體上，供體內捕獲內毒素。
全文摘要
下述結構Z－間隔基－[NX－A]
文檔編號A61M1/16GK1658908SQ03813610
公開日2005年8月24日 申請日期2003年5月22日 優(yōu)先權日2002年5月22日
發(fā)明者S·J·伯頓, T·博德格爾斯基, S·S·艾潘 申請人:普羅米蒂克生物科學有限公司