專利名稱：卡諾拉蛋白分離物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卡諾拉(canola)蛋白分離物組合物和上述組合物的各個蛋白質(zhì)組分。
背景技術(shù)：
卡諾拉蛋白分離物可由卡諾拉油籽粗粉制得。在共同未決的2001年5月4日提交的美國專利申請?zhí)?0/288,415、2001年10月5日提交的60/326,987、2001年11月7日提交的60/331,066、2001年11月26日提交的60/333,494、2002年4月24日提交的60/374,801以及2002年5月3日提交的10/137,391中描述了一種從卡諾拉油籽粗粉中生產(chǎn)卡諾拉蛋白分離物的方法，該蛋白分離物的蛋白質(zhì)含量為至少100％重量(N×6.25)，上述專利均指定了受讓人，其公開內(nèi)容在此均引入作為參考。該方法包括多步驟工序，其包含用鹽溶液浸提卡諾拉油籽粗粉，將所得蛋白質(zhì)水溶液與油籽粗粉殘渣分離，利用選擇性的膜技術(shù)在保持離子強(qiáng)度基本恒定的同時，將蛋白質(zhì)水溶液的蛋白質(zhì)濃度增加到至少約200g/L，將所得的濃縮的蛋白質(zhì)水溶液稀釋于冷卻水中，導(dǎo)致形成蛋白質(zhì)微粒，沉降蛋白質(zhì)微粒，形成無定形、稠密的粘膠質(zhì)面筋樣蛋白質(zhì)微粒團(tuán)(PMM)，并從上清液中回收蛋白質(zhì)微粒團(tuán)，其蛋白質(zhì)含量為至少約100％重量，以Kjeldahl氮(N)×6.25測定。在此處提到的蛋白質(zhì)含量是以干重為基準(zhǔn)測定的?；厥盏腜MM可被干燥。
在上述方法的一個實施方案中以及特別是如專利申請?zhí)?0/326,987、60/331,066、60/333,494、60/374,801和10/137,391中所描述的，處理來自PMM沉降步驟的上清液，以從濕的PMM和上清液中回收含有干燥蛋白的蛋白分離物。該工藝是通過最初用超濾膜濃縮上清液，然后將濃縮的上清液與濕PMM混合并干燥該混合物而完成的。所得的卡諾拉蛋白分離物具有至少約90％重量蛋白質(zhì)(N×6.25)的高純度，優(yōu)選至少約100％重量蛋白質(zhì)(N×6.25)。
在上述方法的另一個實施方案中以及特別是如專利申請60/333,494、60/374,801和10/137,391所描述的，處理來自PMM沉降步驟的上清液，以從上清液中回收蛋白質(zhì)。該工藝是通過最初用超濾膜濃縮上清液并干燥濃縮物完成的。所得的卡諾拉蛋白分離物具有至少約90％重量蛋白質(zhì)(N×6.25)，優(yōu)選至少約100％重量蛋白質(zhì)(N×6.25)的高純度。
上述美國專利申請所描述的工藝實質(zhì)上是成批處理工藝。在2001年11月20日提交的共同未決的美國專利申請60/331,646、2002年5月30日提交的60/383,809和2002年11月19日提交的10/298,678中描述了一種生產(chǎn)卡諾拉蛋白分離物的連續(xù)方法，上述專利均指定了受讓人，其公開內(nèi)容在此均引入作為參考。根據(jù)上述專利，將卡諾拉油籽粗粉連續(xù)與鹽溶液混合，通過管道輸送所得的混合物，同時從卡諾拉油籽粗粉中浸提出蛋白質(zhì)而形成蛋白質(zhì)水溶液，將蛋白質(zhì)水溶液與卡諾拉油籽粗粉殘渣連續(xù)分離，連續(xù)地輸送蛋白質(zhì)水溶液使其通過選擇性膜操作以使在保持離子強(qiáng)度基本恒定的同時，將蛋白質(zhì)水溶液中的蛋白質(zhì)含量增加到至少約200g/L，將所得的濃縮蛋白質(zhì)溶液與冷卻水連續(xù)混合，導(dǎo)致形成蛋白質(zhì)微粒，并且使蛋白質(zhì)微粒連續(xù)沉降，同時讓上清液連續(xù)地溢出，直至在沉降器中積累得到所需量的PMM。從沉降器中轉(zhuǎn)移出PMM并干燥。該P(yáng)MM的蛋白質(zhì)含量至少約為90％重量，以Kjeldahl氮(N)×6.25測定，優(yōu)選至少約100％重量(N×6.25)。
如上述美國專利申請?zhí)?0/326,987、60/331,066、60/333,494、60/374,801和10/137,391所述，可以處理溢出的上清液，從中回收得到卡諾拉蛋白分離物。
已知卡諾拉油籽含有約10-30％重量的蛋白質(zhì)并且已鑒定出多種不同的蛋白質(zhì)組分。根據(jù)不同的沉降系數(shù)區(qū)分這些蛋白質(zhì)。已知并鑒定的蛋白質(zhì)包括被稱為cruciferin 12S球蛋白和被稱為napin的2S貯存蛋白質(zhì)。
卡諾拉也被稱為菜籽或油籽油菜。
發(fā)明概述除了12S和2S蛋白質(zhì)外，我們還發(fā)現(xiàn)上述分離卡諾拉蛋白分離物的方法生產(chǎn)出了相當(dāng)數(shù)量的一種7S蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是一種新蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明一方面提供了一種分離并純化的卡諾拉7S蛋白質(zhì)。
目前，我們還發(fā)現(xiàn)來自蛋白質(zhì)微粒團(tuán)的卡諾拉蛋白分離物與來自上清液的卡諾拉蛋白分離物之間的12S、7S和2S蛋白質(zhì)的相對比例存在差異，上述卡諾拉蛋白分離物由上述方法制備。特別是發(fā)現(xiàn)來自PMM的卡諾拉蛋白分離物具有的蛋白質(zhì)含量至少為約90％重量(N×6.25)，優(yōu)選至少為約100％重量，其蛋白質(zhì)組分的含量為約60-98％重量的7S蛋白質(zhì)、約1-15％重量的12S蛋白質(zhì)和約0-25％重量的2S蛋白質(zhì)。相反地，來自上清液的卡諾拉蛋白分離物具有的蛋白質(zhì)含量至少為約90％重量(N×6.25)，優(yōu)選至少為約100％重量，其蛋白質(zhì)組分的含量為約0-5％重量的12S蛋白質(zhì)、約5-40％重量的7S蛋白質(zhì)和約60-95％重量的2S蛋白質(zhì)。
來自PMM的卡諾拉蛋白分離物的蛋白質(zhì)組分的含量優(yōu)選為約88-98％重量的7S蛋白質(zhì)、約1-10％重量的12S蛋白質(zhì)和約0-6％重量的2S蛋白質(zhì)，而來自上清液的卡諾拉蛋白分離物的蛋白質(zhì)組分的含量優(yōu)選為約70-95％重量的2S蛋白質(zhì)、約5-30％重量的7S蛋白質(zhì)和約0-2％重量的12S蛋白質(zhì)。
因此上述兩種卡諾拉蛋白分離物的蛋白質(zhì)組分的分布非常不同。對于來自PMM的卡諾拉蛋白分離物，主要的蛋白質(zhì)種類是7S蛋白質(zhì)，而對于來自上清液的卡諾拉蛋白分離物，主要的蛋白質(zhì)種類是2S蛋白質(zhì)。這種差異導(dǎo)致在卡諾拉蛋白分離物應(yīng)用環(huán)境中出現(xiàn)不同的性能。
不同的蛋白質(zhì)含量分布使得可以提供卡諾拉蛋白分離物的組合物，其中根據(jù)具體的應(yīng)用以任何所需的比例混合這兩種不同的卡諾拉蛋白分離物，得到介于來自PMM的蛋白分離物和來自上清液的蛋白分離物的2S/7S/12S蛋白質(zhì)分布之間的任何所需的2S/7S/12S蛋白質(zhì)分布。
來自上清液的蛋白分離物是新的卡諾拉蛋白分離物。因此，本發(fā)明的另一方面是提供了一種卡諾拉蛋白分離物，其蛋白質(zhì)含量至少為約90％重量，優(yōu)選至少為約100％重量，以干重為基準(zhǔn)并且以Kjeldahl氮轉(zhuǎn)換率N×6.25測定，并且其所呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約60-95％重量的2S蛋白質(zhì)、約5-40％重量的7S蛋白質(zhì)和約0-5％重量的12S蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，來自上清液的卡諾拉蛋白分離物所呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約70-95％重量的2S蛋白質(zhì)、約5-30％重量的7S蛋白質(zhì)和約0-2％重量的12S蛋白質(zhì)。
來自PMM的卡諾拉蛋白分離物產(chǎn)物以任何所需的比例與任何所需比例的來自上清液的卡諾拉蛋白分離物產(chǎn)物混合，所得的組合物含有所需比例的2S、7S和12S卡諾拉蛋白質(zhì)，該組合物是一種新的卡諾拉蛋白分離物組合物。因此，另一方面，本發(fā)明提供了一種卡諾拉蛋白分離物組合物，其含有(1)第一種卡諾拉蛋白分離物，其蛋白質(zhì)含量為至少約90％重量，優(yōu)選至少為約100％重量，以干重為基準(zhǔn)并且以Kjeldahl氮轉(zhuǎn)換率N×6.25測定，并且其所呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約60-98％重量的7S蛋白質(zhì)、約1-15％重量的12S蛋白質(zhì)和約0-25％重量的2S蛋白質(zhì)，和(2)第二種卡諾拉蛋白分離物，其蛋白質(zhì)含量為至少為約90％重量，優(yōu)選至少為約100％重量，以干重為基準(zhǔn)并且以Kjeldahl氮轉(zhuǎn)換率N×6.25測定，并且其所呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約60-95％重量的2S蛋白質(zhì)、約5-40％重量的7S蛋白質(zhì)和約0-5％重量的12S蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，第一種卡諾拉蛋白分離物所呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約88-98％重量的7S蛋白質(zhì)、約1-10％重量的12S蛋白質(zhì)和約0-6％重量的2S蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，第二種卡諾拉蛋白分離物呈現(xiàn)本文所述的新卡諾拉蛋白分離物的優(yōu)選的蛋白質(zhì)分布。
改變具體來自PMM的卡諾拉蛋白分離物和/或具體來自上清液的卡諾拉蛋白分離物的12S/7S/2S蛋白質(zhì)比例可以通過改變從卡諾拉油籽粗粉生產(chǎn)各個卡諾拉蛋白分離物的工藝條件而實現(xiàn)。
已經(jīng)分離、純化并表征了卡諾拉蛋白分離物的各組分。利用任何常規(guī)方法的從如上述方法獲得的分別來自PMM和上清液的卡諾拉蛋白分離物中分離出單個的蛋白質(zhì)，其中可以根據(jù)大小差異將蛋白質(zhì)混合物分離，優(yōu)選通過制備型高壓液相色譜(HPLC)，隨后通過超濾減少洗脫液體積和通過透析減少殘余的溶解的鹽濃度。干燥已透析的物質(zhì)，分離出的純蛋白質(zhì)。
從含有選自2S、7S和12S中的至少兩種的不同卡諾拉蛋白質(zhì)混合物的卡諾拉蛋白分離物，包括本文所述的來自PMM的卡諾拉蛋白分離物和來自上清液的卡諾拉蛋白分離物中分離和純化單個的卡諾拉蛋白質(zhì)的方法構(gòu)成了本發(fā)明的另一個方面。
通常2S蛋白質(zhì)從來自上清液的卡諾拉蛋白分離物中分離和純化，而7S和12S蛋白質(zhì)通常從蛋白質(zhì)的微粒團(tuán)中分離和純化。經(jīng)MALDI-MS測定，2S蛋白質(zhì)的分子量為約14kDa，經(jīng)MALDI-MS測定，7S蛋白質(zhì)的分子量為約145kDa，經(jīng)MALDI-MS測定，12S蛋白質(zhì)的分子量為約290kDa。
7S和12S蛋白質(zhì)具有非常相似的氨基酸分布并且由許多相同的亞基組成，每個亞基含有大約413個氨基酸。7S蛋白質(zhì)含有大約1240個氨基酸，而12S蛋白質(zhì)含有大約2480個氨基酸。2S蛋白質(zhì)具有與7S和12S蛋白質(zhì)差異相當(dāng)大的氨基酸分布，并且含有大約120個氨基酸。在下面的實施例中給出了所得到的氨基酸分布。
通過提供單個的分離并純化的2S、7S和12S卡諾拉蛋白質(zhì)，使得可以生產(chǎn)7S蛋白質(zhì)與12S和/或2S蛋白質(zhì)的不同混合比例的組合物，從而提供了在純化的蛋白質(zhì)的應(yīng)用中具有獨(dú)特的功能性的組合物。上述組合物構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。
根據(jù)本文中的方法生產(chǎn)的卡諾拉蛋白分離物可用于蛋白分離物的常規(guī)應(yīng)用領(lǐng)域，比如加工食品的蛋白質(zhì)營養(yǎng)強(qiáng)化劑、油的乳化劑、焙烤食品的成形劑和夾帶氣體的產(chǎn)品的起泡劑。此外，卡諾拉蛋白分離物可以形成蛋白質(zhì)纖維用于肉類似物中，可以用作蛋白替代物或在將蛋白用作粘合劑的食品中用作補(bǔ)充劑?？ㄖZ拉蛋白分離物可用作營養(yǎng)增補(bǔ)劑。卡諾拉蛋白分離物還可用于寵物食物、動物飼料、工業(yè)和化妝品應(yīng)用，以及個人護(hù)理用品。單個的分離并且純化的蛋白質(zhì)可以有相似的用途。
附圖簡介

圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案生產(chǎn)具有不同的蛋白質(zhì)分布的卡諾拉蛋白分離物的方法的示意流程圖。
圖2是根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案生產(chǎn)具有不同的蛋白質(zhì)分布的卡諾拉蛋白分離物的連續(xù)方法的示意流程圖。
圖3-5是低溫粗粉提取物的分析HPLC色圖譜；和圖6和7包含了為了收集單個的2S、7S和12S卡諾拉蛋白質(zhì)的七次連續(xù)的制備HPLC的重疊圖譜。
發(fā)明詳述通過上述美國專利申請中描述的成批處理方法或連續(xù)處理方法或半連續(xù)處理方法可以從卡諾拉油籽粗粉中分別分離出來自PMM的卡諾拉蛋白分離物和來自上清液的卡諾拉蛋白分離物。
提供卡諾拉蛋白分離物的方法的初始步驟包括溶解卡諾拉油籽粗粉中的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。從卡諾拉油籽粗粉中回收的蛋白質(zhì)類物質(zhì)可以是天然存在于卡諾拉油籽或其它油籽中的蛋白質(zhì)，或者該蛋白質(zhì)類物質(zhì)可以是經(jīng)基因操作改性的，但具有天然蛋白質(zhì)的典型的疏水性和極性特性的蛋白質(zhì)?？ㄖZ拉粗粉可以是來自從卡諾拉油籽脫去卡諾拉油的并且含有不同量的未變性蛋白質(zhì)，例如經(jīng)過了熱的己烷浸提或冷油擠壓處理所得的蛋白質(zhì)的任何卡諾拉粗粉。從卡諾拉油籽脫去卡諾拉油通常作為分離的操作由本文中所述的蛋白分離物回收方法進(jìn)行。
蛋白質(zhì)的溶出最有效地是通過使用食品級的鹽溶液來完成，因為鹽的存在可以增加可溶解的蛋白質(zhì)從油籽粗粉中分離。當(dāng)卡諾拉蛋白分離物用于非食品應(yīng)用時，可以使用非食品級的化學(xué)品。雖然可以使用其它的鹽如氯化鉀，但通常鹽是氯化鈉。鹽溶液的離子強(qiáng)度至少約為0.10，優(yōu)選至少約為0.15，如此可以有效地溶出相當(dāng)含量的蛋白質(zhì)。隨著鹽溶液的離子強(qiáng)度的逐漸增加，從油籽中溶出的蛋白質(zhì)的程度也一起增多直至達(dá)到最高值。接下來，無論怎樣增高離子強(qiáng)度，將不再增加溶出的蛋白質(zhì)的總量。使溶出的蛋白質(zhì)的量達(dá)到最大值時所需要的食品級鹽溶液的離子強(qiáng)度，取決于所選用的鹽和油籽粗粉。
考慮到隨著離子強(qiáng)度的增高，在使蛋白質(zhì)沉淀下來的過程中需要更大的稀釋度，所以一般優(yōu)選離子強(qiáng)度低于約0.8，更優(yōu)選約為0.15-0.6。
在成批處理方法中，至少在約5℃的溫度下用鹽溶解蛋白質(zhì)，優(yōu)選溫度最高達(dá)約35℃，優(yōu)選同時攪拌以縮短溶解時間，一般耗時約10-60分鐘。優(yōu)選溶解步驟從油籽粗粉中基本上盡可能多地浸提出蛋白質(zhì)，從而獲得整體上的高產(chǎn)率。
確定約5℃作為下限溫度是因為低于該溫度時溶解作用十分緩慢，不切實際，而確定約35℃作為上限溫度是因為在成批處理方式中在較高溫度水平進(jìn)行處理是不經(jīng)濟(jì)的。
在連續(xù)處理方法中，從卡諾拉油籽粗粉中浸提蛋白質(zhì)可以按照能從卡諾拉油籽粗粉中連續(xù)浸提蛋白質(zhì)的任何方式進(jìn)行。在一個實施方案中，將卡諾拉油籽粗粉和食品級鹽溶液連續(xù)地混合，并且讓所得的混合物以某一流速流過具有某一長度的導(dǎo)管或管道，以使其滯留時間足以按照本文中的參數(shù)進(jìn)行所需浸提。在上述連續(xù)工藝中，鹽溶解步驟起效迅速，約10分鐘，優(yōu)選溶解步驟從卡諾拉油籽粗粉中基本上盡可能多地浸提出蛋白質(zhì)。連續(xù)工藝中的溶解優(yōu)選在升高的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選高于約35℃，一般達(dá)到約65℃。
鹽水溶液和卡諾拉油籽粗粉的天然pH介于約5-6.8之間，由此可以通過微團(tuán)途徑得到蛋白分離物，這些將在后文中詳細(xì)介紹。
當(dāng)處于或者接近pH范圍的極限時，通過微團(tuán)途徑只能部分地生成蛋白分離物，較之其它取值范圍內(nèi)的pH，其產(chǎn)率要低。因此，優(yōu)選約5.3-6.2的弱酸性pH值。
在浸提步驟中，可以使用任何方便的酸，通常為鹽酸，或堿，通常為氫氧化鈉，將鹽溶液的pH調(diào)節(jié)到約5-6.8范圍內(nèi)的任何想要的值。
在溶解步驟中，食品級鹽溶液中的油籽粗粉濃度可以在較大為范圍內(nèi)變化。一般其濃度范圍為約5-15％w/v(重量/體積)。
在鹽水溶液浸提蛋白質(zhì)的步驟中，還有溶出卡諾拉粗粉中脂肪的附帶作用，這將導(dǎo)致水相中出現(xiàn)脂肪。
來自浸提步驟的蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)濃度一般為約5-40g/L，優(yōu)選為約10-30g/L。
由浸提步驟得到的水相隨后以任何便利的方式從卡諾拉粗粉殘渣中分離，比如利用真空過濾，隨后經(jīng)離心和/或過濾除去粗粉殘渣。分離出來的粗粉殘渣可先行干燥后再經(jīng)處理。
通過將活性炭粉末或其它色素吸附劑與分離所得的蛋白質(zhì)水溶液混合并隨后除去這些吸附劑，便利地通過過濾得到蛋白質(zhì)溶液，可以使最終蛋白分離物的顏色在淺色和較少黃色方面有所改進(jìn)。滲濾也可用于除去色素。
上述色素去除步驟可以在任何方便的條件下進(jìn)行，一般在分離所得的蛋白質(zhì)水溶液的環(huán)境溫度下使用任何適宜的色素吸附劑。就活性炭粉末而言，用量為約0.025-5％w/v，優(yōu)選為約0.05-2％w/v。
如美國專利號5,844,086和6,005,076中所描述，卡諾拉油籽粗粉含有相當(dāng)量的脂肪，上述專利均指定了受讓人，其公開內(nèi)容在此均引入作為參考，因而在分離所得的蛋白質(zhì)水溶液和下述討論的濃縮蛋白質(zhì)水溶液中可以進(jìn)行所述的脫脂步驟。當(dāng)要進(jìn)行顏色改進(jìn)步驟時，該步驟可以在第一次脫脂步驟后進(jìn)行。
作為鹽水溶液浸提油籽粗粉的替代方案是僅用水浸提，雖然僅用水浸提油籽粗粉所得的蛋白質(zhì)少于用鹽水溶液。當(dāng)采用該替代方案時，在除去油籽粗粉殘渣后向蛋白質(zhì)溶液中加入上述討論濃度的鹽，以在下述濃縮步驟期間維持溶液中的蛋白質(zhì)。當(dāng)進(jìn)行脫色步驟和/或第一次脫脂步驟時，一般在上述操作完成后加入鹽。
另一替代方法是用具有超過約pH6.8的相對高pH值的食品級鹽溶液浸提油籽粗粉，一般高達(dá)約pH9.9?？梢允褂萌魏畏奖愕氖称芳墘A，比如氫氧化鈉水溶液將食品級鹽溶液的pH調(diào)節(jié)到堿性值?？商鎿Q地，油籽粗粉可以用相對低pH值低于約pH5，一般低至約pH3的鹽溶液進(jìn)行浸提。當(dāng)采用該替代方案時，由浸提油籽粗粉步驟得到的水相隨后以任何便利的方式從卡諾拉粗粉殘渣中分離，比如利用真空過濾，隨后經(jīng)離心和/或過濾除去粗粉殘渣。分離出來的粗粉殘渣可先行干燥后再經(jīng)處理。
在進(jìn)行下述的其它工序之前，將由高或低pH浸提步驟所得的蛋白質(zhì)水溶液的pH調(diào)節(jié)到上述約5-6.8范圍內(nèi)，優(yōu)選約5.3-6.2?？梢允褂萌魏畏奖愕乃幔琨}酸，或堿，如氫氧化鈉來調(diào)節(jié)pH。
而后將蛋白質(zhì)水溶液濃縮，以增高蛋白質(zhì)濃度，同時維持溶液的離子強(qiáng)度基本上恒定。經(jīng)過上述濃縮，濃縮蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)濃度至少為約200g/L，優(yōu)選為約250g/L。
按照與成批或連續(xù)操作相一致的任何方便的方式進(jìn)行濃縮步驟，例如利用任何方便的選擇性膜技術(shù)，比如利用膜如中空纖維膜或螺旋纏繞膜進(jìn)行超濾或滲濾，根據(jù)不同的膜材料和構(gòu)造，該膜具有適宜的截止分子量，如約3000-50,000道爾頓，并且對于連續(xù)操作，將其尺寸定到蛋白質(zhì)水溶液通過該膜時能獲得所需的濃縮程度。
濃縮步驟可以在任何方便的溫度下進(jìn)行，一般為約20℃-60℃，并且在一定時間內(nèi)達(dá)到所需的濃縮程度。溫度及其它條件在一定程度上取決于濃縮所使用的膜設(shè)備和所需的溶液中蛋白質(zhì)的濃度。
在該步驟中，就作為干燥的蛋白分離物回收的浸提蛋白質(zhì)的比例而言，將蛋白質(zhì)溶液濃縮為大于約200g/L濃度的濃縮物不僅使該方法的產(chǎn)率增加到大于約40％，優(yōu)選大于約80％的水平，而且降低了干燥后的最終蛋白分離物中的鹽濃度?？刂频鞍追蛛x物鹽濃度的能力對于蛋白分離物的應(yīng)用是很重要的，因為鹽濃度的變化會影響特定食物應(yīng)用的功能性和感官性。
眾所周知，超濾和相似的選擇性膜技術(shù)允許低分子量物質(zhì)通過而阻止高分子量物質(zhì)通過。低分子量物質(zhì)不僅包括鹽的各種離子，而且還包括從原料中浸提出來的低分子量物質(zhì)，比如碳水化合物、色素和抗?fàn)I養(yǎng)因子，以及任何低分子量形式的蛋白質(zhì)。通常根據(jù)不同的膜材料和構(gòu)造，選擇好膜的截止分子量，以保證保留住溶液中相當(dāng)比例的蛋白質(zhì)，同時排除污染物。
根據(jù)濃縮步驟所處的溫度，可以將濃縮蛋白質(zhì)溶液加熱到至少約20℃，并最高到60℃，優(yōu)選為約25℃-40℃，以降低濃縮蛋白質(zhì)溶液的粘度而有利于隨后的稀釋步驟和微粒形成。濃縮的蛋白質(zhì)溶液不能被加熱到超過使?jié)饪s蛋白質(zhì)溶液不能通過用冷卻水稀釋形成微粒的溫度。如果需要，可以對濃縮的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行如上述美國專利號5,844,086和6,005,076中所述的進(jìn)一步脫脂操作。
隨后，經(jīng)過濃縮步驟和任選的脫脂步驟而得到的濃縮蛋白質(zhì)溶液通過與冷卻水混合而進(jìn)行稀釋，冷卻水的體積應(yīng)達(dá)到所需的稀釋度，以實現(xiàn)微粒的形成。根據(jù)通過微粒途徑獲得的所需卡諾拉蛋白質(zhì)比例和從上清液中獲得的比例，改變濃縮的蛋白質(zhì)溶液的稀釋度。一般，在較高的稀釋水平下，水相中保持有較高比例的卡諾拉蛋白質(zhì)。
當(dāng)需要通過微粒途徑獲得最高比例的蛋白質(zhì)時，將濃縮的蛋白質(zhì)溶液稀釋約15倍或更少，優(yōu)選約10倍或更少。
與濃縮的蛋白質(zhì)溶液混合的冷卻水的溫度低于約15℃，一般為約3℃-15℃，優(yōu)選低于約10℃，因為在所用的稀釋倍數(shù)下，在較低的溫度下可以提高蛋白質(zhì)微粒團(tuán)形式的蛋白分離物的產(chǎn)率。
在成批操作中，將濃縮的蛋白質(zhì)溶液分批加入到靜體的如上討論的所需體積的冷卻水中。稀釋濃縮的蛋白質(zhì)溶液以及隨之的離子強(qiáng)度減少導(dǎo)致高度密集的蛋白分子的云狀團(tuán)形成微粒狀的分散的蛋白質(zhì)微粒。在成批處理工藝中，蛋白質(zhì)微粒在冷卻水體中沉降以形成聚集的、凝聚而稠密的無定形面筋樣蛋白質(zhì)微粒團(tuán)(PMM)。并且例如可以借助離心進(jìn)行沉降。上述誘導(dǎo)的沉降可以減少蛋白質(zhì)微粒團(tuán)的含水量，由此一般使含水量從占總微粒團(tuán)的約70％重量-95％重量降低到約50％重量-80％重量。這樣，降低蛋白質(zhì)微粒團(tuán)的含水量的同時還降低了微粒團(tuán)中被吸附的鹽含量，從而降低了干燥的蛋白分離物的鹽含量。
另外，可以通過連續(xù)地將濃縮的蛋白質(zhì)溶液輸入T形管的一個入口，同時稀釋水流入T形管的另一個入口，使它們在管中混合連續(xù)地進(jìn)行稀釋操作。稀釋水以足以獲得所需稀釋度的流速流入T形管。
濃縮的蛋白質(zhì)溶液和稀釋水在管道中混合，引發(fā)蛋白質(zhì)微粒形成，并且該混合物從T形管出口連續(xù)地流入沉降器中，當(dāng)其充滿沉降器時，上清液從沉降器中溢出。優(yōu)選，混合物以能最小化液體湍流的方式流入沉降器中的液體中。
在連續(xù)工藝中，蛋白質(zhì)微粒在沉降器中沉積以形成聚集的、凝聚而稠密的無定形面筋樣蛋白質(zhì)微粒團(tuán)(PMM)，并且該工藝可以連續(xù)地進(jìn)行直至在沉降器底部積累到所需量的PMM，隨之積累的PMM從沉降器除去。
與上述美國專利中所述的任何已知的現(xiàn)有技術(shù)中蛋白分離物的生產(chǎn)方法相比，結(jié)合使用將蛋白質(zhì)溶液濃縮為蛋白質(zhì)含量至少為約200g/L的處理參數(shù)和使稀釋倍數(shù)低于約15可以導(dǎo)致就從原始粗粉浸提物中的蛋白質(zhì)微粒團(tuán)形式的蛋白質(zhì)回收率而言，更高的產(chǎn)率，通常是相當(dāng)高的產(chǎn)率，以及就蛋白質(zhì)含量而言獲得更純的蛋白分離物。
與成批處理相比，通過利用連續(xù)方法回收卡諾拉蛋白分離物，可以顯著地縮短浸提相同的蛋白水平所需的初始蛋白質(zhì)浸提步驟的時間，以及在高很多的溫度下進(jìn)行浸提步驟。此外，在連續(xù)的操作過程中污染的機(jī)會比成批處理的少，從而產(chǎn)品的純度較高并且該方法可以在更簡單的設(shè)備中進(jìn)行。
例如可以通過從沉降物中傾析出殘余的水相或通過離心的方法將沉降的分離物從殘余的水相或上清液中分離。PMM可在濕態(tài)應(yīng)用，或通過任何方便的技術(shù)例如噴霧干燥、冷凍干燥或真空鍋干燥，干燥得到干品。干燥的PMM具有超過約90％重量的高蛋白質(zhì)含量，通常至少約100％的重量蛋白質(zhì)(用Kjeldahl N×6.25計算)，并且基本上沒有變性(根據(jù)差示掃描量熱法測定)。當(dāng)應(yīng)用上述美國專利5,844,086和6,005,076的方法時，這種從含有脂肪的油籽粗粉里分離得到的干燥PMM還含有較低的脂肪殘存量，可以低于約1％重量。
來自PMM的卡諾拉蛋白分離物主要含有7S卡諾拉蛋白質(zhì)以及較少量的12S卡諾拉蛋白質(zhì)和任選的少量的2S卡諾拉蛋白質(zhì)。一般，PMM含有約60-98％重量的7S蛋白質(zhì)，約1-15％重量的12S蛋白質(zhì)約0-25％重量的2S蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，PMM含有約88-98％重量的7S蛋白質(zhì)，約1-10％重量的12S蛋白質(zhì)約0-6％重量的2S蛋白質(zhì)。
通過PMM形成以及沉降步驟得到的上清液含有相當(dāng)量的在稀釋步驟中未沉降的卡諾拉蛋白質(zhì)，并且可以處理該上清液以回收其中的蛋白質(zhì)。在除去PMM后，濃縮來自稀釋步驟的上清液，增加其中的蛋白質(zhì)濃度。上述濃縮可利用任何方便的選擇性膜技術(shù)進(jìn)行，例如使用膜進(jìn)行超濾，該膜具有適宜的截止分子量，可以允許低分子量物質(zhì)，包括鹽以及從蛋白質(zhì)原料中浸提出來的其它非蛋白質(zhì)類的低分子量物質(zhì)通過該膜，同時將卡諾拉蛋白質(zhì)保留在溶液中。根據(jù)不同的膜材料和構(gòu)造，可以使用截止分子量為約3000-約10,000道爾頓的超濾膜。
這樣，濃縮上清液的同時還降低了回收蛋白分離物所需干燥的液體體積。在干燥前，上清液經(jīng)濃縮后蛋白質(zhì)濃度一般為約100-400g/L，優(yōu)選為約200-300g/L。上述濃縮操作可以按照上述蛋白質(zhì)溶液的濃縮步驟以分批處理的方式或連續(xù)操作的方式進(jìn)行。
通過任何方便的技術(shù)，例如噴霧干燥、冷凍干燥或真空筒干燥，干燥濃縮上清液得到干品，從而提供了另一種卡諾拉蛋白分離物。該另一種卡諾拉蛋白分離物具有超過約90％重量的高蛋白質(zhì)含量，通常至少約100％重量蛋白質(zhì)(用Kjeldahl N×6.25計算)，并且基本上沒有變性(根據(jù)差示掃描量熱法測定)。
干燥的上清液主要含有2S卡諾拉蛋白質(zhì)以及較少量的7S卡諾拉蛋白質(zhì)和任選少量的12S卡諾拉蛋白質(zhì)。一般，來自上清液的卡諾拉蛋白分離物含有約60-95％重量的2S蛋白質(zhì)，
約5-40％重量的7S蛋白質(zhì)，約0-5％重量的l2S蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，來自上清液的卡諾拉蛋白分離物含有約70-95％重量的2S蛋白質(zhì)，約5-30％重量的7S蛋白質(zhì)，約0-2％重量的12S蛋白質(zhì)。
如果需要，在利用任何便利的技術(shù)干燥所得混合蛋白流之前，可將至少一部分濕PMM和至少一部分濃縮的上清液混合，得到根據(jù)本發(fā)明的混合卡諾拉蛋白分離物組合物?？蛇x擇蛋白質(zhì)類物質(zhì)相互混合的相對比例，從而得到具有所需2S/7S/12S蛋白質(zhì)分布的最終卡諾拉蛋白分離物組合物。另外，干燥的蛋白分離物可以任何需要的比例混合，以在混合物中獲得任何需要的特定的2S/7S/12S蛋白質(zhì)分布，從而提供根據(jù)本發(fā)明的組合物?；旌系目ㄖZ拉蛋白分離物組合物具有超過約90％重量的高蛋白質(zhì)含量，通常至少為約100％重量(用Kjeldahl N×6.25計算)，并且基本上沒有變性(根據(jù)差示掃描量熱法測定)。
在另一替代方法中，僅僅部分濃縮上清液與僅僅部分PMM混合，并且干燥所得的混合物，濃縮上清液的殘渣可以像PMM的任何殘渣那樣干燥。另外，干燥的PMM和干燥的上清液可以按如上討論的任何需要的相對比例混合干燥。
按照該方式進(jìn)行操作，可以回收得到許多卡諾拉蛋白分離物，它們可以是干燥的PMM、干燥的上清液和來自PMM的卡諾拉蛋白分離物與來自上清液的卡諾拉蛋白分離物的各種重量比例的干燥混合物，該重量比例一般為5∶95-95∶5，這可根據(jù)組合物中2S/7S/12S蛋白質(zhì)的不同比例實現(xiàn)不同功能性和營養(yǎng)性的需求。
作為將濃縮蛋白質(zhì)溶液稀釋到冷卻水中并如上所述處理所得沉淀和上清液的替代方案，可以通過透析濃縮蛋白質(zhì)溶液以減少其中的鹽含量，從濃縮的蛋白質(zhì)溶液中回收蛋白質(zhì)。濃縮的蛋白質(zhì)溶液的鹽含量的減少導(dǎo)致透析袋中蛋白質(zhì)微粒的形成。透析后，如上所述沉降蛋白質(zhì)微粒，收集并干燥。如上所述處理來自蛋白質(zhì)微粒沉降步驟的上清液，進(jìn)一步回收其中的蛋白質(zhì)?？商娲?，可以直接干燥透析袋中的內(nèi)容物。當(dāng)需要小規(guī)模實驗量的蛋白質(zhì)時，后一種替代方法是有用的。
可以通過任何便利的分析技術(shù)比如分析分離技術(shù)來測定任何指定的蛋白分離物的各個蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量。這些技術(shù)中最常用的是在柱中使用選擇性介質(zhì)，它能根據(jù)大小進(jìn)行分離。對于應(yīng)用凝膠滲透色譜(GPC)，使用的是球形凝膠材料。當(dāng)施加壓力時，如在高壓液相色譜(HPLC)中，那么使用的是剛性介質(zhì)。后一種技術(shù)還被稱為大小排阻色譜(SEC)。利用上述技術(shù)得到的如上所述制備的卡諾拉蛋白分離物樣品的結(jié)果包括在下面的實施例中。
質(zhì)譜(MS)方法可用于鑒定和分析蛋白質(zhì)樣品，包括所述的卡諾拉2S、7S和12S蛋白質(zhì)。在電噴霧離子化(ESI)質(zhì)譜中，蛋白質(zhì)被低能量電子轟擊并且檢測由碰撞形成的帶電碎片或物質(zhì)。特別是，可以使用基質(zhì)輔助的激光解吸附離子化(MALDI)質(zhì)譜儀，其中存在用于分析干燥的材料樣品的激光汽化，該樣品含有特定分子基質(zhì)。該基質(zhì)含有相容的小分子量的有機(jī)分子，它能在分析時充分保護(hù)生物高聚物從而減少激光撞擊能量產(chǎn)生的離子化物質(zhì)的數(shù)量。
從上述蛋白分離物樣品得到的數(shù)據(jù)提示2S蛋白質(zhì)對ESI-MS的電子轟擊不穩(wěn)定，并易于斷裂為許多多肽碎片，它包括4kDa、10kDa和21kDa物質(zhì)。但是，使用MALDI-MS可以產(chǎn)生完整的2S片斷，其分子量接近14,000道爾頓。
來自PMM的蛋白分離物中的7S蛋白質(zhì)還產(chǎn)生大量的亞10kDa碎片，這提示分子對ESI-MS的電子轟擊不穩(wěn)定。此外，在分析來自PMM的卡諾拉蛋白分離物的7S蛋白質(zhì)時鑒定出21kDa物質(zhì)，但在分析來自上清液的卡諾拉蛋白分離物的7S蛋白質(zhì)時卻不存在該物質(zhì)。
對來自PMM的卡諾拉蛋白分離物的7S蛋白質(zhì)的ESI-MS分析還顯示了分子量從126kDa到166kDa的六種蛋白質(zhì)，而來自上清液的卡諾拉蛋白分離物的7S蛋白質(zhì)卻在167kDa顯示一個大物質(zhì)。
上述MALDI-MS分析結(jié)果顯示2S蛋白質(zhì)的分子量在13,960-14,250道爾頓之間，并且其對弱酸處理有相當(dāng)?shù)目剐浴?S和12S蛋白質(zhì)含有48,200-48,400道爾頓的基本亞基的相同構(gòu)件。7S蛋白質(zhì)具有三個亞基，分子量約為145,000道爾頓，而12S蛋白質(zhì)含有6個亞基，混合分子量為約290,000道爾頓。酸解7S和12S蛋白質(zhì)沒有產(chǎn)生2S蛋白質(zhì)并且產(chǎn)生幾乎同樣的結(jié)果，這證實這兩種球蛋白來自相同的亞基。
通過任何常規(guī)的方法，包括用于較少量蛋白質(zhì)分析的高壓液相色譜(HPLC)和用于較大量的制備型HPLC，從各個蛋白分離物中分離純化出單獨(dú)的2S、7S和12S蛋白質(zhì)?？梢允褂没诜肿恿康墨@得組分的其它方法。一般，從來自上清液的卡諾拉蛋白分離物中分離純化出2S蛋白質(zhì)，而從來自PMM的卡諾拉蛋白分離物中分離純化出7S和12S蛋白質(zhì)。例如用鹽溶液溶解卡諾拉蛋白分離物，然后通過HPLC柱。HPLC分離的蛋白質(zhì)包含于含有一種蛋白質(zhì)的洗脫液部分中，通常用超濾來減少洗脫液的體積，隨后透析蛋白分離物以減少蛋白質(zhì)中殘留的鹽含量?？梢愿稍镆淹肝龅奈镔|(zhì)而得到干燥的分離且純化的單個卡諾拉蛋白質(zhì)。
優(yōu)選實施方案的描述參看圖1，它示意性地圖示了制備卡諾拉蛋白分離物的成批處理方法的流程圖?？ㄖZ拉油籽粗粉和含水浸提介質(zhì)經(jīng)管道10加入浸提器12中，在浸提器中浸提油籽粗粉，形成蛋白質(zhì)水溶液。蛋白質(zhì)水溶液和油籽粗粉殘渣的懸浮液經(jīng)管道14送入真空過濾帶16，以分離油籽粗粉殘渣，該殘渣經(jīng)管道18排出。隨后蛋白質(zhì)水溶液經(jīng)管道20被送入凈化操作室22，蛋白質(zhì)水溶液在其中離心和過濾以除去細(xì)粉，并通過管道24回收細(xì)粉。
將凈化過的蛋白質(zhì)水溶液經(jīng)管道26泵送通過超濾膜28，從而產(chǎn)生作為保留物存在于管道30中的濃縮蛋白質(zhì)溶液，同時滲透物經(jīng)管道32回收。濃縮蛋白質(zhì)溶液被送入含有冷卻水的沉降罐34中，通過管道36加入冷卻水。在沉降罐34中形成的蛋白質(zhì)微粒團(tuán)經(jīng)管道38除去，并通過噴霧干燥器40得到干燥的卡諾拉蛋白分離物42。
將上清液經(jīng)管道44從沉降罐34中除去，并且泵送通過超濾膜46，得到作為保留物存在于管道48中的濃縮蛋白質(zhì)溶液，同時滲透物經(jīng)管道50被除去。濃縮蛋白質(zhì)溶液通過噴霧干燥器52得到另一種干燥的卡諾拉蛋白分離物54。
可替換地，在混合物被噴霧干燥器40干燥之前，管道48中的濃縮蛋白質(zhì)溶液可經(jīng)管道56輸送與蛋白質(zhì)微粒團(tuán)混合。
參看圖2，它示意性地圖示了制備卡諾拉蛋白分離物的連續(xù)方法的流程圖?？ㄖZ拉油籽粗粉和含水浸提介質(zhì)分別經(jīng)管道110和112加入攪拌器114，油籽粗粉和含水浸提介質(zhì)在其中混合并且混合物經(jīng)管道116送入混合管118中。在混合管118中，浸提油籽粗粉并且得到蛋白質(zhì)水溶液。將蛋白質(zhì)水溶液和油籽粗粉殘渣的懸浮液經(jīng)管道120送入真空過濾帶122，以分離油籽粗粉殘渣，該殘渣經(jīng)管道124排出。隨后將蛋白質(zhì)水溶液經(jīng)管道126送入凈化操作室128，將蛋白質(zhì)水溶液在其中離心和過濾以除去細(xì)粉，并通過管道130回收細(xì)粉。
凈化過的蛋白質(zhì)水溶液經(jīng)管道132泵送通過超濾膜134，確定膜尺寸使得能獲得所需的蛋白質(zhì)水溶液濃縮程度，從而產(chǎn)生作為保留物存在于管道136中的濃縮蛋白質(zhì)溶液，同時滲透物經(jīng)管道138被回收。濃縮蛋白質(zhì)溶液被送入混合三通管140的入口，同時冷卻水經(jīng)管道142也被送入其中，冷卻水的體積足以獲得所需的稀釋度。所得溶液經(jīng)管道144流入沉降罐146中以使蛋白質(zhì)微粒團(tuán)沉降。在沉降罐146中沉降的蛋白質(zhì)微粒團(tuán)不時地經(jīng)管道148除去，并通過噴霧干燥器150得到干燥的卡諾拉蛋白分離物152。
將上清液經(jīng)管道154從沉降罐中除去，并且泵送通過超濾膜152，得到作為保留物存在于管道158中的濃縮的蛋白質(zhì)溶液，同時滲透物經(jīng)管道160被除去。濃縮的蛋白質(zhì)溶液通過噴霧干燥器162得到另一種干燥的卡諾拉蛋白分離物164。
可替換地，在混合物被噴霧干燥器150干燥前，管道158中的濃縮蛋白質(zhì)溶液可以經(jīng)管道166輸送與蛋白質(zhì)微粒團(tuán)混合。
實施例實施例1本實施例說明了該方法適于提供本發(fā)明的卡諾拉蛋白分離物。
在環(huán)境溫度下，將‘a(chǎn)’kg商購卡諾拉粗粉加入‘b’L 0.15M的NaCl溶液中，攪拌30分鐘得到蛋白質(zhì)含量為‘c’g/L的蛋白質(zhì)水溶液。除去卡諾拉粗粉殘渣并在真空過濾帶上洗滌。所得蛋白質(zhì)溶液經(jīng)離心凈化，獲得蛋白質(zhì)含量為‘e’g/L的‘d’L凈化的蛋白質(zhì)溶液。
‘f’L蛋白質(zhì)浸提液等分樣品經(jīng)超濾系統(tǒng)濃縮，體積減少為‘g’L，所使用膜的截止分子量為‘h’道爾頓。所得濃縮蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)含量為‘i’g/L。
在‘j’℃下，濃縮溶液被4℃水稀釋‘k’倍。立即形成白云狀并開始沉降。除去上層稀釋水并從沉降罐底部回收沉淀的粘稠團(tuán)塊(PMM)，浸提蛋白質(zhì)的產(chǎn)率為‘1’％重量。干燥的來自PMM的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為‘m’％(N×6.25)d.b.(使用Leco FP528氮測定儀測定氮的百分含量)。經(jīng)產(chǎn)品起名為‘n’。
在下表I中列出了五種來自PMM的卡諾拉蛋白分離物的參數(shù)‘a(chǎn)’至‘n’
表I
除去的稀釋水經(jīng)利用截止分子量為‘o’道爾頓的膜的超濾系統(tǒng)減少體積，使蛋白質(zhì)濃度為‘p’g/L。干燥濃縮物。加上從上清液回收的蛋白質(zhì)，總共回收的蛋白質(zhì)為‘q’％重量。形成的干燥蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為‘r’％重量(N×6.25)d.b.。
產(chǎn)品被起名為‘s’。在下表II中列出了五種來自上清液的卡諾拉蛋白分離物的參數(shù)‘o’至‘s’
表II
實施例2本實施例說明了對實施例1中來自PMM和來自上清液的卡諾拉蛋白分離物的分析。
在配有100cm柱和Sephacryl 300 HR介質(zhì)(Sephacryl 300 HR是葡聚糖聚合物，它用亞甲基雙丙烯酰胺進(jìn)行了交聯(lián)，這使得可以分離10,000-1,500,000道爾頓大小的球蛋白)的Gradi-Frac(PharmaciaAmersham)蛋白質(zhì)分離器上洗脫一系列的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)源，以測定每種組分的保留時間(RT)，在A280nm處測定，流速為1.0mL/min。調(diào)節(jié)了pH并含有疊氮化鈉作為抗菌劑的鹽水溶液用作柱溶劑。將洗脫液收集于放在自動樣品固定盤上的試管中，每個試管裝5mL液體。根據(jù)峰面積計算相關(guān)的蛋白質(zhì)組分，通過最大峰高乘以半峰寬得到峰面積。
采用與Gradi-Frac系統(tǒng)相同的BioRad蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，使用300×7.8mm BioSep S3000大小排阻色譜(SEC)柱運(yùn)行分析型的Varian高壓液相色譜柱(HPLC)，該排阻色譜柱裝有直徑為5微米、孔徑為290的親水鍵合的硅膠剛性載體介質(zhì)，能分離5,000-700,000道爾頓大小的球蛋白。BioRad蛋白質(zhì)包括了17,000道爾頓(肌肉球蛋白)至670,000道爾頓(甲狀腺球蛋白)的蛋白質(zhì)，并添加了維生素B12作為1,350道爾頓的低分子量標(biāo)記。在280nm和洗脫速率為1.0mL/min的條件下測定每個組分。調(diào)節(jié)了pH并含有疊氮化鈉作為抗菌劑的鹽水溶液用作柱溶劑以及用于溶解干樣品。經(jīng)UV檢測后丟棄洗脫液，因為每次操作所需的樣品不超過50微升。HPLC Prostar系統(tǒng)自動計算保留時間和峰面積并打印出總結(jié)報告。
在上述每種柱上分析如實施例1所述制備的BW-AL-017-B14-02A-C300和BW-AL017-B20-02A-C300來自PMM的卡諾拉蛋白分離物和來自上清液的卡諾拉蛋白分離物。將峰面積轉(zhuǎn)化為每個峰的百分?jǐn)?shù)。計算各次測試的所有峰，然后分別再計算三種主要的蛋白質(zhì)組分12S、7S和2S。
此外，用由BioRad標(biāo)準(zhǔn)品測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算三種蛋白質(zhì)組分12S、7S和2S的大約分子量，它們由GPC和HPLC得到。Gradi-Frac系統(tǒng)比HPLC系統(tǒng)更具可變性，這是由于較大的樣品體積(1毫升∶25微升)和柱直徑，手工計算Gradi-Frac結(jié)果和操作時間差異(25分鐘(HPLC)5小時(Gradi-Frac))。此外，Gradi-Frac系統(tǒng)使用體積作為蛋白質(zhì)保留的量度而HPLC使用時間作為蛋白質(zhì)的量度。
在下表III和IV中所示的數(shù)據(jù)變化反映了上述差異。統(tǒng)計學(xué)上HPLC比Gradi-Frac系統(tǒng)更好(較低的可變性)。但Gradi-Frac系統(tǒng)具有能提供可被進(jìn)一步測試的單獨(dú)的樣品組分(例如使用質(zhì)譜)的優(yōu)點(diǎn)，這與HPLC系統(tǒng)不同。
所得結(jié)果列于下表中，表III是針對來自PMM的卡諾拉蛋白分離物(CPI)的，表IV是針對來自上清液的卡諾拉蛋白分離物(CPI)的。
表III
基于含有動物蛋白質(zhì)的BioRad GPC標(biāo)準(zhǔn)的分子量計算。
表IV
基于含有動物蛋白質(zhì)的BioRad GPC標(biāo)準(zhǔn)的分子量計算。
從表III中所給出的數(shù)據(jù)可以看出，來自PMM的樣品含有大量的7S蛋白質(zhì)和較少百分比的2S和12S蛋白質(zhì)。
從表IV可以看出，上清液的卡諾拉蛋白分離物基本上不含有12S蛋白質(zhì)，而主要的蛋白質(zhì)是2S蛋白質(zhì)，還存在一些7S蛋白質(zhì)。
計算出的12S和7S蛋白質(zhì)的HPLC分子量較低而2S蛋白質(zhì)的HPLC分子量較高。這種明顯的差異部分地是由于難以用手工精確地標(biāo)定出GPC的峰的最大值。
GPC計算的12S分子量為385,000道爾頓，這高于文獻(xiàn)中報道的卡諾拉cruciferin的分子量300,000-310,000道爾頓。GPC和HPLC計算的7S的分子量相似并接近約為150,000道爾頓的報道值。HPLC估算的2S的分子量高于GPC的平均值，并且它們均低于napin的報道值14,000道爾頓。
從上述數(shù)據(jù)值可以看出，測試樣品中的來自PMM的卡諾拉蛋白分離物含有82-89％(由GPC測定)和94％(由HPLC測定)的7S蛋白質(zhì)。如上所述，HPLC方法更快捷并且被認(rèn)為比GPC更精確。根據(jù)三種蛋白質(zhì)組分的面積，認(rèn)為來自PMM的樣品含有約88-98％重量的7S蛋白質(zhì)，約1-10％重量的12S蛋白質(zhì)約0-6％重量的2S蛋白質(zhì)。
類似地，對于來自上清液的樣品，根據(jù)三種蛋白質(zhì)組分的面積，認(rèn)為該類樣品合有約70-95％重量的2S蛋白質(zhì)，約5-30％重量的7S蛋白質(zhì)，約0-2％重量的12S蛋白質(zhì)。
所使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)組分”是指在HPLC(或GPC)保留時間內(nèi)的峰面積，根據(jù)可接受的GPC/HPLC蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品比如購自BioRad，得到上述范圍內(nèi)的計算分子量。這些峰可以含有其它成分，但只要它們在目標(biāo)分子量可接受的范圍內(nèi)存在，則它們的存在是無關(guān)緊要的。
根據(jù)該實施例所含的信息，可以接受的分子量為12S300,000-360,000道爾頓7S125,000-160,000道爾頓2S9,000-15,000道爾頓實施例3該實施例顯示了一些參數(shù)對蛋白質(zhì)浸提的影響。
在第一組試驗中，為了除去殘余溶劑，在100℃下低溫烘烤卡諾拉油籽粗粉。然后在室溫下將已烘烤的50g卡諾拉油籽粗粉樣品(LT粗粉)加入500ml 0.05M或0.10M的NaCl溶液中并攪拌15分鐘。在5000×g下離心所得淤漿10分鐘以完全浸提粗粉。
在第二組試驗中，首先在加熱板式攪拌器上加熱500ml沒加鹽的水到60℃，然后加入已在100℃下低溫烘烤除去殘余溶劑的50g卡諾拉油籽粗粉，并在維持60℃的同時攪拌15分鐘。通過在5000×g下離心10分鐘從耗盡的粗粉中分離出浸提物。
測定了上述試驗所得各種蛋白質(zhì)水溶液的蛋白質(zhì)濃度，并列于下表V中表V浸提物中的蛋白質(zhì)濃度(％重量)
由表V的蛋白質(zhì)濃度數(shù)據(jù)確定了粗粉的蛋白質(zhì)可提取度，將該數(shù)據(jù)列于表VI中表VI蛋白質(zhì)可提取度(％重量)*
*表示浸提的蛋白質(zhì)的量占粗粉中的總蛋白質(zhì)量的百分比。
在實施例2所述的每種HPLC和SEC柱上測試如該實施例所述制備的浸提樣品。將峰面積轉(zhuǎn)化為每個峰的百分?jǐn)?shù)。計算各次測試的所有峰，然后分別再計算三種主要的蛋白質(zhì)組分12S、7S和2S。所得結(jié)果表示在圖2-4的圖譜數(shù)據(jù)中。
每個色圖譜所顯示了代表7S卡諾拉蛋白質(zhì)組分的明顯峰以及代表12S卡諾拉蛋白質(zhì)組分的小凸起。2S卡諾拉蛋白質(zhì)組分的峰存在于浸提物的其它成分的峰之中。圖譜末端的較低的分子量峰沒有被完全確定，但可能對應(yīng)于非蛋白質(zhì)的含氮化合物，比如短肽和游離氨基酸，以及其它粗粉成分如酚類化合物、硫甙和肌醇六磷酸。
實施例4該實施例闡述了對卡諾拉蛋白分離物樣品的分析。
用如實施例2所述對噴霧干燥的卡諾拉蛋白分離物樣品進(jìn)行凝膠滲透色譜處理，這些樣品來自按照實施例1所述制備的批次BW-AL017-D29-C200和BW-AL017-D29-C300，獲得四種蛋白質(zhì)組分，將其標(biāo)記為2S、＞2S、7S和125，2S和可能的＞2S組分代表小的水溶性的白蛋白，以及7S和12S蛋白質(zhì)代表更疏水的、較少水溶性的球蛋白。
用MALDI質(zhì)譜分析這些組分和經(jīng)弱酸處理的樣品，并得出下述結(jié)果2S組分MALDI-MS分析顯示分子量接近14,000道爾頓。觀測到峰頂分裂的一個窄頻帶峰，主要的尖峰在13,960道爾頓和14,250道爾頓之間，相差了2-3個氨基酸，這提示為不同的蛋白質(zhì)同功酶。
在5％乙酸中酸處理2S組分24小時，沒有出現(xiàn)截止分子量下限值為8,000道爾頓的任何較小多肽物質(zhì)，這提示2S蛋白質(zhì)對弱酸化有抗性。
＞2S組分對該物質(zhì)的MS掃描顯示了約在13,950-13,990道爾頓處的小峰，這歸屬為2S蛋白質(zhì)，以及在13,380-13,410道爾頓的未知來源的主峰。該組分還含有在17,160-17,260道爾頓之間的明顯但較低強(qiáng)度的峰，也是未知來源的峰。
在5％乙酸中酸處理后一種組分24小時，僅在13,400道爾頓處的主峰減少，并在約7,000-8,000道爾頓處出現(xiàn)了一些次要成分，這可能是水解產(chǎn)物。2S峰沒有表現(xiàn)出減小。
7S組分
對該物質(zhì)的MS掃描顯示了最明顯的峰出現(xiàn)在48,150道爾頓和49,950道爾頓之間，主峰在約48,400+/-100道爾頓處。出現(xiàn)了一較低強(qiáng)度且較寬的峰，其分別在約95,940道爾頓和97,7150道爾頓處出現(xiàn)兩個尖峰，這提示存在少量的含有兩個亞基的蛋白質(zhì)。在實施例2中進(jìn)行的分析提示7S蛋白質(zhì)的分子量約為150,000道爾頓，而這里所作的MALDI分析指示了約為145,000道爾頓的稍低的分子量。
在主要的＞2S組分的峰面積中，在13,420道爾頓而不是在14,000道爾頓出現(xiàn)了次要成分。主要的三重峰出現(xiàn)在16,975道爾頓和17,905道爾頓之間。這些峰可能是來自蛋白質(zhì)亞基中的主要多肽并且也存在于＞2S組分而非2S組分中。
用1％乙酸酸處理7S組分24小時，殘留下在48,310道爾頓處的完整的主要物質(zhì)和在45,750道爾頓處的較小峰(可能失去了一個小的多肽)。在16,310道爾頓、22,710道爾頓和24,070道爾頓處出現(xiàn)了新的峰，這可能代表水解產(chǎn)物。
用20％的甲酸進(jìn)一步酸處理7S組分。處理1小時后進(jìn)行掃描并且在三天后再次用甲酸處理。
處理1小時后，在約26,300道爾頓出現(xiàn)新物質(zhì)，大約在5％乙酸處理時觀測到其它峰。處理3天導(dǎo)致主要亞基(48,260道爾頓)的峰強(qiáng)度降低，并且在16,315道爾頓和17,850道爾頓處出現(xiàn)主峰。
在9,000道爾頓以下掃描發(fā)現(xiàn)了在4,490道爾頓、5,720道爾頓、6,530道爾頓、7,030道爾頓和7,330道爾頓處的六個峰的特征譜圖，然而在第三天4,490道爾頓的峰明顯增加。
12S組分對12S組分進(jìn)行的MALDI-MS分析產(chǎn)生了中心在48,150道爾頓和48,200道爾頓之間主峰，它代表主要的蛋白質(zhì)亞基。低場主峰出現(xiàn)在94,960道爾頓，并在64,620道爾頓、77,540道爾頓、126,990道爾頓和143,280道爾頓處出現(xiàn)了其它較低的峰。對于大的分子量峰沒有精確地確定，僅能近似地測定其確定其真實的分子量。低場主峰在接近于兩倍亞基分子量處，而143,280道爾頓的寬峰在接近于三倍亞基分子量處。
其它明顯的峰出現(xiàn)在約13,400道爾頓、16,4000道爾頓、17,900道爾頓和29,000-29,700道爾頓處，這可能是一些組成蛋白質(zhì)亞基的多肽。
用5％乙酸酸處理12S組分24小時，產(chǎn)生的譜圖與7S組分幾乎相同并如上所述。三天后用20％甲酸處理，失去了在48,100道爾頓處的亞基而出現(xiàn)了17,900道爾頓的物質(zhì)。
在9,000道爾頓以下的掃描圖譜與20％甲酸酸解1小時后的幾乎相同，具有在4,480道爾頓、5,730道爾頓、6,510道爾頓、6,650道爾頓、7,020道爾頓和7,310道爾頓處的六個峰。與7S組分結(jié)果不同的是，在第3天甲酸處理后4,480道爾頓的峰沒有明顯的增大。
根據(jù)該實施例報道的MALDI-MS分析結(jié)果，可以得出以下結(jié)論(a)2S蛋白質(zhì)的分子量在13,960-14,250道爾頓之間，與公開的接近14,000道爾頓的結(jié)果相符，并且2S蛋白質(zhì)對弱酸處理具有相當(dāng)?shù)目剐浴?br> (b)7S和12S蛋白質(zhì)是由在48,200-48,400道爾頓范圍內(nèi)的基本亞基的相同構(gòu)件構(gòu)成的。7S蛋白質(zhì)具有三個亞基的分子量或具有約145,000道爾頓的分子量，而12S蛋白質(zhì)含有6個亞基，其組合分子量為約290,000道爾頓。這些值低于實施例2中通過GPL和HPLC SEC分子量計算基于動物標(biāo)準(zhǔn)品測得的結(jié)果。
(c)酸解7S和12S蛋白質(zhì)沒有產(chǎn)生2S蛋白質(zhì)。
(d)對這兩種球蛋白的酸解的結(jié)果幾乎相同，這證實了上述兩種蛋白質(zhì)來自同樣的亞基。
實施例5該實施例闡述了制備型高壓液相色譜(HPLC)。
使用Varian制備型高壓液相色譜系統(tǒng)(prep-HPLC)分離卡諾拉蛋白質(zhì)，使用300×21.20mm Phenomenex BioSep S3000大小排阻色譜(SEC)主柱，其裝有直徑為5微米、孔徑為290的親水鍵合的硅膠剛性載體介質(zhì)。在主柱的前端連有可更換的預(yù)柱，其裝有同樣的填料并且大小為60×21.20mm。
在280nm下檢測每種分析物，洗脫速率在6mL/分鐘-8mL/分鐘之間。在上述流速下沒有超過柱壓上限1,000psi。含有疊氮化鈉的作為抗菌劑的鹽水溶液用作柱子的流動相并用于溶解干燥的卡諾拉蛋白質(zhì)樣品。將洗脫液收集于Varian Model 701型組分收集儀中。根據(jù)樣品的不同，運(yùn)行時間為12分鐘-15分鐘。
對于占蛋白分離物干重的2.0％至3.0％之間的樣品濃度，樣品注射體積為1.0-1.5mL，或每次注射20mg-45mg固體。根據(jù)樣品類型和濃度，柱載量可以超過1.5mL。先攪拌樣品30分鐘，然后在10,000rpm離心20分鐘。然后讓上清液真空濾過最小孔徑為0.45微米的膜。
雖然該系統(tǒng)可以24小時連續(xù)地運(yùn)轉(zhuǎn)，但通常不這樣操作，因為每天需要涉及乙腈水溶液的清洗步驟來除去柱中的雜質(zhì)。雖然如此，通常每天可以運(yùn)行80-100次，收集到0.5-1.2克被分析物。
從來自PMM和來自上清液的卡諾拉蛋白分離物制備樣品，蛋白分離物包括下述如實施例1制備的BW-AL-017-D29-02A-C200、BW--AL021-I24-02A-C200、BW-AL021-I30-02A-C200、BW-AL-017-D29-02A-C300、BW-AL021-I24-02A-C300和BW-AL021-I30-02A-C300。
PMM(C300)樣品用于收集7S和12S蛋白質(zhì)，而來自上清液(C200)的樣品主要用于收集2S。將組分的等分用Varian分析型SEC-HPLC檢測純度。洗脫液的蛋白質(zhì)濃度一般低于0.3％重量(N×6.25)或在280nm下低于2.0的吸收單位，并且通過電導(dǎo)率測定，鹽含量通常在0.5％重量NaCl-0.7％重量NaCl之間。
實施例6該實施例闡述了對實施例5中收集的組分的超濾和透析。
超濾以及隨后的透析均可減少大量的洗脫液體積和高的鹽蛋白質(zhì)比例。來自實施例5中所述的Varian制備型HPLC系統(tǒng)的稀釋洗脫液在兩個Amicon 8000系列的超濾攪拌池單元中濃縮，每個單元的額定最大容量為400mL。
每個單元裝有具有選擇性的截止分子量的76mm直徑的膜。對于2S蛋白質(zhì)，所用的膜包括具有再生纖維素的Ultracel Amicon YM1 UF膜(1,000 NMWL(常規(guī)分子量截止限)，#13342)和具有再生纖維素的Ultracel Amicon YM10 UF膜(10,000 NMWL，#13642)。
對于較大的7S和12S球蛋白，使用較高NMWL的膜Biomax PBQKUF膜(聚乙烯砜(PES)，50,000 NMWL，#PBQK 07610)或Biomax PBHKUF膜(PES，100,000 NMWL，#PBHK 07610)。
較高NMWL膜導(dǎo)致保留的蛋白質(zhì)(被稱為保留物)出現(xiàn)一些損失，還除去了較低分子量的與蛋白質(zhì)微弱相連的雜質(zhì)。較高的截止NMWL還減少了UF的操作時間。通常1,200ml的HPLC樣品在兩個UF設(shè)備上的運(yùn)行時間為4-5小時。
在常規(guī)運(yùn)行中，將樣品加入每個單元中至325mL的刻線處。在攪拌下，液面水平升高到到約375mL。密封設(shè)備并加壓到60psi，同時攪拌樣品。當(dāng)單元中的保留物降低到約100mL時，釋放壓力并且向每個設(shè)備中再加入樣品。該過程連續(xù)直至加入全部樣品。每個池中的最終保留物被濃縮到75-100mL。
從每個設(shè)備中除去洗脫液(稱為滲透物)并根據(jù)電導(dǎo)率測定鹽濃度。通過用紫外-可見光UltraSpec 1000E分光光度計在1cm池中測定的280nm處的吸收值來確定相對的蛋白質(zhì)含量。計算質(zhì)量平衡，得出UF膜的使用效率。如實施例2所述，用分析型SEC-HPLC檢測UF滲透物和最終保留樣品的純度。
將超濾保留物倒入Spectra/Por 7透析膜(1,000MWCO(截止分子量)，24.2mm直徑，#132104)中。每個管被分隔為約300mm。然后將裝滿的膜放在含有RO水的密封的4升容器中。在透析樣品從管中轉(zhuǎn)移出之前換兩次RO水，然后將透析樣品放于平底盤中于-65℃下冷凍。根據(jù)電導(dǎo)率，最終的鹽濃度一般低于0.1％重量。
然后將冷凍的樣品放于Virtis SRCX-15凍干機(jī)中。根據(jù)所含的水量，改變干燥時間。從平底盤上取下干燥樣品并在分析前稱重。
實施例7該實施例闡明了氨基酸分析。
分析了按照實施例5和6所述制備的各個經(jīng)超濾、透析和凍干的卡諾拉蛋白質(zhì)2S、7S和12S的氨基酸成分。2S樣品來自卡諾拉蛋白分離物AL021-I30-02A C200，而7S和12S蛋白質(zhì)來自卡諾拉蛋白分離物AL017-D29-02A C300。
氨基酸分析列于下表VII
表VII
注示(1)“游離”氨基酸分子量。
(2)聚合的氨基酸的平均分子量。
表VII中給出的值代表基于每100克干重的氨基酸克數(shù)。即使在超濾后，12S樣品仍含有殘余的鹽，這是由于與7S和2S樣品相比，該樣品中的總氨基酸重量低。將該數(shù)據(jù)調(diào)節(jié)為以100g氨基酸為基準(zhǔn)，修訂的數(shù)據(jù)顯示在下表VIII中
表VIII
e＝11種必需氨基酸aa＝氨基酸*谷氨酸和天冬氨酸通常被酰胺化為谷氨酰胺和天冬酰胺。
從表VIII中可以看出，白蛋白2S蛋白質(zhì)在不同氨基酸的相對含量方面與球蛋白7S和12S存在差異。雖然列出的大多數(shù)氨基酸均存在明顯差異，但主要的差異出現(xiàn)在天冬氨酸、谷氨酸、胱氨酸、賴氨酸和脯氨酸。經(jīng)比較，7S和12S的氨基酸分布幾乎相同，并且確實在本測試的標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。谷氨酸的質(zhì)量包括谷氨酰胺，并且天冬氨酸的質(zhì)量包括天冬酰胺。在酸解中谷氨酰胺和天冬酰胺均被脫去了氨基，從而檢測到氨基酸。
表VII包括各個氨基酸的分子量。結(jié)合單獨(dú)的質(zhì)量，給出了2S、7S和12S的“游離”氨基酸的平均分子量，它們均剛好低于135道爾頓。由于蛋白質(zhì)是脫水氨基酸的生物聚合物(每個多肽除了一個末端氨基酸之外，每個氨基酸均減去一分子水)，還給出了脫水重量的平均分子量。盡管這兩種類型的蛋白質(zhì)之間存在差異，但平均聚合氨基酸分子量幾乎相同，約為117道爾頓。這意謂著由MALDI-MS測定的分子量為14kDa的2S含有大約120個氨基酸，由MALDI-MS測定的分子量為145kDa的7S含有大約1,240個氨基酸，12S含有該數(shù)量的兩倍，即2,480個氨基酸。每個7S/12S亞基含有約413個氨基酸。
表VIII還顯示了不能由人體合成的必需氨基酸。這兩種蛋白質(zhì)的11種必需氨基酸的總量十分相似。一種氨基酸的減少被另一種必需氨基酸的增加所平衡。2S中的賴氨酸約是7S和12S中含量的兩倍。但是，球蛋白具有較高的芳香族必需氨基酸-酪氨酸和苯丙氨酸總含量，并且除了蛋氨酸和胱氨酸之外，一般來說脂肪族疏水必需氨基酸含量較高。
根據(jù)Gibb’s自由能值確定表VIII中氨基酸的疏水性，表示為KJ/100g氨基酸。Gibb’s自由能值列于《食品化學(xué)》第三版，由Fennema，Marcel Dekker，New York出版，1996年，330頁中。這兩種蛋白質(zhì)無論在疏水性的總重量或是在總能量上基本上沒有差異，但是疏水性還取決于多肽的構(gòu)向而不僅僅是單個氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)?？傊?，根據(jù)Mieth等人(下表IX)對油籽蛋白質(zhì)的綜述，球蛋白的等電點(diǎn)在接近中性的pH(7.2)處，而2S的等電點(diǎn)高于pH9.0。2S的分子量非常小，而7S和12S明顯較大，具有更多的可抵抗水合的潛在的疏水內(nèi)部區(qū)域。
通過計算生物聚合物中氨基酸殘基的數(shù)量，可以將氨基酸組分轉(zhuǎn)化為氨基酸殘基。如前所述，根據(jù)MALDI-MS分析，2S含有大約120個氨基酸殘基，而7S含有約1,240個氨基酸殘基，12S含有約2,480個氨基酸殘基。
下表IX將上述氨基酸分析結(jié)果轉(zhuǎn)化為2S的氨基酸，并且將該結(jié)果與公開的氨基酸殘基范圍進(jìn)行了比較。
表IX
e＝11種必需氨基酸 aa＝氨基酸MALDI-MS數(shù)據(jù)顯示2S分子量為約14,000道爾頓，即120個聚合氨基酸。
*谷氨酸和天冬氨酸大多數(shù)被酰胺化。
1Monsalve等人，J.Experimental Botany，第41卷，第222期，89-94頁，1990年1月。
2Mieth等人，Die Nahrung，27，7，1983，675-697頁。
該轉(zhuǎn)化值與公開的結(jié)果非常一致。近年來，Monsalve等人(1990，按照表IX)和Gehrig等人，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，第93卷，3647-3652頁，1996年4月和Ericson等人，J.Biological Chem.，第261卷，第31期，14576-14581頁，1986年11月的文章給出了關(guān)于2S和前體分子pro-Napin的詳細(xì)信息，包括實際的氨基酸序列。
各個氨基酸包括在表IX中的公開文件給出的范圍內(nèi)。列出范圍是由于油籽種類的變化，以及還可能由于實驗工作報道的較少的水解損失。
雖然關(guān)于cruciferin(12S)的報道較少，但是關(guān)于該球形卡諾拉蛋白質(zhì)的已知內(nèi)容與我們目前的發(fā)現(xiàn)很好地吻合。在表X中將氨基酸分析數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為氨基酸殘基，并與12S蛋白質(zhì)的公開范圍比較。
表X
7S和12S的平均(脫水)分子量計算為116.8道爾頓。
MALDI-MS結(jié)果顯示7S分子量為145kDa，12S蛋白質(zhì)為290kDa(實施例4)。因此，7S含有約1,240個氨基酸殘基，12S含有其兩倍，即約2,480個氨基酸殘基。
1Mieth等人，Die Nahrung，27，7，1983，675-697頁。
公開的信息來自Mieth等人的對油籽蛋白質(zhì)的綜述(1983年)。該參考文獻(xiàn)列出了具體氨基酸殘基的范圍。本文中給出的數(shù)據(jù)普遍地與上述給出的范圍一致。
作者(Mieth等人)指出12S分子含有6個主要的亞基，每個亞基含有兩個分子量約為18,000道爾頓和31,000道爾頓的多肽。該信息也與實施例4給出的MALDI-MS數(shù)據(jù)一致。
內(nèi)容總結(jié)綜上所述，本發(fā)明提供了具有獨(dú)特的2S、7S和12S蛋白質(zhì)分布的新穎卡諾拉蛋白分離物組合物，還提供了單個的分離純化的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明范圍內(nèi)還可能進(jìn)行各種改變。
權(quán)利要求
1.一種卡諾拉蛋白分離物，其蛋白質(zhì)含量至少為約90％重量，以干重為基準(zhǔn)并且以Kjeldahl氮轉(zhuǎn)換率N×6.25測定，并且其呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約60-95％重量的2S蛋白質(zhì)，約5-40％重量的7S蛋白質(zhì)，和約0-5％重量的12S蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的蛋白分離物，其呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約70-95％重量的2S蛋白質(zhì)，約5-30％重量的7S蛋白質(zhì)，和約0-2％重量的12S蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的蛋白分離物，其蛋白質(zhì)含量至少為約100％重量。
4.一種卡諾拉蛋白分離物的組合物，其含有(1)第一種卡諾拉蛋白分離物，其蛋白質(zhì)含量至少為約90％重量，以干重為基準(zhǔn)并且以Kjeldahl氮轉(zhuǎn)換率N×6.25測定，并且其呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約60-98％重量的7S蛋白質(zhì)，約1-15％重量的12S蛋白質(zhì)，和約0-25％重量的2S蛋白質(zhì)，和(2)第二種卡諾拉蛋白分離物，其蛋白質(zhì)含量至少為約90％重量，以干重為基準(zhǔn)并且以Kjeldahl氮轉(zhuǎn)換率N×6.25測定，并且其呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約60-95％重量的2S蛋白質(zhì)，約5-40％重量的7S蛋白質(zhì)，和約0-5％重量的12S蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中在所述的組合物中，所述的第一種卡諾拉蛋白分離物和所述的第二種卡諾拉蛋白分離物以約5∶95-95∶5的重量比存在。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述的第一種卡諾拉蛋白分離物呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約88-98％重量的7S蛋白質(zhì)，約1-10％重量的12S蛋白質(zhì)，和約0-6％重量的2S蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述第一種卡諾拉蛋白分離物的蛋白質(zhì)含量至少為約100％重量。
8.權(quán)利要求5的組合物，其中所述第二種卡諾拉蛋白分離物呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約70-95％重量的2S蛋白質(zhì)，約5-30％重量的7S蛋白質(zhì)，和約0-2％重量的12S蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述的第二種卡諾拉蛋白分離物的蛋白質(zhì)含量至少約100％重量。
10.分離并純化的7S卡諾拉蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，根據(jù)MALDI-MS測定其分子量為約145kDa。
12.權(quán)利要求11的蛋白質(zhì)，其含有三個亞基，每個亞基約有413個氨基酸。
13.權(quán)利要求12的蛋白質(zhì)，其具有基本上如表VII或表VIII所列出的氨基酸分析。
14.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，它是從卡諾拉蛋白質(zhì)微粒團(tuán)中分離并純化得到的。
15.權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)微粒團(tuán)是通過在弱酸條件下稀釋從卡諾拉油籽粗粉中浸提得到的濃縮的蛋白質(zhì)的鹽水溶液形成的。
16.一種組合物，其含有分離純化的7S卡諾拉蛋白質(zhì)與至少另外一種選自2S和12S卡諾拉蛋白質(zhì)中的分離純化的卡諾拉蛋白分離物的混合物。
17.一種從含有選自2S、7S和12S中至少兩種不同的卡諾拉蛋白質(zhì)混合物的卡諾拉蛋白分離物中分離純化單個的卡諾拉蛋白質(zhì)的方法，其包括提供所述的卡諾拉蛋白分離物，其蛋白質(zhì)含量至少為約90％重量，以干重為基準(zhǔn)并且以Kjeldahl氮轉(zhuǎn)換率N×6.25測定，溶解該卡諾拉蛋白分離物，用制備型的高壓液相色譜或等效的方法處理所得的蛋白質(zhì)溶液，基于分子大小分離蛋白質(zhì)，收集含有單個所選卡諾拉蛋白質(zhì)的洗脫液組分，超濾所選組分以減少洗脫液體積，透析濃縮的洗脫液以除去溶解的物質(zhì)，并且干燥透析產(chǎn)物以回收單個的卡諾拉蛋白質(zhì)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的卡諾拉蛋白分離物呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約60-98％重量的7S蛋白質(zhì)，約1-15％重量的12S蛋白質(zhì)，和約0-25％重量的2S蛋白質(zhì)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述的卡諾拉蛋白分離物呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約88-98％重量的7S蛋白質(zhì)，約1-10％重量的12S蛋白質(zhì)，和約0-6％重量的2S蛋白質(zhì)。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述的卡諾拉蛋白分離物被分離純化為7S和/或12S蛋白質(zhì)。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述的卡諾拉蛋白分離物呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約60-95％重量的2S蛋白質(zhì)，約5-30％重量的7S蛋白質(zhì)，和約0-2％重量的12S蛋白質(zhì)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的卡諾拉蛋白分離物呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)分布為約70-95％重量的2S蛋白質(zhì)，約5-30％重量的7S蛋白質(zhì)，和約0-2％重量的12S蛋白質(zhì)。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述卡諾拉蛋白分離物被分離純化為2S蛋白質(zhì)。
全文摘要
隨同新的卡諾拉蛋白質(zhì)一起，提供了一種新的卡諾拉蛋白分離物。該新的卡諾拉蛋白分離物是從生產(chǎn)卡諾拉蛋白質(zhì)微粒團(tuán)的上清液中得到的，并且主要含有2S蛋白質(zhì)。來自PMM的卡諾拉蛋白分離物主要含有7S蛋白質(zhì)。還提供了卡諾拉蛋白分離物的組合物。
文檔編號A61K8/97GK1658763SQ03812721
公開日2005年8月24日 申請日期2003年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月15日
發(fā)明者J·洛吉伊, R·米拉諾瓦 申請人:伯康營養(yǎng)科學(xué)(Mb)公司